CN116457457B

CN116457457B - 改善早期胚胎发育的方法

Info

Publication number: CN116457457B
Application number: CN202280005739.4A
Authority: CN
Inventors: 陈子江; 赵涵; 吴克良; 张鸿惠
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2024-03-01
Anticipated expiration: 2042-04-27
Also published as: WO2022228481A1; CN116457457A; US20240174977A1; EP4330376A1

Abstract

本发明的理念是基于对哺乳动物的生育力和胚胎发育可以被CHK1抑制剂增强的发现。本发明公开了一种治疗人类不育的方法。该方法包括识别CHK1功能改变的个体并施用治疗有效量的CHK1抑制剂。此外，使用含有CHK1抑制剂的培养基可以促进胚胎发育。

Description

改善早期胚胎发育的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年4月28日提交的美国临时专利申请第63/180,926号的优先权和权益，其整体内容通过如同全文陈述的引用方式并入本文。

序列表的引用

于2022年4月22日创建并同时提交的、名为36682.04011_ST25.txt的8kb的ASCII文本文件的内容整体通过引用并入。

技术领域

本公开涉及治疗不孕症的方法，特别是与受精卵阻滞和/或胚胎发育有关的不孕症。

背景技术

生殖健康对维持人口可持续性至关重要，然而随着人类所处自然和社会环境的不断变化，围绕生育和生育率的问题引发了关注。全球不孕症患病率从1997年的11.0％上升到2019年的16.4％，预计到2023年将上升到17.2％。受如环境污染、生育年龄推迟、生活压力等因素的影响，不孕不育人数仍在增加。为了解决不孕不育个体的生育困境，辅助生殖技术(ART)应运而生并迅速发展，在世界范围内得到了广泛应用。在北欧一些低生育率国家，每年有7％的新生儿是通过ART出生的。近年来，多个国家的体外受精(IVF)和卵胞浆内单精子注射(ICSI)的治疗数量增加。但目前辅助生殖技术的成功妊娠率仍然较低，亟待研究者们进一步完善胚胎培养体系，尤其是从体外受精到移植的胚胎培养体系。在现有常用的胚胎培养基中添加适量能促进胚胎发育的因子来辅助胚胎多个阶段的发育是一种可行且有效的方法。

哺乳动物卵子受精是一个复杂的多阶段过程。受精的特征是两个高度特化的减数分裂生殖细胞——卵母细胞和精子，转化为全能受精卵。这种转变触发了一个复杂的细胞程序，可能代表了哺乳动物/人类生物学中最复杂的细胞转变。在该过程中的任何步骤的失败都可能导致不育。

辅助生殖技术(包括IVF和ICSI)使不孕妇女在体外获得其生物胚胎，并在胚胎移植后进一步生下婴儿。据估计，通过ART产生的人类胚胎中约有10％被阻滞在非常早期的胚胎阶段，约2％的源自ART受精卵无法完成第一次细胞分裂。大约一半的人类不孕病例涉及潜在的遗传因素，但大多数遗传原因仍不明确。受精卵发育失败的一个重要原因是受精卵阻滞(ZA)。受精卵阻滞导致女性不孕的遗传决定因素和合适的临床治疗方法在很大程度上仍然是未知的。

发明内容

对治疗、预防或以其他方式改善哺乳动物受精卵阻滞和/或不育相关症状的组合物和方法的需求尚未得到满足。

本发明的总体发明理念部分基于对激酶活性增强会阻碍胚胎发育的认知，更具体地，增强的CHK1表达和/或暴露在哺乳动物(不)生育和胚胎发育中起作用。这是基于以下发现：CHK1突变显示出激酶活性增加以及应用CHK1抑制剂能够显著挽救小鼠和人类的表型、有效地逆转/治疗受精卵阻滞。进一步地，本发明的总体发明理念认识到，将胚胎暴露于一定浓度的CHK1抑制剂(例如，在培养基中)可以增强(例如，加速)胚胎发育，同时避免与胚胎质量相关的问题。

本发明的总体发明理念认识到一种治疗不孕症的方法，其包括：识别具有CHK1功能改变的个体，并施用治疗有效量的CHK1抑制剂。

本发明的总体发明理念还涉及一种用于哺乳动物胚胎培养的培养基，所述培养基包含治疗有效量的CHK1抑制剂。在某些实施方案中，所述添加剂是用量为0.1nM至100nM的CHK1抑制剂。

本发明的总体发明理念还涉及并考虑了一种促进胚胎发育的方法。该方法包括提供培养基，添加治疗有效量的CHK1抑制剂，并将胚胎与所述培养基接触。在某些示例性的实施方案中，通过调节囊胚发育率来增强胚胎发育。

本发明的总体发明理念还涉及并考虑了一种治疗和/或预防受精卵阻滞的方法，该方法包括识别患有受精卵阻滞或受精卵阻滞风险增加的受试者，使来自该个体的受精卵与治疗有效量的CHK1抑制剂接触。在某些示例性的实施方案中，所述治疗有效量相当于足以克服受精卵阻滞的用量。

本发明的总体发明理念还涉及并考虑了一种用于治疗和/或预防受精卵阻滞的组合物，该组合物包含治疗有效量的CHK1抑制剂。

本发明的总体发明理念还涉及并考虑了一种治疗激酶活性改变的方法，该方法包括识别具有CHK1功能改变的个体，并施用治疗有效量的CHK1抑制剂。在某些实施方案中，所述个体的激酶活性增加导致了受精卵阻滞和/或不育。

附图说明

图1显示了CHK1在卵母细胞和植入前胚胎中的表达模式的蛋白免疫印迹和柱状图。图1A：蛋白免疫印迹结果显示CHK1在小鼠卵母细胞和早期胚胎不同时期的表达。GAPDH用于作为内参。图1B显示了CHK1在小鼠卵母细胞和早期胚胎中蛋白表达的相对定量结果。图1C：RT-PCR结果显示CHK1在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的mRNA水平。图1D为人成熟卵母细胞和受精前胚胎中CHK1的RNA-seq结果。条柱表示平均值±SEM。

图2表明了CHK1突变导致小鼠受精卵阻滞。图2A显示了小鼠受精卵注射流程图。将MII期卵母细胞和获能精子在体外受精4小时，将带有EGFP标签的野生型或突变型hCHK1cRNA注射到受精卵的细胞质中，继续培养18小时，观察受精卵的卵裂率。图2B显示了过表达野生型或突变型人EGFP-CHK1的小鼠受精卵18h后的图像。标尺：100um。

图3表明了CHK1的突变氨基酸残基的保守性分析和结构展示。图3A显示了序列比对，揭示了家系1中氨基酸残基R379、家系2中氨基酸残基F441、家系3中氨基酸残基R442和家系4中R420氨基酸残基在9个物种中的进化保守性。图3B显示了野生型CHK1蛋白的预测结构概况(左图)。箭头表示R379、R442和R420的位置。R379(a)和R442(c)周围预测结构的放大图以及它们在突变(b和d)后的结构变化(右图)。黑色箭头指示的黄色虚线代表预测的氢键。箭头标记了突变的氨基酸Q442和具有新形成的氢键的L443。

图4是一个示意图，显示了R379Q突变和R442Q突变使CHK1表面带正电荷的区域转变为带负电荷的区域(黄色圆圈)。

图5表明了CHK1蛋白核质定位的改变是由于NES或NLS的突变。HEK-293细胞在转染30h后，用DMSO或来普霉素B(LMB，一种Crm1抑制剂，抑制出核转运信号)处理15h。红色：mCherry-WT CHK1，绿色：EGFP-WT或突变的CHK1，蓝色：DAPI，标尺：10um。(A)其显示了与野生型组相比，突变组有细胞质定位的趋势，尤其是DMSO处理组中的突变F441fs*16。(B)除F441fs*16外，LMB处理组几乎完全表现出核定位。

图6A是表示CHK1的自我抑制调控的示意图。正常生长条件下，CHK1的N-末端激酶结构域与C-末端调节结构域相互作用，形成“闭合”结构，保持无活性形式(上图)。在DNA损伤因子存在的情况下，CHK1的磷酸化会打破N-末端和C-末端之间的相互作用，使激酶结构域暴露，诱导CHK1的激活(下图)。蓝色框：C-末端的两个保守基序CM1和CM2。图6B显示，转染野生型或突变型CHK1质粒48小时后，收集HEK-293T细胞，然后500nM CPT处理2小时以检测激酶活性。结果显示，各突变组的相对激酶活性(每个重复中OD_{野生组或突变组}/OD_野生组)均高于野生型组，但R420K突变无显著性差异(t检验)。条柱：平均值±SEM，ns：无显著性差异。

图7A显示，转染30小时后分别用DMSO或PF477736(150nM)处理HEK-293T细胞18小时。蛋白免疫印迹结果表明CHK1抑制剂PF477736能够显著降低CHK1下游蛋白(p.CDC25C和pCDK1)的表达。图7B为柱状图，显示了注射野生型或突变型CHK1 cRNA的小鼠受精卵分别用DMSO或PF477736(10nM)处理的结果。18小时后，此处记录的各组的卵裂结果表明抑制剂可以显著提高携带突变的受精卵的卵裂率(p<0.05)。采用卡方检验，每组3个重复，每组共计约90颗受精卵。图7C是柱状图，显示了在DMSO或不同PF477736浓度(1/10/100nM)下，携带野生型或突变型hCHK1的受精卵的囊胚率。

图8显示了分别用DMSO或PF477736(10uM)处理注射了野生型或突变型CHK1 cRNA的小鼠受精卵的图像。

图9显示了来自对照受精卵或过表达突变型CHK1受精卵的囊胚的染色体拷贝数分析(CNV-seq)结果。将突变囊胚的基因组序列与正常对照囊胚的序列进行比对。比对结果表明，PF477736处理的突变囊胚中没有染色体非整倍体异常或大于4Mb的染色体缺失或重复。

图10为显示各组仔鼠出生后5周测量体重的柱状图，PF477736处理的野生型(WT)和突变(F441fs*16/R379Q)组与正常对照组之间无显著性差异(t检验)。条柱：平均值±SEM，ns：无显著性差异。

图11是显示CHK1在受精卵阻滞中的激活作用的图。我们鉴定的四个突变位于CHK1C-末端两个高度保守的区域(CM1和CM2)，与CHK1的自我抑制调节有关。我们的结果表明，在没有DNA损伤信号刺激的情况下，那些突变的活性增加。突变可以通过改变蛋白质构象使其激酶结构域暴露，从而在正常情况下激活，产生更多的抑制性磷酸化的CDC25C/CDK1。曾有报道，抑制CDK1严重抑制了海星受精卵雌雄原核的迁移和融合。抑制性pCDK1的积累可以干扰雌雄原核的融合，并导致人受精卵细胞周期阻滞。

图12显示了4个具有遗传性或新发的CHK1突变的家系的图谱。所有受影响的个体均表现为单等位基因突变，但男性携带者没有患病，其特点是限于女性的常染色体显性遗传。家系1中的CHK1突变c.1136G>A(Ⅲ-1和Ⅲ-2)由父亲遗传，而家系2中的c.1323delC和家系3中的1325G>A为新发突变，父母均不是携带者。正方形表示男性家庭成员，圆形表示女性家庭成员，黑色符号表示受影响者，白色符号表示未受影响者。斜线表示死亡，问号表示未知生育状态，箭头表示家系1和家系4中的先证者。CHK1基因型标记在相应家系成员的下方，“W”代表野生型。Sanger测序图谱如下方的图所示。

图13A是受精卵卵裂率的柱状图，显示为三个实验的总比率(每组约90枚卵子)，根据卡方检验，与野生型卵相比，携带突变RNA的小鼠受精卵卵裂率显著降低(P<0.05)。图13B显示了突变小鼠受精卵或野生型CHK1的2-细胞期胚胎的免疫荧光结果。将小鼠受精卵注入野生型或突变型hCHK1 cRNA，体外培养18小时后固定，用于免疫荧光检测。绿色：EGFP标记的野生型或突变型CHK1，蓝色：DAPI，标尺：10um。图13C为CHK1蛋白的结构示意图，显示了其激酶结构域、C-末端结构域(具有SQ、CM1和CM2基序)以及改变的氨基酸位置。NES：出核信号；NLS：核定位信号。图13D为共转染mCherry-WT CHK1和EGFP-CHK1(野生型或突变型)的HEK-293细胞的免疫荧光结果，用来显示蛋白的细胞内定位。红色：mCherry-WT CHK1；绿色：EGFP-WT或EGFP-突变的CHK1；蓝色：DAPI；标尺：10um。图13E显示了HEK-293细胞中野生型或突变型CHK1的细胞核信号相对于总细胞的相对强度。误差条：S.E.M.，****P<0.0001，采用双侧Student’s t检验。

图14A显示了HEK-293T细胞提取物的蛋白免疫印迹分析。HEK-293T细胞转染EGFP-WT或突变型CHK1构建体48小时，用来检测下游CHK1蛋白。以500nM喜树碱(CPT，Sigma公司，C9911)诱导DNA损伤的EGFP-WT组作为阳性对照。图14B为显示CHK1激活后的下游通路的示意图。活化的CHK1能够磷酸化CDC25C上的S216，从而导致抑制性磷酸化的CDK1(在T14和Y15)的积累，这阻断了G2-M转换。图14C显示，关键磷酸化位点CDC25C(S216)和CDK1(T14和Y15)的突变可以改善小鼠受精卵的受精卵阻滞表型。将CDC25C(S216)和CDK1(T14和Y15)突变为丙氨酸，然后分别与突变F441fs*16一起在小鼠受精卵中过表达。展示了代表性的图像。WT：野生型，MT：突变型；标尺：100uM。图14D是表示携带突变的CDC25C和CDK1的受精卵卵裂率显著增加的柱状图(p<0.05；卡方检验)。条柱上方为3组重复的总卵裂率。每组约80枚卵子。

图15A显示，患者Ⅲ-2(家系1，p.R379Q)阻滞的受精卵可以用PF477736恢复分裂。患者捐献的受精卵已培养至第3个胚胎日但仍未卵裂，随后进行冷冻保存以待进一步研究。在解冻后，申请人用PF477736(10nM)培养受精卵一天，以观测药物的效果，发现阻滞的受精卵在PF477736处理后能够分裂。相反，用DMSO处理的受精卵不能分裂。图15B显示，过表达野生型或突变型CHK1(p.F441fs*16或p.R379Q)的小鼠受精卵在添加或不添加PF477736(10nM)的条件下培养至2细胞胚胎期，然后转入不含DMSO或PF477736的新培养基中以获得囊胚。展示了囊胚的代表性图像。图15C是显示突变组中抑制剂显著提高囊胚率(基于非配对t检验)的柱状图。条柱：SEM，ns：无显著性差异。图15D是显示对照组和WT组或PF477736突变组的2-细胞胚胎被转移到假孕雌鼠后以观察产仔情况的柱状图(表3)。根据t检验，未经任何处理的正常对照组与经10nM PF477736处理的野生型组或突变型组(p.F441fs*16或p.R379Q)之间的出生率存在相当大的差异。条柱：SEM。图15E显示了突变型组(R379Q)中子代(黄色虚线圆圈)的代表性图像。图15F为描述不同浓度的囊胚培养和胚胎移植的流程图。过表达突变p.F441fs*16或p.R379Q的小鼠受精卵用1nM、10nM或100nM的PF477736处理至2-细胞期胚胎，然后将胚胎转移到不含PF477736的培养基中培养至囊胚期；采用10nM的PF477736处理的表达CHK1野生型和突变型p.F441fs*16或p.R379Q的2-细胞胚胎转染至假孕雌性小鼠，用来观察产仔情况。

图16A显示了对照组和PF477736处理组(PF-1)中胚胎发育进程的延时成像。图16B显示了胚胎PF-1和PF-3的Sanger测序图谱。“W”代表野生型，“M”代表突变型。图16C显示了PF-1和PF-3来源的两个胚胎干细胞系中人ESC标志物的表达，包括OCT4，SOX2，SSEA4，TRA-1-60和TRA-1-81。

图17显示了患者(Ⅲ-2，家系1)来源的两种胚胎干细胞系的CNV-seq结果。取患者PF477736处理后的2枚囊胚，建立胚胎干细胞：ESC_PF-1(a)和ESC_PF-3(b)。

图18A是显示促进哺乳动物囊胚发育的总体步骤的示意图。

图18B显示了在培养基中暴露于不同浓度添加剂的受精卵的图像。

图18C是显示在培养基中暴露于不同浓度添加剂的受精卵的囊胚发育率结果。

图19A是显示按等级对胚胎进行定性评估的结果的柱状图。

图19B是显示对中等剂量添加剂处理的胚胎进行DNA损伤标记蛋白γH2AX免疫荧光染色的图像。

图19C显示了对中等剂量添加剂处理的胚胎进行CNV-seq分析，结果显示抑制剂组的胚胎倍性完整，没有明显的染色质大片段的缺失或重复。

具体实施方式

下面将详细介绍几个说明性的实施方案，应理解本公开仅例举了总体发明理念。包含总体发明理念的实施方案可以采取各种形式，并且该总体发明理念不限于本文所描述的具体实施方案。

哺乳动物受精的特点是两个高度特化的减数分裂生殖细胞，卵母细胞和精子，转变为全能性受精卵。这种转变触发了一个复杂的细胞程序，很可能代表了人类生物学中最复杂的细胞转变。成熟的卵母细胞最初与获能精子融合分别形成雌性和雄性原核，启动新生命的发育。随后，两个单倍体原核相互迁移和聚集，经过第一次对称分裂后形成2-细胞胚胎，这是一个从成功完成减数分裂到开始有丝分裂的重要转变。此后，两细胞胚胎经过数次连续的有丝分裂事件和分化发育为囊胚。上述过程中任何一个步骤的失败都可能导致人类不育。据估计，辅助生殖技术(ART)产生的所有人类胚胎中，约有10％阻滞在非常早期的胚胎阶段。已报道WEE2缺失导致以原核形成失败为特征的人类不育。然而，对于调控雌雄原核融合以及受精后减数分裂向有丝分裂转变的遗传因素知之甚少。

进化上高度保守的DNA损伤应答和细胞周期检查点保证了基因组的稳定性，其中的核心是细胞周期检查点激酶1(CHK1)。CHK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其调节细胞周期G2期和M期之间的转换，于1993年在裂殖酵母中被首次确认。该蛋白在基因组维持、癌症治疗和早期胚胎发育中具有重要意义。虽然CHK1在小鼠早期胚胎发育中发挥重要作用，但CHK1在人类原核融合和胚胎有丝分裂启动中的关联机制尚不清楚。

除非另有说明，本文使用的术语“易感”和“处于风险中”是指具有遗传倾向、有家族史和/或有症状的病症或疾病(例如，显示不需要的标记或蛋白的表达)。该术语是指那些易感性高于一般人群的人群。

除非另有说明，本文使用的术语“调节”或“调制”是指所选特征(例如，表达水平或症状)的目标活动。在某些实施方案中，该术语指的是平衡或“正确调整”或“塑造”生物响应或表达水平，使其达到与健康人群相似的水平。在某些实施方案中，该术语指的是增强一个参数以达到一个期望的目标，例如，提高个体的生育能力或胚胎的生存能力。

除非另有说明，本文使用的术语“改善”，是指消除、推迟或减少病症的患病率(例如，受精卵阻滞或不育)或与病症或疾病相关的症状的严重程度。

属于“有效量”和“治疗有效量”旨在量化活性成分(例如，CHK1抑制剂)的量，以达到预防或治疗疾病或病症的目的，或达到降低患者遭受不良健康事件(例如，不期望的不育，受精卵阻滞)的风险的目的，同时避免诸如通常与替代疗法相关的不良副作用。该术语还指培养基中能够促进/增强胚胎发育的添加剂的量。

除非另有说明，本文使用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”，包括延缓病症的发作，减轻病症的症状的严重程度，或消除病症的部分或全部症状。

本发明的总体发明理念部分基于对特定激酶活性的增强可以阻断胚胎发育以及CHK1的表达在人类(不)生育中发挥作用的认知。这基于对CHK1突变显示激酶活性增加以及应用CHK1抑制剂能够显著挽救小鼠和人类的表型的发现。虽然不希望受到理论的束缚，但申请人已经证明CHK1的显性突变导致原核融合失败和受精卵阻滞(PFF-ZA)。

此外，申请人证明了暴露于CHK1抑制剂(即，在培养基中)可以显著增强囊胚发育，而且不影响胚胎质量。众所周知，囊胚发育可以增强，但这往往是以降低胚胎质量为代价的，而这在不孕不育领域是一个不受欢迎的结果。

更具体地，申请人证实了29例病例中的7例CHK1突变导致PFF-ZA，可能是通过增加CHK1活性来实现的。重要的是，这些突变引起的PFF-ZA可以通过暴露于CHK1抑制剂来缓解或治疗。申请人还证实了暴露于含有一定浓度的添加剂(例如，CHK1抑制剂)的培养基中，可以在不降低胚胎质量的情况下提高(改善/增加)囊胚发育。在某些实施方案中，CHK1抑制剂选自Rabusertib、CCT245737、Prexasertib、AZD7762和PF477736。在某些示例性的实施方案中，CHK1抑制剂为PF477736。一个示例性的CHK1抑制剂的结构如下所示：

因此，本发明的总体发明理念认识到了一种治疗不孕症的方法，其包括：识别具有CHK1功能改变的个体，并施用治疗有效量的CHK1抑制剂。

本发明的总体发明理念还涉及用于哺乳动物胚胎培养的培养基，所述培养基包含治疗有效量的CHK1抑制剂。在某些实施方案中，所述添加剂是用量为0.1nM至100nM的CHK1抑制剂。

本发明的总体发明理念还涉及和考虑到了一种促进胚胎发育的方法。该方法包括提供培养基、添加治疗有效量的CHK1抑制剂以及使培养与所述培养基接触。在某些示例性的实施方案中，通过调节囊胚发育率来提高胚胎发育。

本发明的总体发明理念还涉及和考虑到了一种治疗和/或预防受精卵阻滞的方法，该方法包括识别患有受精卵阻滞或受精卵阻滞风险增加的受试者，使来自个体的受精卵与治疗有效量的CHK1抑制剂接触。在某些示例性的实施方案中，所述治疗有效量指足以克服受精卵阻滞的用量。

本发明的总体发明理念还涉及和考虑到了用于治疗和/或预防受精卵阻滞的组合物，该组合物包含治疗有效量的CHK1抑制剂。

本发明的总体发明理念还涉及和考虑到了治疗激酶活性改变的方法，该方法包括识别具有CHK1功能改变的个体，并施用治疗有效量的CHK1抑制剂。在某些实施方案中，所述个体的激酶活性增加，导致了受精卵阻滞和/或不育。

在某些示例性的实施方案中，个体通过测量CHK1的表达水平并确定该水平是否超过从健康或其他可育人群中确定的阈值而被识别为具有CHK1功能改变。在一个示例性的实施方案中，通过对突变的遗传鉴定，个体被识别为具有CHK1功能改变。在某些实施方案中，所述突变导致CHK1的表达水平升高，包括升高到高于阈值的水平。

本公开中描述的任何一种培养基添加剂(即，CHK1抑制剂)均可用于本文所描述的方法或组合物，包括常规胚胎培养、促进胚胎发育的方法、治疗不孕症的方法、治疗和/或预防受精卵阻滞的方法、治疗CHK1功能改变的方法等。

如上述总体发明理念所述，在某些实施方案中(例如培养基)，任何添加剂(如CHK1抑制剂)的浓度都应该被调节至达到理想的结果(例如，提高胚胎发育率)，同时避免胚胎质量问题。在某些示例性的实施方案中，添加剂(例如，CHK1抑制剂)的浓度为0.1nM至100nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.1nM至10nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.1nM至20nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.1nM至30nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.1nM至40nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.1nM至50nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.1nM至60nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.1nM至70nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.1nM至80nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.1nM至90nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.2nM至100nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.3nM至100nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.4nM至100nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.5nM至100nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.6nM至100nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.7nM至100nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.8nM至100nM。在某些示例性的实施方案中，添加剂的浓度为0.9nM至100nM。

申请人通过使用全外显子测序(WES)，在4个独立的家系中筛选出了导致人类受精卵阻滞的候选基因并鉴定出CHK1(MIM:603078；GenBank:NM_001274.5)突变。

最近的一项研究表明，人类受精卵分裂失败是一种孟德尔遗传病，但大多数患者的病因尚不清楚。本发明的总体发明理念部分是基于对CHK1突变可引起主要表现为女性限制性常染色体显性遗传模式下的原核融合障碍的人类受精卵阻滞的发现。在小鼠和人类中，与其他植入前阶段相比，CHK1在受精卵阶段高表达。这些激活的突变位于CHK1蛋白的C-末端结构域，对受精卵有特异性的影响。具体来说，这些突变改变了蛋白结构和蛋白定位，引起CDC25C/CDK1通路的抑制性磷酸化，导致细胞周期阻滞(图11)。

人CHK1的激酶结构域，其缺乏包括ATR磷酸化位点(S345)的C-末端结构域，在体外表现出比全长CHK1蛋白更强的催化活性。此外，人们普遍认为CHK1以自我抑制模式驱动激活和失活之间的转变。在没有DNA损伤的情况下，CHK1的N-末端与其C-末端相互作用形成闭合结构，以保持失活状态；当出现DNA损伤信号时，上游激酶(ATR)磷酸化CHK1的S345位点触发其开放结构，进而激活CHK1(图6A)。这些突变很可能破坏CHK1的闭合构象，从而解除其分子内的自我抑制，使激酶暴露并导致CHK1激活。

已广泛报道CHK1抑制剂与其他抗癌剂联合应用可以提高肿瘤治疗的敏感性。由于CHK1突变体具有增加的的激酶活性，我们选择了一种选择性ATP竞争性抑制剂PF477736来抑制该增加的活性。这使通过下调磷酸化CDC25C和CDK1来克服小鼠受精卵阻滞成为可能。为了进一步探索PF477736的效用，申请人在小鼠受精卵中探索了其最佳浓度以获得囊胚，随后应用PF477736显著提高了携带CHK1突变受精卵的囊胚产量，并产生了健康的小鼠后代。此外，患者(家系1中III-2)培养至第3天仍无卵裂而后冻存的受精卵经PF477736处理后发生卵裂。

申请人确定了女性不育的一个新的遗传原因，阐明了CHK1在完成卵母细胞减数分裂到启动胚胎有丝分裂、开始新生命的转变中发挥的关键作用。CHK1抑制剂在患者阻滞的受精卵中的应用，以及在小鼠受精卵中其效用的确认，为此类疾病的治疗提供了一种潜在的干预手段，这将是实现受精卵阻滞不孕患者精准治疗的第一步。

申请人鉴定了一个三代的女性原发性不孕家系(家系1)(图12A)。先证者经历3个IVF或ICSI周期，共获得24枚受精卵。这些受精卵多数在第1个卵裂日(Day 1)具有明显的原核，雌、雄原核直到第3个卵裂日(Day 3)仍未融合；而对照个体在Day 1已经分裂，在Day 3进入八细胞期(表1)。重要的是，先证者的姐姐和姨妈也患有不孕症(图12A)。对家系1(Ⅲ-2、Ⅱ-1和Ⅱ-3)进行WES分析发现了CHK1杂合错义突变c.1136G>A(p.R379Q)，与女性不孕共分离，呈常染色体显性遗传模式(父本传递)，而父亲不受影响(图12A)。

表1

＊IVF体外受精，ICSI卵胞浆内单精子显微注射，PN原核，C细胞

随后，申请人在26例具有类似受精卵阻滞表型的不孕症患者中，利用Sanger测序或WES在4例不孕妇女中发现了另外3个CHK1突变：家系2中1例(c.1323delC，p.F441fs*16，新发)，家系3中1例(c.1325G>A，p.R442Q，新发)和家系4中2例(c.1259G>A，p.R420K，未知)(图12A)。单倍型分析证明了家系2和家系3中患者与其父母的亲缘关系，同时也表明4个家系的疾病等位基因来源完全独立。家系2、家系3和家系4中的4例患者至少进行了两次失败的IVF或ICSI助孕尝试，其受精卵大多停育且具有明显的雌、雄原核(表1)。

在基因组聚合数据库(Genome Aggregation Database，gnom AD)和千人基因组(1000G_All)数据库中均未发现上述突变，在300例健康女性对照中也未发现上述突变。除截短突变p.F441fs*16外，其余3个突变(R379Q、R442Q和R420K)均被SIFT、Polyphen-2和Mutation Taster预测影响CHK1蛋白的功能。此外，根据ACMG(美国医学遗传学与基因组学学院)的标准，所有鉴定的突变都被归类为可能致病，见表2。

表2

缩写：D，有害：P，可能有害：NA，查询不到：LP：可能致病

^a通过SIFT、Polyphen-2(PPH2)与Mutation Taster评估突变。

^b1000 Genomes(1000g_E)与gnomAD数据库所有人群中对应突变的等位基因频率。

^c根据美国医学遗传学与基因组学学会的标准的突变评估。

在小鼠受精卵中表达人CHK1突变

CHK1在小鼠卵母细胞和植入前胚胎中的蛋白免疫印迹和实时定量PCR结果显示，CHK1在受精前和受精后直到2-细胞期表达水平较高，在4-细胞期之后表达水平下降(图1A-C)。已发表的人卵母细胞和早期胚胎RNA-Seq数据显示，CHK1的mRNA水平在8-细胞期之前相对较高(图1D)，提示CHK1可能在非常早期的胚胎阶段发挥重要作用。

为了验证鉴定的CHK1突变与受精卵阻滞表型之间的关系，申请人将突变体EGFP-人-CHK1互补RNA(cRNA)注射到小鼠受精卵中，18小时后评估卵裂率(图2A)。申请人的结果显示，与携带野生型hCHK1(human CHK1，人CHK1)相比，携带突变型hCHK1的小鼠受精卵卵裂率显著降低，尤其是家系2的截短突变(8.5％：75.5％)(图13A和图2B)。同时，免疫荧光结果显示，当携带野生型hCHK1的受精卵发育至2-细胞期胚胎时，突变组的受精卵雌雄原核尚未融合(图13B)，这与患者的表型相符。这些结果表明，hCHK1的致病突变可以引起受精卵阻滞。

结构提示

CHK1的N-末端是一个极其保守的激酶结构域，而调节结构域的C-末端含有一个丝氨酸/苏氨酸(SQ)基序和两个高度保守的基序(CM1和CM2)(图6A)。R379、F441、R442和R420四个突变氨基酸残基位于或靠近两个保守基序(图13C)，且在不同物种间高度保守(图3A)。根据CHK1的三维结构预测(图3B)，R379可以与周围的残基形成氢键，而Q379取代后氢键消失(图3B a和b)。R442可与周围残基形成四个氢键，而R442与N-末端结构域中的两个残基(Y86和C87)之间的氢键在被Q442取代后消失，同时与L443形成新的氢键(图3B c和d)。Q取代残基R也引起了蛋白质表面电势的变化(图4)，可能是由于R为碱性氨基酸，Q为中性氨基酸。申请人在不希望受到理论束缚的前提下，推断结构变化可能进一步影响蛋白质的功能。

CHK1突变体的核质定位改变

CHK1在正常情况下定位于细胞核的染色质上；当CHK1被激活时，CHK1从染色质中解离，与核质中的14-3-3蛋白结合，并将一定比例的蛋白输出到细胞质中，从而调节细胞核和细胞质检查点。CM1和CM2分别对应CHK1的出核信号(NES)和核定位信号(NLS)，这些保守区域或附近的突变会影响蛋白的亚细胞定位，甚至影响其检查点功能。应强调，p.R379Q突变(家系1)位于NES区域，而突变p.F441fs*16(家系2)、p.R442Q(家系3)和p.R420K(家系4)均位于NLS区域(图13C)。为了探究这些突变对CHK1蛋白胞内定位的影响，申请人将带有mCherry标签的野生型CHK1构建体和带有EGFP标签的CHK1(野生型或突变型)构建体以杂合的方式共转染HEK-293细胞。与野生型对照(WT)相比，所有突变体均增加了细胞质信号(图13D和13E)，尤其是截短突变体p.F441fs*16在细胞核中几乎完全丧失表达(图13D)。

蛋白质核输出通常由Crm1调控，Crm1与底物的NES结合，CHK1的核输出是Crm1依赖的。用Crm1抑制剂来普霉素B处理后，p.R379Q、p.R442Q和p.R420K突变的细胞质定位消失(图5)，表明这三个突变的细胞质定位主要由NES驱动，而非NLS驱动。然而，突变体p.F441fs*16经LMB处理后仍呈现细胞质定位(图5)，说明截短蛋白的细胞质定位是NLS破坏的结果。

总而言之，位于CHK1的C-末端调节结构域的四个致病突变改变了蛋白的核质定位，这与突变所在的出核信号区和核定位信号区有关。虽然不希望受到理论的束缚，但申请人认为CHK1的定位与其胞内功能密切相关。

CHK1突变对CDC25C/CDK1通路的影响

活化的CHK1可以直接磷酸化CDC25C的S216位点，导致抑制性磷酸化的CDK1(T14和Y15位点)降解减少，从而阻止G2/M转换并引起细胞周期阻滞(图14B)。此外，受精卵晚期原核期对应G2期，之后受精卵进入有丝分裂期。为了进一步探究CHK1突变对细胞周期的影响，申请人对野生型和突变体CHK1的激酶活性进行了评估，发现与野生型相比，突变体的激酶活性增加(图6B)。之后，申请人通过蛋白免疫印迹检测HEK-293T细胞中CHK1下游效应子的表达。如预期的那样，CHK1突变体增加了磷酸化CDC25C(S216)和CDK1(T14和Y15)的表达，与CPT(一种可以激活CHK1的DNA损伤药物)处理的结果相似，并且截短突变对抑制性pCDK1的积累影响最强(图14A)。已有研究报道，抑制CDK1严重抑制海星受精卵雌雄原核的迁移和融合。因此，我们推断CHK1突变体可能通过产生更多的抑制性pCDK1来干扰受精卵的原核融合。

为了进一步评估CHK1/CDC25C/CDK1通路对受精卵阻滞的影响，申请人在小鼠受精卵中过表达p.F441fs*16突变，以及缺少磷酸化位点的CDC25C或CDK1突变。申请人发现突变的CDC25C(CDC25C_MT)和CDK1(CDC25C_MT)都能够挽救p.F441fs*16诱导的受精卵卵裂失败(图14C和14D)。总的来说，这些结果证实了CHK1突变具有更高的活性，并且可以通过磷酸化和抑制CDC25C/CDK1通路引起受精卵阻滞。

通过CHK1抑制剂进行挽救

CHK1的C-末端突变体表现出激活的功能和较高的激酶活性，通过磷酸化下游因子导致细胞周期阻滞。因此，可以通过应用CHK1的抑制剂之一来挽救CHK1活性升高导致的受精卵阻滞。PF477736是一种选择性的ATP竞争性CHK1抑制剂，在临床试验中曾被用来抑制CHK1的活性，与抗肿瘤药物吉西他滨联合治疗肿瘤。

在本研究中，申请人观察到PF477736能够降低HEK-293T细胞中CHK1下游蛋白pCDC25C和pCDK1的表达水平(图7A)。与DMSO相比，在10nM浓度下，它也能显著提高突变受精卵的卵裂率(突变型R442Q中92.5％：49.2％；突变型F441fs*16中83.8％：1.5％；突变型R379Q中95.6％：51.3％；突变型R442Q中92.9％：21.6％)(图7B和图8)。申请人进一步探索了PF477736的有效浓度，发现在突变组中，与DMSO相比，10nM浓度对提高囊胚率的效率最佳(突变型F441fs*16中66.7％：6.8％；突变型R379Q中81.3％：10.7％)(图7C和15B-C)。此外，申请人随机挑选了九个携带突变hCHK1(F441*fs或R379Q)的PF477736处理的囊胚，均未检测到非整倍体(图9)。将处理后的胚胎移植到假孕雌性小鼠体内(图15F)，能够产生健康的后代(图4)。与完全正常对照相比，PF477736(10nM)处理的突变组的出生率没有显著差异(表3和图15D)，并且产仔数表现出正常的生长和体重(图10)。

表3

人受精卵检测：患者III-2(家系1)捐献的冻存受精卵，曾在受精后培养至第3天(Day3)仍不分裂，解冻后用10nM PF477736处理。令人惊讶的是，申请人发现这些受阻的受精卵在PF477736处理时能够分裂发育(图15A)。因此，PF477736可以通过抑制突变型CHK1的活性来帮助挽救受精卵卵裂失败，这为携带CHK1突变的患者提供了一种潜在的新型临床干预手段。

同一患者捐献的五枚新鲜受精卵在原核形成后立即用PF477736处理。申请人观察到，两个未经处理的对照受精卵未像预期那样分裂，仍处于原核期，但经PF477736处理的五个受精卵都克服了一细胞阶段，其中两个甚至发育成优质囊胚(图16A，PF-1和PF-3，表4)。基因型分析显示一个囊胚为WT，另一个囊胚携带R379Q突变(图16B)。此外，这两个囊胚均成功地被诱导分化为具有多能性的人胚胎干细胞(图16C，ESC_PF-1和ESC_PF-3)，并通过遗传学检测证明其遗传完整性(图17)。

表4

“Em”表示胚胎；“D”表示天数；“UD”表示未分裂；“D”表示分裂人胚胎干细胞(hESC)系的建立

将PF477736处理产生的患者囊胚(PF-1和PF-3)的内细胞团(ICM)种植于有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，使用改良的人胚胎干细胞培养基¹，在37℃、6％CO₂、5％O₂的湿润培养箱中培养。通常每天更换培养基，五天后形成克隆，在新鲜的MEF饲养层上传代分离，然后机械地分离成若干块。

人受试者

在山东大学生殖医学研究中心招募家族性或散发性受精卵阻滞患者以及健康对照个体。所有受试者均签署知情同意书，本研究经山东大学生殖医学伦理委员会审查批准。

家系1先证者(Ⅲ-2)，28岁，未避孕，不孕3.5年。患者月经周期规律，性激素水平正常，配偶精子数量、形态及活力正常。患者被诊断为原发性不孕。进行了三个IVF/ICSI周期，共获得24枚受精卵。然而，大多数受精卵在受精后第一天被阻滞在原核(PN)或1-细胞期，而正常对照组的胚胎通常处于2-细胞期。患者受精卵在接下来的三天内几乎都没有分裂，导致无法获得可移植胚胎。我们认为这种表型是以原核融合失败(PFF-ZA)为主要特征的受精卵阻滞。更值得注意的是，患者的一位姐姐和一位姨妈也患有不孕症。

家系2中患者(Ⅱ-1)31岁。虽月经周期及性激素水平正常，但有7年原发性不孕史。随后在本中心尝试了三个IVF/ICSI周期，共获得25枚受精卵。卵裂第1天，23枚受精卵仍有PN，只有2枚卵处于1-细胞期。在接下来的几天里，几乎所有受精卵都没有分裂，仍然表现出明显的PN，比家系1中患者的情况严重得多。

我们在家系3中发现的第三例患者(Ⅱ-2)27岁。与前两例患者相似，她有5年原发性不孕史，月经周期规律，性激素正常。她进行了四个IVF/ICSI周期，共获得26枚受精卵，其中23枚受精卵阻滞在PN期，仅2枚卵裂第1天阻滞在1-细胞期，不能进行胚胎移植。

家系4先证者(Ⅱ-1)，36岁，有7年不孕史，月经周期及性激素水平正常，被诊断为原发性不孕。进行了两个IVF/ICSI周期，共获受精卵10枚，其中五枚卵裂第1天处于PN期，其余均处于1-细胞期。大部分胚胎未分裂，也没有可移植胚胎。患者妹妹有10年不孕史，两次IVF/ICSI治疗失败，同样表现为受精卵阻滞。

全外显子组测序，数据分析及验证

按照QIAamp DNAMini Kit试剂盒说明书提取人外周血DNA。使用AgilentSureSelect全外显子组捕获和Illumina平台进行外显子捕获和测序。满足以下条件的变体将会被认为是候选突变：1)以前没有被三个公共数据库(dbSNP、1000Genome和gnomAD)报道过或突变频率低于0.01％；2)为编码区或剪接区非同义SNP/插入/缺失；3)经至少两个软件预测为有害，如SIFT、Polyphen-2和Variation Taster。接下来，将过滤后的候选突变在家系成员中进行sanger测序验证，排除与疾病不共分离的突变。最后在本中心300例育龄妇女中进一步验证候选基因，去除正常对照中的位点。引物见下表。

表5

申请人在四个独立的家系中确定了七例携带CHK1杂合突变(家系1：c.1136G>A，p.R379Q，遗传；家系2：c.1323delC，p.F441fs*16，新发；家系3：c.1325G>A，p.R442Q，新发；家系4：c.1259G>A，p.R420K，未知)的患者。单倍型分析证明了家系2和家系3中患者与其父母的亲缘关系。此外，无论受精卵是否携带CHK1突变，它们都停滞在从未分裂的受精卵阶段，表明母系因素可能对表型有影响。

表达构建

从含有人CHK1全长编码序列(NM_001274)的pENTER载体(Vigene生物)中设计引物以扩增目的基因。然后将CHK1基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白(mCherry)编码序列一起克隆到pcDNA3.1(+)载体中，以获得N-末端带有绿色或红色荧光蛋白标签的CHK1融合蛋白。按照制造商的方法，将含有EGFP和CHK1编码序列的质粒用QuickChange Lightning Site-DirectedMutagenetic Kit(Agilent科技)进行诱变，以获得CHK1突变质粒(c.G1136A、c.1323delC、c.G1325A和c.G1259A)。用同样的试剂盒获得CDC25C(BC019089.2)和CDK1(NM_001786.4)突变质粒。定点突变的引物见表4。

小鼠卵母细胞/胚胎收集

取6～8周龄健康ICR雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，用7.5IU孕马血清促性腺激素(PMSG，宁波三生)和7.5IU人绒毛膜促性腺激素(HCG，宁波三生)进行超数排卵(间隔44～48h)。18小时后收集小鼠输卵管壶腹部的卵丘卵母细胞复合体(COC)。取8～12周ICR雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)附睾尾精子，在G-IVF培养基(Vitrolife)中获能1小时。然后将收获的COC和获能精子加入到新的G-IVF培养基中，在37℃、5％CO₂的气体环境下培养4至6小时，获得受精卵，然后将其转移到覆盖矿物油的KSOM培养基(SigmaAldrich)中，获得2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚期胚胎。PMSG注射44小时后取小鼠卵巢获得GV期卵母细胞。MII期卵母细胞需要用透明质酸酶(Sigma-Aldrich)消化去除颗粒细胞。

胚胎免疫荧光

小鼠胚胎在4％多聚甲醛(Solarbio)中固定30分钟，在含0.3％TritonX-100的PBS中透膜20分钟。用1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)在PBS中封闭1h后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Vector Laboratories)复染10分钟。封片后，用激光共聚焦显微镜(ZeissLSM 780，卡尔蔡司，德国)观察卵母细胞/胚胎。

体外cRNA合成及显微注射

用适当的限制性内切酶将质粒线性化。按照公司的方法，使用mMESSAGE mMACHINET7 Transcription Kit(Invitrogen,AM1344)合成含5'帽子的cRNA，然后使用Poly(A)Tailing Kit(Invitgen,AM1350)加入poly(A)尾，最后使用RNeasy MinElute Cleanup Kit(QIAGEN,74204)纯化并在无核酸酶水中稀释。将约5pl的cRNA溶液(1400ng/ul)显微注射到受精卵的细胞质中。

分子建模和进化保守性分析

利用SWISS-MODLE网站(PDB ID：6C9D)预测CHK1(NP_001265.2)的三维结构。通过PyMol软件进行分子绘图和分析。用Clustalx软件进行进化保守性分析。

细胞转染和免疫荧光

HEK-293(T)细胞用含10％胎牛血清(FBS，BI，04-001-1ACS)的DMEM/高糖培养基(HyClone，SH30243.01B)在37℃、5％CO₂条件下培养。当细胞密度达到70％～80％融合时，使用Lipofectamine 3000转染试剂盒(Invitrogen,L3000015)按照制造商提供的方案进行转染。

HEK-293(T)细胞用含10％胎牛血清(FBS，BI，04-001-1ACS)的DMEM/高糖培养基(HyClone,SH30243.01B)在37℃、5％CO₂条件下培养。当细胞密度达到70％～80％融合时，使用Lipofectamine 3000转染试剂盒(Invitrogen,L3000015)按照制造商提供的方案进行转染。生长在载玻片(NEST，801007)上的HEK-293细胞，共转染mCherry-WT和EGFP-WT或突变的Chk148小时后，用温PBS漂洗，然后用4％多聚甲醛室温固定20分钟。接着用冷PBS洗涤3次后，在含0.3％Triton X-100的PBS中透化20min，随后用含5％BSA的PBS封闭1h，并用DAPI复染10分钟。对于胚胎干细胞，封闭后在4℃孵育一抗过夜，然后在室温下孵育二抗(invitrogen)1小时。抗体如表7所示。

CHK1激酶活性测定

收集具有转染野生型或突变型CHK1构建体的HEK-293T细胞，48小时后加入500nMCPT处理2小时。根据制造商的说明，采用96孔板检查点激酶活性检测试剂盒(STA-414，CellBiolabs)检测不同组别CHK1激酶活性。以各组OD值(450nm)与WT组OD值的比值表示相对激酶活性。

定量RT-PCR

根据制造商的说明，使用REPLI-g WTA Single Cell Kit(QIAGEN)试剂盒，使用不同发育阶段的小鼠卵母细胞和胚胎获得cDNA。使用Power SYBR Green Master Mix(Takara)在Roche 480PCR系统上进行qRT-PCR分析。CHK1的相对表达量为1000·2^-ΔCt，其中ΔCt＝Ct(CHK1)-Ct(GAPDH)。qRT-PCR引物见下表。

表6

外显子测序引物	序列
		CHK1-Exon2-F	GCTGTTAATTTTCGTGGGCA
CHK1-Exon2-R	TTCAGTTGCCAAAACCCTTG
		CHK1-Exon3-F	TGAGAACATAGCAGAAACCACT
CHK1-Exon3-R	TCCAATTTCACAGTTGCATGAG
		CHK1-Exon4_5-F	AAGCCCCATATGTGTTAGTGG
CHK1-Exon4_5-R	AGACTTGATTTTGCCTTGTATGG
		CHK1-Exon6-F	TGATGAGGGGCCTTGCTTTA
CHK1-Exon6-R	TCTGGCCAAGAGTGAGACC
		CHK1-Exon7-F	TGAAGTGCCTCTAAAGTTTCCA
CHK1-Exon7-R	TGCTCTGAATATACACTCCCCA
		CHK1-Exon8-F	ACTCCAAGATACAGCAGCAGA
CHK1-Exon8-R	GCTATCATGTGTTGTTGACTTGT
		CHK1-Exon9-F	ACTCCACACTTTGAACATGTCT
CHK1-Exon9-R	TCACACACAAGTTCTCATGCT
		CHK1-Exon10-F	TCAGGTGGTGTGTCAGAGTC
CHK1-Exon10-R	GCCTCCCTCCTCTCTTTCTT
		CHK1-Exon11-F	GGGAGGCCTTCATGCAAAAT
CHK1-Exon11-R	CACCCCAGCCTCCCAAAA
		CHK1-Exon12-F	CCTGGTCTGAAGCGATCCT
CHK1-Exon12-R	AGTCTCTTGTATTGTCACCCAGA
		CHK1-Exon13-F	AGGAACAGTGATGGGCATGA
CHK1-Exon13-R	TGGATAAACAGGGAAGTGAACAC

蛋白免疫印迹检测

将100枚卵母细胞/早期胚胎或收集的HEK-293T细胞在含有蛋白磷酸酶抑制剂(碧云天，P1046)的蛋白裂解液中裂解30min左右，然后在95℃下变性10min。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白并转移至PVDF膜(Millipore)。使用一抗在4℃孵育过夜，然后用HRP缀合的二抗室温孵育1小时。最终采用Image Lab凝胶成像系统(Bio-Rad)进行制膜。所用抗体见下表。

表7

抗体	来源	货号	应用
				OCT4抗体	Santa Cruz	sc-5279	IF
Sox2(D6D9)抗体	Cell Signaling Technology	3579S	IF
				SSEA4抗体	Abcam	ab16287	IF
TRA-1-60抗体	Abcam	ab16288	IF
				TRA-1-81抗体	Santa Cruz	sc-21706	IF
β-肌动蛋白单克隆抗体	Protein tech	66009-1-Ig	WB
				GAPDH单克隆抗体	Protein tech	60004-1-Ig	WB
CDK1抗体	Abcam	ab32094	WB
				CDK1(磷酸化T14)抗体	Abcam	ab58509	WB
磷酸化-cdc25C(丝氨酸216)抗体	Cell Signaling Technology	9528S	WB
				Cdc25C抗体	Abcam	ab226958	WB
p-Cdc2 p34(pY 15.44)抗体	Santa Cruz	sc-136014	WB

胚胎移植

在胚胎移植实验中，将野生型或突变型CHK1 cRNA注射到C57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)的受精卵中。将携带突变体的受精卵在含10nM PF477736(Selleck，S2904)的M16培养基(Sigma公司，M7292)中培养至2-细胞胚胎，分别与对照和WT2-细胞胚胎一起移植到假孕ICR雌性小鼠体内，观察各组小鼠的产仔数和体重。所有小鼠实验方案均经山东大学生殖医学伦理审查委员会(IRB)审查批准。

拷贝数变异分析(Cnv-seq)

根据制造商的说明，使用SurePlex WGA(Veri Seq PGS Kit，Illumina)进行全基因组扩增。随后采用DA8600高通量测序平台进行测序。CNV分析是将PF477736处理的突变囊胚序列与正常对照囊胚序列进行比对，以检测是否存在染色体非整倍体异常或大于4Mb的染色体缺失或重复。对于PF477736处理的胚胎来源的ESC，用相同的方法使用一个细胞系的克隆进行WGA，然后在Miseq系统(Illumina)上进行文库制备和测序。下表显示了PF477736处理后突变的小鼠囊胚的CNV分析结果。

表8

囊胚	CNV-seq结果
		F441fs*16-1	平衡，整倍体
F441fs*16-2	平衡，整倍体
		F441fs*16-3	平衡，整倍体
F441fs*16-4	平衡，整倍体
		R379Q-1	平衡，整倍体
R379Q-2	平衡，整倍体
		R379Q-3	平衡，整倍体
R379Q-4	平衡，整倍体

统计学分析

采用GraphPadPrism 8.0进行统计分析。大多数实验至少重复3次。两组间比较采用非配对t检验或卡方检验。GraphPad显著性评价如下：**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

胚胎发育培养基添加剂

在确定过表达野生型CHK1的小鼠受精卵可以正常发育至囊胚后，申请人还注意到添加CHK1抑制剂后卵裂率和囊胚发育率都有显著提高。在此基础上，申请人进一步检测改良培养基(即，按照本发明的总体发明理念改良的培养基)能否提高囊胚发育率。

基于总培养基体积的浓度，在小于0.1nM的低浓度(低)、0.1nM到100nM的中浓度(中)和大于100nM的高浓度(高)三个浓度范围内测试CHK1抑制剂。

总的来说，在受精后4-6小时，将获得具有明显双原核的受精卵加入到添加不同剂量CHK1抑制剂的培养基中，培养至囊胚阶段(图18A)，比较不同组别囊胚发育情况(发育速率与胚胎质量)。结果表明，添加一定剂量的CHK1抑制剂(例如，中等剂量)可以显著提高囊胚发育率。相比之下，低剂量组在提高囊胚发育率方面无显著获益，而高剂量组抑制胚胎发育(例如，胚胎质量)。据此，本发明的总体发明理念认识到特定剂量范围的CHK1抑制剂确实显著促进了囊胚发育(图18B&C)。

因此，本发明的总体发明理念也部分基于这样的发现，即通过在培养基中添加添加剂可以增强或改善胚胎发育。改良的培养基可以提高哺乳动物胚胎的早期胚胎发育，包括促进囊胚发育率，避免与其他疗法相关的胚胎质量问题。在某些实施方案中，添加剂选自CHK1抑制剂。在某些实施方案中，添加剂选自第一代抑制剂(例如，PF477736和/或AZD7762等)、第二代抑制剂CCT245737等。

本发明的总体发明理念也认识到并涉及在所述培养物中生产培养基和培养哺乳动物胚胎的过程。如本文所示，该添加剂可以在不影响胚胎发育潜能的情况下，显著提高常规哺乳动物胚胎培养基和各种商业培养基中的囊胚发育率，并且可以与已知显著促进早期胚胎发育的各种添加剂联合使用。

囊胚发育培养方法

小鼠卵母细胞体外受精：选取适龄雌性小鼠进行超数排卵：腹腔注射5IU孕马血清促性腺激素(PMSG)，44-48小时后注射5IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)。约16小时后在输卵管壶腹部收集卵丘卵母细胞复合体(COC)。从雄性小鼠附睾尾收集精子，在常规获能培养基中获能1小时。将COC和获能精子加入到覆盖有矿物油的常规体外受精培养基中，在37℃和5％CO₂下培养。4-6小时后，将形成的受精卵移入覆盖有矿物油的胚胎培养基中，在37℃、5％CO₂下继续培养至囊胚期。

含添加剂(例如，CHK1抑制剂)的胚胎发育培养基的制备

本领域技术人员将认识到本发明的添加剂的适用性，其可赋予本领域中已知的任何合适的哺乳动物胚胎培养基，包括，例如，碳酸氢盐缓冲培养基、Hepes缓冲或MOPS缓冲培养基或磷酸盐缓冲盐水，常用培养基的实例包括G1/G1-Plus、G2/G2-Plus、G-MOPS、KSOM、M16、M2、PBS。此外，在某些实施方案中，该添加剂与已知的促进早期胚胎发育的补充因子(如人血清白蛋白、胎牛血清白蛋白、生长激素、褪黑素、IGF2等)联合使用。这种强化培养基可以改善胚胎发育的至少一个方面，包括但不限于哺乳动物早期胚胎发育的速度和质量。

在含有CHK1抑制剂的胚胎培养基中培养胚胎

将胚胎培养基(例如，G1-plus)提前在合适的条件下平衡适当的时间，加入相应的CHK1抑制剂。按照上述方法对小鼠卵母细胞进行体外受精。4-6小时后，可观察到受精卵雌雄原核的形成。此时，将受精卵转入含有CHK1抑制剂的胚胎培养基中继续培养至囊胚期，或待胚胎发育至晚期2细胞并培养至囊胚后换为不含抑制剂的胚胎培养基。

囊胚发育

为了检测添加CHK1抑制剂后获得的胚胎质量，申请人按照以下标准对各浓度组的囊胚进行评分：

1级：早期有腔囊胚，囊胚腔腔小于胚胎体积的1/2。

2级：囊胚腔体积大于或等于囊胚体积的1/2。

3级：囊胚完全扩张，囊胚腔占据胚胎。

4级：囊胚完全扩张，囊胚腔较早期胚胎大，透明带变薄。

5级：孵化囊胚，滋养层开始突破透明层。

6级：孵出囊胚，囊胚完全从透明带处孵出。

结果显示，中等剂量组各等级胚胎尤其是优质胚胎(4/5/6级)所占比例与无抑制剂组相当(图19A)。同时，对中剂量组获得的胚胎进行DNA损伤标志蛋白γH2AX的免疫荧光染色，结果显示抑制剂组囊胚并没有显著提高γH2AX的表达(图19B)。接下来，我们选取中剂量组囊胚进行CNV-seq分析，结果显示抑制剂组胚胎倍体完整，未见明显的大片段染色质缺失或重复(图19C)。综上结果表明，在培养基中添加适当剂量的CHK1抑制剂可以在不影响胚胎质量的情况下显著提高囊胚发育率。

正如总体发明理念所表明的那样，在某些实施方案中(例如，培养基)，任何添加剂的浓度(如CHK1抑制剂)，都应该被调节以达到预期的结果(例如，提高胚胎发育率)，同时避免胚胎质量问题。在某些示例性实施方案中，添加剂(例如，CHK1抑制剂)的浓度为0.1nM-100nM。

下表是根据本发明的总体发明理念在组合物和方法中考虑使用的CHK1抑制剂列表。

表9

综上所述，本文所呈结果表明，在卵母细胞中CHK1功能改变(包括激酶活性增加的突变CHK1蛋白)的个体诱导受精卵分裂失败。因此，本发明的总体发明理念认识到抑制CHK1激酶活性可以成功恢复受精卵分裂的方法，并在早期胚胎发育中完成从减数分裂到有丝分裂的转变，从而治疗CHK1活性改变和相关的不育(例如，受精卵阻滞)。

这在一定程度上是基于CHK1中发现了新的显性遗传变异，引发受精卵阻滞导致女性不育，表现为原核融合失败。申请人还证实，突变引起的CHK1活性增加使受精卵G2/M转换停滞。重要的是，施用CHK1抑制剂抑制其激酶的活性，可以挽救小鼠和人类的受精卵阻滞的表型，为这种类型的不孕症提供有效和安全的治疗方案。申请人还证明，在胚胎培养基中添加CHK1抑制剂可以提高囊胚的发育率，同时避免了先前已知的与胚胎质量有关的缺陷。

虽然本发明的各种发明方面、理念和特征可以在示例性实施案例中以组合的形式加以描述和说明，但这些不同的方面、理念和特征可以在许多替代实施方案中单独使用，也可以在其各种组合和子组合中使用。除非在本文明确排除，否则所有此类组合及子组合均在本发明的范围内。此外，尽管对本发明的各个方面、理念和特征的各种替代性实施方案(例如替代性材料、结构、配置和方法)的描述无意成为一个完整或详尽的可用替代性实施方案列表，无论是目前已知的还是后来开发的。在本发明的范围内，即使在本文中没有明确披露该实施方案，本领域技术人员可以很容易地将本发明的一个或多个方面、理念或特征纳入本发明范围内的附加实施方案和用途中。此外，即使本发明的某些特征、理念或方面在本文可被描述为一种优选的安排或方法，但除非明文规定，否则这种描述无意表明这种特征是必要的或必需的。此外，还可以包括示例性或代表性的数值和范围，以帮助理解本公开，但是，这些数值和范围不应在有限的意义上解释，只有在明确说明的情况下，才能够成为关键数值或范围。此外，还可以包括示例性或代表性的数值和范围，以帮助理解本公开，但是，这些数值和范围不应在有限的意义上解释，只有在明确说明的情况下，才能够成为关键数值或范围。

被认定为“近似”或“大约”的某一具体数值的参数，除非另有明文规定，旨在既包括具体数值，也包括具体数值10％以内的值。此外，应理解，本申请所附附图可以但不必须是标尺，因此可以理解为教导了附图中明显的各种比例和占比。此外，虽然各方面、特征和理念可以在本文中被明确认定为发明或构成发明的一部分，但这种认定并不是排他性的，而是可能存在在本文中被完整描述的发明方面、理念和特征，而没有被明确认定为发明或构成具体发明的一部分，相反，这些发明在所附权利要求中加以阐述。除非有明确说明，对示例性方法或过程的描述不限于将所有步骤包括在所有情况下都是必需的，也不限于将步骤呈现的顺序解释为必需或必要。

序列表

<110> 山东大学

<120> 改善早期胚胎发育的方法

<130> DSP1V230067XN

<150> US63/180,926

<151> 2021-04-28

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-LF097-正向引物

<400> 1

ggttggtcaa aagaatgaca caattcttta ccaaattgga tgc 43

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-LF097-反向引物

<400> 2

gcatccaatt tggtaaagaa ttgtgtcatt cttttgacca acc 43

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-LF057- 正向引物

<400> 3

agaaatggat gataaaatat tggttgactt cggctttcta aggtatttt 49

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-LF057- 反向引物

<400> 4

aaaatacctt agaaagccga agtcaaccaa tattttatca tccatttct 49

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-LF033- 正向引物

<400> 5

ggatgataaa atattggttg acttccagct ttctaaggta tttttatgtt tta 53

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-LF033- 反向引物

<400> 6

taaaacataa aaatacctta gaaagctgga agtcaaccaa tattttatca tcc 53

<210> 7

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-LF160- 正向引物

<400> 7

ggttactata tcaacaactg ataggaaaaa caataaactc attttcaaag tga 53

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-LF160- 反向引物

<400> 8

tcactttgaa aatgagttta ttgtttttcc tatcagttgt tgatatagta acc 53

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDC25C- 正向引物

<400> 9

agttctctgg catcgccggg gagcgatata g 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDC25C- 反向引物

<400> 10

ctatatcgct ccccggcgat gccagagaac t 31

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDK1- 正向引物

<400> 11

cccttataca caactccagc ggcaccttct ccaattttct ctattttggt ataatctt 58

<210> 12

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CDK1- 反向引物

<400> 12

aagattatac caaaatagag aaaattggag aaggtgccgc tggagttgtg tataaggg 58

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-RT- 正向引物

<400> 13

gatcatcagc aatgcctcct 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-RT- 反向引物

<400> 14

ttcagctcag ggatgacctt 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH-RT- 正向引物

<400> 15

ctgcaccacc aactgcttag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH-RT- 反向引物

<400> 16

ggatgcaggg atgatgttct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon2- 正向引物

<400> 17

gctgttaatt ttcgtgggca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon2- 反向引物

<400> 18

ttcagttgcc aaaacccttg 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon3- 正向引物

<400> 19

tgagaacata gcagaaacca ct 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon3- 反向引物

<400> 20

tccaatttca cagttgcatg ag 22

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon4_5- 正向引物

<400> 21

aagccccata tgtgttagtg g 21

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon4_5- 反向引物

<400> 22

agacttgatt ttgccttgta tgg 23

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon6- 正向引物

<400> 23

tgatgagggg ccttgcttta 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon6- 反向引物

<400> 24

tctggccaag agtgagacc 19

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon7- 正向引物

<400> 25

tgaagtgcct ctaaagtttc ca 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon7- 反向引物

<400> 26

tgctctgaat atacactccc ca 22

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon8- 正向引物

<400> 27

actccaagat acagcagcag a 21

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon8- 反向引物

<400> 28

gctatcatgt gttgttgact tgt 23

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon9- 正向引物

<400> 29

actccacact ttgaacatgt ct 22

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon9- 反向引物

<400> 30

tcacacacaa gttctcatgc t 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon10- 正向引物

<400> 31

tcaggtggtg tgtcagagtc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon10- 反向引物

<400> 32

gcctccctcc tctctttctt 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon11- 正向引物

<400> 33

gggaggcctt catgcaaaat 20

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon11- 反向引物

<400> 34

caccccagcc tcccaaaa 18

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon12- 正向引物

<400> 35

cctggtctga agcgatcct 19

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon12- 反向引物

<400> 36

agtctcttgt attgtcaccc aga 23

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon13- 正向引物

<400> 37

aggaacagtg atgggcatga 20

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CHK1-Exon13- 反向引物

<400> 38

tggataaaca gggaagtgaa cac 23

Claims

1.培养基在哺乳动物胚胎培养中的用途，其中所述哺乳动物胚胎为受精卵原核形成到囊胚期的哺乳动物胚胎，所述培养基包含治疗有效量的CHK1抑制剂；所述CHK1抑制剂为PF477736。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述培养基包含0.1nM至100nM的用量的CHK1抑制剂。

3.一种促进胚胎发育的方法，其包括：提供培养基，添加治疗有效量的CHK1抑制剂，并将胚胎与所述培养基接触；所述胚胎是利用未经过体内发育的受精14天以内的胚胎；所述CHK1抑制剂为PF477736。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述CHK1抑制剂以0.1nM至100nM的用量存在。

5.根据权利要求3所述的方法，其中发育是通过提高囊胚发育率来增强。

6.CHK1抑制剂在制备用于治疗不孕症的产品中的用途，所述产品用于如下方法，所述方法包括：识别具有CHK1活性增强的个体，并向所述个体施用治疗有效量的CHK1抑制剂；其中，所述CHK1抑制剂为PF477736。