SU1767433A1

SU1767433A1 - Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа

Info

Publication number: SU1767433A1
Application number: SU894764167A
Authority: SU
Inventors: Аделаида Александровна Быкова; Татьяна Александровна Юшкова; Елена Викторовна Быкова
Original assignee: Пермский государственный медицинский институт
Priority date: 1989-11-27
Filing date: 1989-11-27
Publication date: 1992-10-07

Abstract

Изобретение относитс к медицине, а именно к лабораторной диагностике инсулинорезистентности и ее генеза у больных сахарным диабетом I типа. Цель изобретени - повышение точности диагностики. Ак- тивированные ин витро инсулином лимфоциты донора обрабатывают цельной сывороткой крови больного при температуре +37&deg;с в течение 30 мин, добавл ют к ним эритроциты барана, сенсибилизированные инсулином, при снижении числа розеткооб- разующих клеток в 2 и более раз диагностируют инсулинорезистентность иммунного генеза. Способ дает возможность чувствительной и объективной диагностики инсулинорезистентности и ее генеза, что важно в плане ее своевременной специфической профилактики и терапии.

Description

Ё

Изобретение относитс к области медицины , а именно к лабораторной диагностике инсулинорезистентности и ее генеза у больных сахарным диабетом I типа.

Наиболее часто встречаетс иммунный тип инсулинорезистентности - прототип (Потемкин В.В. Эндокринологи , - М., 1986 г., с. 250). Одним из факторов ее генеза вл етс образование антител к инсулино- рецепторам (Tan or S. Clin Res. - 1987, У.35, - 1 ISb 5. - P. 459-472).

Однако, методов выполнени этих антител , пригодных дл клиники, в доступной нам медицинской литературе, мы не встретили .

Целью изобретени вл етс повышение точности диагностики.

Способ осуществл ют следующим образом .

В две центрифужные пробирки (одна - дл определени исходного содержани инсулиновых розеток в активированной гормоном суспензии лейкоцитов крови донора; друга -дл изучени действи на лейкоциты сыворотки крови больного) забирают по 0,1-0,2 мл крови донора в 0,1-0,2 мл 5% свежеприготовленног6 р ас твора цитрата натри дл предупреждени свертывани крови. После тщательного встр хивани содержимого пробирок в него внос т дл ли- зировани эритроцитов по 0,8-0,9 мл дистиллированной воды. Смесь встр хивают в течение 10-3,0 сек и добавл ют до 10 мл питательную среду 199 Суспензии клеток центрифугируют в течение 5-6 мин при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, вновь добавл ют 1 мл среды 299 и снова центрифугируют . Отсосав надосадочную жидкость, лимфоциты осадков активируют инсулином, дл чего в пробирки внос т по 0,01 Ед бычьXI

О

VI

Јь

со со

его инсулина, содержащегос в 0,25 мл питательной среды. Осадок осторожно встр хивают и смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 30 мин. После инкубации смесь лейкоцитов в обеих пробирках отмывают от гормона с помощью 10 мл изотони- ческого раствора натри хлорида центрифугированием при 1500 об/мин, в течение 5-6 мин. Затем осадок первой пробирки оставл юют временно без воздействи . Осадок второй пробирки соедин ют с 0,1-0,2 мл исслеДУемойТполученной путем отстаива Ш кЈови дек мплементирован- ной .сыворотки крови больного, осторожно встр хивают и инкубируют при температуре +37°С в течение 30 мин.

После инкубации с сывороткой лейкоциты отмывают изотоническим раствором натри хлорида (10 мл) путем центрифугировани при 1500 об/мин в течение 5-6 мин. Надосадочную жидкость отсасывают пипет- кой, после чего осадки в обеих пробирках ресуспендируют в 0,1-0,2 мл изотонического раствора натри хлорида рН -7,2. К полученным взвес м лейкоцитов добавл ют по 0,1-0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитного диагностикума, и смесь инкубируют при температуре +37°С в течение 10-15 мин, а затем в течение 18 ч в услови х холодильника . Через 18 ч в обе пробирки добавл ют по 1 мл 50%-ного раствора бычьей сыворотки, центрифугируют смеси при 1500 об/мин 5- 6 мин, надосадочную жидкость сливают, а из осадков делают мазки, которые высушивают на воздухе, фиксируют в этиловом спирте 20-25 мин и окрашивают по Рома- новскому-Гимза. Просматривают под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмеча среди них число (в процентах) лимфоцитов, фиксировавших на себе три и более эритроцитов (розеткообра- зующие клетки - РОК). Суспензи лейкоцитов донора считаетс активированной гормоном, если в ней содержитс от 20% и более розеткообразующих лимфоцитов, специфичных инсулину. При наличии в сы- воротке крови больного антител к инсули- норецепторам отмечаетс блокада ими инсулинорецепторов лимфоцитов крови донора с резким (в 2 - 10 раз и более) уменьшением числа РОК, взаимодействующих с гормоном, фиксированным на эритроцитах барана. На основании этих данных ставитс диагноз инсулинорезистентности иммунного генеза.

Дл приготовлени диагностикума ис- пользуют эритроциты барана, обработанные гютаровым альдегидом. Свежие эритроциты барана трижды отмывают изотоническим раствором натри хлорида (рН- 7,2), центрифугиру взвесь в течение 5

минут при 1500 об/мин. Из отмытых эритроцитов готов т 5% взвесь, соедин 055 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл забуференного изотонического раствора натри хлорида рН-7,2. При глютаризации смешивают 5% взвесь эритроцитов с 0,25% свежеприготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1:1. Выдерживают смесь при температуре +37°С в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от глютарового альдегида забуференным изотоническим раствором натри хлорида и довод т тем же раствором до первоначального объема (5% взвесь). Приготовленные таким образом эритроциты хран тс при температуре +14°С в течение 6 мес цев.

Дл сенсибилизации эритроцитов инсулином глютаризированные эритроциты отмывают изотоническим раствором натри хлорида рН-6,4 и довод т им же взвесь до первоначального объема. Затем соедин ют с раствором инсулина, содержащим 20 ЕД в мл, в соотношении 1:1. Смесь оставл ют при комнатной температуре на 20 мин, после чего отмывают дважды забуференным раствором натри хлорида рН-7,2. Слив надосадочную жидкость, довод т обьем до первоначального (5% взвесь). В реакции используют 0,5% взвесь сенсибилизированных эритроцитов, которую готов т из исходной (5%) взвеси путем соединени 1 мл ее с 9 мл среды 199.

Пример 1. Больна П-ва Т,В, 1968 года рождени , Поступила в эндокринологическое отделение ОКБ г. Перми 28 окт бр 1988 года с жалобами на тошному, головную боль, периодически наступающее ощущение слабости. Больна с 1981 года , когда по вились жажда, значительное похудание. В сент бре 1981 года после перенесенной ангины состо ние резко ухудшилось и в т желом состо нии была госпитализирована в ОКБ, где был установлен диагноз сахарного диабета. С 1981 года периодически лечитс с эндокринологическом отделении ОКБ. Объективно: рост 165 см, вес 64 кг. Кожные покровы гиперемированы, руброз щек, зык рко-красный. Содержание сахара в крови - 10,8 - 8,19; 12,0; 16,1; 11,6:9,8; 12,2 м/моль/л. Содержание сахара в моче -5,6-2,8; 0,8; 1,2%. Больна получает 56 ЕД инсулина дл инъекций.

Диагноз: сахарный диабет, 1 тип, средней т жести, декомпенсированный, рецидивирующий . Кетоацидоз. Липодистрофи , печени. Инсулинорезистентность.

При исследовании крови больной в две центрифужные пробирки забрали 0,1 мл крови донора в 0,1 мл 5% свежеприготовленного раствора цитрата натри . После

тщательного встр хивани содержимого пробирок в нег лнесли по 0,8 мл дистиллированной воды. В смеси после встр хивани в течение 10 секунд добавили до 10 мл среду 199. Затем суспензии клеток отцентри- фугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин надосадочную жидкость отсосали пипеткой , добавили 1 мл среды 199 и снова отцен- трифугировали. Отсосав надосадочную жидкость, лимфоциты осадка проактивири- вали инсулином, дл чего в пробирки внесли по 0,001 ЕД инсулина, содержащегос в 0,25 мл среды 199. Смесь инкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. После инкубации смесь лейкоцитов в обеих пробирках отмывали от гормона с помощью 10 мл изотонического раствора натри хлорида центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Осадок одной пробирки соединили в 0,1 мл исследуемой сыворотки крови больного, встр хнули смесь и проинкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. Затем дейкоциты отмыли изотоническим раствором натри хлорида (10 мл) путем центрифугировани и отсосали надосадочную жидкость. Далее осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натри хлорида и к обеим взвес м добавили по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума, после чего проинкубировали их при температуре +37°С в течение 10 мин, а затем в течение 18 часов в услови х холодильника. Через 18 часов в обе пробирки добанили по 1 мл 50%-ного раствора бычьей сыворотки и процентрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость слили , а из осадков сделали мазки, которые высушили, зафиксирорвали этиловым спиртом в течение 20 мин и окрасили по Рома- новскому-Гимза, после чего просмотрели в мазках 100 лимфоцитов, отметив среди них число лимфоцитов, фиксировавших на себе три и более эритроцита.

При исследовании сыворотки крови больной за вл емым способом в ней обнаружены аутоантитела к инсулинорецепто- рам, так как сыворотка заблокирована инсулинорецепторы активированных лимфоцитов крови донора и уменьшила число инсулиновых розеток с 55% до 9%. Заключение: на основании данных проведенного анализа поставлен диагноз инсулино- резистентности иммунного генеза, обусловленной действием антирецепторных антител .

Пример 2, 0-ев А.А., 28 лет, поступил в эндокринологическое отделение ОКБ Г. Перми 27 сент бр 1988 года с жалобами на общую слабость, жажду, жидкий стул. Болен

в течение 11 лет, в первые два года болезни перенес п ть диабетических ком. В последние 4 года наблюдаетс частые гипогликемии . Объективно: больной пониженного

питани , вес 59 кг. Запах ацетона изо рта. Язык обложен. При пальпации отмечаетс болезненность в эпигастрии. Печень увеличена и выступает из-под подреберь на два поперечных пальца. Содержание сахара в

крови: 10,0-15,5-11,0-7,0-21,2 м/моль/л. Содержание сахара в моче: 3,6-3,8-3,6- 2,6%, ацетон +. Больной получает 54 ЕД инсулина дл инъекций.

Диагноз: сахарный диабет Е типа, т желое течение. Кетоацидоз. Диабетическа энцефалопати , Нефропати II. Пиэлонефрит. Диабетический гепатит. Ретинспати I. Ин- сулинорезистентность.

При исследовании крови больного в две

центрифужные пробирки забрали 0,1 мл крови донора в 0,1 мл 5% свежеприготовленного раствора цитрата натри . После тщательного встр хивани содержимого пробирки в него внесли по 0,8 мл дистиллированной воды. В смеси после встр хивани в течение 10 секунд добавили до 10 мл среду 199. Затем суспензии клеток отцент- рифугировали в течение 5 минут при 1500 об/мин, надосадочную жидкость

отсосали пипеткой, добавили 1 мл среды 199 и снова отцентрифугировали. Отсосав надосадочную жидкость, лимфоциты осадка проактивировали инсулином, дл чего в пробирки внесли по 0,001 ЕД инсулина, содержащего в 0,25 мл среды 199. Смесь инкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. После инкубации смесь лейкоцитов в обеих пробирках отмыли от гормона с помощью 10 мл изотонического

раствора натри хлорида центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Осадок одной пробирки соединили с 0,1 мл исследуемой сыворотки крови больного, встр хнули смесь и проинкубировали при

температуре +37°С в течение 30 мин. Затем лейкоциты отмыли изотоническим раствором натри хлорида (10 мл) путем центрифугировани и отсосали надосадочную жидкость. Далее осадки в обеих пробирках

ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натри хлорида и к обеим взвес м добавили по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного дизгностикума, после чего проинкубировали их при температуре +37°С в

течение 10 мин, а затем в течение 18 ч в услови х холодильника. Через 18 ч в обе пробирки добавили по 1 мл 30%-ного раствора бычьей сыворотки и процентрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин,

Надосадочную жидкость слили, а из осадков

сделали мазки, которые высушили, зафиксировали этиловым спиртом в течение 20 мин и окрасили по Роман овскому- Гимза, после чего просмотрели в мазках 100 лимфоцитов, отметив среди них число лимфоцитов, фиксировавших на себе три и более эритроцитов.

Пи исследовании сыворотки крови больного за вленным способом обнаружены аутоантитела к инсулинорецепторам, так как сыворотка заблокирована инсулиноре- цепторы активированных лимфоцитов донора и уменьшила число инсулиновых розеток в суспензии лейкоцитов донора с 55% до 5%.

Заключение: у больного диагносцирова- на инсулинорезистентность иммунного ге- неза, обусловленна . антирецепторными антителами.

П р и м е р 3: П-в И.М., 30 лет, практически здоров. Объективно: нормального телосложени , вес 64 кг. Язык чистый. Дыхание и сердечно-сосудиста система без особенностей . Живот м гкий, безболезненный. Содержание сахара в крови в пределах нормы. При исследовании сыворотки крови в две центрифужные пробирки забрали 0,1 мл крови донора в 0,1 мл 6% свежеприготовленного раствора цитрата натри . После тщательного встр хивани содержимого пробирок в него внесли по 0,6 мл дистиллированной воды. В смеси после встр хивани в течение 10 сек добавили до 10 мл среду 199. Затем суспензии клеток отцент- рифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость отсосали пипеткой, добавили 1 мл среды 199 и снова отцентрифугировали. Отсосав надосадочную жидкость лимфоциты осадка проакти- вировали инсулином, дл чего в пробирки внесли по 0,001 ЕД инсулина, содержащегос в 0,25 мл среды 199. Смесь инкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. После инкубации смесь лейкоцитов в обеих пробирках отмыли от гормона с помощью 10 мл изотонического раствора натри хлорида центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Осадок одной пробирки соединили с 0,1 мл исследуемой сыворотки крови, встр хнули смесь и проинкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин. Затем лейкоциты отмыли изотоническим раствором натри хлорида (10 мл) путем центрифугировани и отсосали надосадочную жидкость. Далее осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натри хлорида и к обеим взвес м добавили по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума, после чего проинкубировали их при температуре +37°С в течение 10 мин, а затем в течение 18 ч в услови х холодильника. Через

18 ч в обе пробирки добавили по 1 мл 50%- ного раствора бычьей сыворотки и процент- рифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость слили, а из

5 осадков сделали мазки, которые высушили , зафиксировали этиловым спиртом в те- чение 20 мин и окрасили по РомановскомуТимза, после чего просмотрели в мазках 100 лимфоцитов, отметив сре0 ди них число димфоцитов фиксированных на себе три и более эритроцита.

В результате исследовани установлено , что обработка лимфоцитов донора, стимулированных инсулином, сывороткой

5 крови здорового человека числа инсулиновых розеток не измен ет (41 % - до обработки и 43% после обработки клеток). Заключение: антител к инсулинорецепторам в крови здорового человека нет, инсули0 норезистентность исключаетс ,

Дл доказательства того, что мы имеет дело с антителами к инсулинорецепторам, а также дл доказательства специфичности способа проводилась адсорбци антител к

5 инсулинорецепторам из сыворотки крови больного путем двойной обработки исследуемых сывороток крови больных активированными в услови х подкожным введением инсулина в дозе 0,25 КД/кг массы сплено0 цитами крысы. Цель активации - экспресси на мембране спленоцитов крысы инсулино- рецепторов. После адсорбции спленоцита- ми, активированными инсулином, но не любым другим соединением (гистамином, се5 ротонином), сыворотки больных тер ли способность блокировать образование розеток, специфичных инсулину. Так, если до адсорбции сыворотка крови больного Манылова уменьшала число инсулиновых

0 розеток в суспензии лейкоцитов крови донора с 38% до 12%, то после истощени сплено- цитами крысы она утратила эту способность, и число инсулиновых розеток в суспензии клеток крови донора после обработки их

5 адсорбированной сывороткой больного не отличалась от исходного (34%).

Преимущества предлагаемого способа заключаютс в его высокой специфичности, точности, чувствительности, малом количе0 стве (0,1-0,2 мл) крови, забираемой как у донора, так и у больного, простоте технического исполнени способа и чтени его результатов , в необходимости минимальных количеств доступных реактивов и несложно5 го оборудовани , что позвол ет осуществл ть проведение способа в услови х клиники (больницы), в отсутствии необходимости привлечени высококвалифицированных кадров дл выполнени способа.

Вы снение генеза неэффективности инсулинотерапии , обусловленной разными иммунными фактор 5ми (антителами к инсулину, инсулинорецепторам и т.д.), представл ет большой практический интерес, вл сь основой дл рациональной гормонотерапии, иммуносупрессивного и других видов лечени .

Claims

Способ дает возможность объективной диагностики инсулинорезистентности и ее генеза, что важно в плане ее своевременной специфической профилактики и терапии. Формула изобретени Способ определени инсулинорезистентности иммунного генеза у больных са

харным диабетом типа, включающий забор крови, выделение сыворотки с последующим ее исследованием, отличающий- с тем, что, с целью повышени точности диагностики, сыворотку больного инкубируют с обработанными инсулином лимфоцитами донора при 37°С в течение 30 мин, далее добавл ют сенсибилизированные инсулином эритроциты барана, подсчитывают количество розеткообразующих клеток и при снижении их количества по сравнению с количеством розеткообразующих клеток без сыворотки в два раза диагностируют инсулинорезистетность.