RU2664864C1 - Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы - Google Patents
Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2664864C1 RU2664864C1 RU2016116258A RU2016116258A RU2664864C1 RU 2664864 C1 RU2664864 C1 RU 2664864C1 RU 2016116258 A RU2016116258 A RU 2016116258A RU 2016116258 A RU2016116258 A RU 2016116258A RU 2664864 C1 RU2664864 C1 RU 2664864C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- kinase
- bank
- cell
- inhibitor
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 58
- 101000603702 Homo sapiens Neurogenin-3 Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 title claims description 28
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 title description 22
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 82
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 61
- 101000578254 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.1 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101000578258 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.2 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102100028096 Homeobox protein Nkx-6.2 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 347
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 66
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 59
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 48
- -1 Tyrfostin 46 Chemical compound 0.000 claims description 33
- ZKZXNDJNWUTGDK-NSCUHMNNSA-N (E)-N-[2-(4-bromocinnamylamino)ethyl]isoquinoline-5-sulfonamide Chemical compound C1=CC(Br)=CC=C1\C=C\CNCCNS(=O)(=O)C1=CC=CC2=CN=CC=C12 ZKZXNDJNWUTGDK-NSCUHMNNSA-N 0.000 claims description 25
- PBBRWFOVCUAONR-UHFFFAOYSA-N PP2 Chemical compound C12=C(N)N=CN=C2N(C(C)(C)C)N=C1C1=CC=C(Cl)C=C1 PBBRWFOVCUAONR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- MZNDNBFMSVMUCX-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(5-isoquinolinylsulfonylamino)ethyl]guanidine Chemical compound N1=CC=C2C(S(=O)(=O)NCCN=C(N)N)=CC=CC2=C1 MZNDNBFMSVMUCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- ZVPDNRVYHLRXLX-UHFFFAOYSA-N 1-ter-butyl-3-p-tolyl-1h-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ylamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=NN(C(C)(C)C)C2=NC=NC(N)=C12 ZVPDNRVYHLRXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- GFNNBHLJANVSQV-UHFFFAOYSA-N tyrphostin AG 1478 Chemical compound C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(Cl)=C1 GFNNBHLJANVSQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- TUCIOBMMDDOEMM-RIYZIHGNSA-N tyrphostin B42 Chemical compound C1=C(O)C(O)=CC=C1\C=C(/C#N)C(=O)NCC1=CC=CC=C1 TUCIOBMMDDOEMM-RIYZIHGNSA-N 0.000 claims description 18
- GEHJIACZUFWBTK-UHFFFAOYSA-N ML-7 Chemical compound C1=CC=C2C(I)=CC=CC2=C1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 GEHJIACZUFWBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- AMJJLDJPDLKNJA-UHFFFAOYSA-N [hydroxy(naphthalen-2-yl)methyl]phosphonic acid Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C(O)P(O)(O)=O)=CC=C21 AMJJLDJPDLKNJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- QMGUOJYZJKLOLH-UHFFFAOYSA-N 3-[1-[3-(dimethylamino)propyl]indol-3-yl]-4-(1h-indol-3-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2N(CCCN(C)C)C=C1C1=C(C=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)NC1=O QMGUOJYZJKLOLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 10
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 9
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 9
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 claims description 5
- 102000024905 CD99 Human genes 0.000 claims description 4
- 108060001253 CD99 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025745 Cerberus Human genes 0.000 claims description 4
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 4
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010069241 Connexin 43 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001045 Connexin 43 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037986 Dickkopf-related protein 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100035308 Fibroblast growth factor 17 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100039290 Gap junction gamma-1 protein Human genes 0.000 claims description 3
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000914195 Homo sapiens Cerberus Proteins 0.000 claims description 3
- 101000951340 Homo sapiens Dickkopf-related protein 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000878124 Homo sapiens Fibroblast growth factor 17 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 claims description 3
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010015426 connexin 45 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000819088 Homo sapiens Transcription factor GATA-6 Proteins 0.000 claims description 2
- 101100369076 Mus musculus Tdgf1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100021382 Transcription factor GATA-6 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100030751 Eomesodermin homolog Human genes 0.000 claims 1
- 101001064167 Homo sapiens Eomesodermin homolog Proteins 0.000 claims 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 158
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 158
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 72
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 55
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 55
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 37
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 28
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 28
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 28
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 27
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 27
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 26
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 26
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 26
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 26
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 24
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 24
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 24
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 24
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 21
- 102000004654 Cyclic GMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 20
- 108010003591 Cyclic GMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 20
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 20
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 20
- CZQHHVNHHHRRDU-UHFFFAOYSA-N LY294002 Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C=C(N3CCOCC3)OC2=C1C1=CC=CC=C1 CZQHHVNHHHRRDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 description 19
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 19
- QDLHCMPXEPAAMD-QAIWCSMKSA-N wortmannin Chemical compound C1([C@]2(C)C3=C(C4=O)OC=C3C(=O)O[C@@H]2COC)=C4[C@@H]2CCC(=O)[C@@]2(C)C[C@H]1OC(C)=O QDLHCMPXEPAAMD-QAIWCSMKSA-N 0.000 description 18
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 17
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 17
- QDLHCMPXEPAAMD-UHFFFAOYSA-N wortmannin Natural products COCC1OC(=O)C2=COC(C3=O)=C2C1(C)C1=C3C2CCC(=O)C2(C)CC1OC(C)=O QDLHCMPXEPAAMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 16
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 16
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 16
- PZIRTMUUDNWDHP-BGPOSVGRSA-N (e)-2-cyano-n-[2-[[(e)-2-cyano-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]amino]ethyl]-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enamide Chemical compound C1=C(O)C(O)=CC=C1\C=C(/C#N)C(=O)NCCNC(=O)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 PZIRTMUUDNWDHP-BGPOSVGRSA-N 0.000 description 15
- 102100035044 Myosin light chain kinase, smooth muscle Human genes 0.000 description 15
- 108010074596 Myosin-Light-Chain Kinase Proteins 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 13
- IYOZTVGMEWJPKR-VOMCLLRMSA-N 4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-pyridin-4-yl-1-cyclohexanecarboxamide Chemical compound C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IYOZTVGMEWJPKR-VOMCLLRMSA-N 0.000 description 12
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 12
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 12
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 12
- 102100038104 Glycogen synthase kinase-3 beta Human genes 0.000 description 12
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 12
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 12
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 12
- 101100356682 Caenorhabditis elegans rho-1 gene Proteins 0.000 description 11
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 11
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 11
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 11
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 11
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 11
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 11
- 101150111584 RHOA gene Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N fasudil Chemical compound C=1C=CC2=CN=CC=C2C=1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 10
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 10
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 10
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 10
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 9
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 9
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 9
- ZQSIJRDFPHDXIC-UHFFFAOYSA-N daidzein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC=C2C1=O ZQSIJRDFPHDXIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 9
- TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N genistein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 108010025454 Cyclin-Dependent Kinase 5 Proteins 0.000 description 8
- 102100026805 Cyclin-dependent-like kinase 5 Human genes 0.000 description 8
- 102000004232 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Human genes 0.000 description 8
- 108090000744 Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases Proteins 0.000 description 8
- 102100041030 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 229940045109 genistein Drugs 0.000 description 8
- 235000006539 genistein Nutrition 0.000 description 8
- ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N genistein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N 0.000 description 8
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 8
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 8
- WDHRPWOAMDJICD-FOAQWNCLSA-N n-[2-[(3'r,3'as,6's,6as,6bs,7'ar,9r,11as,11br)-3',6',10,11b-tetramethyl-3-oxospiro[1,2,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-decahydrobenzo[a]fluorene-9,2'-3,3a,5,6,7,7a-hexahydrofuro[3,2-b]pyridine]-4'-yl]ethyl]-6-(3-phenylpropanoylamino)hexanamide Chemical compound C([C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@H]([C@]3(C(=C4C[C@@H]5[C@@]6(C)CCC(=O)CC6=CC[C@H]5[C@@H]4CC3)C)O1)C)N2CCNC(=O)CCCCCNC(=O)CCC1=CC=CC=C1 WDHRPWOAMDJICD-FOAQWNCLSA-N 0.000 description 8
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- ULTTYPMRMMDONC-UHFFFAOYSA-N 5-[(2,5-dihydroxyphenyl)methyl-[(2-hydroxyphenyl)methyl]amino]-2-hydroxybenzoic acid Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(N(CC=2C(=CC=CC=2)O)CC=2C(=CC=C(O)C=2)O)=C1 ULTTYPMRMMDONC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100032857 Cyclin-dependent kinase 1 Human genes 0.000 description 7
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 description 7
- 101710146526 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Proteins 0.000 description 7
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 7
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 7
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 7
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 7
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 7
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 7
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 7
- 229960002435 fasudil Drugs 0.000 description 7
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 7
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 7
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- CRDNMYFJWFXOCH-YPKPFQOOSA-N (3z)-3-(3-oxo-1h-indol-2-ylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound N/1C2=CC=CC=C2C(=O)C\1=C1/C2=CC=CC=C2NC1=O CRDNMYFJWFXOCH-YPKPFQOOSA-N 0.000 description 6
- DOEWDSDBFRHVAP-KRXBUXKQSA-N (E)-3-tosylacrylonitrile Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)\C=C\C#N)C=C1 DOEWDSDBFRHVAP-KRXBUXKQSA-N 0.000 description 6
- USOXQZNJFMKTKJ-XVNBXDOJSA-N (e)-2-cyano-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enamide Chemical compound NC(=O)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 USOXQZNJFMKTKJ-XVNBXDOJSA-N 0.000 description 6
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 6
- 239000012825 JNK inhibitor Substances 0.000 description 6
- 229940118135 JNK inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 101150088608 Kdr gene Proteins 0.000 description 6
- 101100523539 Mus musculus Raf1 gene Proteins 0.000 description 6
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000038012 SFKs Human genes 0.000 description 6
- 108091008118 SFKs Proteins 0.000 description 6
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 6
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- PMXCMJLOPOFPBT-HNNXBMFYSA-N purvalanol A Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)C(C)C)=NC=1NC1=CC=CC(Cl)=C1 PMXCMJLOPOFPBT-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 6
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- BGVLELSCIHASRV-QPEQYQDCSA-N (1z)-1-(3-ethyl-5-methoxy-1,3-benzothiazol-2-ylidene)propan-2-one Chemical compound C1=C(OC)C=C2N(CC)\C(=C\C(C)=O)SC2=C1 BGVLELSCIHASRV-QPEQYQDCSA-N 0.000 description 5
- KFAKESMKRPNZTM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimethoxy-10H-acridine-9-thione Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C(=S)C2=C1C(OC)=CC=C2OC KFAKESMKRPNZTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BQCNSTFWSKOWMA-GORDUTHDSA-N 2,5-dihydroxycinnamic acid methyl ester Chemical compound COC(=O)\C=C\C1=CC(O)=CC=C1O BQCNSTFWSKOWMA-GORDUTHDSA-N 0.000 description 5
- VTJXFTPMFYAJJU-UHFFFAOYSA-N 2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylidene]propanedinitrile Chemical compound OC1=CC=C(C=C(C#N)C#N)C=C1O VTJXFTPMFYAJJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IGRZXNLKVUEFDM-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-N-(5-propan-2-yl-2-thiazolyl)acetamide Chemical compound S1C(C(C)C)=CN=C1NC(=O)CC1=CC=CC=C1 IGRZXNLKVUEFDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XVECMUKVOMUNLE-UHFFFAOYSA-N 5-(2-phenyl-3-pyrazolo[1,5-a]pyridinyl)-2H-pyrazolo[3,4-c]pyridazin-3-amine Chemical compound C1=C2C(N)=NNC2=NN=C1C(=C1C=CC=CN1N=1)C=1C1=CC=CC=C1 XVECMUKVOMUNLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010034798 CDC2 Protein Kinase Proteins 0.000 description 5
- 102100021854 Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta Human genes 0.000 description 5
- 101710205525 Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta Proteins 0.000 description 5
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 5
- 229940122696 MAP kinase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 5
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 5
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 5
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- BTXNYTINYBABQR-UHFFFAOYSA-N hypericin Chemical compound C12=C(O)C=C(O)C(C(C=3C(O)=CC(C)=C4C=33)=O)=C2C3=C2C3=C4C(C)=CC(O)=C3C(=O)C3=C(O)C=C(O)C1=C32 BTXNYTINYBABQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HBDSHCUSXQATPO-BGBJRWHRSA-N indirubin-3'-monoxime Chemical compound O=C/1NC2=CC=CC=C2C\1=C\1/C(=N/O)/C2=CC=CC=C2N/1 HBDSHCUSXQATPO-BGBJRWHRSA-N 0.000 description 5
- 108010042209 insulin receptor tyrosine kinase Proteins 0.000 description 5
- GTVPOLSIJWJJNY-UHFFFAOYSA-N olomoucine Chemical compound N1=C(NCCO)N=C2N(C)C=NC2=C1NCC1=CC=CC=C1 GTVPOLSIJWJJNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 5
- 229940124617 receptor tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 5
- ATFNSNUJZOYXFC-RQJHMYQMSA-N terreic acid Chemical compound O=C1C(C)=C(O)C(=O)[C@@H]2O[C@@H]21 ATFNSNUJZOYXFC-RQJHMYQMSA-N 0.000 description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 5
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 5
- JKNOYWVMHPMBEL-UNXLUWIOSA-N (3z)-2-amino-4-(3,4,5-trihydroxyphenyl)buta-1,3-diene-1,1,3-tricarbonitrile Chemical compound N#CC(C#N)=C(N)\C(C#N)=C\C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 JKNOYWVMHPMBEL-UNXLUWIOSA-N 0.000 description 4
- UAKWLVYMKBWHMX-PTNGSMBKSA-N (3z)-3-[[4-(dimethylamino)phenyl]methylidene]-1h-indol-2-one Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\C=C/1C2=CC=CC=C2NC\1=O UAKWLVYMKBWHMX-PTNGSMBKSA-N 0.000 description 4
- GMGIWEZSKCNYSW-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one;dihydrate Chemical compound O.O.C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 GMGIWEZSKCNYSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SAYGKHKXGCPTLX-UHFFFAOYSA-N 2-(carbamoylamino)-5-(4-fluorophenyl)-3-thiophenecarboxamide Chemical compound NC(=O)C1=C(NC(=O)N)SC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1 SAYGKHKXGCPTLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YZOFLYUAQDJWKV-UHFFFAOYSA-N 2-[(3,4,5-trihydroxyphenyl)methylidene]propanedinitrile Chemical compound OC1=CC(C=C(C#N)C#N)=CC(O)=C1O YZOFLYUAQDJWKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHDJEAZLMYPLGL-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[(phenylmethyl)amino]-9-propan-2-yl-2-purinyl]amino]ethanol Chemical compound N1=C(NCCO)N=C2N(C(C)C)C=NC2=C1NCC1=CC=CC=C1 WHDJEAZLMYPLGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GAMKNLFIHBMGQT-UHFFFAOYSA-N 3-hexadecanoyloxy-4-(trimethylazaniumyl)butanoate;hydrochloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CC(O)=O)C[N+](C)(C)C GAMKNLFIHBMGQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODYAQBDIXCVKAE-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2-fluorophenyl)phenyl]-N-(4-hydroxyphenyl)butanamide Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1NC(=O)CCCC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)F)C=C1 ODYAQBDIXCVKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YOELZIQOLWZLQC-UHFFFAOYSA-N 6-(4-fluorophenyl)-5-pyridin-4-yl-2,3-dihydroimidazo[2,1-b]thiazole Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C1=C(C=2C=CN=CC=2)N2CCSC2=N1 YOELZIQOLWZLQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 101150012716 CDK1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 4
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 4
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 description 4
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 4
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 4
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 4
- UVSVTDVJQAJIFG-VURMDHGXSA-N LFM-A13 Chemical compound C\C(O)=C(/C#N)C(=O)NC1=CC(Br)=CC=C1Br UVSVTDVJQAJIFG-VURMDHGXSA-N 0.000 description 4
- MZOPWQKISXCCTP-UHFFFAOYSA-N Malonoben Chemical compound CC(C)(C)C1=CC(C=C(C#N)C#N)=CC(C(C)(C)C)=C1O MZOPWQKISXCCTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000005913 Notch signaling pathway Effects 0.000 description 4
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 4
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 4
- 108010016672 Syk Kinase Proteins 0.000 description 4
- ATFNSNUJZOYXFC-UHFFFAOYSA-N Tenein-saeure Natural products O=C1C(C)=C(O)C(=O)C2OC21 ATFNSNUJZOYXFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102100033444 Tyrosine-protein kinase JAK2 Human genes 0.000 description 4
- 102100038183 Tyrosine-protein kinase SYK Human genes 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N apigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 4
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 4
- ZGHQGWOETPXKLY-XVNBXDOJSA-N chembl77030 Chemical compound NC(=S)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 ZGHQGWOETPXKLY-XVNBXDOJSA-N 0.000 description 4
- 235000007240 daidzein Nutrition 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 4
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical class C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940005608 hypericin Drugs 0.000 description 4
- PHOKTTKFQUYZPI-UHFFFAOYSA-N hypericin Natural products Cc1cc(O)c2c3C(=O)C(=Cc4c(O)c5c(O)cc(O)c6c7C(=O)C(=Cc8c(C)c1c2c(c78)c(c34)c56)O)O PHOKTTKFQUYZPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CRDNMYFJWFXOCH-UHFFFAOYSA-N indirubin Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C2=CC=CC=C2NC1=O CRDNMYFJWFXOCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 4
- SSKVDVBQSWQEGJ-UHFFFAOYSA-N pseudohypericin Natural products C12=C(O)C=C(O)C(C(C=3C(O)=CC(O)=C4C=33)=O)=C2C3=C2C3=C4C(C)=CC(O)=C3C(=O)C3=C(O)C=C(O)C1=C32 SSKVDVBQSWQEGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DEZFNHCVIZBHBI-ZHACJKMWSA-N rottlerin Chemical compound CC(=O)C1=C(O)C(C)=C(O)C(CC=2C(=C(C(=O)\C=C\C=3C=CC=CC=3)C=3OC(C)(C)C=CC=3C=2O)O)=C1O DEZFNHCVIZBHBI-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 4
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 4
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 4
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 4
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- UOHFCPXBKJPCAD-UHFFFAOYSA-N tyrphostin 1 Chemical compound COC1=CC=C(C=C(C#N)C#N)C=C1 UOHFCPXBKJPCAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SVJQCVOKYJWUBC-OWOJBTEDSA-N (e)-3-(2,3,4,5-tetrabromophenyl)prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC(Br)=C(Br)C(Br)=C1Br SVJQCVOKYJWUBC-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 3
- GYQSWJNGTWVFOL-UHFFFAOYSA-N 1-(3-chloro-1,4-dioxonaphthalen-2-yl)pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C(Cl)=C1N1C(=O)CCC1=O GYQSWJNGTWVFOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710175516 14 kDa zinc-binding protein Proteins 0.000 description 3
- HLCDNLNLQNYZTK-UHFFFAOYSA-N 2,2-diphenyl-N-[2,2,2-trichloro-1-[[(4-fluoro-3-nitroanilino)-sulfanylidenemethyl]amino]ethyl]acetamide Chemical compound C1=C(F)C([N+](=O)[O-])=CC(NC(=S)NC(NC(=O)C(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)C(Cl)(Cl)Cl)=C1 HLCDNLNLQNYZTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFWGZXMTCUOPFI-UHFFFAOYSA-N 2,3-diphenyl-6-quinoxalinecarboxylic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=NC2=CC(C(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 LFWGZXMTCUOPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXGJAOIJSROTTN-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(4-chlorophenoxy)phenyl]-3h-benzimidazole-5-carboxamide Chemical compound N1C2=CC(C(=O)N)=CC=C2N=C1C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1 UXGJAOIJSROTTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDEJZKULWCZIHL-UHFFFAOYSA-N 3-[1-(3-hydroxypropyl)pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl]-4-pyrazin-2-ylpyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CN=C2N(CCCO)C=C1C(C(NC1=O)=O)=C1C1=CN=CC=N1 ZDEJZKULWCZIHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NMEUKWOOQOHUNA-UHFFFAOYSA-N 4-(3-chloro-4-fluoroanilino)-6-(pyridin-3-ylmethylamino)-1,7-naphthyridine-3-carbonitrile Chemical compound C1=C(Cl)C(F)=CC=C1NC(C1=C2)=C(C#N)C=NC1=CN=C2NCC1=CC=CN=C1 NMEUKWOOQOHUNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DPDZHVCKYBCJHW-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(C(=O)N)=CC=C1C1=NC(C=2C=C3OCCOC3=CC=2)=C(C=2N=CC=CC=2)N1 DPDZHVCKYBCJHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XHEQSRJCJTWWAH-UHFFFAOYSA-N 4-[[6-(cyclohexylmethoxy)-7h-purin-2-yl]amino]-n,n-diethylbenzamide Chemical compound C1=CC(C(=O)N(CC)CC)=CC=C1NC1=NC(OCC2CCCCC2)=C(NC=N2)C2=N1 XHEQSRJCJTWWAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NEBCAMAQXZIVRE-UHFFFAOYSA-N 5-(methoxymethyl)-4-[2,3,4-trihydroxy-6-(methoxymethyl)phenyl]benzene-1,2,3-triol Chemical compound COCC1=CC(O)=C(O)C(O)=C1C1=C(O)C(O)=C(O)C=C1COC NEBCAMAQXZIVRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LULATDWLDJOKCX-UHFFFAOYSA-N 5-[(2,5-dihydroxyphenyl)methylamino]-2-hydroxybenzoic acid Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(NCC=2C(=CC=C(O)C=2)O)=C1 LULATDWLDJOKCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHSIXKUPQCKWBY-IOSLPCCCSA-N 5-iodotubercidin Chemical compound C1=C(I)C=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WHSIXKUPQCKWBY-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 3
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 3
- KUWAFJHRXZRHJH-UHFFFAOYSA-N 8-hydroxy-2,4,9,19-tetrazapentacyclo[10.7.0.02,6.07,11.013,18]nonadeca-1(19),3,5,7,11,13,15,17-octaen-10-one Chemical compound Oc1[nH]c(=O)c2c1c1cncn1c1nc3ccccc3c21 KUWAFJHRXZRHJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940122485 ATM kinase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 3
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 229940126074 CDK kinase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 101710116137 Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II Proteins 0.000 description 3
- CRDNMYFJWFXOCH-BUHFOSPRSA-N Couroupitine B Natural products N\1C2=CC=CC=C2C(=O)C/1=C1/C2=CC=CC=C2NC1=O CRDNMYFJWFXOCH-BUHFOSPRSA-N 0.000 description 3
- 108010024986 Cyclin-Dependent Kinase 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100037912 Cyclin-dependent kinase 11A Human genes 0.000 description 3
- 102100036239 Cyclin-dependent kinase 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102100029087 Hepatocyte nuclear factor 6 Human genes 0.000 description 3
- 101000738403 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 11A Proteins 0.000 description 3
- 101000988619 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 6 Proteins 0.000 description 3
- MYKOWOGZBMOVBJ-UHFFFAOYSA-N LSM-3164 Chemical compound C12=NC3=CC=CC=C3N2C(=O)C2=CC=CC3=C2C1=CC=C3C(=O)O MYKOWOGZBMOVBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 3
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 3
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 3
- 102000052651 Pancreatic hormone Human genes 0.000 description 3
- IIXHQGSINFQLRR-UHFFFAOYSA-N Piceatannol Natural products Oc1ccc(C=Cc2c(O)c(O)c3CCCCc3c2O)cc1O IIXHQGSINFQLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010050276 Protein Kinase C-alpha Proteins 0.000 description 3
- 108010039230 Protein Kinase C-delta Proteins 0.000 description 3
- 102100024924 Protein kinase C alpha type Human genes 0.000 description 3
- 102100037340 Protein kinase C delta type Human genes 0.000 description 3
- 102100037314 Protein kinase C gamma type Human genes 0.000 description 3
- 229940123924 Protein kinase C inhibitor Drugs 0.000 description 3
- LHHQTXPEHJNOCX-UHFFFAOYSA-N Rottlerin Natural products CC(=O)c1c(O)c(C)c(O)c(Oc2c(O)c3C=CC(C)(C)Cc3c(C(=O)C=Cc4ccccc4)c2O)c1O LHHQTXPEHJNOCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 3
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 3
- 101710112791 Tyrosine-protein kinase JAK2 Proteins 0.000 description 3
- 102100025387 Tyrosine-protein kinase JAK3 Human genes 0.000 description 3
- 101710112792 Tyrosine-protein kinase JAK3 Proteins 0.000 description 3
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 3
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 229940117893 apigenin Drugs 0.000 description 3
- XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N apigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000008714 apigenin Nutrition 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 3
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 3
- BMGQWWVMWDBQGC-IIFHNQTCSA-N midostaurin Chemical compound CN([C@H]1[C@H]([C@]2(C)O[C@@H](N3C4=CC=CC=C4C4=C5C(=O)NCC5=C5C6=CC=CC=C6N2C5=C43)C1)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 BMGQWWVMWDBQGC-IIFHNQTCSA-N 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000011527 multiparameter analysis Methods 0.000 description 3
- YAEMHJKFIIIULI-UHFFFAOYSA-N n-(4-methoxybenzyl)-n'-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CNC(=O)NC1=NC=C([N+]([O-])=O)S1 YAEMHJKFIIIULI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RDTDWGQDFJPTPD-UHFFFAOYSA-N n-{3-[(4-{[3-(trifluoromethyl)phenyl]amino}pyrimidin-2-yl)amino]phenyl}cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)N=CC=2)=C1 RDTDWGQDFJPTPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004025 pancreas hormone Substances 0.000 description 3
- 229940032957 pancreatic hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 108010062154 protein kinase C gamma Proteins 0.000 description 3
- 239000003881 protein kinase C inhibitor Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 3
- QNUKRWAIZMBVCU-WCIBSUBMSA-N su9516 Chemical compound C12=CC(OC)=CC=C2NC(=O)\C1=C/C1=CN=CN1 QNUKRWAIZMBVCU-WCIBSUBMSA-N 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 description 2
- XJBQVBPGIOOPMP-HNNXBMFYSA-N (3s)-3-[[6-[[[3-(methylsulfonylcarbamoyl)phenyl]sulfonylamino]methyl]pyridine-3-carbonyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CS(=O)(=O)NC(=O)C1=CC=CC(S(=O)(=O)NCC=2N=CC(=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C=O)=C1 XJBQVBPGIOOPMP-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 2
- RODAAYVFYDKHGT-AUWJEWJLSA-N 1-nitro-2-[(z)-[5-(3-nitrophenyl)furan-2-yl]methylideneamino]guanidine Chemical compound O1C(/C=N\N=C(N[N+]([O-])=O)/N)=CC=C1C1=CC=CC([N+]([O-])=O)=C1 RODAAYVFYDKHGT-AUWJEWJLSA-N 0.000 description 2
- XRKYMMUGXMWDAO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-morpholinyl)-6-(1-thianthrenyl)-4-pyranone Chemical compound O1C(C=2C=3SC4=CC=CC=C4SC=3C=CC=2)=CC(=O)C=C1N1CCOCC1 XRKYMMUGXMWDAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRHRPGSSSVYBRG-UHFFFAOYSA-N 2-[(3-iodophenyl)methylthio]-5-pyridin-4-yl-1,3,4-oxadiazole Chemical compound IC1=CC=CC(CSC=2OC(=NN=2)C=2C=CN=CC=2)=C1 ZRHRPGSSSVYBRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQVIIUBWMBHLOZ-UHFFFAOYSA-N 2-[2-hydroxyethyl-[6-[(4-methoxyphenyl)methylamino]-9-propan-2-ylpurin-2-yl]amino]ethanol Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CNC1=NC(N(CCO)CCO)=NC2=C1N=CN2C(C)C NQVIIUBWMBHLOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRFPVMFCRNYQNR-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyphenylalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1O WRFPVMFCRNYQNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFPLHASLIOXVGS-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-(4-methylanilino)-1,3-benzothiazole-4,7-dione Chemical compound S1C(C)=NC(C2=O)=C1C(=O)C=C2NC1=CC=C(C)C=C1 HFPLHASLIOXVGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTBSBSOBZHXMHI-LSDHHAIUSA-N 2-n-[(1r,2s)-2-aminocyclohexyl]-6-n-(3-chlorophenyl)-9-ethylpurine-2,6-diamine Chemical compound N1=C(N[C@H]2[C@H](CCCC2)N)N=C2N(CC)C=NC2=C1NC1=CC=CC(Cl)=C1 UTBSBSOBZHXMHI-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 102100036009 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 2
- QMBDONCHHMIWFJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-phenylpyrazolo[1,5-a]pyridin-3-yl)-1,2-dihydropyrazolo[3,4-c]pyridazin-3-one Chemical group C1=C2C(=O)NNC2=NN=C1C(=C1C=CC=CN1N=1)C=1C1=CC=CC=C1 QMBDONCHHMIWFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OOXNYFKPOPJIOT-UHFFFAOYSA-N 5-(3-bromophenyl)-7-(6-morpholin-4-ylpyridin-3-yl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-4-amine;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=12C(N)=NC=NC2=NC(C=2C=NC(=CC=2)N2CCOCC2)=CC=1C1=CC=CC(Br)=C1 OOXNYFKPOPJIOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ARIOBGGRZJITQX-UHFFFAOYSA-N 5-amino-3-{[4-(aminosulfonyl)phenyl]amino}-n-(2,6-difluorophenyl)-1h-1,2,4-triazole-1-carbothioamide Chemical compound N=1N(C(=S)NC=2C(=CC=CC=2F)F)C(N)=NC=1NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 ARIOBGGRZJITQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940125775 ATR kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100032534 Adenosine kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010076278 Adenosine kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 101000810330 Arabidopsis thaliana Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit E Proteins 0.000 description 2
- 102000002804 Ataxia Telangiectasia Mutated Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004586 Ataxia Telangiectasia Mutated Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 229940121968 Cyclin-dependent kinase 2 inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100034770 Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 Human genes 0.000 description 2
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 description 2
- 102100040795 DNA primase large subunit Human genes 0.000 description 2
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 101710199605 Endoribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 101000704130 Escherichia coli (strain K12) Signal recognition particle protein Proteins 0.000 description 2
- 102100023374 Forkhead box protein M1 Human genes 0.000 description 2
- 108091007911 GSKs Proteins 0.000 description 2
- 102000004103 Glycogen Synthase Kinases Human genes 0.000 description 2
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100024208 Homeobox protein MIXL1 Human genes 0.000 description 2
- 101000783681 Homo sapiens 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000945639 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000907578 Homo sapiens Forkhead box protein M1 Proteins 0.000 description 2
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001052462 Homo sapiens Homeobox protein MIXL1 Proteins 0.000 description 2
- 101001053263 Homo sapiens Insulin gene enhancer protein ISL-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000576323 Homo sapiens Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000613495 Homo sapiens Paired box protein Pax-4 Proteins 0.000 description 2
- 101000738523 Homo sapiens Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000777293 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase Chk1 Proteins 0.000 description 2
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 description 2
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- WXUJAQBSBZLVEV-UHFFFAOYSA-N Isogranulatimide Natural products N1C2=CC=CC=C2C2=C1N1C=NC=C1C1=C2C(=O)NC1=O WXUJAQBSBZLVEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KOZFSFOOLUUIGY-SOLYNIJKSA-N K-252a Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@](C(=O)OC)(O)[C@]4(C)O1 KOZFSFOOLUUIGY-SOLYNIJKSA-N 0.000 description 2
- 102100026299 MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710139011 MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100025170 Motor neuron and pancreas homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000720386 Mus musculus Acyl-coenzyme A thioesterase 9, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101150079937 NEUROD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000741177 Oat chlorotic stunt virus (isolate United Kingdom) Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 102100040909 Paired box protein Pax-4 Human genes 0.000 description 2
- 102100037878 Pancreas transcription factor 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800001268 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 2
- 101710113029 Serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 102100031081 Serine/threonine-protein kinase Chk1 Human genes 0.000 description 2
- JDSJDASOXWCHPN-UHFFFAOYSA-N TDZD-8 Chemical compound O=C1N(C)SC(=O)N1CC1=CC=CC=C1 JDSJDASOXWCHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- RAMROQQYRRQPDL-HNNXBMFYSA-N aminopurvalanol Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)C(C)C)=NC=1NC1=CC(N)=CC(Cl)=C1 RAMROQQYRRQPDL-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- FQCPPVRJPILDIK-UHFFFAOYSA-N chembl126077 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C(N=O)=C1C1=C(O)NC2=CC=CC=C21 FQCPPVRJPILDIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RSQPNXBTPUXMQN-UHFFFAOYSA-N chembl258721 Chemical compound C1=2N=C(CC=3C=CC(OCCO)=CC=3)NC(=O)C=2C(C(C)C)=NN1C1=C(Cl)C=CC=C1Cl RSQPNXBTPUXMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 239000002875 cyclin dependent kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229950010895 midostaurin Drugs 0.000 description 2
- KQMPRSZTUSSXND-UHFFFAOYSA-N n-(4-amino-5-cyano-6-ethoxypyridin-2-yl)-2-(2,5-dimethoxyphenyl)acetamide Chemical compound NC1=C(C#N)C(OCC)=NC(NC(=O)CC=2C(=CC=C(OC)C=2)OC)=C1 KQMPRSZTUSSXND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODZGYELAMAOARP-UHFFFAOYSA-N n1-methyl-1,9-pyrazoloanthrone Chemical group C12=CC=CC=C2C(=O)C2=CC=CC3=C2C1=NN3C ODZGYELAMAOARP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 2
- 108010087686 src-Family Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000009076 src-Family Kinases Human genes 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 1
- UMHYHMWMJNTZIX-HNNXBMFYSA-N (3s)-3-[[6-[[[4-(methanesulfonamido)phenyl]sulfonylamino]methyl]pyridine-3-carbonyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC(NS(=O)(=O)C)=CC=C1S(=O)(=O)NCC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C=O)C=N1 UMHYHMWMJNTZIX-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- UTBSBSOBZHXMHI-UHFFFAOYSA-N 2-n-(2-aminocyclohexyl)-6-n-(3-chlorophenyl)-9-ethylpurine-2,6-diamine Chemical compound N1=C(NC2C(CCCC2)N)N=C2N(CC)C=NC2=C1NC1=CC=CC(Cl)=C1 UTBSBSOBZHXMHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 3-[[6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol Chemical compound NC1=CC=CC(C=2NC3=NC=NC(OC=4C=C(O)C=CC=4)=C3C=2)=C1 VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWOSIFOFWWXXIG-PTGBLXJZSA-N 4-[(E)-[2-(2-hydroxy-1H-indol-3-yl)indol-3-ylidene]amino]oxybutane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)CCO\N=C1\C(=Nc2ccccc12)c1c(O)[nH]c2ccccc12 TWOSIFOFWWXXIG-PTGBLXJZSA-N 0.000 description 1
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710168331 ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010029445 Agammaglobulinaemia Tyrosine Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000003989 Aurora kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000433 Aurora kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101150047144 CDC28 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 1
- 101710010675 Cerberus Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 101710106279 Cyclin-dependent kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229940083347 Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710158095 Cyclin-dependent kinase F-1 Proteins 0.000 description 1
- QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N Cyclopamine Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H](CC2=C3C)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@@]13O[C@@H]2C[C@H](C)CN[C@H]2[C@H]1C QASFUMOKHFSJGL-LAFRSMQTSA-N 0.000 description 1
- 101100518002 Danio rerio nkx2.2a gene Proteins 0.000 description 1
- 241000027355 Ferocactus setispinus Species 0.000 description 1
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 1
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 description 1
- 102000012004 Ghrelin Human genes 0.000 description 1
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- 229940122049 Glycogen synthase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108700031316 Goosecoid Proteins 0.000 description 1
- 102000050057 Goosecoid Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700014808 Homeobox Protein Nkx-2.2 Proteins 0.000 description 1
- 102100027886 Homeobox protein Nkx-2.2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000868333 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000909198 Homo sapiens DNA polymerase delta catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100460496 Homo sapiens NKX2-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001069749 Homo sapiens Prospero homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000777277 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase Chk2 Proteins 0.000 description 1
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 101000835745 Homo sapiens Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000979205 Homo sapiens Transcription factor MafA Proteins 0.000 description 1
- 101000997832 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK2 Proteins 0.000 description 1
- 102000001284 I-kappa-B kinase Human genes 0.000 description 1
- 108060006678 I-kappa-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- JZKXXXDKRQWDET-QMMMGPOBSA-N L-m-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC(O)=C1 JZKXXXDKRQWDET-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010002481 Lymphocyte Specific Protein Tyrosine Kinase p56(lck) Proteins 0.000 description 1
- 102000036243 Lymphocyte Specific Protein Tyrosine Kinase p56(lck) Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101150010110 Map3k8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100026907 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8 Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101710096141 Neurogenin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 241001221335 Nocardiopsis sp. Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000012826 P38 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 1
- 101710144033 Pancreas/duodenum homeobox protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700020479 Pancreatic hormone Proteins 0.000 description 1
- 101150075928 Pax4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 102100033880 Prospero homeobox protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 101100321932 Rattus norvegicus Prkaa2 gene Proteins 0.000 description 1
- LOGJQOUIVKBFGH-UHFFFAOYSA-N SU6656 Chemical compound C1CCCC(N2)=C1C=C2C=C1C(=O)NC2=CC=C(S(=O)(=O)N(C)C)C=C21 LOGJQOUIVKBFGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031075 Serine/threonine-protein kinase Chk2 Human genes 0.000 description 1
- 229940123928 Sphingosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026404 Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 102100029823 Tyrosine-protein kinase BTK Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000005441 aurora Substances 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N cyclopamine Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C(CC2=C3C)C1C2CCC13OC2CC(C)CNC2C1C QASFUMOKHFSJGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 108010069764 helospectin I Proteins 0.000 description 1
- HTMVMVKJOPFRMK-OYZAELBCSA-N helospectin i Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HTMVMVKJOPFRMK-OYZAELBCSA-N 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H iron(3+);methyl-dioxido-oxo-$l^{5}-arsane Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O.C[As]([O-])([O-])=O OGQSCIYDJSNCMY-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N n-[2-chloro-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-[3-(4-ethyl-5-ethylsulfanyl-1,2,4-triazol-3-yl)piperidin-1-yl]acetamide Chemical compound CCN1C(SCC)=NN=C1C1CN(CC(=O)NC=2C(=CC=C(C=2)C(F)(F)F)Cl)CCC1 NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003577 pancreatic endocrine progenitor Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002935 phosphatidylinositol 3 kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- CDRPUGZCRXZLFL-OWOJBTEDSA-N piceatannol Chemical compound OC1=CC(O)=CC(\C=C\C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 CDRPUGZCRXZLFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108010005709 protein kinase C kinase Proteins 0.000 description 1
- 150000004728 pyruvic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003243 quercetin Chemical class 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
- C12N5/063—Kereatinocyte stem cells; Keratinocyte progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0613—Cells from endocrine organs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, конкретно к способу увеличения экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток эндокринной линии поджелудочной железы. Способ включает дифференцировку клеток линии дефинитивной эндодермы в клетки линии панкреатической эндодермы с последующей их дифференцировкой в клетки эндокринной линии поджелудочной железы. Изобретение позволяет увеличить экспрессию генов NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток эндокринной линии поджелудочной железы. 9 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 пр.
Description
Настоящий пункт формулы изобретения свидетельствует в пользу предварительной заявки U.S. № 61/289692, которая была подана 23 декабря 2009 года и включена сюда в качестве ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам активации дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, настоящее изобретение относится к способам увеличения экспрессии генов NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
Во время эмбрионального развития позвоночных плюрипотентные клетки порождают группу клеток, создающих три зародышевых листка (эктодерма, мезодерма и эндодерма) в процессе, известном как гаструляция. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование дефинитивной эндодермы. Дефинитивные эндодермальные клетки экспрессируют множество маркеров, таких как HNF-3 бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании дефинитивной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.
Клетки, несущие черты островковых клеток, как сообщается, были получены in vitro из эмбриональных клеток мышей. Например, Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) сообщил о дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в продуцирующие инсулин структуры, схожие с островками поджелудочной железы. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) сообщил о инсулинпродуцирующих клетках, полученных из эмбриональных стволовых клеток мыши, которые могли нормализовать содержание сахара в крови при их имплантации мышам со стрептозотоцин-индуцированным диабетом.
В одном примере Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.
В другом примере Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) сообщил о создании инсулинпродуцирующих клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши, которые постоянно экспрессировали Pax4.
В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию PDX1 при добавлении в культуру на четвертый день дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).
В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Их результаты показали, что экспрессия экзогенного Pdx1 несомненно повышает экспрессию инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в полученных дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Они также наблюдали, что уровень экспрессии инсулина и мРНК Pdx1 не зависел от ретиноевой кислоты; однако обработка 3nM FGF7 привела к повышению содержания транскриптов Pdx1 (Biochem. j. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. Эти авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).
Gordon et al. показали индукцию brachyury [положительных ]/ HNF3 бета [положительных] эндодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши при отсутствии сыворотки и в присутствии активина с ингибитором сигнального пути Wnt (США 2006/0003446A1).
Gordon et al. (PNAS, Vol 103, page 16806, 2006) сообщил, что “Сигнальные пути Wnt и TGF-бета/nodal/активина одновременно были необходимы для формирования передней первичной полоски.”
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например у человека.
В работе Thomson et al. эмбриональные стволовые клетки выделяли из человеческих бластоцист (Science 282:114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцировке которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека должны культивироваться в очень специфических условиях (патент США № 6200806, WO 99/20741, WO 01/51616).
D’Amour et al. описывают производство обогащенных культур дефинитивной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцировке в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки дефинитивной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшей дифференцировке в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).
D’Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) сообщили: “Мы разработали процесс дифференцировки, который позволяет превращать человеческие эмбриональные клетки (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать такие гормоны поджелудочной железы, как инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через фазы, напоминающие образование дефинитивной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны”.
В другом примере, в публикации Fisk et al., сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (US2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Сначала человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировались с антагонистами TGF-β, такими как Noggin, в сочетании с EGF или бетацеллюлином с получением Pdx1-положительных клеток. Окончательное дифференцировка запускалось никотинамидом.
В одном примере Benvenistry et al. сообщили: “Мы считаем, что чрезмерная экспрессия PDX1 усиливает экспрессию различных генов поджелудочной железы, индукция экспрессии инсулина может требовать дополнительных сигналов, которые присутствуют только in vivo” (Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930).
В другом примере Grapin-Botton et al. сообщили: “Ранняя активация Ngn3 почти исключительно индуцирует глюкагон [положительные] клетки, что истощает пул клеток-предшественниц поджелудочной железы. Начиная с E11.5, PDX-1 предшественницы получили возможность дифференцироваться в инсулин [положительные] и PP [положительные] клетки” (Johansson KA et al, Developmental Cell 12, 457-465, March 2007).
Экспрессия NGN3 в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для эндодермальной клеточной линии поджелудочной железы, может снизить способность клеток к дальнейшей дифференцировке в инсулинпродуцирующие клетки. Предыдущие исследования показали, что эти клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндодермальной клеточной линии поджелудочной железы и NGN3, при последующей дифференцировке более склонны к преобразованию в глюкагонпродуцирующие клетки, чем в инсулинпродуцирующие. Однако экспрессия NGN3 требуется для формирования эндокринных клеток поджелудочной железы или их предшественниц (клеток, которые могут превращаться, например, в глюкагон- или инсулинпродуцирующие клетки). Поэтому временная регуляция NGN3 важна для определения дальнейшей судьбы предшественниц эндокринных клеток поджелудочной железы с целью их преобразования в инсулинпродуцирующие клетки.
Поэтому все еще существует существенная необходимость в разработке условий для создания линий плюрипотентных стволовых клеток, которые могут быть использованы для удовлетворения текущих клинических потребностей, сохраняя при этом возможность к дифференцировке в инсулинпродуцирующие клетки. Настоящее изобретение предлагает альтернативный подход к повышению эффективности дифференциации человеческих эмбриональных стволовых клеток в инсулинпродуцирующие клетки при помощи способа усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы, которая состоит из следующих шагов:
a) культивирование плюрипотентных стволовых клеток,
b) дифференциация плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных эндодермальных клеточных линий,
c) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивных эндодермальных клеточных линий, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндодермальных клеточных линий поджелудочной железы, при помощи добавления в среду, используемую для дифференциации клеток, экспрессирующих маркеры, характерныедля дефинитивных эндодермальных клеточных линий, соединений, выбранных из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7, и
d) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндодермальных клеточных линий поджелудочной железы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения в среду, используемую для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндодермальных клеточных линий поджелудочной железы, добавляется соединение, выбранное из группы, состоящей из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для ясности описания, а не в ограничение изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируются по своему потенциалу развития на: (1) тотипотентные, способные к порождению всех эмбриональных и экстраэмбриональных видов клеток; (2) плюрипотентные, способные к порождению всех эмбриональных видов клеток; (3) мультипотентные, способные к порождению субпопуляций клеточных линий в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтическая стволовая клетка (HSC) может образовывать предшественниц, которые могут включать HSC (в целях самообновления), олигопотентных предшественниц клеток крови и все виды клеток и элементов крови (например, тромбоциты), которые являются нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, способные порождать более ограниченные субпопуляции клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, способные породить одну клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцировка представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцировкам представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцировкой называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцировки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцировки клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркером, специфичным для линии дифференцировки, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцировки, которая может использоваться для оценки дифференцировки некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцировки.
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF-3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-одобный гомеобокс белок типа Mix, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки дефинитивной эндодермы.
Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, NKX6.1 или HB9. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.
Используемый в настоящей заявке термин «дефинитивная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
Использованные здесь термины “эндокринная клетка поджелудочной железы”, или “экспрессирующая гормоны клетка поджелудочной железы "относятся к клеткам, способным экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Выделение, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспресии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при их наличии) и повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Полипотентность полипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида, и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т. е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам полипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся стабильные линии полипотентных клеток, получаемых из ткани, образующейся после беременности, в том числе, из преэмбриональной ткани (такой, как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе беременности, как правило, но не обязательно, до срока около 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей- источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения человеческие эмбриональные стволовые клетки обрабатываются в соответствии с методикой, описанной Thomson et al. (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные клетки в различных отношениях. Как вариант, полипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию полипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.
Например, Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) and Thompson et al (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147) открыли культуру клеточной линии плюрипотентных стволовых клеток из человеческой бластоцисты при помощи слоя питающих фибробластов эмбриона мыши.
Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003) оценил набор из 11 различных зрелых, фетальных и неонатальных питающих клеток человека по их способности поддерживать жизнедеятельность клеточной культуры плюрипотентных стволовых клеток. Richards et al, сообщил: “клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированные на зрелых питающих фибробластах кожи, сохраняют морфологию человеческих эмбриональных стволовых клеток и остаются плюрипотентными”.
В заявке на патент США № 20020072117 описываются линии клеток, продуцирующие среду, осуществляющую поддержку полипотентных стволовых клеток приматов в культуре, не содержащей питающих клеток. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимо- и фибробластоподобные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент США № 20020072117 также описывается использование этих клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.
В другом примере Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) описывают способы длительного выращивания человеческих плюрипотентных стволовых клеток на слоях питающих клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) описывают систему питающих клеток, получаемую в результате спонтанного дифференцирования человеческих эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004) описывают получение питающих клеток из человеческой плаценты.
Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческой крайней плоти.
В другом примере Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческих фибробластов постнатальной крайней плоти.
В патенте США № 6642048 описывается среда, поддерживающая рост полипотентных стволовых клеток приматов (пПС) в среде, не содержащей питающих клеток, и клеточные линии, которые могут использоваться для производства такой среды. В патенте США № 6642048 сообщается: “Это изобретение включает мезенхимальные и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В документе описываются и иллюстрируются способ получения таких клеточных линий, обработки среды и выращивания стволовых клеток с применением кондиционированной среды”.
В другом примере, заявке на патент WO2005014799, описывается кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцировки клеток млекопитающих. В патенте WO2005014799 сообщается: “Культуральная среда, произведенная в соответствии с настоящим изобретением, обуславливает секреторную активность клеток мыши; В частности, эти дифференцированные и иммортализованные трансгенные гепатоциты, названные MMH (Met-гепатоциты мыши)”.
В другом примере, Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004) описывают кондиционированную среду, полученную из производных человеческих эмбриональных стволовых клеток, генетически модифицированных для увеличения экспрессии обратной транскриптазы человеческой теломеразы.
В другом примере, заявке на патент США № 20070010011, описывается культуральная среда определенного химического состава для поддержания полипотентных стволовых клеток.
В альтернативной культуральной системе используется не содержащая сыворотки среда, обогащенная факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Например, Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описывают не содержащую питающих клеток и сыворотки культуральную систему, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) описывают способы длительного культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды, с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF).
В другом примере, в патенте США № 20050148070 описывается способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток на определенной среде без сыворотки и фибробластных питающих клеток, этот способ состоит из: культивирования стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минералы, по меньшей мере один трансферрин или его заменитель, по меньшей мере один инсулин или его заменитель; в культуральной среде фактически отсутствует эмбриональная сыворотка млекопитающих и она содержит по меньшей мере 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способствующего активации сигнального рецептора фактора роста фибробластов, в то время как этот фактор роста поступает не из слоя питающих фибробластов, а из другого источника; среда поддерживает пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без использования питающих клеток или кондиционированной среды.
В другом примере, в патенте США № 20050233446 описывается среда, которая может использоваться для культивирования стволовых клеток, включая недифференцированные примордиальные стволовые клетки приматов. Клетки из раствора, представленного фактически изотонической средой, сравнивались с культивированными стволовыми клетками. В данной культуре указанная среда содержит основную среду и количество bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста зародышевых стволовых клеток без существенной дифференцировки.
В другом примере, патенте США № 6800480, говорится “В одном варианте осуществления предлагается культуральная среда для выращивания клеток зародышевых стволовых клеток приматов, в значительной степени в недифференцированном состоянии, включающая основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. Основная среда объединяется с питательной сывороткой, способной поддерживать рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбираемым из группы, включающей питающие клетки и экстраклеточный матрикс, полученный из питающих клеток. Среда также содержит аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбираемый из группы, содержащей нуклеозиды и соль-пируват”.
В другом примере, патенте США № 20050244962 сообщается: “В одной особенности изобретения предлагается методика культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов. Стволовые клетки культивируются в культуре, в основном, не содержащей эмбриональной сыворотки млекопитающих (предпочтительно, также, в основном, не содержащей эмбриональной сыворотки любых животных) и в присутствии фактора роста фибробластов, полученного из источника, иного чем просто питающие клетки-фибробласты. В предпочтительной форме, слой питающих фибробластов, ранее необходимый для поддержания культуры стволовых клеток, становится необязательным вследствие добавления достаточного количества фактора роста фибробластов”.
В еще одном примере, патенте WO2005065354 описывается определенная изотоническая культурная среда, в которой фактически отсутствуют питающие клетки и эмбриональная сыворотка, эта среда состоит из: a. базальной среды; b. основного фактора роста фибробластов в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; в. инсулина в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; и d. аскорбиновой кислоты в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих.
В другом примере, в заявке на патент WO2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним членом семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF-β), одним членом семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® является растворимым препаратом из опухолевых клеток Энгельбрет-Холм-Сварм, которые превращаются в гель при комнатной температуре с образованием воссозданной базальной мембраны.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.
Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.
Подходящая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco №10829-018, базовая среда Хэма F12/50% DMEM, 200 ммоль L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор заменимых аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.
Образование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные эндокринной линии клеток поджелудочной железы, с усилением экспрессии NGN3 и NKX6.1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии клеток поджелудочной железы, которая состоит из следующих шагов:
a) культивирования плюрипотентных стволовых клеток,
b) дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии клеток дефинитивной эндодермы,
c) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеточной линии дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, с добавлением в среду, используемую для дифференцировки клеточной линии дефинитивной эндодермы, соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7, и
d) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной клеточной линии поджелудочной железы.
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеточной линии дефинитивной эндодермы
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцировка плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.
Полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации Shinozaki et al, Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al, Stem Cells 25, 29-38 (2007).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой, а затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology, 2005.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А и лиганд Wnt в отсутствие сыворотки, затем удаления лиганда Wnt и культивирования клеток с активином A и сывороткой. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной сформированной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. No. 11/779,311, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. No. 60/990,529.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 61/076889.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 61/076900.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 61/076908.
Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 61/076915.
Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или с использованием способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии с методикой, описанной D’Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, фактором роста фибробластов и ингибитором сигнального пути Hedgehog KAAD-циклопамином с последующим удалением содержащей фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин среды и культивированием клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/779,311, принадлежащей LifeScan, Inc.
В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 60/990529.
Эффективность дифференцировки может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологический анализ, такой как иммуногистохимический анализ секционного материала, Вестерн-блоттинг и проточный цитометрический анализ (FACS) для исследования маркеров, экспрессируемых в живых клетках (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы.
К плюрипотентным стволовым клеткам, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, например, человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также для использования в рамках настоящего изобретения подходят клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, и Tra 1-81.
Маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, выбираются из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, NODAL, FGF8, Brachyury, Mix-подобного гомеобоксового белка, FGF4 CD48, эомезодермина (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии дефинитивной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, представляет собой клетку-предшественницу первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, представляет собой клетку дефинитивной эндодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбирают из группы, состоящей из PDX1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы. В настоящем изобретении предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы .
Усиление экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, может быть достигнуто путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, соединениями, выбранными из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7. Кроме того, усиление экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, может быть достигнуто путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, соединениями, выбранными из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.
В случае, когда клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, обрабатываются соединением, выбранным из группы, состоящей из веществ X, Y и Z, клетки обрабатываются путем добавления в среду, которая используется для дифференцировки клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.
В случае, когда клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатываются соединением, выбранным из группы, состоящей из веществ X, Y и Z, клетки обрабатываются путем добавления в среду, которая используется для дифференцировки клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.
Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, с усилением экспрессии NGN3 и NKX6.1
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, при помощи любого способа из этой области техники или любого способа, который был предложен в настоящем изобретении.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, средой, содержащей экзендин 4, затем удаления среды, содержащей экзендин 4 с последующим культивированием клеток в среде, содержащей экзендин 1, IGF-1 и HGF. Пример использования данного способа приведен в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, средой, содержащей DAPT (Sigma-Aldrich, Миссури) и экзендин 4. Пример использования данного способа приведен в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, средой, содержащей экзендин 4. Пример использования данного способа приведен в публикации D’ Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США с серийным № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США с серийным No. 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США с серийным No. 60/953178, принадлежащей LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США с серийным No. 60/990529, принадлежащей LifeScan, Inc.
Маркеры, характерные для эндокринной линии дифференцировки клеток поджелудочной железы, выбирают из группы, состоящей из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 и PTF-1 альфа. В одном осуществлении настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Указанная панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте указанная панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцировки β-клеток. Клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3-бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцировки β-клеток, представляет собой β-клетку.
В настоящем изобретении предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения усиление экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, может быть достигнуто путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, соединением, выбранным из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.
В случае, когда клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатический эндодермы, обрабатываются соединением, выбранным из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7, клетки, обработанные путем добавления в среду, использующуюся для дифференцировки клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется, помимо прочих, следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Скрининг аналогов малых молекул, регулирующих экспрессию NGN3
Во время превращения клеток-предшественниц в эндокринные клетки необходима экспрессия фактора транскрипции NGN3. Желаемым результатом является увеличение эффективности этого процесса. Скрининг низкомолекулярных соединений был произведен на основании предположения, что энзиматические ингибиторы могут регулировать передачу клеточных сигналов во время дифференцировки и оказывают прямое или непрямое влияние на экспрессию генов наиболее важных факторов транскрипции, таких как NGN3.
Подготовка клеток для анализа: Недифференцированное, плюрипотентное состояние исходной культуры эмбриональных стволовых клеток человека (клеточная линия H1 эмбриональных стволовых клеток человека) поддерживалось при помощи подавления факторов роста на планшетах с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши, которая была покрыта MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) с проведением пассирования клеток в среднем раз в четыре дня. Пассирование проводилось путем обработки клеточной культуры раствором диспазы с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen, Cat #: 17105-041) в течение 5-7 минут при 37°C с последующим промыванием монослоя с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши и аккуратным соскабливанием для восстановления клеточных кластеров. Кластеры были центрифугированы на низкой скорости для сбора сгустка клеток и удаления остаточного количества диспазы. Для проведения планового обслуживания клеточные кластеры были разведены в отношении 1:3 или 1:4. Все линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее P50 и периодически проверяли на нормальный кариотип и отсутствие микоплазмы. Для скринингов в формате небольшого исследования кластеры эмбриональных стволовых клеток человека H1 были забраны из клеточной культуры, которая была предварительно обработана диспазой описанным выше способом, и были высеяны с распределением 1:2 (по площади поверхности) на черный планшет с 96 лунками объемом 100 мкл, которые для инактивации факторов роста были покрыты MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231); PerkinElmer; Cat #6005182 Клеткам дали зафиксироваться, и затем восстановили фазу логарифмического роста с периодичностью от 1 до 3 дней, подкармливая клетки кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши с добавлением 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (R&D Systems; Cat # 233-FB). Во время проведения исследования планшеты содержались во влажной камере при 37°C с 5% содержанием CO2.
Подготовка соединений: Скрининг был проведен с использованием двух имеющихся в продаже банков низкомолекулярных ингибиторов киназ (BioMol Intl; Cat # 2832A(V2.2) и EMD Biosciences: Cat # 539745). В Таблице 1 и Таблице 2 показаны соединения из этих банков ингибиторов киназ BioMol и EMD соответственно. Соединения из этих банков были доступны в чистом виде в количестве 10 ммоль на планшетах с 96 лунками, где они были разведены в 100% ДМСО и хранились при -80°C. Соединения из этих банков далее были разведены до промежуточной концентрации 2,5 ммоль в 100% ДМСО (Sigma; Cat # D2650), после чего хранились до использования при -80°C. В день проведения исследования соединения были разведены в соотношении 1:12.5 в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы до получения рабочего запаса с концентрацией 200 мкмоль в 8% ДМСО, после чего они были разведены в соотношении 1:80 в каждой лунке для проведения анализа до получения итоговой концентрации соединения 2,5мкмоль в 0,1% ДМСО.
Скрининговое исследование дифференцировки: Шаг 1 протокола дифференцировки проводился в течение 3 дней, во время которых ежедневно происходила подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100мкл). В первый день исследования для подкормки в лунки вводилась среда RPMI-1640 (Invitrogen; Cat #: 22400), в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA) (Proliant Inc.; Cat #: SKU 68700), 100 нг/мл Активина A (PeproTech; Cat #120-14), 20 нг/мл Wnt3a (R&D Systems; Cat # 1324-WN/CF) и 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) (R&D Systems; Cat # 233-FB). На второй и третий день исследования для подкормки в лунки вводилась та же среда, за исключением того, что из нее был удален Wnt3a. Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.
Шаг 2 протокола дифференцировки проводился в течение двух дней. Происходила ежедневная подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100мкл) Игла в модификации Дульбекко/F12 (Invitrogen; Cat # 11330-032), в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA), 50 нг/мл фактора роста фибробластов (PeproTech; Cat # 100-19) и 250 нмоль KAAD-циклопамина (Calbiochem; Cat # 239804). Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.
Третий этап протокола дифференцировки занял четыре дня. Происходила подкормка клеток через день путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200 мкл) с (Invitrogen; Cat # 10569) с добавлением 0,1% Albumax (Invitrogen; Cat #: 11020-021), 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена (ITS-X; Invitrogen; Cat # 51500056), 50 нг/мл фактора роста фибробластов, 100 нг/мл Noggin (R&D Systems; Cat # 3344-NG), 250 нмоль KAAD-циклопамина, 2 мкмоль транс-ретиноевой кислоты (RA) (Sigma-Aldrich; Cat # R2625) и 30 нг/мл Активина A. Во время шага 3 опытные образцы ингибиторов киназ были добавлены в каждую лунку на двух отдельных планшетах (Планшеты A и B); третий планшет (Планшет C) остался необработанным. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.
Четвертый этап протокола дифференцировки занял три дня. Происходила подкормка клеток на 1 и 2 день (но не на 3) путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы с добавлением 0,1% Albumax, 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена, 100 нг/мл Noggin, и 1 мкмоль ингибитора Alk 5(Axxora; Cat # ALX-270-445). Во время шага 3 опытные образцы ингибиторов киназ были добавлены в каждую лунку на двух отдельных планшетах (Планшеты В и С); третий планшет (Планшет А) остался необработанным. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.
Одновременный многопараметрический анализ: В конце шага 4 среды из всех исследуемых планшетов были аспирированы с последующей фиксацией при комнатной температуре с 4% параформальдегидом (Sigma-Aldrich; Cat # 158127), разведенным в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) без двухвалентных катионов (Invitrogen; Cat # 14190), а затем однократно промыты ФСБ. Клеточные мембраны образцов были пермеабилизированы 0,5% Тритоном X-100 (VWR; Cat # VW3929-2) в течение 20 минут при комнатной температуре, двукратно промыты ФСБ и блокированы 5% ослиной сывороткой (Jackson ImmunoResearch; Cat # 017-000-121) в ФСБ в течение 30 минут при комнатной температуре. Первое антитело (анти-NGN3 барана; R&D Systems; AF3444) было разведено в соотношении 1:300 в 5% ослиной сыворотке и добавлено в каждую лунку на один час при комнатной температуре. После двукратного промывания ФСБ вторичные ослиные противобараньи антитела Alexa Fluor 647 (Invitrogen; Cat # A21448) были разведены в соотношении 1:100 и добавлены в лунку к каждому образцу в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего они были дважды промыты ФСБ. Для контрастной окраски ядер было добавлено 4мкг/мл Хехст33342 (Invitrogen; Cat # H3570) в течение 10 минут при комнатной температуре. Планшеты были однократно промыты ФСБ, после чего в каждой лунке для визуализации было оставлено по 100 мкл ФСБ.
При помощи IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) с использованием дихроического зеркала с 51008 светоделителями проводилась визуализация клеток, окрашенных красителями Хехст 33342 и Alexa Flour 647. Время воздействия было оптимизировано в сравнении с лунками с положительным контролем, которые были окрашены только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания каждую лунку снимали в 15 проекциях. Общее число клеток и общую интенсивность сигнала NGN3 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Общий уровень экспрессии белка NGN3 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение общей интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон оценивался на основе критериев допустимости шкалы оттенков серого в диапазоне от 200 до 3500. Данные об общей интенсивности были нормализованы путем деления общей интенсивности флюоресценции каждой лунки на среднюю общую интенсивность флюоресценции положительного контроля.
Результаты исследования показаны в Таблице 3 из комбинаций двух банков ингибиторов киназ, которые были использованы для обработки 6 исследуемых планшетов в рамках этого единичного эксперимента. Представленные данные являются репрезентативными коэффициентами интенсивности флуоресценции окрашивания NGN3 для обработанных лунок с индивидуальными соединениями в сравнении с лунками, которые были обработаны только нейтральным ДМСО. Коэффициенты интенсивности, как и ранжирование, показаны для индивидуальных соединений, которые были получены отдельно во время 3 или 4 шага, или при сочетании 3 и 4 шага. Соединения с коэффициентами интенсивности >1,4 относительно контроля, который был обработан нейтральным веществом, были отмечены как пики для подтверждения и дополнительной оценки. Особенно интересно, как было обобщено в Таблице 4, что соединения, при добавлении которых были обнаружены некоторые целевые сигнальные клеточные пути, могут быть вовлечены в оптимальную схему экспрессии NGN3 во время дифференцировки эндокринных клеток.
Пример 2
Скрининг аналогов малых молекул, регулирующих экспрессию NKX6.1 и NGN3
Во время превращения клеток-предшественниц в эндокринные клетки необходима экспрессия факторов NKX6.1 и NGN3. Исследование ингибиторов киназ было проведено для определения того, могут ли они оказывать положительное действие на экспрессию одного или обоих маркеров во время дифференцировки клеток. В данном примере в протокол дифференцировки также был включен ингибитор деацетилазы гистонов Трихостатин А с целью регуляции реконструкции хроматина и возможного усиления транскрипции генов.
Подготовка клеток для анализа: Недифференцированное, плюрипотентное состояние исходной культуры эмбриональных стволовых клеток человека (клеточная линия H1 эмбриональных стволовых клеток человека) поддерживалось при помощи подавления факторов роста на планшетах с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши, которая была покрыта MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) с проведением пассирования клеток в среднем раз в четыре дня. Пассирование проводилось путем обработки клеточной культуры раствором диспазы с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen, Cat #: 17105-041) в течение 5-7 минут при 37°C с последующим промыванием монослоя с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши и аккуратным соскабливанием для восстановления клеточных кластеров. Кластеры были центрифугированы на низкой скорости для сбора сгустка клеток и удаления остаточного количества диспазы. Для проведения планового обслуживания клеточные кластеры были разведены в отношении 1:3 или 1:4. Все линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее P50 и периодически проверяли на нормальный кариотип и отсутствие микоплазмы. Для скринингов в формате небольшого исследования кластеры эмбриональных стволовых клеток человека H1 были забраны из клеточной культуры, которая была предварительно обработана диспазой описанным выше способом, и были высеяны с распределением 1:2 (по площади поверхности) на черный планшет с 96 лунками объемом 100 мкл, которые для инактивации факторов роста были покрыты MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) (Packard ViewPlates; PerkinElmer; Cat #6005182) Клеткам дали зафиксироваться, и затем восстановили фазу логарифмического роста с периодичностью от 1 до 3 дней, подкармливая клетки кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши с добавлением 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (R&D Systems; Cat # 233-FB). Во время проведения исследования планшеты содержались во влажной камере при 37°C с 5% содержанием CO2.
Подготовка соединений: Скрининг был проведен с использованием двух имеющихся в продаже банков низкомолекулярных ингибиторов киназ (BioMol Intl; Cat # 2832A(V2.2), как показано в Таблице 1. Соединения из этих банков были доступны в чистом виде в количестве 10 ммоль на планшетах с 96 лунками, где они были разведены в 100% ДМСО и хранились при -80°C. Соединения из этих банков далее были разведены до промежуточной концентрации 2,5 ммоль в 100% ДМСО (Sigma; Cat # D2650), после чего хранились до использования при -80°C. В день проведения исследования соединения были разведены в соотношении 1:12.5 в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы до получения рабочего запаса с концентрацией 200 мкмоль в 8% ДМСО, после чего они были разведены в соотношении 1:80 в каждой лунке для проведения анализа до получения итоговой концентрации соединения 2,5мкмоль в 0,1% ДМСО.
Скрининговое исследование дифференцировки: Шаг 1 протокола дифференцировки проводился в течение 3 дней, во время которых ежедневно происходила подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100 мкл). В первый день исследования для подкормки в лунки вводилась среда RPMI-1640 (Invitrogen; Cat #: 22400) в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA) (Proliant Inc.; Cat #: SKU 68700), 100 нг/мл Активина A (PeproTech; Cat #120-14), 20 нг/мл Wnt3a (R&D Systems; Cat # 1324-WN/CF) и 8 нг/мло сновного фактора роста фибробластов (bFGF) (R&D Systems; Cat # 233-FB). На второй и третий день исследования для подкормки в лунки вводилась та же среда, за исключением того, что из нее был удален Wnt3a. Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.
Шаг 2 протокола дифференцировки проводился в течение двух дней. Происходила ежедневная подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100 мкл) Игла в модификации Дульбекко/F12 (Invitrogen; Cat # 11330-032) в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA), 50 нг/мл фактора роста фибробластов (PeproTech; Cat # 100-19), и 250 нмоль KAAD-циклопамина (Calbiochem; Cat # 239804). Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.
Третий этап протокола дифференцировки занял пять дней. Происходила подкормка клеток через день путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200 мкл) (Invitrogen; Cat # 10569) с добавлением 0,1% Albumax (Invitrogen; Cat #: 11020-021), 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена (ITS-X; Invitrogen; Cat # 51500056), 50 нг/мл фактора роста фибробластов, 100 нг/мл Noggin (R&D Systems; Cat # 3344-NG), 250 нмоль KAAD-циклопамина, 2 мкмоль M транс ретиноевой кислоты (RA) (Sigma-Aldrich; Cat # R2625), 30 нг/мл Активина A и 100 нмоль Трихостатина A (TsA; Sigma; Cat # T8552). Во время шага 3 опытные образцы ингибиторов киназ были добавлены в каждую лунку на 2 и 4 день. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.
Четвертый этап протокола дифференцировки занял три дня. Происходила ежедневная подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200 мкл) с добавлением 0,1% Albumax, 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена, 100 нг/мл Noggin,мкмоль ингибитора Alk 5 (Axxora; Cat # ALX-270-445) и 1 мкг/мл DAPT (Sigma; Cat #D5942). Во время шага 4 в первый день в каждую лунку были добавлены опытные образцы ингибиторов киназ и 100 нмоль Трихостатина А, затем на 2 и 3 день при подкормке клеток оба опытных образца ингибиторов киназ и Трихостатин А уже не добавлялись. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.
Одновременный многопараметрический анализ: В конце шага 4 среды из всех исследуемых планшетов были аспирированы с последующей фиксацией при комнатной температуре в течение 20 минут с 4% параформальдегидом (Sigma-Aldrich; Cat # 158127), разведенным в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) без двухвалентных катионов (Invitrogen; Cat # 14190), а затем однократно промыты ФСБ. Клеточные мембраны образцов были пермеабилизированы 0,5% Тритоном X-100 (VWR; Cat # VW3929-2) в течение 20 минут при комнатной температуре, двукратно промыты ФСБ и блокированы 5% ослиной сывороткой (Jackson ImmunoResearch; Cat # 017-000-121) В ФСБв течение 30 минут при комнатной температуре. Первое антитело (анти-NGN3 барана; R&D Systems; AF3444 или анти-NKX6.1 мыши; Университет штата Айова; Cat # F55A12) было разведено (в соотношении 1:300 для анти-NGN3; в соотношении 1:500 для анти-NKX6.1) в 5% ослиной сыворотке и добавлено в каждую лунку на один час при комнатной температуре. После двукратного промывания ФСБ вторичные ослиные противобараньи антитела Alexa Fluor 647 (Invitrogen; Cat # A21448) и вторичные ослиные противомышиные антитела Alexa Fluor 488 (Invitrogen; Cat #A21202) были разведены в соотношении 1:100 (для обоих видов вторичных антител) и добавлены в лунку к каждому образцу в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего они были дважды промыты ФСБ. Для контрастной окраски ядер было добавлено 4 мкг/мл красителя Хехст 33342 (Invitrogen; Cat # H3570)в течение 10 минут при комнатной температуре. Планшеты были однократно промыты ФСБ, после чего в каждой лунке для визуализации было оставлено по 100 мкл ФСБ.
При помощи IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) с использованием дихроического зеркала с 51008 светоделителями проводилась визуализация клеток, окрашенных красителями Хехст 33342, Alexa Flour 647 и Alexa Flour 647. Время воздействия было оптимизировано в сравнении с лунками с положительным контролем, которые были окрашены только вторичными антителами Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания каждую лунку снимали в 15 проекциях. Общее число клеток и общую интенсивность сигнала NGN3 или NKX6.1 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Общий уровень экспрессии белка NGN3 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение общей интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки Фон оценивался на основе критериев допустимости шкалы оттенков серого в диапазоне от 200 до 3500. Данные об общей интенсивности были нормализованы путем деления общей интенсивности флюоресценции каждой лунки на среднюю общую интенсивность флюоресценции положительного контроля.
Результаты данного исследования были обобщены в Таблице 5, Таблице 6 и Таблице 7. Данные из Таблицы 5 являются репрезентативными коэффициентами интенсивности флуоресценции окрашивания NGN3 и NKX6.1 для обработанных лунок с индивидуальными соединениями в сравнении с лунками, которые были обработаны только нейтральным ДМСО. Кроме того, также показано ранжирование воздействия каждого соединения на экспрессию белков NGN3 или NKX6.1. В Таблице 6 приводится ранжирование 16 наивысших пиков, которые оказали положительное воздействие на экспрессию NGN3 и/или NKX6.1. В Таблице 7 обобщаются данные о мишенях и путях передачи сигнала, которые имеют отношение к этим пикам. Сигнальные пути, обусловленные воздействием соединения с множественными пиками, которые были получены в рамках этого исследования, должны иметь наибольшее значение с точки зрения влияния на экспрессию этих двух факторов транскрипции, которые играют критическую роль в дифференцировке эндокринных клеток.
Пример 3
Подтверждение регулирующей роли аналогов малых молекул в экспрессии NGN3 и NKX6.1
Во время превращения клеток-предшественниц в эндокринные клетки необходима экспрессия фактора NKX6.1 и NGN3. Исследование ингибиторов киназ было проведено для определения того, могут ли они оказывать положительное действие на экспрессию одного или обоих маркеров во время дифференцировки клеток. В данном примере в протокол дифференцировки также был включен ингибитор деацетилазы гистонов Трихостатин А с целью регуляции реконструкции хроматина и возможного усиления транскрипции генов.
Подготовка клеток для анализа: Недифференцированное, плюрипотентное состояние исходной культуры эмбриональных стволовых клеток человека (клеточная линия H1 эмбриональных стволовых клеток человека) поддерживалось при помощи подавления факторов роста на планшетах с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши, которая была покрыта MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) с проведением пассирования клеток в среднем раз в четыре дня. Пассирование проводилось путем обработки клеточной культуры раствором диспазы с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen, Cat #: 17105-041) в течение 5-7 минут при 37°C с последующим промыванием монослоя с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши и аккуратным соскабливанием для восстановления клеточных кластеров. Кластеры были центрифугированы на низкой скорости для сбора сгустка клеток и удаления остаточного количества диспазы. Для проведения планового обслуживания клеточные кластеры были разведены в отношении 1:3 или 1:4. Все линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее P50 и периодически проверяли на нормальный кариотип и отсутствие микоплазмы. Для скринингов в формате небольшого исследования кластеры эмбриональных стволовых клеток человека H1 были забраны из клеточной культуры, которая была предварительно обработана диспазой описанным выше способом, и были высеяны с распределением 1:2 (по площади поверхности) на черный планшет с 96 лунками объемом 100 мкл, которые для инактивации факторов роста были покрыты MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) (Packard ViewPlates; PerkinElmer; Cat #6005182) . Клеткам дали зафиксироваться, и затем восстановили фазу логарифмического роста с периодичностью от 1 до 3 дней, подкармливая клетки кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши с добавлением 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (R&D Systems; Cat # 233-FB). Во время проведения исследования планшеты содержались во влажной камере при 37°C с 5% содержанием CO2.
Подготовка соединений: Подтверждающий скрининг был проведен с использованием одного имеющегося в продаже банка низкомолекулярных ингибиторов киназ (BioMol Intl; Cat # 2832A(V2.2), как показано в Таблице 1. Интересующие соединения из этого банка были доступны в чистом виде в количестве 10 ммоль на планшетах с 96 лунками, где они были разведены в 100% ДМСО и хранились при -80°C. Интересующие нас индивидуальные соединения из этого банка далее были разведены до промежуточной концентрации 2,5 ммоль в 100% ДМСО (Sigma; Cat # D2650), после чего хранились до использования при -80°C. В день проведения исследования эти индивидуальные соединения были разведены в соотношении 1:12.5 в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы до получения рабочего запаса с концентрацией 200 мкмоль в 8% ДМСО, после чего они были разведены в соотношении 1:80 в каждой лунке для проведения анализа до получения итоговой концентрации соединения 2,5 мкмоль в 0,1% ДМСО.
Скрининговое исследование дифференцировки: Шаг 1 протокола дифференцировки проводился в течение 3 дней, во время которых ежедневно происходила подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100 мкл). В первый день исследования для подкормки в лунки вводилась среда RPMI-1640 (Invitrogen; Cat #: 22400) в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA) (Proliant Inc.; Cat #: SKU 68700), 100 нг/мл Активина A (PeproTech; Cat #120-14), 20 нг/мл Wnt3a (R&D Systems; Cat # 1324-WN/CF) и 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) (R&D Systems; Cat # 233-FB). На второй и третий день исследования для подкормки в лунки вводилась та же среда, за исключением того, что из нее был удален Wnt3a. Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.
Шаг 2 протокола дифференцировки проводился в течение двух дней. Происходила ежедневная подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100 мкл) Игла в модификации Дульбекко/F12 (Invitrogen; Cat # 11330-032) в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA), 50 нг/мл фактора роста фибробластов (PeproTech; Cat # 100-19) и 250 нмоль KAAD-циклопамина (Calbiochem; Cat # 239804). Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.
Третий этап протокола дифференцировки занял четыре дня. Происходила подкормка клеток через день путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200 мкл) (Invitrogen; Cat # 10569) с добавлением 0,1% Albumax (Invitrogen; Cat #: 11020-021), 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена (ITS-X; Invitrogen; Cat # 51500056), 0 нг/мл фактора роста фибробластов, 100 нг/мл Noggin (R&D Systems; Cat # 3344-NG), 250 нмоль KAAD-циклопамина, 2 мкмоль транс-ретиноевой кислоты (RA) (Sigma-Aldrich; Cat # R2625) и 20 нг/мл Активина А. Во время подкормки в 1 и 3 день шага 3 опытные образцы ингибиторов киназ в трех экземплярах были добавлены в каждую лунку планшетов. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.
Третий этап протокола дифференцировки занял четыре дня. Происходила подкормка клеток через день путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200μl) с добавлением 0,1% Albumax, 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена, 100 нг/мл Noggin и 1мкмоль ингибитора Alk 5(Axxora; Cat # ALX-270-445). Во время шага 4 опытные образцы ингибиторов киназ в трех экземплярах были добавлены в каждую лунку планшетов во время подкорма клеток на 1 и 3 день. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.
Одновременный многопараметрический анализ: В конце шага 4 среды из всех исследуемых планшетов были аспирированы и зафиксированы при комнатной температуре в течение 20 минут с 4% параформальдегидом (Sigma-Aldrich; Cat # 158127), разведенным в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) без двухвалентных катионов (Invitrogen; Cat # 14190), а затем однократно промыты ФСБ. Клеточные мембраны образцов были пермеабилизированы 0,5% Тритоном X-100 (VWR; Cat # VW3929-2) в течение 20 минут при комнатной температуре, двукратно промыты ФСБ и блокированы 5% ослиной сывороткой (Jackson ImmunoResearch; Cat # 017-000-121) в ФСБ в течение 30 минут при комнатной температуре. Первые антитела (анти-NGN3 барана; R&D Systems; AF3444 или анти-NKX6.1 мыши ; Университет Штата Айова; Cat # F55A12) было разведено (в соотношении 1:300 для anti-NGN3; в соотношении 1:500 для анти-NKX6.1) в 5% ослиной сыворотке и добавлено в каждую лунку на один час при комнатной температуре. После двукратного промывания ФСБ вторичные ослиные противобараньи антитела Alexa Fluor 647 (Invitrogen; Cat # A21448) и вторичные ослиные противомышиные антитела Alexa Fluor 488 (Invitrogen; Cat #A21202) были разведены в соотношении 1:100 (для обоих видов вторичных антител) и добавлены в лунку к каждому образцу в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего они были дважды промыты ФСБ. Для контрастной окраски ядер было добавлено 4мкг/мл красителя Хехст 33342 (Invitrogen; Cat # H3570) в течение 10 минут при комнатной температуре. Планшеты были однократно промыты ФСБ, после чего в каждой лунке для визуализации было оставлено по 100 мкл ФСБ.
При помощи IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) с использованием дихроического зеркала с 51008 светоделителями проводилась визуализация клеток, окрашенныхкрасителями Хехст 33342, Alexa Flourr 488 и Alexa Flour 647. Время воздействия было оптимизировано в сравнении с лунками с положительным контролем, которые были окрашены только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания каждую лунку снимали в 15 проекциях. Общее число клеток и общую интенсивность сигнала NGN3 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Общий уровень экспрессии белка NGN3 или NKX6.1 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение общей интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон оценивался на основе критериев допустимости шкалы оттенков серого в диапазоне от 200 до 3500. Данные об общей интенсивности были нормализованы путем деления общей интенсивности флюоресценции каждой лунки на среднюю общую интенсивность флюоресценции положительного контроля.
Результаты этих исследований показаны в Таблице 8. Предположения о свойствах двух соединений (кенпаулона и BML-259) не подтвердились, и они не оказывали усиливающее действие на экспрессию NGN3 или NKX6.1 в сравнении с контролем. Было показано, что оставшиеся исследованные соединения оказывают положительное воздействие на оба фактора транскрипции, что подтверждает полученные ранее результаты и подчеркивает важность этих связанных сигнальных путей.
Таблица 1 Банк ингибиторов киназ BioMol (Cat # 2832, v2.2) |
||||
РАСПОЛОЖЕНИЕ НА ПЛАНШЕТЕ | № CAS | НАИМЕНОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЛИ № | Молекулярная масса | Мишень |
B1 | 167869-21-8 | PD-98059 | 267,3 | MEK |
B2 | 109511-58-2 | U-0126 | 380,5 | MEK |
B3 | 152121-47-6 | SB-203580 | 377,4 | p38 митоген-активируемая протеинкиназа |
B4 | 84477-87-2 | H-7 | 364,3 | Протеинкиназа А, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа С. |
B5 | 84468-17-7 | H-9 | 324,3 | Протеинкиназа А, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа С. |
B6 | 62996-74-1 | Стауроспорин | 466,5 | Неспецифично |
B7 | 133550-35-5 | AG-494 | 280,3 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа фактора роста тромбоцитов |
B8 | AG-825 | 397,5 | HER1-2 | |
B9 | 125697-92-9 | Лавендустин A | 381,4 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса |
B10 | 136831-49-7 | RG-14620 | 274,1 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса |
B11 | 118409-57-7 | Тирфостин 23 | 186,1 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса |
B12 | 118409-58-8 | Тирфостин 25 | 202,1 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса |
C1 | 122520-85-8 | Тирфостин 46 | 204,2 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа фактора роста тромбоцитов |
C2 | 122520-86-9 | Тирфостин 47 | 220,2 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса |
C3 | 122520-90-5 | Тирфостин 51 | 268,2 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса |
C4 | 2826-26-8 | Тирфостин 1 | 184,2 | Отрицательный контроль для ингибиторов тирозинкиназы. |
C5 | 116313-73-6 | Тирфостин AG 1288 | 231,2 | Тирозинкиназы |
C6 | 63177-57-1 | Тирфостин AG 1478 | 315,8 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса |
C7 | 71897-07-9 | Тирфостин AG 1295 | 234,3 | Тирозинкиназы |
C8 | 10537-47-0 | Тирфостин 9 | 282,4 | Киназа фактора роста тромбоцитов |
C9 | HNMPA (гидрокси-2-нафталенилметилфосфоновая кислота) | 238,2 | Киназа инсулинового рецептора | |
C10 | 120685-11-2 | PKC-412 (протеинкиназа С) | 570,6 | Ингибитор протеинкиназы С |
C11 | 10083-24-6 | Пицеатаннол | 244,3 | Тирозинкиназа селезенки |
C12 | 172889-26-8 | PP1 | 281,4 | Киназы семейства Src |
D1 | 133550-35-3 | AG-490 | 294,3 | JAK-2 киназа |
D2 | AG-126 | 215,2 | ИЛ1-ассоцированная цитоплазматическая киназа | |
D3 | AG-370 | 259,3 | Киназа фактора роста тромбоцитов | |
D4 | AG-879 | 316,5 | Киназа рецептора фактора роста нервов | |
D5 | 154447-36-6 | LY 294002 | 307,4 | PI 3-K |
D6 | 19545-26-7 | Вортманнин | 428,4 | Фосфоинозитид-3-киназа |
D7 | 133052-90-1 | GF 109203X | 412,5 | Протеинкиназа С |
D8 | 548-04-9 | Гиперицин | 504,4 | Протеинкиназа С |
D9 | 138489-18-6 | Ro 31-8220 | 553,7 | Протеинкиназа С |
D10 | 123-78-4 | Сфингозин | 299,5 | Протеинкиназа С |
D11 | 127243-85-0 | H-89 | 519,2 | Протеинкиназа A |
D12 | 84478-11-5 | H-8 | 338,3 | Протеинкиназа A, Протеинкиназа G |
E1 | 91742-10-8 | HA-1004 | 329,8 | Протеинкиназа A, Протеинкиназа G |
E2 | 103745-39-7 | HA-1077 | 327,8 | Протеинкиназа A, Протеинкиназа G |
E3 | HDBA (2-гидрокси-5-(2,5-дигидроксибензиламино)бензойная кислота) | 275,3 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, кальций/кальмодулин - зависимая протеинкиназа II | |
E4 | 127191-97-3 | KN-62 | 721,9 | Кальций/кальмодулин - зависимая протеинкиназа II |
E5 | KN-93 | 501 | Кальций/кальмодулин - зависимая протеинкиназа II | |
E6 | 109376-83-2 | ML-7 | 452,7 | Киназа легких цепей миозина |
E7 | 105637-50-1 | ML-9 | 361,3 | Киназа легких цепей миозина |
E8 | 452-06-2 | 2-аминопурин | 135,1 | p58 протеинкиназа PITSLRE бета 1 |
E9 | 158982-15-1 | N9-изопропилоломоуцин | 326,4 | Циклин-зависимая киназа |
E10 | 101622-51-9 | Оломоуцин | 298,3 | Циклин-зависимая киназа |
E11 | 101622-50-8 | изооломоуцин | 298,4 | Негативный контроль для оломицина. |
E12 | 186692-46-6 | Росковитин | 354,5 | Циклин-зависимая киназа |
F1 | 24386-93-4 | 5-йодотуберцидин | 392,2 | Внеклеточно регулируемая киназа 2, аденозин-киназа, креатинкиназа 1, креатинкиназа 2, |
F2 | 62004-35-7 | LFM-A13 | 360 | Тирозинкиназа Брутона |
F3 | 152121-30-7 | SB-202190 | 331,3 | p38 митоген-активируемая протеинкиназа |
F4 | 172889-27-9 | PP2 | 301,8 | Семейство киназ Src |
F5 | 208260-29-1 | ZM 336372 | 389,4 | RAF прото-онкогенная серин/треонин протеинкиназа |
F6 | 5812-07-7 | SU 4312 | 264,3 | Flk1 |
F7 | 146535-11-7 | AG-1296 | 266,3 | Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов |
F8 | 220904-83-6 | GW 5074 | 520,9 | RAF прото-онкогенная серин/треонин протеинкиназа |
F9 | 6865-14-1 | Пальмитоил-DL-карнитин Cl | 436,1 | Протеинкиназа C |
F10 | 82-08-6 | Роттлерин | 516,6 | Протеинкиназа C дельта |
F11 | 446-72-0 | Генистеин | 270,2 | Тирозинкиназы |
F12 | 486-66-8 | Даидзеин | 254,2 | Негативный контроль для генистеина. |
G1 | 63177-57-1 | Эрбстатина аналог | 194 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса |
G2 | 6151-25-3 | Кверцитина дигидрат | 338,3 | Фосфоинозитид-3-киназа |
G3 | SU1498 | 390,5 | Flk1 | |
G4 | 4452-06-6 | ZM 449829 | 182,2 | JAK-3 киназа |
G5 | 195462-67-7 | BAY 11-7082 | 207,3 | Сигнальный путь IκB киназ |
G6 | 53-85-0 | DRB (5,6-дихлор-1-b-D-рибофуранозилбензимидазол) | 319,1 | Креатинкиназа II |
G7 | HBDDE (2,2',3,3',4,4'-гексагидрокси-1,1'-бифенил-6,6'-диметанола диметиловый эфир) | 338,4 | Протеинкиназа C альфа, протеинкиназа C гамма | |
G8 | 129-56-6 | SP 600125 | 220,2 | c-Jun-N-терминальная киназа |
G9 | 479-41-4 | Индирубин | 262 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета, циклин-зависимая киназа 5 |
G10 | 160807-49-8 | Индирубин-3'-моноксим | 277,3 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета |
G11 | 146986-50-7 | Y-27632 | 338,3 | RhoA-активируемая киназа |
G12 | 142273-20-9 | Кенпауллон | 327,2 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета |
H1 | 121-40-4 | Терреиновая кислота | 154,1 | Киназа Брутона |
H2 | 35943-35-2 | Трицирибин | 320,3 | Сигнальный путь протеинкиназы В |
H3 | BML-257 | 326,4 | Протеинкиназа В | |
H4 | SC-514 | 224,3 | IKK2 | |
H5 | BML-259 | 260,4 | Циклин-зависимая киназа 5/p25 | |
H6 | 520-36-5 | Апигенин | 270,2 | Креатинкиназа-II |
H7 | BML-265 (аналог эрлотиниба) | 305,4 | EGFRK | |
H8 | 53123-88-9 | Рапамицин | 914,2 | мишень рапамицина в клетках млекопитающих |
Таблица 2 Банк ингибиторов киназ EMD Calbiochem (Cat # 539745) |
|||
РАСПОЛОЖЕНИЕ НА ПЛАНШЕТЕ | № CAS | НАИМЕНОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЛИ № | Молекулярная масса |
A2 | 127191-97-3 | KN-62 | 721,9 |
A3 | 587871-26-9 | Ингибитор ATM-киназы | 395,5 |
A4 | 905973-89-9 | Ингибитор ATM/ATR-киназы | 555,8 |
A5 | 237430-03-4 | Алстерпауллон | 293,3 |
A6 | 852527-97-0 | Алстерпауллон, 2-цианоэтил | 346,3 |
A7 | 496864-16-5 | Алоизин A, RP107 | 267,3 |
A8 | 496864-15-4 | Алоизин, RP106 | 281,4 |
A9 | 220792-57-4 | Аминопурваланол A | 403,9 |
A10 | 866405-64-3 | Ингибитор AMPK, Соединение C | 399,5 |
A11 | 879127-16-9 | Ингибитор III киназы Aurora | 413,4 |
B2 | 443797-96-4 | Ингибитор киназы Aurora / Cdk | 435,4 |
B3 | 160807-49-8 | Индирубин-3′-моноксим | 277,3 |
B4 | 19542-67-7 | BAY 11-7082 | 207,2 |
B5 | 189232-42-6 | Богемин | 340,4 |
B6 | 220749-41-7 | Ингибитор Cdk1 | 294,7 |
B7 | 190654-01-4 | Ингибитор Cdk1, CGP74514A | 385,9 |
B8 | 443798-55-8 | Cdk1/2-ингибитор III | 425,4 |
B9 | 40254-90-8 | Ингибитор Cdk1/5 | 185,2 |
B10 | 301836-43-1 | Ингибитор казеинкиназы I, D4476 | 398,4 |
B11 | 934358-00-6 | Ингибитор III казеинкиназы II, TBCA | 463,8 |
C2 | 546102-60-7 | Ингибитор Cdk4 | 404,2 |
C3 | 141992-47-4 | Cdk4-ингибитор II, NSC 625987 | 271,3 |
C4 | 265312-55-8 | Cdk4-ингибитор III | 284,3 |
C5 | 300801-52-9 | Ингибитор Cdc2-подобной киназы, TG003 | 249,3 |
C6 | 516480-79-8 | Chk2-ингибитор II | 363,8 |
C7 | 212779-48-1 | Соединение 52 | 346,8 |
C8 | 199986-75-9 | Cdk2-ингибитор III | 400,5 |
C9 | 444723-13-1 | Cdk2-ингибитор IV, NU6140 | 422,5 |
C10 | 784211-09-2 | Ингибитор Cdk/Crk | 473,4 |
C11 | ERK-ингибитор III | 318,3 | |
D2 | 146986-50-7 | Ингибитор ROCK, Y-27632 | 338,3 |
D3 | 865362-74-9 | ERK-ингибитор II, FR180204 | 327,3 |
D4 | ERK-ингибитор II, отрицательная контрольная группа | 328,3 | |
D5 | Фаскаплизин, синтетический | 306,8 | |
D6 | GSK-3b-ингибитор I | 222,3 | |
D7 | 478482-75-6 | GSK-3b-ингибитор II | 395,2 |
D8 | 487021-52-3 | GSK-3b-ингибитор VIII | 308,3 |
D9 | 667463-62-9 | GSK-3-ингибитор IX | 356,2 |
D10 | GSK-3-ингибитор X | 398,2 | |
D11 | 626604-39-5 | GSK-3b-ингибитор XI | 349,3 |
E2 | 330161-87-0 | SU6656 | 371,5 |
E3 | 404828-08-6 | GSK-3-ингибитор XIII | 301,4 |
E4 | 244148-46-7 | Изогранулатимид | 276,3 |
E5 | 186611-52-9 | IC261 | 311,3 |
E6 | 507475-17-4 | IKK-2-ингибитор IV | 279,3 |
E7 | Индирубиновое производное E804 | 365,4 | |
E8 | 129-56-6 | JNK-ингибитор II | 220,2 |
E9 | JNK ингибитор, отрицательная контрольная группа | 234,2 | |
E10 | 345987-15-7 | JNK-ингибитор V | 372,5 |
E11 | 312917-14-9 | JNK-ингибитор IX | 350,4 |
F2 | 41179-33-3 | Ингибитор MK2a | 349,4 |
F3 | 894804-07-0 | JNK-ингибитор VIII | 356,4 |
F4 | 97161-97-2 | K-252a, Nocardiopsis sp. | 467,5 |
F5 | 142273-20-9 | Кенпауллон | 327,2 |
F6 | 139298-40-1 | KN-93 | 501,0 |
F7 | MEK-ингибитор I | 374,5 | |
F8 | 623163-52-0 | MEK-ингибитор II | 289,7 |
F9 | 305350-87-2 | Ингибитор MEK1/2 | 335,4 |
F10 | 522629-08-9 | Ингибитор MNK1 | 244,2 |
F11 | 545380-34-5 | Ингибитор активации транскрипционного фактора NF-κB | 356,4 |
G2 | 581098-48-8 | Ингибитор III MAP-киназы p38 | 404,5 |
G3 | 219138-24-6 | Ингибитор MAP-киназы p38 | 365,8 |
G4 | 167869-21-8 | PD 98059 | 267,3 |
G5 | 152121-53-4 | PD 169316 | 360,3 |
G6 | 165806-53-1 | SB220025 | 338,4 |
G7 | 212844-53-6 | Пурваланол A | 388,9 |
G8 | GSK3b-ингибитор XII, TWS119 | 318,3 | |
G9 | 127243-85-0 | H-89, дигидрохлорид | 519,3 |
G10 | SB 202474, отрицательная контрольная группа для опытов с ингибированием p38 MAPK | 279,3 | |
G11 | 152121-30-7 | SB 202190 | 331,3 |
H2 | 152121-47-6 | SB 203580 | 377,4 |
H3 | 103745-39-7 | HA 1077, дигидрохлорида фасудил | 364,3 |
H4 | 135897-06-2 | SB 218078 | 393,4 |
H5 | 318480-82-9 | SC-68376 | 236,3 |
H6 | 72873-74-6 | SKF-86002 | 297,4 |
H7 | Ингибитор сфингозинкиназы | 339,2 | |
H8 | 62996-74-1 | Стауроспорин, Streptomyces sp. | 466,5 |
H9 | 52029-86-4 | STO-609 | 374,4 |
H10 | 666837-93-0 | SU9516 | 241,3 |
H11 | 871307-18-5 | Ингибитор Tpl2-киназы | 404,8 |
Таблица 3 Банки ингибиторов киназ EMDII и BioMol |
|||||||||
NGN3 Интенсивность | |||||||||
Доза на шаге 3 | Доза на шаге 4 | Доза на шаге 3&4 | |||||||
Банк | Лунка | Мишень | Ингибитор | Ранжирование | Коэффициент | Ранжирование | Коэффициент | Ранжирование | Коэффициент |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 4 | Семейство киназ Src | PP2 | 8 | 1,81 | 2 | 2,50 | 1 | 2,49 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 5 | Фосфоинозитид-3-киназа | LY 294002 | 7 | 1,82 | 9 | 1,63 | 2 | 2,46 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | B - 3 | p38 митоген-активируемая протеинкиназа | SB-203580 | 3 | 2,23 | 7 | 1,88 | 3 | 2,34 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | H - 2 | p38 | SB 203580 | 19 | 1,53 | 52 | 1,08 | 4 | 2,22 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | H - 5 | p38 | SC-68376 | 29 | 1,41 | 121 | 0,69 | 5 | 2,12 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | B - 4 | Протеинкиназа А, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. | H-7 | 5 | 1,93 | 5 | 2,18 | 6 | 2,08 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | G - 10 | не является ингибитором протеинкиназы p38 | SB 202474, отрицательный контроль для p38 митоген-активируемая протеинкиназы | 116 | 0,88 | 62 | 1,03 | 7 | 2,02 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | A - 7 | (CDK1/2/5)(GSK3i) | Алоизин A, RP107 | 58 | 1,25 | 55 | 1,06 | 8 | 1,97 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | H - 3 | RhoA-активируемая киназа | гиалуронат 1077, фасудил | 47 | 1,32 | 20 | 1,40 | 9 | 1,93 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 3 | p38 митоген-активируемая протеинкиназа | SB-202190 | 11 | 1,72 | 58 | 1,05 | 10 | 1,83 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | A - 2 | Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II | KN-62 | 110 | 0,93 | 107 | 0,81 | 11 | 1,82 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 11 | RhoA-активируемая киназа | Y-27632 | 120 | 0,84 | 1 | 2,67 | 12 | 1,78 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 11 | Протеинкиназа A | H-89 | 2 | 2,57 | 4 | 2,23 | 13 | 1,75 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 6 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Тирфостин AG 1478 | 15 | 1,62 | 10 | 1,57 | 14 | 1,74 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | A - 3 | ATM-киназа | Ингибитор ATM-киназы | 54 | 1,28 | 88 | 0,91 | 15 | 1,70 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 12 | Семейство киназ Src | PP1 | 4 | 2,05 | 12 | 1,48 | 16 | 1,67 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 1 | Протеинкиназа А, протеинкиназа G | HA-1004 | 6 | 1,82 | 3 | 2,30 | 17 | 1,63 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | B - 9 | Циклин-зависимая киназа1/5 | Ингибитор циклин-зависимой киназы 1/5 | 83 | 1,12 | 100 | 0,85 | 18 | 1,61 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | C - 7 | CDC28 | Соединение 52 | 67 | 1,22 | 122 | 0,68 | 19 | 1,61 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | F - 9 | MEK1/2 | Ингибитор MEK1/2 | 94 | 1,03 | 110 | 0,77 | 20 | 1,60 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | H - 7 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | BML-265 (аналог эрлотиниба) | 16 | 1,58 | 30 | 1,25 | 21 | 1,59 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | G - 4 | MEK1/2 | PD 98059 | 71 | 1,21 | 78 | 0,96 | 22 | 1,57 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | F - 2 | MK2a | Ингибитор MK2a | 107 | 0,95 | 80 | 0,95 | 23 | 1,54 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | H - 6 | p38 | SKF-86002 | 46 | 1,32 | 92 | 0,89 | 24 | 1,49 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 9 | Киназа инсулинового рецептора | Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора | 93 | 1,06 | 39 | 1,19 | 25 | 1,38 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | B - 5 | Протеинкиназа A, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. | H-9 | 1 | 2,62 | 6 | 1,97 | 26 | 1,36 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | H - 6 | Креатинкиназа-II | Апигенин | 38 | 1,35 | 120 | 0,70 | 27 | 1,32 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 2 | Протеинкиназа A, протеинкиназа G | HA-1077 | 12 | 1,69 | 35 | 1,21 | 28 | 1,30 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 12 | Протеинкиназа PKA, протеинкиназа G | H-8 | 28 | 1,43 | 16 | 1,45 | 29 | 1,30 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 10 | Циклин-зависимая киназа | Оломоуцин | 25 | 1,46 | 41 | 1,17 | 30 | 1,30 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | F - 8 | MEK | MEK-ингибитор II | 105 | 0,96 | 96 | 0,88 | 31 | 1,28 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | H - 4 | CHK1 | SB 218078 | 61 | 1,23 | 29 | 1,25 | 32 | 1,27 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 7 | Тирозинкиназы | Тирфостин AG 1295 | 90 | 1,07 | 48 | 1,12 | 33 | 1,24 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 7 | Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | AG-1296 | 43 | 1,33 | 82 | 0,94 | 34 | 1,24 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 3 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Тирфостин 51 | 79 | 1,16 | 28 | 1,26 | 35 | 1,22 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 5 | cRAF | ZM 336372 | 23 | 1,48 | 114 | 0,76 | 36 | 1,19 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 2 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Тирфостин 47 | 40 | 1,35 | 47 | 1,12 | 37 | 1,18 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 6 | Flk1 | SU 4312 | 37 | 1,35 | 65 | 1,01 | 38 | 1,13 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | H - 4 | IKK2 | SC-514 | 20 | 1,52 | 64 | 1,01 | 39 | 1,13 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | D - 11 | GSK3 | GSK-3b-ингибитор XI | 132 | 0,62 | 44 | 1,15 | 40 | 1,13 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | C - 6 | CHK2 | Chk2-ингибитор II | 63 | 1,23 | 66 | 1,00 | 41 | 1,11 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | D - 3 | ERK | ERK-ингибитор II, FR180204 | 55 | 1,27 | 33 | 1,22 | 42 | 1,11 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | A - 10 | AMPK | Ингибитор AMPK, Соединение C | 32 | 1,38 | 87 | 0,92 | 43 | 1,08 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 8 | JNK | JNK-ингибитор II | 48 | 1,31 | 115 | 0,75 | 44 | 1,08 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | B - 8 | HER1-2 | AG-825 | 106 | 0,96 | 37 | 1,20 | 45 | 1,06 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | B - 10 | Креатинкиназа 1/киназа анапластической лимфомы/p38 | Ингибитор казеинкиназы I, D4476 | 100 | 0,99 | 45 | 1,13 | 46 | 1,05 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | B - 11 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Тирфостин 23 | 36 | 1,36 | 13 | 1,47 | 47 | 1,05 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | H - 1 | Киназа Брутона | Терреиновая кислота | 10 | 1,78 | 15 | 1,46 | 48 | 1,05 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | F - 11 | Транскрипционный фактор NF-кB | Ингибитор активации транскрипционного фактора NF-кB | 121 | 0,84 | 125 | 0,65 | 49 | 1,04 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | E - 5 | CHK1 | IC261 | 118 | 0,87 | 131 | 0,55 | 50 | 1,04 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 7 | Протеинкиназа C | GF 109203X | 101 | 0,99 | 26 | 1,29 | 51 | 1,04 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | A - 11 | Киназа Aurora /LCK киназа /BMX тирозинкиназа/инсулиноподобный фактор роста 1R/тирозинкиназа селезенки | Ингибитор III киназы Aurora | 87 | 1,10 | 67 | 1,00 | 52 | 1,03 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 12 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета | Кенпауллон | 14 | 1,66 | 23 | 1,32 | 53 | 1,03 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | B - 4 | Транскрипционный фактор NF-кB | BAY 11-7082 | 123 | 0,83 | 79 | 0,96 | 54 | 1,03 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 4 | Негативный контроль для ингибиторов тирозинкиназы. | Тирфостин 1 | 131 | 0,66 | 49 | 1,12 | 55 | 1,02 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 12 | Негативный контроль для генистеина | Даидзеин | 62 | 1,23 | 19 | 1,41 | 56 | 1,01 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 10 | Протеинкиназа C | Сфингозин | 72 | 1,20 | 25 | 1,30 | 57 | 1,00 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 8 | p58 киназа PITSLRE бета 1 | 2-аминопурин | 111 | 0,93 | 60 | 1,04 | 58 | 1,00 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 3 | Flk1 | SU1498 | 68 | 1,21 | 59 | 1,04 | 59 | 0,99 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | B - 10 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | RG-14620 | 114 | 0,89 | 17 | 1,44 | 60 | 0,97 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | H - 11 | TPL2 | Ингибитор Tpl2-киназы | 99 | 0,99 | 76 | 0,97 | 61 | 0,96 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 8 | c-Jun-N-терминальная киназа | SP 600125 | 31 | 1,38 | 89 | 0,91 | 62 | 0,95 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | G - 11 | p38 | SB 202190 | 50 | 1,30 | 38 | 1,20 | 63 | 0,94 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 3 | Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | AG-370 | 70 | 1,21 | 70 | 0,98 | 64 | 0,94 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 8 | Киназа cRAF | GW 5074 | 39 | 1,35 | 111 | 0,77 | 65 | 0,94 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 6 | Фосфоинозитид-3-киназа | Вортманнин | 9 | 1,80 | 50 | 1,10 | 66 | 0,93 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | D - 2 | RhoA-активируемая киназа | Ингибитор RhoA-активируемой киназы, Y-27632 | 122 | 0,83 | 14 | 1,46 | 67 | 0,93 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 2 | Киназа IRAK | AG-126 | 18 | 1,53 | 85 | 0,93 | 68 | 0,92 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 5 | Тирозинкиназы | Тирфостин AG 1288 | 104 | 0,98 | 34 | 1,22 | 69 | 0,91 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | F - 7 | MEK | MEK-ингибитор I | 126 | 0,74 | 102 | 0,85 | 70 | 0,91 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | H - 10 | Циклин-зависимая киназа 1/2/4 | SU9516 | 89 | 1,09 | 132 | 0,54 | 71 | 0,91 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 9 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета, циклин-зависимая киназа 5 | Индирубин | 115 | 0,88 | 124 | 0,66 | 72 | 0,91 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | A - 4 | ATM/ATR | Ингибитор ATM/ATR-киназы | 82 | 1,14 | 43 | 1,15 | 73 | 0,89 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | G - 2 | p38 | Ингибитор III MAP-киназы p38 | 22 | 1,51 | 18 | 1,43 | 74 | 0,89 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | G - 9 | Протеинкиназа A | H-89, дигидрохлорид | 57 | 1,26 | 24 | 1,31 | 75 | 0,89 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | D - 6 | Киназа гликогенсинтазы 3 | GSK-3b-ингибитор I | 96 | 1,03 | 75 | 0,97 | 76 | 0,89 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | G - 3 | p38 | Ингибитор MAP-киназы p38 | 53 | 1,28 | 94 | 0,89 | 77 | 0,88 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 11 | Негативный контроль для оломуцина. | изооломоуцин | 34 | 1,38 | 22 | 1,37 | 78 | 0,88 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 9 | Циклин-зависимая киназа | N9-изопропилоломоуцин | 73 | 1,19 | 93 | 0,89 | 79 | 0,87 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 12 | Циклин-зависимая киназа | Росковитин | 52 | 1,28 | 108 | 0,79 | 80 | 0,86 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | H - 3 | Протеинкиназа В | BML-257 | 33 | 1,38 | 51 | 1.09 | 81 | 0,86 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 11 | Тирозинкиназы | Генистеин | 27 | 1,44 | 11 | 1,56 | 82 | 0,85 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 3 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II | HDBAd) | 85 | 1,11 | 95 | 0,89 | 83 | 0,84 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | C - 11 | ERK | ERK-ингибитор III | 78 | 1,16 | 27 | 1,28 | 84 | 0,84 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 1 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | Тирфостин 46 | 66 | 1,22 | 21 | 1,40 | 85 | 0,84 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 2 | Киназа Брутона | LFM-A13 | 51 | 1,29 | 105 | 0,83 | 86 | 0,83 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | E - 3 | Киназа гликогенсинтазы | GSK-3-ингибитор XIII | 17 | 1,56 | 98 | 0,87 | 87 | 0,82 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | B - 7 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | AG-494 | 84 | 1,12 | 63 | 1,03 | 88 | 0,82 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 9 | Протеинкиназа C | Пальмитоил-DL-карнитин Cl | 92 | 1,06 | 74 | 0,97 | 89 | 0,82 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | H - 5 | Циклин-зависимая киназа 5/p25 | BML-259 | 41 | 1,34 | 77 | 0,96 | 90 | 0,80 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 10 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета | Индирубин-3'-моноксим | 86 | 1,10 | 53 | 1,08 | 91 | 0,80 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | D - 7 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета | Ингибитор II киназы гликогенсинтазы-3 бета | 109 | 0,94 | 81 | 0,94 | 92 | 0,77 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 6 | Креатинкиназа II | DRB | 49 | 1,31 | 84 | 0,93 | 93 | 0,76 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | C - 5 | CDC2 | Ингибитор Cdc2-подобной киназы, TG003 | 44 | 1,33 | 61 | 1,04 | 94 | 0,75 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | B - 2 | MEK | U-0126 | 75 | 1,17 | 8 | 1,73 | 95 | 0,74 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | D - 10 | Киназа гликогенсинтазы 3 | Ингибитор X киназы гликогенсинтазы 3 | 136 | 0,44 | 56 | 1,05 | 96 | 0,71 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 1 | Киназа JAK-2 | AG-490 | 60 | 1,24 | 71 | 0,98 | 97 | 0,70 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | B - 11 | Ингибитор III казеинкиназы II, TBCA | 69 | 1,21 | 36 | 1,21 | 98 | 0,70 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | H - 9 | STO-609 | 91 | 1,06 | 126 | 0,62 | 99 | 0,69 | |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 4 | Киназа JAK-3 | ZM 449829 | 59 | 1,24 | 83 | 0,94 | 100 | 0,68 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 11 | Тирозинкиназа селезенки | Пицеатаннол | 65 | 1,22 | 69 | 0,98 | 101 | 0,65 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | A - 5 | Алстерпауллон | 103 | 0,98 | 119 | 0,72 | 102 | 0,64 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | F - 6 | Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II | KN-93 | 108 | 0,94 | 113 | 0,76 | 103 | 0,61 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | F - 3 | c-Jun-N-терминальная киназа | Ингибитор VIII c-Jun-N-терминальной киназы | 42 | 1,34 | 46 | 1,12 | 104 | 0,60 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | D - 8 | Киназа гликогенсинтазы 3 | GSK-3b-ингибитор VIII | 77 | 1,17 | 103 | 0,85 | 105 | 0,60 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 2 | Фосфоинозитид-3-киназа | Кверцитина дигидрат | 21 | 1,51 | 128 | 0,59 | 106 | 0,59 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | E - 9 | Не является ингибитором JNK | JNK ингибитор, отрицательный контроль | 74 | 1,18 | 72 | 0,98 | 107 | 0,59 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | E - 4 | Изогранулатимид | 76 | 1,17 | 99 | 0,86 | 108 | 0,59 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | B - 3 | Индирубин-3′-моноксим | 97 | 1,02 | 118 | 0,72 | 109 | 0,57 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | B - 7 | Ингибитор Cdk1, CGP74514A | 119 | 0,86 | 123 | 0,67 | 110 | 0,55 | |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | B - 9 | Киназа рецептора фактора роста эпителия | Лавендустин A | 98 | 1,01 | 40 | 1,17 | 111 | 0,54 |
Ингибиторы киназ из банка INH | E - 5 | Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II | KN-93 | 113 | 0,90 | 86 | 0,93 | 112 | 0,54 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | D - 4 | Киназа рецептора фактора роста нервов | AG-879 | 102 | 0,99 | 112 | 0,77 | 113 | 0,53 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 1 | Киназа рецептора фактора роста эпителия | Эрбстатина аналог | 35 | 1,38 | 109 | 0,77 | 114 | 0,53 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | C - 3 | Cdk4-ингибитор II, NSC 625987 | 64 | 1,23 | 54 | 1,06 | 115 | 0,51 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | F - 5 | Кенпауллон | 124 | 0,80 | 106 | 0,82 | 116 | 0,46 | |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | F - 10 | Протеинкиназа С дельта | Роттлерин | 133 | 0,61 | 136 | 0,39 | 117 | 0,45 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | B - 5 | Циклин-зависимая киназа 1 | Богемин | 30 | 1,39 | 90 | 0,90 | 118 | 0,44 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 4 | Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II | KN-62 | 125 | 0,80 | 32 | 1,23 | 119 | 0,44 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 7 | Протеинкиназа C альфа, протеинкиназа С гамма | HBDDE | 88 | 1,09 | 134 | 0,48 | 120 | 0,43 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 7 | Киназа легких цепей миозина | ML-9 | 134 | 0,61 | 73 | 0,97 | 121 | 0,40 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | E - 10 | JNK-ингибитор V | 130 | 0,66 | 101 | 0,85 | 122 | 0,39 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | G - 6 | SB220025 | 95 | 1,03 | 130 | 0,55 | 123 | 0,36 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | A - 8 | Алоизин, RP106 | 80 | 1,15 | 91 | 0,89 | 124 | 0,35 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | E - 6 | IKK2 | IKK-2-ингибитор IV | 26 | 1,44 | 116 | 0,74 | 125 | 0,35 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | E - 6 | Киназа легких цепей миозина | ML-7 | 127 | 0,73 | 31 | 1,25 | 126 | 0,35 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | C - 8 | Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | Тирфостин 9 | 135 | 0,58 | 135 | 0,40 | 127 | 0,34 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | G - 5 | Сигнальный путь IkB-киназа | BAY 11-7082 | 128 | 0,71 | 127 | 0,60 | 128 | 0,34 |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | H - 2 | Сигнальный путь протеинкиназы В | Трицирибин | 13 | 1,68 | 129 | 0,57 | 129 | 0,34 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | C - 8 | Циклин-зависимая киназа 2 | Ингибитор III циклин-зависимой киназы 2 | 24 | 1,46 | 117 | 0,73 | 130 | 0,32 |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | G - 7 | Пурваланол A | 112 | 0,91 | 133 | 0,53 | 131 | 0,32 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | G - 5 | p38 | PD 169316 | 45 | 1,32 | 97 | 0,87 | 132 | 0,31 |
EMDII | D - 4 | ERK-ингибитор II, негативный контроль | 56 | 1,26 | 57 | 1,05 | 133 | 0,31 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | F - 10 | Ингибитор MNK1 | 81 | 1,15 | 42 | 1,16 | 134 | 0,31 | |
Ингибиторы киназ из банка EMDII | C - 9 | Ингибитор IV циклин-зависимой киназы 2, NU6140 | 129 | 0,70 | 68 | 0,99 | 135 | 0,29 | |
Ингибиторы киназ из банка BioMol | H - 8 | Мишень рапамицина в клетках млекопитающих | Рапамицин | 117 | 0,87 | 104 | 0,84 | 136 | 0,25 |
Таблица 4 | |||||||
Доза на стадии 3 | Доза на стадии 4 | Доза на стадии 3&4 | |||||
Метаболический путь мишени | ингибитор | Ранжирование | Коэффициент | Ранжирование | Коэффициент | Ранжирование | Коэффициент |
Семейство киназ Src | PP2 | 8 | 1,81 | 2 | 2,50 | 1 | 2,49 |
Фосфоинозитид-3-киназа | LY 294002 | 7 | 1,82 | 9 | 1,63 | 2 | 2,46 |
p38 митоген-активируемая протеинкиназа | SB-203580 | 3 | 2,23 | 7 | 1,88 | 3 | 2,34 |
p38 | SB 203580 | 19 | 1,53 | 52 | 1,08 | 4 | 2,22 |
p38 | SC-68376 | 29 | 1,41 | 121 | 0,69 | 5 | 2,12 |
Протеинкиназа A, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. | H-7 | 5 | 1,93 | 5 | 2,18 | 6 | 2,08 |
Не является ингибитором p38 | SB 202474, негативный контроль для p38 митоген-активируемой протеинкиназы | 116 | 0,88 | 62 | 1,03 | 7 | 2,02 |
(Циклин-зависимая киназа 1/2/5)(киназа гликогенсинтазы 3i) | Алоизин A, RP107 | 58 | 1,25 | 55 | 1,06 | 8 | 1,97 |
RhoA-активируемая киназа | гиалуронат 1077, фасудил | 47 | 1,32 | 20 | 1,40 | 9 | 1,93 |
p38 митоген-активируемая протеинкиназа | SB-202190 | 11 | 1,72 | 58 | 1,05 | 10 | 1,83 |
Кальций\кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II | KN-62 | 110 | 0,93 | 107 | 0,81 | 11 | 1,82 |
RhoA-активируемая киназа | Y-27632 | 120 | 0,84 | 1 | 2,67 | 12 | 1,78 |
Протеинкиназа A | H-89 | 2 | 2,57 | 4 | 2,23 | 13 | 1,75 |
Киназа рецептора фактора роста эпителия | Тирфостин AG 1478 | 15 | 1,62 | 10 | 1,57 | 14 | 1,74 |
ATM | Ингибитор ATM-киназы | 54 | 1,28 | 88 | 0,91 | 15 | 1,70 |
Семейство киназ Src | PP1 | 4 | 2,05 | 12 | 1,48 | 16 | 1,67 |
Протеинкиназа A, протеинкиназа G | HA-1004 | 6 | 1,82 | 3 | 2,30 | 17 | 1,63 |
Циклин-зависимая киназа 1/5 | Ингибитор циклин-зависимой киназы 1/5 | 83 | 1,12 | 100 | 0,85 | 18 | 1,61 |
Циклин-зависимая киназа 28 | Соединение 52 | 67 | 1,22 | 122 | 0,68 | 19 | 1,61 |
MEK1/2 | Ингибитор MEK1/2 | 94 | 1,03 | 110 | 0,77 | 20 | 1,60 |
Киназа рецептора фактора роста эпителия | BML-265 (аналог эрлотиниба) | 16 | 1,58 | 30 | 1,25 | 21 | 1,59 |
MEK1/2 | PD 98059 | 71 | 1,21 | 78 | 0,96 | 22 | 1,57 |
MK2a | Ингибитор MK2a | 107 | 0,95 | 80 | 0,95 | 23 | 1,54 |
p38 | SKF-86002 | 46 | 1,32 | 92 | 0,89 | 24 | 1,49 |
Протеинкиназа A, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. | H-9 | 1 | 2,62 | 6 | 1,97 | 26 | 1,36 |
PKA, PKG | HA-1077 | 12 | 1,69 | 35 | 1,21 | 28 | 1,30 |
Протеинкиназа A, протеинкиназа G | H-8 | 28 | 1,43 | 16 | 1,45 | 29 | 1,30 |
Циклин-зависимая киназа | Оломоуцин | 25 | 1,46 | 41 | 1,17 | 30 | 1,30 |
Киназа cRAF | ZM 336372 | 23 | 1,48 | 114 | 0,76 | 36 | 1,19 |
IKK2 | SC-514 | 20 | 1,52 | 64 | 1,01 | 39 | 1,13 |
Киназа рецептора фактора роста эпителия | Тирфостин 23 | 36 | 1,36 | 13 | 1,47 | 47 | 1,05 |
Киназа Брутона | Терреиновая кислота | 10 | 1,78 | 15 | 1,46 | 48 | 1,05 |
Киназа гликогенсинтазы 3 бета | Кенпауллон | 14 | 1,66 | 23 | 1,32 | 53 | 1,03 |
Негативный контроль для генистеина. | Даидзеин | 62 | 1,23 | 19 | 1,41 | 56 | 1,01 |
Киназа рецептора фактора роста эпителия | RG-14620 | 114 | 0,89 | 17 | 1,44 | 60 | 0,97 |
Фосфоинозитид-3-киназа | Вортманнин | 9 | 1,80 | 50 | 1,10 | 66 | 0,93 |
RhoA-активируемая киназа | Ингибитор RhoA-активируемой киназы, Y-27632 | 122 | 0,83 | 14 | 1,46 | 67 | 0,93 |
ИЛ1-ассоцированная цитоплазматическая киназа | AG-126 | 18 | 1,53 | 85 | 0,93 | 68 | 0,92 |
p38 | Ингибитор III MAP-киназы p38 | 22 | 1,51 | 18 | 1,43 | 74 | 0,89 |
Тирозинкиназы | Генистеин | 27 | 1,44 | 11 | 1,56 | 82 | 0,85 |
Киназа рецептора фактора роста эпителия, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | Тирфостин 46 | 66 | 1,22 | 21 | 1,40 | 85 | 0,84 |
Киназа гликогенсинтазы | Ингибитор XIII гликогенсинтазы 3 | 17 | 1,56 | 98 | 0,87 | 87 | 0,82 |
MEK | U-0126 | 75 | 1,17 | 8 | 1,73 | 95 | 0,74 |
Фосфоинозитид-3-киназа | Дегидратированный кверцитин | 21 | 1,51 | 128 | 0,59 | 106 | 0,59 |
IKK2 | IKK-2-ингибитор IV | 26 | 1,44 | 116 | 0,74 | 125 | 0,35 |
Сигнальный путь протеинкиназы В | Трицирибин | 13 | 1,68 | 129 | 0,57 | 129 | 0,34 |
Циклин-зависимая протеинкиназа 2 | Ингибитор III циклин-зависимой протеинкиназы 2 | 24 | 1,46 | 117 | 0,73 | 130 | 0,32 |
Таблица 5 | |||||||
NKX6.1 Интенсивность | NGN3 Интенсивность | ||||||
Лунка | Активность мишени | Вещество | Общая интенсивность ядер | Коэффициент | Ранжирование | Коэффициент | Ранжирование |
B - 5 | Протеинкиназа А, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа С. | H-9 | 1,00 | 7,36 | 1 | 2,24 | 1 |
D - 8 | Протеинкиназа C | Гиперицин | 1,07 | 2,15 | 18 | 2,22 | 2 |
D - 5 | PI 3-K | LY 294002 | 1,08 | 6,84 | 2 | 2,18 | 3 |
D - 11 | Протеинкиназа A | H-89 | 1,09 | 5,39 | 3 | 2,13 | 4 |
F - 4 | Семейство Src | PP2 | 1,01 | 4,07 | 7 | 2,09 | 5 |
B - 3 | p38 митоген-активируемая протеинкиназа | SB-203580 | 1,07 | 5,05 | 4 | 1,95 | 6 |
C - 6 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Тирфостин AG 1478 | 1,10 | 2,41 | 14 | 1,89 | 7 |
F - 8 | Киназа cRAF | GW 5074 | 1,06 | 3,48 | 10 | 1,78 | 8 |
D - 6 | Фосфоинозитид-3-киназа | Вортманнин | 1,10 | 3,87 | 9 | 1,67 | 9 |
E - 1 | Протеинкиназа А, протеинкиназа G | HA-1004 | 1,08 | 3,88 | 8 | 1,55 | 10 |
D - 7 | Протеинкиназа C | GF 109203X | 1,05 | 4,54 | 6 | 1,53 | 11 |
C - 12 | Семейство киназ Src | PP1 | 0,99 | 1,90 | 22 | 1,43 | 12 |
F - 3 | p38 митоген-активируемая протеинкиназа | SB-202190 | 1,08 | 1,90 | 23 | 1,40 | 13 |
G - 11 | RhoA-активируемая киназа | Y-27632 | 1,08 | 1,31 | 40 | 1,40 | 14 |
G - 12 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета | Кенпауллон | 0,99 | 3,18 | 11 | 1,32 | 15 |
C - 9 | Киназа инсулинового рецептора | Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора | 1,01 | 2,31 | 15 | 1,32 | 16 |
B - 4 | Протеинкиназа A, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. | H-7 | 1,02 | 1,99 | 21 | 1,26 | 17 |
B - 7 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | AG-494 | 1,10 | 1,57 | 30 | 1,26 | 18 |
C - 7 | Тирозинкиназы | Тирфостин AG 1295 | 1,08 | 1,43 | 36 | 1,26 | 19 |
H - 7 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | BML-265 (аналог эрлотиниба) | 1,06 | 2,15 | 17 | 1,25 | 20 |
B - 12 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Тирфостин 25 | 1,02 | 4,68 | 5 | 1,24 | 21 |
E - 2 | Протеинкиназа A, протеинкиназа G | HA-1077 | 1,02 | 1,46 | 34 | 1,20 | 22 |
F - 7 | Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | AG-1296 | 1,09 | 1,74 | 25 | 1,18 | 23 |
E - 9 | Циклин-зависимая киназа | N9-изопропилоломоуцин | 1,05 | 1,42 | 37 | 1,18 | 24 |
B - 11 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Тирфостин 23 | 1,03 | 1,43 | 35 | 1,17 | 25 |
D - 12 | Протеинкиназа А, протеинкиназа G | H-8 | 0,99 | 1,21 | 45 | 1,16 | 26 |
C - 5 | Тирозинкиназы | Тирфостин AG 1288 | 1,04 | 1,63 | 27 | 1,15 | 27 |
E - 11 | Негативный контроль для оломуцина. | изооломоуцин | 1,04 | 1,51 | 31 | 1,14 | 28 |
F - 6 | Flk1 | SU 4312 | 1,07 | 1,01 | 55 | 1,12 | 29 |
C - 11 | Тирозинкиназа селезенки | Пицеатаннол | 1,07 | 1,32 | 39 | 1,10 | 30 |
G - 8 | c-Jun-N-терминальная киназа | SP 600125 | 1,04 | 1,67 | 26 | 1,09 | 31 |
H - 11 | ДМСО | 1,03 | 1,04 | 53 | 1,09 | 32 | |
E - 5 | Кальций/ кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II | KN-93 | 1,04 | 1,10 | 51 | 1,03 | 33 |
E - 12 | Циклин-зависимая киназа | Росковитин | 1,03 | 0,67 | 75 | 1,03 | 34 |
F - 11 | Тирозинкиназы | Генистеин | 1,03 | 1,10 | 52 | 1,02 | 35 |
B - 8 | HER1-2 | AG-825 | 1,05 | 1,12 | 50 | 1,00 | 36 |
B - 10 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | RG-14620 | 1,02 | 1,26 | 41 | 1,00 | 37 |
F - 9 | Протеинкиназа C | Пальмитоил-DL-карнитин Cl | 1,05 | 1,19 | 47 | 0,99 | 38 |
E - 10 | Циклин-зависимая протеинкиназа | Оломоуцин | 1,04 | 1,22 | 44 | 0,99 | 39 |
D - 10 | Протеинкиназа C | Сфингозин | 1,04 | 1,62 | 28 | 0,99 | 40 |
G - 6 | Креатинкиназа II | DRB | 1,01 | 1,50 | 32 | 0,98 | 41 |
C - 3 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Тирфостин 51 | 1,04 | 1,46 | 33 | 0,97 | 42 |
F - 2 | Киназа Брутона | LFM-A13 | 0,97 | 1,82 | 24 | 0,96 | 43 |
E - 8 | Киназа p58 PITSLRE бета 1 | 2-аминопурин | 1,07 | 0,93 | 61 | 0,93 | 44 |
B - 9 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Лавендустин A | 1,02 | 0,98 | 57 | 0,92 | 45 |
G - 7 | Протеинкиназа C альфа, Протеинкиназа C гамма | Селективный ингибитор протеинкиназы С | 1,07 | 0,92 | 63 | 0,91 | 46 |
D - 2 | ИЛ1-ассоцированная цитоплазматическая киназа | AG-126 | 0,99 | 1,21 | 46 | 0,86 | 47 |
H - 12 | ДМСО | 1,02 | 0,75 | 69 | 0,86 | 48 | |
H - 6 | Креатинкиназа-II | Апигенин | 1,05 | 0,77 | 68 | 0,84 | 49 |
F - 5 | Киназа cRAF | ZM 336372 | 1,06 | 1,36 | 38 | 0,83 | 50 |
F - 12 | Негативный контроль для генистеина. | Даидзеин | 1,03 | 0,92 | 62 | 0,83 | 51 |
C - 1 | Киназа рецептора фактора роста эпимермиса, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | Тирфостин 46 | 1,05 | 2,54 | 13 | 0,82 | 52 |
H - 9 | ДМСО | 1,03 | 0,95 | 60 | 0,81 | 53 | |
B - 1 | MEK | PD-98059 | 0,92 | 2,02 | 20 | 0,81 | 54 |
H - 1 | Киназа Брутона | Терреиновая кислота | 1,02 | 1,24 | 42 | 0,81 | 55 |
H - 5 | Циклин-зависимая киназа 5/p25 | BML-259 | 1,04 | 0,83 | 67 | 0,80 | 56 |
C - 2 | Киназа рецептора фактора роста эпимермиса | Тирфостин 47 | 1,00 | 1,13 | 49 | 0,79 | 57 |
H - 2 | Сигнальный путь протеинкиназы В | Трицирибин | 0,73 | 2,06 | 19 | 0,78 | 58 |
D - 3 | Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | AG-370 | 1,01 | 1,15 | 48 | 0,77 | 59 |
G - 10 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета | Индирубин-3'-моноксим | 0,96 | 0,92 | 64 | 0,74 | 60 |
C - 4 | Негативный контроль для ингибиторов тирозинкиназы. | Тирфостин 1 | 1,00 | 0,95 | 59 | 0,73 | 61 |
G - 4 | Киназа JAK-3 | ZM 449829 | 1,01 | 1,23 | 43 | 0,73 | 62 |
D - 1 | Киназа JAK-2 | AG-490 | 1,04 | 2,26 | 16 | 0,72 | 63 |
D - 4 | Киназа рецептора фактора роста нервов | AG-879 | 1,03 | 0,39 | 80 | 0,72 | 64 |
G - 2 | Фосфоинозитид-3-киназа | Кверцитина дигидрат | 0,97 | 1,03 | 54 | 0,71 | 65 |
G - 5 | Сигнальный путь IkB-киназы | BAY 11-7082 | 0,93 | 1,00 | 56 | 0,68 | 66 |
H - 10 | ДМСО | 0,99 | 0,88 | 65 | 0,67 | 67 | |
G - 9 | Киназа гликогенсинтазы-3 бета, циклин-зависимая киназа 5 | Индирубин | 1,01 | 0,59 | 77 | 0,66 | 68 |
E - 6 | Киназа легких цепей миозина | ML-7 | 0,98 | 2,84 | 12 | 0,65 | 69 |
B - 2 | MEK | U-0126 | 0,87 | 0,68 | 73 | 0,65 | 70 |
G - 3 | Flk1 | SU1498 | 1,01 | 0,70 | 72 | 0,65 | 71 |
E - 3 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, кальций/ кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II |
HDBA | 0,99 | 0,88 | 66 | 0,64 | 72 |
H - 4 | IkB-киназа 2 | SC-514 | 0,95 | 0,71 | 71 | 0,62 | 73 |
E - 7 | Киназа легких цепей миозина | ML-9 | 1,06 | 1,60 | 29 | 0,59 | 74 |
F - 10 | Протеинкиназа C дельта | Роттлерин | 0,24 | 0,96 | 58 | 0,56 | 75 |
E - 4 | Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II | KN-62 | 0,96 | 0,71 | 70 | 0,56 | 76 |
H - 3 | Протеинкиназа В | BML-257 | 0,98 | 0,68 | 74 | 0,55 | 77 |
H - 8 | Мишень рапамицина в клетках млекопитающих | Рапамицин | 0,47 | 0,65 | 76 | 0,39 | 78 |
C - 10 | Ингибитор протеинкиназы C | PKC-412 (протеинкиназа С) | 0,17 | 0,45 | 79 | 0,39 | 79 |
G - 1 | Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Эрбстатина аналог | 0,82 | 0,38 | 81 | 0,34 | 80 |
D - 9 | Протеинкиназа C | Ro 31-8220 | 0,09 | 0,48 | 78 | 0,30 | 81 |
B - 6 | Неспецифично | Стауроспорин | 0,13 | 0,17 | 83 | 0,30 | 82 |
C - 8 | Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов | Тирфостин 9 | 0,28 | 0,29 | 82 | 0,29 | 83 |
F - 1 | Внеклеточно регулируемая киназа 2, аденозин-киназа, креатинкиназа 1, креатинкиназа 2, | 5-йодотуберцидин | 0,08 | 0,13 | 84 | 0,27 | 84 |
Таблица 6 | ||
Ранжирование | NKX6.1 Ранжирование | NGN3 Ранжирование |
1 | H-9 | H-9 |
2 | LY 294002 | Гиперицин |
3 | H-89 | LY 294002 |
4 | SB-203580 | H-89 |
5 | Тирфостин 25 | PP2 |
6 | GF 109203X | SB-203580 |
7 | PP2 | Тирфостин AG 1478 |
8 | HA-1004 | GW 5074 |
9 | Вортманнин | Вортманнин |
10 | GW 5074 | HA-1004 |
11 | Кенпауллон | GF 109203X |
12 | ML-7 | PP1 |
13 | Тирфостин 46 | SB-202190 |
14 | Тирфостин AG 1478 | Y-27632 |
15 | Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора (HNMPA) | Кенпауллон |
16 | AG-490 | Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора (HNMPA) |
Таблица 7 | |
Сигнальный путь | Соединения |
Протеинкиназа C/ протеинкиназа A/ протеинкиназа G | H-9, гиперицин, H-89, GF 109203X, HA-1004 |
Киназы Src | PP2, PP1 |
Фосфоинозитид-3-киназа | LY 294002, Вортманнин |
p38 митоген-активируемая протеинкиназа | SB-203580, SB-202190 |
Киназа рецептора фактора роста эпидермиса | Тирфостин 25, тирфостин AG1478, тирфостин 46 |
Киназа cRAF | GW 5074 |
Киназа гликогенсинтазы 3 бета | Кенпауллон |
Киназа инсулиноавого рецептора | Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора (HNMPA) |
Киназа JAK2 | AG490 |
RhoA-активируемая киназа | Y27632 |
Киназа легких цепей миозина | ML-7 |
Таблица 8 | ||||||
Общая сегментация ядер | NKX6.1 | NGN3 | ||||
Планшет | Обработка [концентрация] | Коэффициент | Коэффициент количества клеток | Коэффициент интенсивности | Коэффициент количества клеток | Коэффициент интенсивности |
Планшет 1 | PD-98059 [2,5 мкмоль] | 0,96 | 2,08 | 2,37 | 2,21 | 2,41 |
Планшет 1 | SB-203580 [2,5 мкмоль] | 1,05 | 2,93 | 2,58 | 5,26 | 4,74 |
Планшет 1 | H-7 [2,5 мкмоль] | 1,09 | 2,02 | 1,88 | 2,75 | 2,44 |
Планшет 1 | H-9 [2,5 мкмоль] | 1,13 | 1,93 | 1,76 | 2,85 | 2,47 |
Планшет 1 | AG-490 [2,5 мкмоль] | 0,99 | 3,78 | 4,20 | 2,48 | 2,35 |
Планшет 1 | LY 294002 [2,5 мкмоль] | 1,03 | 6,54 | 6,60 | 4,93 | 4,43 |
Планшет 1 | GF109203X [2,5 мкмоль] | 0,82 | 5,20 | 3,57 | 4,17 | 3,33 |
Планшет 1 | H-89 [2,5 мкмоль] | 1,08 | 2,41 | 2,30 | 4,00 | 3,74 |
Планшет 1 | KN-62 [1мкмоль] | 1,02 | 0,69 | 0,61 | 0,81 | 0,77 |
Планшет 1 | KN-93 [1 мкмоль] | 1,05 | 0,59 | 0,55 | 0,84 | 0,79 |
Планшет 1 | Контрольная группа | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
Планшет 2 | HA-1004 [2,5 мкмоль] | 1,08 | 2,83 | 2,66 | 2,77 | 2,49 |
Планшет 2 | HA-1077[2,5 мкмоль] | 1,07 | 1,48 | 1,31 | 2,57 | 2,27 |
Планшет 2 | SB-202190 [2,5 мкмоль] | 1,08 | 2,12 | 1,90 | 4,53 | 3,91 |
Планшет 2 | PP2 [2,5 мкмоль] | 1,04 | 2,06 | 1,71 | 6,21 | 6,12 |
Планшет 2 | GW 5074 [2,5 мкмоль] | 1,11 | 2,77 | 2,32 | 3,15 | 2,79 |
Планшет 2 | Кенпаулон [2,5 мкмоль] | 1,02 | 0,53 | 0,45 | 1,52 | 1,40 |
Планшет 2 | BML-259 [2,5 мкмоль] | 0,99 | 1,08 | 1,02 | 1,21 | 1,23 |
Планшет 2 | BML-265 [2,5 мкмоль] | 0,97 | 6,12 | 6,34 | 4,50 | 4,65 |
Планшет 2 | KN-62 [1 мкмоль] | 1,03 | 0,71 | 0,67 | 0,72 | 0,71 |
Планшет 2 | KN-93 [1 мкмоль] | 1,04 | 0,75 | 0,76 | 0,93 | 0,93 |
Планшет 2 | Контрольная группа | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
Публикации, цитируемые в настоящем документе, в силу ссылки на них полностью включаются в настоящий документ. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.
Claims (14)
1. Способ увеличения экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, включающий:
а) дифференцировку клеток линии дефинитивной эндодермы в клетки линии панкреатической эндодермы путем обработки клеток линии дефинитивной эндодермы соединением, выбранным из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, SB-203580, SB-202190, Тирфостина 25, Тирфостина AG1478, Тирфостина 46, GW 5074, гидрокси-2-нафталенилметилфосфоновой кислоты, AG490, Y-27632 и ML-7, и
b) дифференцировку клеток линии панкреатической эндодермы в клетки эндокринной линии поджелудочной железы путем обработки клеток линии панкреатической эндодермы посредством Noggin, где указанный способ увеличивает экспрессию NGN3 и NKX6.1 по сравнению с клетками, которые не обработаны указанным соединением,
где клетки линии дефинитивной эндодермы получают из стабильных линий Н1, Н7 или Н9 эмбриональных стволовых клеток человека, или
где клетки линии дефинитивной эндодермы получают из неэмбриональных плюрипотентных стволовых клеток человека, которые экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 или Tra 1-81.
2. Способ по п. 1, где стадия b) включает обработку клеток линии панкреатической эндодермы посредством Noggin и соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, SB-203580, SB-202190, Тирфостина 25, Тирфостина AG1478, Тирфостина 46 и GW 5074.
3. Способ по п. 1 или 2, где стадия а), стадия b) или и стадия а), и стадия b) включают обработку клеток H-9, H-89, GF 109203X или HA-1004.
4. Способ по п. 1 или 2, где стадия а), стадия b) или и стадия а), и стадия b) включают обработку клеток PP2 и PP1.
5. Способ по п. 1 или 2, где стадия а), стадия b) или и стадия а), и стадия b) включают обработку клеток SB-203580 и SB-202190.
6. Способ по п. 1 или 2, где стадия а), стадия b) или и стадия а), и стадия b) включают обработку клеток Тирфостином 25, Тирфостином AG1478 или Тирфостином 46.
7. Способ по п. 1 или 2, где стадия а), стадия b) или и стадия а), и стадия b) включают обработку клеток GW 5074.
8. Способ по п. 1 или 2, где стадия а), стадия b) или и стадия а), и стадия b) включают обработку клеток гидрокси-2-нафталенилметилфосфоновой кислотой, AG 490, Y-2763 или ML-7.
9. Способ по п. 1, где клетки линии дефинитивной эндодермы экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобокс белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2.
10. Способ по п. 1 или 2, где стадия а) и стадия b) включают обработку клеток в среде для культивирования клеток, выбранной из модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM), нокаутной модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (KO DMEM), базовой среды Хэма F12/50% DMEM, среды DMEM с высоким содержанием глюкозы или среды RPMI-1640.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US28969209P | 2009-12-23 | 2009-12-23 | |
US61/289,692 | 2009-12-23 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012130940/10A Division RU2586506C2 (ru) | 2009-12-23 | 2010-12-16 | Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2664864C1 true RU2664864C1 (ru) | 2018-08-23 |
Family
ID=44151663
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016116258A RU2664864C1 (ru) | 2009-12-23 | 2010-12-16 | Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы |
RU2012130940/10A RU2586506C2 (ru) | 2009-12-23 | 2010-12-16 | Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012130940/10A RU2586506C2 (ru) | 2009-12-23 | 2010-12-16 | Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9133439B2 (ru) |
EP (1) | EP2516626B1 (ru) |
JP (1) | JP5882226B2 (ru) |
KR (3) | KR101764404B1 (ru) |
CN (1) | CN102712902B (ru) |
AU (1) | AU2010333840B2 (ru) |
BR (1) | BR112012015727A2 (ru) |
CA (1) | CA2784425A1 (ru) |
ES (1) | ES2633648T3 (ru) |
MX (1) | MX339669B (ru) |
PL (1) | PL2516626T3 (ru) |
RU (2) | RU2664864C1 (ru) |
SG (2) | SG181822A1 (ru) |
WO (1) | WO2011079018A2 (ru) |
ZA (1) | ZA201205488B (ru) |
Families Citing this family (50)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
CN101952415B (zh) | 2007-07-31 | 2017-06-27 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
CN102046779A (zh) | 2008-02-21 | 2011-05-04 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物 |
MX2011000125A (es) | 2008-06-30 | 2011-02-25 | Centocor Ortho Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre pluripotentes. |
CN102257132B (zh) | 2008-11-20 | 2014-09-03 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 用于在平面基底上进行细胞附着和培养的方法和组合物 |
MX2011005288A (es) | 2008-11-20 | 2011-06-01 | Centocor Ortho Biotech Inc | Celulas madre pluripotentes en microportadores. |
WO2011011300A2 (en) | 2009-07-20 | 2011-01-27 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9150833B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
JP6013196B2 (ja) | 2010-03-01 | 2016-10-25 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法 |
WO2011140441A2 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation |
MX355340B (es) | 2010-08-31 | 2018-04-16 | Janssen Biotech Inc | Diferenciación de células madre embrionarias humanas. |
CN103890167A (zh) | 2011-06-21 | 2014-06-25 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 自多潜能干细胞有效诱导定形内胚层 |
BR112014015417A8 (pt) | 2011-12-22 | 2017-07-04 | Janssen Biotech Inc | diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células positivas de insulina hormonal únicas |
DK3450542T3 (da) | 2012-06-08 | 2021-11-01 | Janssen Biotech Inc | Differentiering af humane embryonale stamceller til endokrine pancreatiske celler |
JP6470687B2 (ja) | 2012-09-03 | 2019-02-13 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 |
USD933584S1 (en) | 2012-11-08 | 2021-10-19 | Sunpower Corporation | Solar panel |
USD1009775S1 (en) | 2014-10-15 | 2024-01-02 | Maxeon Solar Pte. Ltd. | Solar panel |
CN105189737B (zh) * | 2012-11-28 | 2019-02-12 | 康宁股份有限公司 | 用于增强肝细胞功能的细胞培养基 |
US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
MX2015008578A (es) | 2012-12-31 | 2015-09-07 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9. |
SG11201505128SA (en) | 2012-12-31 | 2015-07-30 | Janssen Biotech Inc | Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells |
CN105705634A (zh) | 2012-12-31 | 2016-06-22 | 詹森生物科技公司 | 用于分化成胰腺内分泌细胞的人多能细胞的悬浮和群集 |
US8859286B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-14 | Viacyte, Inc. | In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells |
WO2014144125A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Broad Institute, Inc. | Compounds for inducing proliferation and differentiation of cells, and methods of use thereof |
CA2949056A1 (en) * | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Janssen Biotech, Inc. | Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells |
JP6687544B2 (ja) | 2014-05-28 | 2020-04-22 | チルドレンズ ホスピタル メディカル センター | 前駆細胞を指向性分化によって胃組織に変換するための方法及びシステム |
USD896747S1 (en) | 2014-10-15 | 2020-09-22 | Sunpower Corporation | Solar panel |
USD999723S1 (en) | 2014-10-15 | 2023-09-26 | Sunpower Corporation | Solar panel |
USD933585S1 (en) | 2014-10-15 | 2021-10-19 | Sunpower Corporation | Solar panel |
USD913210S1 (en) | 2014-10-15 | 2021-03-16 | Sunpower Corporation | Solar panel |
WO2016061464A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Children's Hospital Center, D/B/A Cincinnati Children's Hospital Medical Center | In vivo model of human small intetine using pluripotent stem cells and methods of making and using same |
EP3239293A4 (en) | 2014-12-24 | 2018-08-08 | Kyoto University | Endodermal cell production method, liver cell production method, pancreatic cell production method, endodermal cell induction promoter, liver cell induction promoting kit, pancreatic cell induction promoting kit, and micro fluid device |
MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
CN109415685B (zh) | 2016-05-05 | 2023-07-04 | 儿童医院医疗中心 | 用于体外制造胃底组织的方法和与其相关的组合物 |
CN110062764B (zh) | 2016-12-05 | 2024-07-02 | 儿童医院医学中心 | 结肠类器官及其制备和使用方法 |
US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
US10391156B2 (en) | 2017-07-12 | 2019-08-27 | Viacyte, Inc. | University donor cells and related methods |
KR102244910B1 (ko) | 2018-03-16 | 2021-04-26 | 주식회사 엘지화학 | 세리아-탄소-황 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 양극 및 리튬-황 전지 |
WO2019236949A1 (en) * | 2018-06-08 | 2019-12-12 | Avexis Inc. | Cell-based assay for measuring drug product potency |
US10724052B2 (en) | 2018-09-07 | 2020-07-28 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
CA3139591C (en) | 2019-05-31 | 2024-01-16 | Timothy M. BRUHN | A biocompatible membrane composite |
CA3139292A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | Timothy M. BRUHN | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
JP2022535239A (ja) | 2019-05-31 | 2022-08-05 | ダブリュ.エル.ゴア アンド アソシエイツ,インコーポレイティド | 生体適合性メンブレン複合体 |
US20220370184A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-11-24 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
US11118195B2 (en) | 2019-09-05 | 2021-09-14 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
EP4025224A1 (en) | 2019-09-05 | 2022-07-13 | CRISPR Therapeutics AG | Universal donor cells |
CN111057677B (zh) * | 2019-12-27 | 2021-08-03 | 浙江大学 | 一种软骨祖细胞培养基及其制备方法和应用 |
AU2021414405A1 (en) | 2020-12-31 | 2023-08-10 | Crispr Therapeutics Ag | Universal donor cells |
CN116457457B (zh) * | 2021-04-28 | 2024-03-01 | 山东大学 | 改善早期胚胎发育的方法 |
CN113234664B (zh) * | 2021-05-11 | 2024-05-10 | 澳门大学 | 一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3935067A (en) * | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
SU1767433A1 (ru) * | 1989-11-27 | 1992-10-07 | Пермский государственный медицинский институт | Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа |
US7534608B2 (en) * | 2006-07-26 | 2009-05-19 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
US20090280096A1 (en) * | 2008-05-09 | 2009-11-12 | Atsushi Kubo | Pancreatic endocrine progenitor cells derived from pluripotent stem cells |
Family Cites Families (184)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
US5089396A (en) | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5215893A (en) | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5863531A (en) | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
US5804178A (en) | 1986-11-20 | 1998-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue |
US5567612A (en) | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
CA1340581C (en) | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
DK0628639T3 (da) | 1991-04-25 | 2000-01-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Rekonstitueret humant antistof mod human interleukin-6-receptor |
US5449383A (en) | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
US5523226A (en) | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
GB9310557D0 (en) | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
TW257671B (ru) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
US6703017B1 (en) | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
JP4079461B2 (ja) | 1994-12-29 | 2008-04-23 | 中外製薬株式会社 | Il−6アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤 |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5718922A (en) | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
PL191111B1 (pl) | 1997-04-24 | 2006-03-31 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Podstawione imidazole, sposób ich wytwarzania, kompozycje zawierające podstawione imidazole oraz ich zastosowanie |
ATE358493T1 (de) | 1997-07-03 | 2007-04-15 | Osiris Therapeutics Inc | Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
US6521427B1 (en) | 1997-09-16 | 2003-02-18 | Egea Biosciences, Inc. | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
AU1197699A (en) | 1997-10-23 | 1999-05-10 | Geron Corporation | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells |
US6372779B1 (en) | 1997-12-29 | 2002-04-16 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Anti-inflammatory compounds |
AU755888B2 (en) | 1998-03-18 | 2003-01-02 | Mesoblast International Sarl | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
MY132496A (en) | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
US6413773B1 (en) * | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
US6413556B1 (en) | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
US6458593B1 (en) | 1999-01-21 | 2002-10-01 | Vitro Diagnostics, Inc. | Immortalized cell lines and methods of making the same |
US6815203B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
US6306424B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
US6685936B2 (en) | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
AU778155B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-11-18 | Scripps Research Institute, The | Markers for identification and isolation of pancreatic islet alpha and beta cell progenitors |
US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
EP2295539A1 (en) | 2000-06-26 | 2011-03-16 | Nc Medical Research Inc. | Cell fractions containing cells capable of differentiating into neural cells |
CN100525768C (zh) | 2000-10-23 | 2009-08-12 | 史密丝克莱恩比彻姆公司 | 新化合物 |
MXPA03005139A (es) | 2000-12-08 | 2004-01-29 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Compuestos macroheterociclicos utiles como inhibidores de cinasa. |
RU2003117078A (ru) | 2000-12-08 | 2004-12-10 | Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. (Us) | Индазолил-замещенные соединения пирролина в качестве ингибиторов киназы |
US6599323B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
CA2435826A1 (en) | 2001-01-24 | 2002-08-01 | The Government Of The United States Of America | Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells |
PT3078667T (pt) | 2001-01-25 | 2018-12-28 | The United States Of America Represented By The Sec Dep Of Health And Human Services | Formulação de compostos de ácido borónico |
US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
WO2002086107A2 (en) | 2001-04-19 | 2002-10-31 | DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung | A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells |
JP4296781B2 (ja) | 2001-04-24 | 2009-07-15 | 味の素株式会社 | 幹細胞及びその分離方法 |
EP1393066A4 (en) | 2001-05-15 | 2006-01-25 | Rappaport Family Inst For Res | INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS |
US6626950B2 (en) | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
GB0117583D0 (en) | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
CA2456981C (en) | 2001-08-06 | 2012-02-28 | Bresagen, Inc. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
US6617152B2 (en) | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
US20030138951A1 (en) | 2001-10-18 | 2003-07-24 | Li Yin | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
AU2002363659B2 (en) | 2001-11-15 | 2008-09-25 | Children's Medical Center Corporation | Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof |
US7033831B2 (en) | 2001-12-07 | 2006-04-25 | Geron Corporation | Islet cells from human embryonic stem cells |
EP2305276A3 (en) | 2001-12-07 | 2011-09-21 | Cytori Therapeutics, Inc. | Processed lipoaspirate cells for use in therapy |
AU2002218893A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-09 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
WO2003087349A1 (fr) | 2002-04-17 | 2003-10-23 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Methode de formation de cellules pancreatiques $g(b) a partir de cellules mesenchymales |
US20040161419A1 (en) | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
DE60319364T2 (de) | 2002-05-08 | 2009-02-19 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren |
US20060003446A1 (en) | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
JP2006512046A (ja) | 2002-05-28 | 2006-04-13 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | invitroにおけるヒト膵臓腺房細胞の増殖およびインスリン産生細胞への分化転換のための方法 |
EP1513830A1 (en) | 2002-06-05 | 2005-03-16 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Bisindolyl-maleimid derivatives as kinase inhibitors |
GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
US7838290B2 (en) | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
JP2005534345A (ja) | 2002-07-29 | 2005-11-17 | エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド | インスリン陽性、グルコース応答性細胞の分化のための多段階方法 |
WO2004016747A2 (en) | 2002-08-14 | 2004-02-26 | University Of Florida | Bone marrow cell differentiation |
AU2003268534A1 (en) | 2002-09-06 | 2004-03-29 | Amcyte Inc. | Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells |
US9969977B2 (en) | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
US20060252150A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-11-09 | Linzhao Cheng | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
AU2003302702B2 (en) | 2002-12-05 | 2008-08-07 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Cultured human pancreatic islets, and uses thereof |
KR101156745B1 (ko) | 2002-12-16 | 2012-06-15 | 테크니온 리서치 앤드 디벨롭먼트 파운데이션 리미티드 | 지지세포 비함유, 이종 비함유의 인간 배아줄기세포의 조제방법 및 이들을 사용하여 조제되는 줄기세포 배양물 |
RU2359671C2 (ru) * | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
US20070155661A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
WO2005045001A2 (en) | 2003-02-14 | 2005-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
CA2520861A1 (en) | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
US20060194315A1 (en) | 2003-03-31 | 2006-08-31 | Condie Brian G | Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
CA2530421C (en) | 2003-06-27 | 2015-04-21 | Ethicon, Incorporated | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
IL161903A0 (en) * | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
US20050042595A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Martin Haas | Banking of multipotent amniotic fetal stem cells |
US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
US20060205072A1 (en) | 2003-08-27 | 2006-09-14 | Nobuko Uchida | Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations |
WO2005058301A1 (en) | 2003-12-17 | 2005-06-30 | Allergan, Inc. | Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b |
US20060030042A1 (en) | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
CN103898045B (zh) | 2003-12-23 | 2019-02-01 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
TWI334443B (en) | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
US20050233446A1 (en) | 2003-12-31 | 2005-10-20 | Parsons Xuejun H | Defined media for stem cell culture |
US20080241107A1 (en) | 2004-01-23 | 2008-10-02 | Copland Iii John A | Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells |
US20070298453A1 (en) | 2004-02-12 | 2007-12-27 | University Of Newcastle Upon Tyne | Stem Cells |
AU2005221095A1 (en) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | John J. O'neil | Methods for generating insulin-producing cells |
CA2558486A1 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Alberto Hayek | Compositions and methods for growth of embryonic stem cells |
WO2005097977A2 (en) | 2004-04-01 | 2005-10-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage |
KR101278421B1 (ko) | 2004-04-27 | 2013-07-15 | 비아싸이트, 인크. | Pdx1 발현 내배엽 |
CA2573283C (en) | 2004-07-09 | 2023-03-14 | Cythera, Inc. | Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm |
JP5102030B2 (ja) | 2004-08-13 | 2012-12-19 | ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド | ヒト胚性幹細胞における自己再生および分化のための組成物および方法 |
US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
US7442548B2 (en) | 2004-09-08 | 2008-10-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Culturing human embryonic stem cells in medium containing pipecholic acid and gamma amino butyric acid |
KR101264940B1 (ko) | 2004-09-08 | 2013-05-15 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물 |
CA2613812A1 (en) * | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
WO2006094286A2 (en) | 2005-03-04 | 2006-09-08 | John O'neil | Adult pancreatic derived stromal cells |
GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
EP1876893B1 (en) | 2005-04-15 | 2012-04-11 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
WO2006114097A2 (en) | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Aarhus Universitet | Biosurface structure array |
BRPI0611733A2 (pt) | 2005-06-10 | 2010-09-28 | Irm Llc | compostos que mantêm pluripotência de células-tronco embriÈnicas |
WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
US20080199959A1 (en) | 2005-06-21 | 2008-08-21 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method For Cell Culture |
CA2611438C (en) | 2005-06-30 | 2014-01-07 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Cyclic anilino-pyridinotriazines |
US20090087907A1 (en) | 2005-07-29 | 2009-04-02 | Alice Pebay | Compositions and Methods for Growth of Pluripotent Cells |
US20080194021A1 (en) | 2005-07-29 | 2008-08-14 | Mays Robert W | Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells |
CN101341245A (zh) | 2005-09-02 | 2009-01-07 | 新加坡科技研究局 | 获取祖细胞系的方法 |
WO2007030870A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-22 | Es Cell International Pte Ltd | Cardiomyocyte production |
AU2006304318B2 (en) | 2005-10-14 | 2012-12-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype |
DK1957636T3 (en) | 2005-10-27 | 2018-10-01 | Viacyte Inc | PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FORTARM ENDODERM |
WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
DK2420565T3 (en) | 2006-02-23 | 2017-12-04 | Viacyte Inc | APPLICABLE COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTIVATING DIFFERENTIBLE CELLS |
US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
DK2650360T3 (da) | 2006-03-02 | 2019-10-07 | Viacyte Inc | Endokrine prekursorceller, pancreatiske hormon udtrykkende celler og fremgangsmåder til fremstilling |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
EP3527658B1 (en) | 2006-04-28 | 2024-07-24 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
GB2452186B (en) | 2006-05-02 | 2011-01-26 | Wisconsin Alumni Res Found | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
WO2007139929A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | The Burnham Institute For Medical Research | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
WO2007149182A2 (en) | 2006-06-19 | 2007-12-27 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
CA2656175C (en) | 2006-06-26 | 2018-08-28 | Lifescan, Inc. | Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture |
WO2008004990A2 (en) | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Es Cell International Pte Ltd | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
WO2008039521A2 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-03 | Nmt Medical, Inc. | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
US20100323442A1 (en) | 2006-10-17 | 2010-12-23 | Emmanuel Edward Baetge | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
US8835163B2 (en) | 2006-10-18 | 2014-09-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
WO2008086005A1 (en) | 2007-01-09 | 2008-07-17 | University Of South Florida | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
CA2676044C (en) | 2007-01-30 | 2019-10-22 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc) |
GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
US7839480B2 (en) * | 2007-04-25 | 2010-11-23 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. | Photomask haze reduction via ventilation |
MX2010000746A (es) | 2007-07-18 | 2010-07-05 | Lifescan Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
CN101952415B (zh) * | 2007-07-31 | 2017-06-27 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
CA2696622C (en) | 2007-08-24 | 2016-07-19 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Compositions for the treatment of neoplastic diseases |
CA2706560C (en) | 2007-11-27 | 2017-02-28 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells |
SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
EP2250252A2 (en) | 2008-02-11 | 2010-11-17 | Cambridge Enterprise Limited | Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained |
CN102046779A (zh) | 2008-02-21 | 2011-05-04 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物 |
JP2011514169A (ja) | 2008-03-17 | 2011-05-06 | エージェンシー フォー サイエンス,テクノロジー アンド リサーチ | 幹細胞培養のためのマイクロキャリア |
EP2727998B1 (en) | 2008-04-21 | 2019-06-12 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
US7939322B2 (en) * | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
MX2011000125A (es) | 2008-06-30 | 2011-02-25 | Centocor Ortho Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre pluripotentes. |
US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
PL2346988T3 (pl) | 2008-10-31 | 2017-10-31 | Janssen Biotech Inc | Różnicowanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych do linii endokrynnej trzustki |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
MX2012000898A (es) | 2009-07-20 | 2012-06-01 | Janssen Biotech Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
WO2011108993A1 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | National University Of Singapore | Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response |
-
2010
- 2010-12-16 JP JP2012546059A patent/JP5882226B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-16 SG SG2012045399A patent/SG181822A1/en unknown
- 2010-12-16 BR BR112012015727A patent/BR112012015727A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-12-16 KR KR1020127018933A patent/KR101764404B1/ko active IP Right Grant
- 2010-12-16 RU RU2016116258A patent/RU2664864C1/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-12-16 AU AU2010333840A patent/AU2010333840B2/en not_active Ceased
- 2010-12-16 CN CN201080059058.3A patent/CN102712902B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-16 EP EP10840006.0A patent/EP2516626B1/en not_active Not-in-force
- 2010-12-16 SG SG2012043634A patent/SG181685A1/en unknown
- 2010-12-16 ES ES10840006.0T patent/ES2633648T3/es active Active
- 2010-12-16 MX MX2012007414A patent/MX339669B/es active IP Right Grant
- 2010-12-16 KR KR1020177021141A patent/KR101841271B1/ko active IP Right Grant
- 2010-12-16 RU RU2012130940/10A patent/RU2586506C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-12-16 WO PCT/US2010/060770 patent/WO2011079018A2/en active Application Filing
- 2010-12-16 KR KR1020187007710A patent/KR101923537B1/ko active IP Right Grant
- 2010-12-16 CA CA2784425A patent/CA2784425A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-16 PL PL10840006T patent/PL2516626T3/pl unknown
- 2010-12-16 US US12/970,365 patent/US9133439B2/en active Active
-
2012
- 2012-07-20 ZA ZA2012/05488A patent/ZA201205488B/en unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3935067A (en) * | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
SU1767433A1 (ru) * | 1989-11-27 | 1992-10-07 | Пермский государственный медицинский институт | Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа |
US7534608B2 (en) * | 2006-07-26 | 2009-05-19 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
US20090280096A1 (en) * | 2008-05-09 | 2009-11-12 | Atsushi Kubo | Pancreatic endocrine progenitor cells derived from pluripotent stem cells |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
NELSON SB, et al. "The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells", Development. 2007; 134: 2491-2500. * |
NELSON SB, et al. "The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells", Development. 2007; 134: 2491-2500. OGIHARA T, et al. "Combined Expression of Transcription Factors Induces AR42J-B13 Cells to Differentiate into Insulin-Producing Cells", End J. 2008; 55(4): 691-698. * |
OGIHARA T, et al. "Combined Expression of Transcription Factors Induces AR42J-B13 Cells to Differentiate into Insulin-Producing Cells", End J. 2008; 55(4): 691-698. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2633648T3 (es) | 2017-09-22 |
BR112012015727A2 (pt) | 2015-11-24 |
US9133439B2 (en) | 2015-09-15 |
ZA201205488B (en) | 2016-01-27 |
MX339669B (es) | 2016-06-02 |
RU2012130940A (ru) | 2014-01-27 |
KR101841271B1 (ko) | 2018-03-22 |
SG181685A1 (en) | 2012-07-30 |
AU2010333840A1 (en) | 2012-07-12 |
PL2516626T3 (pl) | 2017-10-31 |
KR20180030737A (ko) | 2018-03-23 |
EP2516626A4 (en) | 2013-06-26 |
JP5882226B2 (ja) | 2016-03-09 |
CN102712902B (zh) | 2019-01-08 |
KR101764404B1 (ko) | 2017-08-03 |
EP2516626B1 (en) | 2017-05-10 |
WO2011079018A2 (en) | 2011-06-30 |
EP2516626A2 (en) | 2012-10-31 |
MX2012007414A (es) | 2012-07-17 |
CN102712902A (zh) | 2012-10-03 |
SG181822A1 (en) | 2012-08-30 |
RU2586506C2 (ru) | 2016-06-10 |
KR101923537B1 (ko) | 2018-11-29 |
WO2011079018A3 (en) | 2011-11-17 |
KR20170090530A (ko) | 2017-08-07 |
JP2013515481A (ja) | 2013-05-09 |
AU2010333840B2 (en) | 2016-01-07 |
CA2784425A1 (en) | 2011-06-30 |
KR20120104386A (ko) | 2012-09-20 |
US20110151561A1 (en) | 2011-06-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2664864C1 (ru) | Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы | |
RU2687378C1 (ru) | Способ получения популяции клеток, экспрессирующих mafa (варианты) | |
US20170327793A1 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
US20170081634A1 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191217 |