ES2633648T3 - Diferenciación de células madre embrionarias humanas - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro para aumentar la expresión de NGN3 y NKX6.1 en una población de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, que comprende las etapas de: a) cultivar las células madre pluripotenciales b) diferenciar las células madre pluripotenciales en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en un medio que comprende activina A, c) diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, complementando el medio utilizado para diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632, y ML-7, y d) diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.

Description

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Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas
DESCRIPCION
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos para estimular la diferenciacion de celulas madre pluripotenciales en celulas productoras de insulina. En particular, la presente invencion proporciona un metodo para aumentar la expresion de NGN3 y NKX6.1 en las poblaciones de celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico.
Antecedentes
Los avances en la terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus tipo I y la escasez de islotes de Langerhans trasplantables han centrado el interes en el desarrollo de fuentes de celulas productoras de insulina, o celulas p, apropiadas para el injerto. Un enfoque es la generacion de celulas p funcionales a partir de celulas madre pluripotenciales, tales como, por ejemplo, celulas madre embrionarias.
Durante el desarrollo embrionario de los vertebrados, una celula pluripotencial da lugar a un grupo de celulas que comprenden tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulacion. Los tejidos tales como, por ejemplo, el tiroides, el timo, el pancreas, el intestino y el tngado, se desarrollara a partir del endodermo, a traves de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso es la formacion de endodermo definitivo. Las celulas definitivas del endodermo expresan una serie de marcadores, tales como, beta HNF3, GATA4, MIXL1, CXCR4 y SOX 17.
La formacion del pancreas surge de la diferenciacion de endodermo definitivo en el endodermo pancreatico. Las celulas del endodermo pancreatico expresan el gen homeobox duodenal-pancreatico, PDX1. En ausencia de PDX1, el pancreas no logra desarrollarse mas alla de la formacion de yemas ventrales y dorsales. Por tanto, la expresion de PDX1 marca una etapa cntica en la organogenesis pancreatica. El pancreas madura contiene, entre otros tipos de celulas, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos exocrinos y endocrinos surgen de la diferenciacion del endodermo pancreatico.
Las celulas que soportan las propiedades de las celulas de los islotes se han derivado in vitro, segun se ha informado, de celulas embrionarias de raton. Por ejemplo, Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) senalan que la diferenciacion de las celulas madre de embriones de raton en estructuras secretoras de insulina es similar a la de los islotes pancreaticos. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) senalan que las celulas secretoras de insulina derivadas de las celulas madre de embriones de raton normalizan la glucemia cuando se implantan en ratones con diabetes inducida por estreptozotocina.
En un ejemplo, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) divulgan que el tratamiento de las celulas madre de embriones de raton con inhibidores de la fosfoinositido 3-quinasa (LY294002) produjo celulas que se paredan a las celulas p.
En otro ejemplo, Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) informan que la generacion de celulas productoras de insulina a partir de celulas madre de embriones de raton expresan constitutivamente Pax4.
Micallef et al. informan que el acido retinoico puede regular la implicacion de las celulas madre embrionarias en la formacion de endodermos pancreatico positivo para PDX1. El acido retinoico es el mas efectivo en la induccion de la expresion de PDX1 cuando se anade a cultivos el dfa 4 de la diferenciacion de la celula madre embrionaria, durante un penodo que se corresponde con el final de la gastrulacion en el embrion (Diabetes 54:301, 2005).
Miyazaki et al. informan que una lmea de celulas madre de embrion de raton sobreexpresa Pdx1. Sus resultados muestran que la expresion exogena de Pdx1 potencia claramente la expresion de insulina, somatostatina, glucoquinasa, neurogenina 3, p48, Pax6, and HNF6 en las celulas diferenciadas resultantes (Diabetes 53: 1030, 2004).
Skoudy et al. informan que la activina A (miembro de la superfamilia de TGF-p) regula por aumento la expresion de los genes pancreaticos exocrinos (p48 y amilasa) y de los genes endocrinos (Pdx1, insulina y glucagon) en celulas madre de embrion de raton. Se observo el maximo efecto utilizando actlvlna A 1 nM. Tambien se observo que el nivel de expresion de ARNm de insulina y Pdx1 no se vefa afectado por el acido retinoico; sin embargo, el tratamiento con FGF7 de 3nM dio como resultado un incremento en el nivel de la transcripcion de Pdx1 (Biochem. J. 379: 749.2004).
Shiraki et al. estudiaron los efectos de los factores de crecimiento que potencian espedficamente la diferenciacion de las celulas madre embrionarias en el interior de las celulas positivas para Pdx1. Observaron que la reproducibilidad de TGF-p2 produda una mayor proporcion de celulas positivas para PDX1 (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).
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Gordon et al. demostraron la induccion de celulas del endodermo [positiva]/ HNF3 beta [positiva] a partir de celulas madre de embriones de raton, en ausencia de suero y en presencia de actlvina, junto con un Inhibidor de la senalizacion de Wnt (documento US 2006/0003446A1).
Gordon et al. (PNAS, Vol. 103, pagina 16806, 2006) declara "se requirio la senalizacion simultanea de Wnt y TGF- beta/ nodal/ activina para la generacion de la lmea primitiva anterior."
Sin embargo, el desarrollo del modelo de celulas madre de embriones de raton puede no imitar exactamente el programa de desarrollo en mairnferos superiores como, por ejemplo, los seres humanos.
Thomson et al. aislaron celulas madre embrionarias de blastocltos humanos (Science 282:114, 1998). Al mismo tiempo, Gearhart y colaboradores derivaron lmeas de celulas germinales embrionarias humanas (hEG) a partir del tejido gonadal fetal (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). A diferencia de las celulas madre embrionarias de raton, a las que se puede impedir la diferenciacion simplemente mediante el cultivo con el factor inhibidor de la leucemia (LIF), las celulas madre embrionarias humanas deben conservarse en condiciones muy especiales (patente de Estados Unidos n.° 6.200.806; documento WO 99/20741; documento WO 01/51616).
D'Amour et al. describen la produccion de cultivos enriquecidos con endodermo definitivo derivado de celulas madre embrionarias de seres humanos en presencia de una elevada concentracion de actlvlna y baja de suero (Nature Biotechnology 2005). El transplante de estas celulas bajo la capsula renal de los ratones dio como resultado la diferenciacion en celulas mas maduras con las caractensticas de algunos organos endodermicos. Las celulas de endodermo definitivo derivado de celulas madre embrionarias pueden diferenciarse adicionalmente en celulas positivas para PDX1 tras la adicion de FGF1 (documento US 2005/266554A1).
D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)) indican: “Hemos desarrollado un proceso de diferenciacion que convierte las celulas madre embrionarias de humanos (hES) en celulas endocrinas capaces de sintetizar las hormonas pancreaticas: insulina, glucagon, somatostatina, polipeptido pancreatico y grelina. Este proceso imita la organogenesis pancreatica in vivo conduciendo las celulas a traves de vahas etapas que se parecen al endodermo definitivo, al endodermo del tubo intestinal, al endodermo pancreatico y al precursor endocrino, en ruta hacia las celulas que expresan hormonas endocrinas".
En otro ejemplo, Fisk et al. senalan un sistema para producir celulas de los islotes pancreaticos a partir de celulas madre embrionarias humanas (documento US2006/0040387A1). En este caso, la via de diferenciacion se dividio en tres etapas. Primero, las celulas madre embrionarias humanas se diferenciaron en endodermo utilizando una combinacion de butirato de sodio y activina A. A continuacion, se cultivaron las celulas con antagonistas de TGF-p, tal como Noggin combinado con EGF o beta-celulina para generar celulas positivas para PDX1. La diferenciacion terminal se indujo con nicotinamida.
En un ejemplo, Benvenistry et al. indica: "Concluimos que la sobreexpresion de PDX1 potenciaba la expresion de los genes pancreaticos enriquecidos, que la induccion de la expresion de insulina puede requerir senales adicionales que solo estan presentes in vivo" (Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930).
En otro ejemplo, Grapin-Botton et al indican: "La activacion temprana de Ngn3 indujo casi exclusivamente celulas [positivas] de glucagon al tiempo que agotaba la reserva de progenitores en el pancreas. Como de E11,5, los progenitores de PDX-1 se hicieron competentes para diferenciarse en celulas [positivas] de insulina y [positivas] de PP (Johansson KA et al, Developmental Cell 12, 457 - 465, marzo de 2007).
La expresion de NGN3 en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico puede reducir la capacidad de las celulas para diferenciarse adicionalmente en celulas que expresan insulina. Estudios previos han demostrado que las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico que expresan NGN3 son mas propensas a producir celulas que expresan glucagon que celulas que expresan insulina, cuando se someten a una mayor diferenciacion. Sin embargo, la expresion de NGN3 se requiere para formar celulas endocrinas pancreaticas, o celulas precursoras endocrinas pancreaticas (celulas que pueden formar, por ejemplo, glucagon, o celulas que expresan insulina). Por lo tanto, la regulacion temporal de NGN3 es importante para guiar el destino final de las celulas precursoras endocrinas pancreaticas hacia celulas que expresan insulina.
En consecuencia, sigue existiendo una necesidad significativa de desarrollar condiciones que permitan establecer lmeas de celulas madre pluripotenciales que puedan expandirse para abordar las necesidades clmicas actuales, al tiempo que retienen el potencial para su diferenciacion en celulas que expresan insulina. La presente invencion adopta un enfoque alternativo para mejorar la eficacia de la diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas a celulas que expresan insulina, proporcionando un metodo para aumentar la expresion de NGN3 y NKX6.1 en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico.
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SUMARIO
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para aumentar la expresion de NGN3 y NKX6.1 en una poblacion de celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, que comprende las etapas de:
a) cultivar las celulas madre pluripotenciales
b) diferenciar las celulas madre pluripotenciales en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo en un medio que comprende activita A,
c) diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico, complementando el medio utilizado para diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7, y
d) diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico.
En una realizacion, el medio usado para diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico se complementa con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmanina, SB-203580, SB-202190, Tirfostina 25, Tirfostina, AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7.
DESCRIPCION DETALLADA
En aras de la claridad de la divulgacion, y no a modo de limitacion, la descripcion detallada de la invencion se divide en las subsecciones que describen o ilustran ciertas caractensticas, realizaciones o aplicaciones de la presente invencion.
Definiciones
Las celulas madre son celulas indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de una sola celula tanto para autorrenovarse como para diferenciarse para producir celulas descendientes, incluidas celulas progenitoras autorrenovantes, progenitoras no renovantes y celulas terminalmente diferenciadas. Las celulas madre tambien se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en celulas funcionales de diversos linajes celulares a partir de multiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), asf como para dar lugar a los tejidos de multiples capas germinales despues del trasplante y para contribuir sustancialmente a la mayona, si no todos, los tejidos despues de inyectarse en blastocistos.
Las celulas madre se clasifican de acuerdo con su potencial de desarrollo como: (1) totipotenciales, que son capaces de dar lugar a todos los tipos de celulas embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotenciales, que significa que son capaces de dar lugar a todos los tipos de celulas embrionarias; (3) multipotenciales, que significa son capaces de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, organo o sistema fisiologico concreto (por ejemplo, las celulas madre hematopoyeticas (HSC) pueden producir una descendencia que incluye HSC (autorrenovantes), progenitoras oligopotenciales limitadas a celulas sangumeas, y todos los tipos de celulas y elementos (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre. (4) oligopotenciales, que significa que son capaces de dar lugar a un subconjunto mas restringido de linajes celulares que las celulas madre multipotenciales; y (5) unipotenciales, que significa que son capaces de dar lugar a un unico linaje celular (por ejemplo, celulas madre espermatogenicas).
La diferenciacion es el proceso mediante el cual una celula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las caractensticas de una celula especializada, tal como, por ejemplo, una celula nerviosa o una celula muscular. Una celula diferenciada o inducida por diferenciacion es la que ha adquirido una posicion mas especializada ("comprometida") dentro del linaje de una celula. El termino “comprometida”, cuando se aplica al proceso de diferenciacion, se refiere a una celula que ha avanzado en la via de diferenciacion hasta un punto en la que, en circunstancias normales, continuara diferenciandose hasta un tipo de celula o subconjunto de tipos de celulas espedfico, y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse a un tipo de celula diferente o volver a un tipo de celula menos diferenciada. Desdiferenciacion se refiere al proceso mediante el cual una celula vuelve a una posicion menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una celula. Tal como se utiliza en el presente documento, el linaje de una celula define la herencia de la celula, es decir, de que celulas procedfa y a que celulas puede dar lugar. El linaje de una celula coloca a la celula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciacion. Un marcador espedfico de linaje se refiere a una caractenstica espedficamente asociada con el fenotipo de celulas de un linaje de interes y puede usarse para evaluar la diferenciacion de una celula no
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comprometida con el linaje de interes.
"Celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje de endodermo definitivo", o "celulas de Etapa 1", o "Etapa 1", como se usa en el presente documento, se refiere a celulas que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, protema homeobox similar a Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 o OTX2. Las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo incluyen celulas precursoras de lmea primitiva, celulas de lmea primitiva, celulas del mesoendodermo y celulas de endodermo definitivo.
"Celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje de endodermo pancreatico", como se usa en el presente documento, se refiere a celulas que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1, HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, NKX6.1, o HB9. Las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje del endodermo pancreatico incluyen celulas de endodermo pancreatico, celulas de tubo intestinal primitivo y celulas de intestino anterior posterior.
“Endodermo definitivo", como se usa en el presente documento, se refiere a celulas que llevan las caractensticas de las celulas derivadas de la epiblasto durante la gastrulacion y que forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las celulas del endodermo definitivo expresan los siguientes marcadores: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 y MIXL1.
“Marcadores", como se usa en el presente documento, son las moleculas de acido nucleico o polipeptfdicas que se expresan diferencialmente en una celula de interes. En este contexto, la expresion diferencial significa un aumento del nivel de un marcador positivo y una disminucion del nivel de un marcador negativo. El nivel detectable del marcador acido nucleico o polipeptido es suficientemente mas alto o mas bajo en las celulas de interes en comparacion con otras celulas, de tal manera que la celula de interes puede identificarse y distinguirse de otras celulas utilizando cualquiera de una variedad de metodos conocidos en la tecnica.
"Celula pancreatica endocrina" o "celula que expresa hormona pancreatica", como se usa en el presente documento, se refiere a una celula capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipeptido pancreatico.
Aislamiento, expansion y cultivo de celulas madre pluripotenciales
Caracterizacidn de celulas madre pluripotenciales
Las celulas madre pluripotenciales pueden expresar uno o mas de los antfgenos embrionarios espedficos de la etapa (SSEA) 3 y 4, y marcadores detectables usando los anticuerpos designados Tra-1- 60 y Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). La diferenciacion de las celulas madre pluripotenciales in vitro da como resultado la perdida de expresion de SSEA-4, Tra 1-60 y Tra 1-81 (si esta presente) y el aumento de expresion de SSEA-1. Las celulas madre pluripotenciales no diferenciadas tienen, tfpicamente, actividad de fosfatasa alcalina, que puede detectarse mediante la fijacion de las celulas con paraformaldel'ndo al 4 % y, despues, desarrollando con Vector Red como sustrato, como describe el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Las celulas madre pluripotenciales no diferenciadas tambien expresan tfpicamente OCT4 y TERT, segun lo detectado mediante RT- PCR.
Otro fenotipo deseable de celulas madre pluripotenciales propagadas es un potencial de diferenciarse en celulas de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. Pluripotencia de las celulas madre pluripotenciales se puede confirmar, por ejemplo, mediante la inyeccion de celulas en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), fijando los teratomas que se forman usando 4 % de paraformaldel'ndo y, despues, examinandolos histologicamente para detectar evidencia de tipos de celulas de las tres capas germinales. Como alternativa, la pluripotencia se puede determinar mediante la creacion de cuerpos embrioides y la evaluacion de los cuerpos embrioides para determinar la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.
Las lmeas de celulas madre pluripotenciales propagadas pueden cariotiparse utilizando una tecnica de bandas G estandar y se comparan con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable obtener celulas que tienen un "cariotipo normal", lo que significa que las celulas son euploides, en las que todos los cromosomas humanos estan presentes y no estan alterados de forma notable.
Fuentes de celulas madre pluripotenciales
Los tipos de celulas madre pluripotenciales incluyen lmeas establecidas de celulas pluripotenciales derivadas de tejido formado despues de la gestacion, incluyendo tejido preembrionario (tal como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestacion, tfpicamente, pero no necesariamente, antes de aproximadamente 10-12 semanas de gestacion. Ejemplos no limitantes son lmeas establecidas de celulas madre embrionarias humanas o celulas germinales embrionarias humanas, tales como, por ejemplo, las lmeas de celulas madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 (WiCell). Tambien se describe el uso de las
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composiciones de la presente divulgacion durante el establecimiento o estabilizacion inicial de dichas celulas, en cuyo caso las celulas fuente senan celulas pluripotenciales primarias ex^das directamente de los tejidos fuente. Tambien se describen celulas tomadas de una poblacion de celulas madre pluripotenciales ya cultivadas en ausencia de celulas alimentadoras. Tambien se describen lmeas mutantes de celulas madre embrionarias humanas, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Athens, GA).
Las celulas madre embrionarias humanas descritas pueden prepararse como describen Thomson et al. (patente de Estados Unidos n.° 5.843.780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Cultivo de celulas madre pluripotenciales
En una realizacion, las celulas madre pluripotenciales se cultivan tfpicamente sobre una capa de celulas alimentadoras que soportan las celulas madre pluripotenciales de varias maneras. Como alternativa, las celulas madre pluripotenciales se cultivan en un sistema de cultivo que esta esencialmente libre de celulas alimentadoras, pero, no obstante, apoya la proliferacion de celulas madre pluripotenciales sin experimentar una diferenciacion sustancial. El crecimiento de celulas madre pluripotenciales en cultivos libres de alimentacion sin diferenciacion se soporta utilizando un medio acondicionado por cultivo previo con otro tipo celular. Como alternativa, el crecimiento de celulas madre pluripotenciales en cultivo libre de alimento sin diferenciacion se soporta utilizando un medio qmmicamente definido.
Por ejemplo, Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)) y Thompson et al (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147) divulgan el cultivo de lmeas de celulas madre pluripotenciales de blastocistos humanos usando una capa de celulas de alimentacion de fibroblastos embrionarios de raton.
Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003) evaluaron un panel de 11 capas de celulas alimentadoras de adultos humanos, fetales y neonatal neonatales n para determinar su capacidad para soportar el cultivo de celulas madre pluripotenciales humanas. Richards et al, indica: "Las lmeas de celulas madre embrionarias humanas cultivadas en los alimentadoras de fibroblastos de piel adultos conservan la morfologfa de las celulas madre embrionarias humanas y siguen siendo pluripotenciales".
El documento US20020072117 divulga lmeas celulares que producen medios que soportan el crecimiento de celulas madre pluripotenciales de primates en cultivo libre de alimentacion. Las lmeas celulares empleadas son lmeas de celulas mesenquimatosas y similares a fibroblastos obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas de celulas madre embrionarias. El documento US20020072117 tambien divulga el uso de las lmeas celulares como una capa de celulas de alimentacion primaria.
En otro ejemplo, Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) divulga metodos para el crecimiento a largo plazo de celulas madre pluripotenciales humanas en capas celulares de alimentacion derivadas de celulas madre embrionarias humanas.
En otro ejemplo, Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) divulgan un sistema de celulas de alimentacion derivado de la diferenciacion espontanea de celulas madre embrionarias humanas.
En un ejemplo adicional, Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004) divulgan una fuente de celulas alimentadoras obtenidas de placenta humana.
Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) divulga una capa de celulas de alimentacion derivada de prepucio humano.
En otro ejemplo, Inzunza et al (Stem Cells 23: 544-549, 2005) divulgan una capa de celulas de alimentacion derivadas de fibroblastos de prepucio posnatal humano.
El documento US6642048 divulga medios que soportan el crecimiento de celulas madre pluripotenciales de primates (pPS) en cultivo libre de alimentacion y lmeas celulares utiles para la produccion de tales medios. El documento US6642048 indica: “Esta invencion incluye lmeas celulares mesenquimatosas y similares a fibroblastos obtenidas de tejido embrionario o diferenciadas de celulas madre embrionarias. Los metodos para derivar tales lmeas celulares, medios de procesamiento y celulas madre en crecimiento utilizando los medios acondicionados se describen e ilustran en la presente divulgacion.”
En otro ejemplo, el documento WO2005014799 divulga medio acondicionado para el mantenimiento, proliferacion y diferenciacion de celulas de mairnfero. El documento WO2005014799 indica: "El medio de cultivo producido de acuerdo con la presente invencion esta acondicionado por la actividad de secrecion celular de celulas murinas, en particular, los hepatocitos transgenicos diferenciados e inmortalizados, denominados MMH (hepatocito murino Met)".
En otro ejemplo, Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004) divulga un medio condicionado obtenido a partir de
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derivados de celulas madre embrionarias humanas que se han modificado geneticamente para sobreexpresar transcriptasa inversa de telomerasa humana.
En otro ejemplo, el documento US20070010011 divulga un medio de cultivo qmmicamente definido para el mantenimiento de celulas madre pluripotenciales.
Un sistema de cultivo alternativo emplea un medio exento de suero suplementado con factores de crecimiento capaces de estimular la proliferacion de celulas madre embrionarias. Por ejemplo, Cheon et al (BioReprod DOI: 10,1095/biolreprod. 105,046870, October 19, 2005) divulgan un sistema de cultivo sin alimentador, sin suero, en el que se mantienen las celulas madre embrionarias en un medio de reemplazo de suero (SR) sin acondicionar suplementado con diferentes factores de crecimiento capaces de desencadenar la autorrenovacion de celulas madre embrionarias.
En otro ejemplo, Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006) divulgan metodos para el cultivo a largo plazo de celulas madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos o medio acondicionado, utilizando medios suplementados con bFGF.
En otro ejemplo, el documento US20050148070 divulga un metodo para cultivar celulas madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero y sin celulas alimentadoras de fibroblastos, comprendiendo el metodo: cultivar las celulas madre en un medio de cultivo que contiene albumina, aminoacidos, vitaminas, minerales, al menos uno de transferrina o sustituto de transferrina, al menos una insulina o sustituto de insulina, el medio de cultivo esencialmente libre de suero fetal de mairnfero y que contiene al menos aproximadamente 100 ng / ml de un factor de crecimiento de fibroblastos capaz de activar un receptor de senalizacion del factor de crecimiento de fibroblastos, en el que el factor de crecimiento se suministra a partir de una fuente distinta de una capa alimentadora de fibroblastos, soportando la proliferacion de celulas madre en un estado indiferenciado sin celulas alimentadoras o medio acondicionado.
En otro ejemplo, el documento US20050233446 divulga un medio definido util en el cultivo de celulas madre, incluyendo celulas madre primordiales de primate no diferenciadas. En solucion, el medio es sustancialmente isotonico en comparacion con las celulas madre que se estan cultivando. En un cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno de bFGF, insulina y acido ascorbico necesarios para soportar el crecimiento sustancialmente indiferenciado de las celulas madre primordiales.
En otro ejemplo, el documento US6800480 indica "En una realizacion, se proporciona un medio de cultivo celular para cultivar celulas madre primordiales derivadas de primates en un estado sustancialmente indiferenciado, que incluye un medio basico de baja presion osmotica y niveles bajos de endotoxina, que es eficaz para soportar el crecimiento de celulas madre primordiales derivadas de primates. El medio basico se combina con un suero nutriente eficaz para soportar el crecimiento de celulas madre primordiales derivadas de primates y un sustrato seleccionado del grupo que consiste en celulas alimentadoras y un componente de matriz extracelular derivado de celulas alimentadoras. El medio incluye ademas aminoacidos no esenciales, un antioxidante, y un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en nucleosidos y una sal de piruvato.”
En otro ejemplo, el documento US20050244962 indica: En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para cultivar celulas madre embrionarias de primate. Se cultivan las celulas madre en un cultivo esencialmente libre de suero fetal de marnffero (preferiblemente, tambien esencialmente libre de cualquier suero animal) y en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos que se suministra a partir de una fuente que distinta de solo la capa alimentadora de fibroblastos. En una forma preferida, la capa alimentadora de fibroblastos, previamente requerida para sostener un cultivo de celulas madre, se hace innecesaria mediante la adicion de suficiente factor de crecimiento de fibroblastos.
En un ejemplo adicional, el documento WO2005065354 describe un medio de cultivo isotonico definido que esta esencialmente libre de alimentacion y exento de suero, que comprende: a. un medio basal; b. una cantidad de bFGF suficiente para soportar el crecimiento de celulas madre de mamffero sustancialmente indiferenciadas; c. una cantidad de insulina suficiente para soportar el crecimiento de celulas madre de mamffero sustancialmente indiferenciadas; y d. una cantidad de acido ascorbico suficiente para soportar el crecimiento de celulas madre de mamfferos sustancialmente indiferenciadas.
En otro ejemplo, el documento WO2005086845 describe un metodo para el mantenimiento de una celula madre indiferenciada, comprendiendo dicho metodo exponer una celula madre a un miembro de la familia de protemas del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p), un miembro de la familia de protemas del factor de crecimiento de fibroblastos FGF), o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la celula en un estado indiferenciado durante un tiempo suficiente para conseguir el resultado deseado.
Las celulas madre pluripotenciales pueden sembrarse sobre un sustrato de cultivo adecuado. En una realizacion, el sustrato de cultivo adecuado es un componente de matriz extracelular, tal como, por ejemplo, los derivados de la membrana basal o que pueden formar parte de los acoplamientos receptor de la molecula de adhesion-ligando. En
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una realizacion, el sustrato de cultivo adecuado es MATRIGEL® (Becton Dickinson). MATRIGEL® es una preparacion soluble de celulas tumorales Engelbreth-Holm Swarm que se gelifican a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida.
Otros componentes de la matriz extracelular y mezclas de componentes son adecuados como alternativa. Dependiendo del tipo de celulas que se proliferan, esto puede incluir laminina, fibronectina, proteoglicano, entactina, sulfato de heparano y similares, solos o en diversas combinaciones.
Las celulas madre pluripotenciales pueden sembrarse en placas sobre el sustrato en una distribucion adecuada y en presencia de un medio que estimula la supervivencia, propagacion y retencion de las caracteristicas deseables. Todas estas caractensticas se benefician de una atencion cuidadosa a la distribucion de la siembra y pueden ser facilmente determinadas por un experto en la tecnica.
Pueden prepararse medios de cultivo adecuados a partir de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Gibco n.° 11965-092; medio de Eagle modificado por Dulbecco Knockout (KO DMEM), Gibco n.° 10829-018; medio basal de Ham F12/50 % DMEM; L-glutamina ; 200 mM, Gibco n.° 15039-027; solucion de aminoacidos no esenciales, Gibco 11140-050; p-mercaptoetanol, Sigma n.° M7522; factor de crecimiento de fibroblastos basicos recombinantes humanos (bFGF), Gibco n.° 13256-029.
Formacion de una poblacion de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endocrino pancreatico con una expresion incrementada de NGN3 y NKX6.1
En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para aumentar la expresion de NGN3 y NKX6.1 en una poblacion de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endocrino pancreatico, que comprende las etapas de:
a) cultivar las celulas madre pluripotenciales
b) diferenciar las celulas madre pluripotenciales en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico definitivo en un medio que comprende activina A,
c) diferenciar las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico definitivo en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico pancreatico, complementando el medio utilizado para diferenciar las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico definitivo con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmanina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7, y
d) diferenciar las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico pancreatico en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endocrino pancreatico.
Diferenciacion de las celulas madre pluripotenciales en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico definitivo
La formacion de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico definitivo se puede determinar determinando la presencia de los marcadores antes y despues de seguir un protocolo particular. Las celulas madre pluripotenciales ripicamente no expresan tales marcadores. Por lo tanto, la diferenciacion de las celulas pluripotenciales se detecta cuando las celulas comienzan a expresarlos.
Las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico definitivo por cualquier metodo conocido en la materia o por cualquier metodo propuesto en la presente invencion.
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caracteristicos del linaje endodermico definitivo de acuerdo con los metodos descritos en D'Amour et al, Nature
Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico definitivo de acuerdo con los metodos descritos en Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662 (2004).
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico definitivo de acuerdo con los metodos descritos en McLean et al, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007).
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caracteristicos del linaje endodermico definitivo de acuerdo con los metodos descritos en D'Amour et al, Nature
Biotechnology 24, 1392 -1401 (2006).
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Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo cultivando las celulas madre pluripotenciales en medio que contiene activina A en ausencia de suero, cultivando a continuacion las celulas con activina A y suero y, despues, luego cultivando las celulas con activina A y suero de una concentracion diferente. Un ejemplo de este metodo se describe en Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caractensiicos del linaje endodermico definitivo cultivando las celulas madre pluripotenciales en medio que contiene activina A en ausencia de suero, cultivando a continuacion las celulas con activina A y suero de otra concentracion. Un ejemplo de este metodo se describe en D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2005.
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caractensticos del linaje endodermico definitivo cultivando las celulas madre pluripotenciales en medio que contiene activina A y un ligando Wnt en ausencia de suero, eliminando a continuacion el ligando Wnt y cultivando las celulas con activina A y suero. Un ejemplo de este metodo se describe en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caractensticos del linaje endodermico definitivo tratando las celulas madre pluripotenciales de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 11/736.908, cedida a LifeScan, Inc.
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caractensticos del linaje endodermico definitivo tratando las celulas madre pluripotenciales de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 11/779.311, cedida a LifeScan, Inc.
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caractensticos del linaje endodermico definitivo tratando las celulas madre pluripotenciales de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 60/990.529.
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caractensticos del linaje endodermico definitivo tratando las celulas madre pluripotenciales de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 61/076.889.
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caractensticos del linaje endodermico definitivo tratando las celulas madre pluripotenciales de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 61/076.900.
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caractensticos del linaje endodermico definitivo tratando las celulas madre pluripotenciales de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 61/076.908.
Por ejemplo, las celulas madre pluripotenciales pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores
caractensticos del linaje endodermico definitivo tratando las celulas madre pluripotenciales de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 61/076.915.
Diferenciacidn de las celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico definitivo en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje de endodermo pancreatico
Las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico por cualquier metodo en la tecnica o por cualquier metodo propuesto en la presente invencion.
Por ejemplo, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico de acuerdo con los metodos divulgados en D'Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006.
Por ejemplo, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico, tratando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo con un factor de crecimiento de fibroblastos y el inhibidor de la via de senalizacion hedgehog KAAD-ciclopamina, eliminando despues el medio que contiene el factor de crecimiento de fibroblastos y KAAD-ciclopamina y, posteriormente, cultivando las celulas en medio que contiene acido retinoico, un factor de crecimiento de fibroblastos y KAAD-ciclopamina. Un ejemplo de este metodo se describe en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
En un aspecto de la presente invencion, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico, tratando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo con
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En un aspecto de la presente invencion, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico, tratando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo con acido retinoico y al menos una factor de crecimiento de fibroblastos durante un periodo de tiempo, de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 11/779.311, asignado a LifeScan, Inc.
En un aspecto de la presente invencion, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermo pancreatico, tratando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo de acuerdo con los metodos divulgados en la solicitud de patente n.° de serie 60 / 990.529.
La eficacia de la diferenciacion puede determinarse exponiendo una poblacion de celulas tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconozca espedficamente un marcador de protema expresado por celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo.
Los metodos para evaluar la expresion de marcadores de protemas y acidos nucleicos en celulas cultivadas o aisladas son convencionales en la tecnica. Estos incluyen la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), transferencias de tipo Northern, hibridacion in situ (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 suplemento)), e inmunoensayos, tales como analisis inmunohistoqmmico del material seccionado, transferencia de de tipo Western, para marcadores que son accesibles en celulas intactas, tal como analisis por citometna de flujo (FACS) (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Las caractensticas de las celulas madre pluripotenciales son bien conocidas por los expertos en la tecnica y siguen identificandose caractensticas adicionales de las celulas madre pluripotenciales. Los marcadores de las celulas madre pluripotenciales incluyen, por ejemplo, la expresion de uno o mas de los siguientes: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXINa43, Connexina45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
Despues de tratar las celulas madre pluripotenciales con los metodos de la presente invencion, las celulas diferenciadas pueden purificarse exponiendo una poblacion de celulas tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconozca espedficamente un marcador de protema, tal como CXCR4, expresado por celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo. Se divulgan celulas madre pluripotenciales que incluyen, por ejemplo, la lmea de celulas madre embrionarias humanas H9 (codigo NIH: WA09), la lmea de celulas madre embrionarias humanas H1 (codigo NIH: WA01), la lmea de celulas madre embrionarias humanas H7 (codigo NIH: WA07) y la lmea de celulas madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia).
Son adecuadas para su uso en la presente invencion las celulas que expresan al menos uno de los siguientes marcadores caractensticos de celulas pluripotenciales: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXINA43, CONNEXINA45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 y Tra 1-81.
Los marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo se seleccionan del grupo que consiste en SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, protema homeobox similar a Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCr4, C-Kit, CD99 y OTX2. Es adecuada para su uso en la presente invencion una celula que expresa al menos uno de los marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo. En un aspecto de la presente invencion, una celula que expresa marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo es una celula precursora lmeas primitivas. En un aspecto alternativo, una celula que expresa marcadores caractensticos del linaje de endodermo definitivo es una celula del mesoendodermo. En un aspecto alternativo, una celula que expresa marcadores caractensticos del linaje de endodermo definitivo es una celula del endodermo definitiva.
Los marcadores caractensticos del linaje del endodermo pancreatico se seleccionan del grupo que consiste en PDX1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HB9 y PROX1. Es adecuada para su uso en la presente invencion una celula que expresa al menos uno de los marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico. En un aspecto de la presente invencion, una celula que expresa marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico es una celula del endodermo pancreatico.
En una realizacion, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico se diferencian aun mas en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico. La presente invencion proporciona metodos para aumentar la expresion de NGN3 y NKX6.1 en las poblaciones de celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico.
El aumento de la expresion de NGN3 y NKX6.1 en poblaciones de celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico puede conseguirse tratando las celulas que expresan marcadores que expresan
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marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7. Alternativamente, el aumento de la expresion de NGN3 y NKX6.1 en poblaciones de celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico se puede lograr tratando las celulas que expresan marcadores que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermo pancreatico con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7.
En el caso en el que las celulas que expresan marcadores que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo se tratan con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en X, Y y Z, las celulas se tratan suplementando el medio usado para diferenciar las celulas en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7.
En el caso en el que las celulas que expresan marcadores que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico se tratan con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en X, Y y Z, las celulas se tratan suplementando el medio usado para diferenciar las celulas en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H- 89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7.
Diferenciacidn de celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endodermico pancreatico en celulas que expresan marcadores caracteristicos del linaje endocrino pancreatico con una expresion aumentada de NGN3 y NKX6.1
Las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico pueden diferenciarse en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico por cualquier metodo en la tecnica o por cualquier metodo propuesto en la presente invencion.
Por ejemplo, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico obtenidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, cultivando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en medio que contiene exendina 4, retirando a continuacion el medio que contiene exendina 4 y cultivando posteriormente las celulas en medio que contiene exendina 1, IGF-1 y HGF. Un ejemplo de este metodo se describe en D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
Por ejemplo, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico obtenidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, cultivando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en medio que contiene DAPT (Sigma-Aldrich, MO) y exendina 4. Un ejemplo de este metodo se divulga en D 'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
Por ejemplo, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico obtenidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, cultivando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en medio que contiene exendina 4. Un ejemplo de este metodo se divulga en D 'Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.
Por ejemplo, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico obtenidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, tratando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico con un factor que inhibe la via de senalizacion Notch, de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 11/736.908, cedida a LifeScan, Inc.
Por ejemplo, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico obtenidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, tratando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico con un factor que inhibe la via de senalizacion Notch, de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 11/779.311, cedida a LifeScan, Inc.
Por ejemplo, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico obtenidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, tratando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico con un factor que inhibe la via de senalizacion Notch, de acuerdo
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con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 60/953.178, cedida a LifeScan, Inc.
Por ejemplo, las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico obtenidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion se diferencian adicionalmente en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, tratando las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico con un factor que inhibe la via de senalizacion Notch, de acuerdo con los metodos descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 60/990.529, cedida a LifeScan, Inc.
Los marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico se seleccionan del grupo que consiste en NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 y PTF-1 alfa. En una realizacion, una celula endocrina pancreatica es capaz de expresar al menos una de las hormonas siguientes: insulina, glucagon, somatostatina y polipeptido pancreatico. Es adecuada para su uso en la presente invencion una celula que expresa al menos uno de los marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico. En un aspecto de la presente invencion, una celula que expresa marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico es una celula endocrina pancreatica. La celula endocrina pancreatica puede ser una celula que expresa la hormona pancreatica. Como alternativa, la celula endocrina pancreatica puede ser una celula que secreta hormona pancreatica.
En un aspecto de la presente invencion, la celula endocrina pancreatica es una celula que expresa marcadores caractensticos del linaje de celulas p. Una celula que expresa marcadores caractensticos del linaje de celulas p expresa PDX1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripcion: NGN3, NKX2,2, NKX6.1, NeUROD, ISL1, hNF3 beta, mAfA, PAX4 y PAX6. En un aspecto de la presente invencion, una celula que expresa marcadores caractensticos del linaje de celulas p es una celula p.
La presente divulgacion se refiere a metodos para aumentar la expresion de NGN3 y NKX6.1 en las poblaciones de celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico.
En una realizacion, el aumento de la expresion de NGN3 y NKX6.1 en poblaciones de celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico se puede conseguir tratando celulas que expresan marcadores que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermo pancreatico con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, Ha-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmanina, SB- 203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina, AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7.
En el caso en que las celulas que expresan marcadores que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico se tratan con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7, las celulas se tratan complementando el medio utilizado para diferenciar las celulas en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7.
La presente invencion se ilustra adicionalmente, aunque sin limitaciones, mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos de referencia Ejemplo 1
Deteccion selectiva de analogos de molecula pequena que participan en la expresion de NGN3
La expresion del factor de transcripcion NGN3 se requiere durante la progresion de las celulas progenitoras hacia un destino celular endocrino. Mejorar la eficiencia de este proceso es un resultado deseable. Se realizo una deteccion selectiva de compuestos de molecula pequena con la suposicion de que los inhibidores enzimaticos pueden regular las senales celulares transmitidas durante la diferenciacion y tener efectos directos o indirectos sobre la expresion genica de factores de transcripcion, cnticos tales como NGN3.
Preparacion de celulas para el ensayo: Se mantuvieron cultivos maestros de celulas madre embrionarias humanas (lmea de celulas madre embrionarias humanas H1) en un estado pluripotencial no diferenciado en placas revestidas con factor de crecimiento reducido MATRIGEL (BD Biosciences, n.° de cat. 35623 1) en medio acondicionado MEF con pases promedio cada cuatro dfas. El pase se realizo exponiendo los cultivos de celulas a una solucion de 1 mg / ml de dispasa (Invitrogen, n.° de cat. 17105-041) durante de 5 a 7 minutos a 37 °C, seguido de lavado de la monocapa con medio de cultivo acondicionado MEF y raspado suave para recuperar los grupos de celulas. Los grupos se centrifugaron a velocidad baja para recoger un sedimento de celulas y eliminar la dispasa residual. Los grupos de celulas se dividieron en una proporcion 1:3 o 1:4 para el cultivo de mantenimiento rutinario. Todas las lmeas de celulas madre embrionarias humanas se mantuvieron en numeros de pase inferiores a 50 y se evaluaron rutinariamente para el cariotipo normal y ausencia de micoplasma. Para las detecciones selectivas en formato de
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ensayo miniaturizado, se recogieron grupos de celulas madre embrionarias humanas H1 del cultivo con tratamiento con dispasa, tal como se describe, y se sembraron con dispersion uniforme en una proporcion de 1:2 (area de superficie) en placas de 96 pocillos (Packard ViewPlates; PerkinElmer; n.° de cat. 6005182) revestidas con factor de crecimiento reducido MATRIGEL (BD Biosciences; 356231) utilizando volumenes de 100 jl / pocillo. Se permitio que las celulas se unieran y luego se recupero el crecimiento de la fase logantmica durante un periodo de tiempo de 1 a 3 dfas, alimentando diariamente con medio acondicionado MEF suplementado con 8 ng / ml de bFGF (R & D Systems; n.° de cat. 233-FB). Las placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % de CO2 en una caja humidificada a lo largo de la duracion del ensayo.
Preparacion de los compuestos: El deteccion selectiva se llevo a cabo utilizando dos bibliotecas comerciales de inhibidores de quinasa de molecula pequena (BioMol Intl; n.° de cat 2832A (V2,2) y EMD Biosciences: n.° de cat. 539745). En la tabla 1 y la tabla 2 se describen los compuestos en estas bibliotecas de inhibidor de la quinasa BioMol y EMD quinasa, respectivamente. Los compuestos de estas bibliotecas se pusieron a disposicion como reservas de 10 mM en un formato de placa de 96 pocillos, se solubilizaron en DMSO al 100 % y se almacenaron a - 80 °C. Los compuestos de la biblioteca se diluyeron adicionalmente a una concentracion intermedia de 2,5 mM en DMSO al 100 % (Sigma, n.° de cat. D2650), tambien almacenados a -80 °C hasta su uso. El dfa del ensayo, los compuestos se diluyeron a 1:12,5 en medio DMEM rico en glucosa, para producir una reserva de trabajo de 200 jM en DMSO al 8 % y, a continuacion, se diluyeron a 1:80 en cada pocillo de ensayo para una concentracion final de 2,5 |jM del compuesto y DMSO al 0,1 %.
Ensayo de diferenciacion y deteccion selectiva: La etapa 1 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante tres dfas, alimentando diariamente aspirando el medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (100 jl). El primer dfa de ensayo, los pocillos se alimentaron usando medio RPMI-1640 (Invitrogen; n.° de cat. 22400) que contema 2 % de fraccion V de albumina bovina, sin acidos grasos (FAF BSA) (Proliant Inc.; N.° de cat.: SKU 68700), 100 ng/ml de activina A (PeproTech; N.° de cat.120-14), 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Systems; N.° de cat. 1324-WN/CF) y 8 ng/ml bFGF (R&D Systems; N.° de cat. 233-FB). Al segundo y tercer dfa del ensayo, los pocillos se alimentaron con el mismo medio excepto que se retiro Wnt3a. Todos los pocillos se alimentaron y trataron de forma identica.
La etapa 2 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante dos dfas. Las celulas se alimentaron diariamente aspirando el medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (100 jl) de medio DMEM: F12 (Invitrogen, N.° de cat.11330-032) que contema 2 % de FAF BSA, 50 ng / ml de FGF7 (PeproTech; 100 - 19), y 250 nM de KAAD - ciclopamina (Calbiochem; N.° de cat. 239804). Todos los pocillos se alimentaron y trataron de forma identica.
La etapa 3 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante cuatro dfas. Se alimento a las celulas en dfas alternos por medio de aspiracion del medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (200 jl) de DMEM rico en glucosa (Invitrogen, N.° de cat.10569) suplementado con Albumax al 0,1 % (Invitrogen; n.° de cat.: 11020-021), 0,5x de Insulina-Transferrina-Selenio (ITS-X; Invitrogen; n.° de cat. 51500056), 50 ng/ml de FGF7, 100 ng/ml de Noggin (R&D Systems; n.° de cat. 3344-NG), KAAD-ciclopamina 250 nM, acido todo-trans retinoico 2 jM (RA) (Sigma-Aldrich; n.° de cat. R2625) y 30 ng/ml de activina A. Durante la etapa 3, se anadieron muestras de ensayo de inhibidores de quinasa a pocillos individuales en dos placas individuales (placas A y B); una tercera placa (placa C) se dejo sin tratar. En cada placa, se trato un total de 16 pocillos de control con una cantidad equivalente de DMSO al 0,1 % sin ningun compuesto de ensayo.
La etapa 4 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante tres dfas. Se alimento a las celulas los dfas 1 y 2, no el dfa 3, aspirando el medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (200 jl) de DMEM rico en glucosa suplementado con 0,1 % de Albumax, 0,5x de Insulina-Transferrina- Selenio, 100 ng / ml de Noggin y 1 jM de inhibidor de Alk 5 (Axxora; n.° de cat. ALX-270-445). Durante la etapa 4, se anadieron muestras de ensayo de inhibidores de quinasas a pocillos individuales en dos placas individuales (placas B y C); una tercera placa se dejo sin tratar (placa A). En cada placa, se trato un total de 16 pocillos de control con una cantidad equivalente de DMSO al 0,1 % sin ningun compuesto de ensayo.
Analisis de alto contenido: Al final de la etapa 4, se aspiro el medio de todas las placas de ensayo, seguido de fijacion a temperatura ambiente durante 20 minutos con paraformaldelmdo al 4 % (Sigma-Aldrich; N.° de cat.158127) diluido en pBs sin cationes divalentes (Invitrogen; N.° de cat.14190), lavando despues una vez con PBS. Los pocillos de muestra se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % (VWR n.° de cat. VW3929-2) durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con PBS y se bloquearon con suero de burro al 5 % (Jackson ImmunoResearch; N.° de cat.017- 000-121) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario (anti-NGN3 de oveja, R & D Systems, AF3444) se diluyo a 1:300 en suero de burro al 5% y se anadio a cada pocillo durante una hora a temperatura ambiente. Despues de lavar dos veces en PBS, se diluyo a 1:100 el anticuerpo secundario anti-oveja de burro Alexa Fluor 647 (Invitrogen; n.° de cat. A21448) y se anadio a cada pocillo de muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en PBS. Para la tincion de contraste de los nucleos, se anadieron 4 jg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen; n.° de cat. H3570) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 jl / pocillo de PBS para la obtencion de imagenes.
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La obtencion de imagenes se realizo utilizando un Analizador celular IN 1000 (GE Healthcare) utilizando el dicroico 51008bs para celulas tenidas con Hoechst 33342 y Alexa Flour 647. Los tiempos de exposicion se optimizaron a partir de pocillos de control positivo tenidos con anticuerpo secundario solo. Se adquirieron imagenes de 15 campos por pocillo para compensar cualquier perdida celular durante el bioensayo y los procedimientos de tincion posteriores. Las mediciones para el numero total de celulas y la intensidad total de NGN3 se obtuvieron de cada pocillo utilizando el software Cell Developer Toolbox 1,7 (GE Healthcare). La segmentacion de los nucleos se determino en base a los niveles de escala de grises (rango de base 100-300) y el tamano nuclear. La expresion total de la protema NGN3 se informo como la intensidad total o la intensidad integrada, definida como la fluorescencia total de la celula multiplicada por el area de la celula. Se elimino el fondo basandose en criterios de aceptacion de rangos de escala de grises entre 200 y 3500. Los datos de intensidad total se normalizaron dividiendo las intensidades totales para cada pocillo por la intensidad total media para el control positivo.
Los resultados de la deteccion selectiva se muestran en la Tabla 3 a partir de la combinacion de dos bibliotecas de inhibidores de quinasa usadas para tratar seis placas de ensayo en este unico experimento. Los datos mostrados son una relacion representativa de la intensidad de la tincion con NGN3 para pocillos tratados con el compuesto individual en relacion con la tincion en pocillos con vehnculo DMSO solo. Las relaciones de intensidad, asf como las comparaciones de orden de rangos se muestran para compuestos individuales dosificados durante la etapa 3 sola o la etapa 4 sola o las etapas 3 y 4 combinadas. Los compuestos con una intensidad de relacion> 1,4 con respecto a un vetnculo control tratado se marcaron como testigos para confirmacion y la evaluacion adicional. De interes especial, tal como se resume en la Tabla 4, estos compuestos parecen tener como objetivo varias vfas de senalizacion celular que pueden estar implicadas en el patron optimo de expresion de NGN3 durante la diferenciacion endocrina.
Ejemplo 2
Deteccion selectiva de analogos de molecula pequena que participan en la expresion de NKX6.1 y NGN3
La expresion de NKX6.1 junto con NGN3 se requiere durante la progresion de las celulas progenitoras hacia un destino celular endocrino. Se llevo a cabo una deteccion selectiva de inhibidores de quinasas para determinar si cualquiera de ellos podna regular por aumento la expresion de uno o ambos marcadores durante la diferenciacion. En este ejemplo, tambien se incluyo en el protocolo de diferenciacion el inhibidor de HDAC Tricostatina A para modular la remodelacion de la cromatina y, posiblemente, potenciar la transcripcion genica.
Preparacion de celulas para el ensayo: Se mantuvieron cultivos maestros de celulas madre embrionarias humanas (lmea de celulas madre embrionarias humanas H1) en un estado pluripotencial no diferenciado en placas revestidas con factor de crecimiento reducido MATRIGEL (BD Biosciences, n.° de cat. 356231 1) en medio acondicionado MEF con pases promedio cada cuatro dfas. El pase se realizo exponiendo los cultivos de celulas a una solucion de 1 mg / ml de dispasa (Invitrogen, n.° de cat. 17105-041) durante de 5 a 7 minutos a 37 °C, seguido de lavado de la monocapa con medio de cultivo acondicionado MEF y raspado suave para recuperar los grupos de celulas. Los grupos se centrifugaron a velocidad baja para recoger un sedimento de celulas y eliminar la dispasa residual. Los grupos de celulas se dividieron en una proporcion 1:3 o 1:4 para el cultivo de mantenimiento rutinario. Todas las lmeas de celulas madre embrionarias humanas se mantuvieron en numeros de pase inferiores a 50 y se evaluaron rutinariamente para el cariotipo normal y ausencia de micoplasma. Para las detecciones selectivas en formato de ensayo miniaturizado, se recogieron grupos de celulas madre embrionarias humanas H1 del cultivo con tratamiento con dispasa, tal como se describe, y se sembraron con dispersion uniforme en una proporcion de 1:2 (area de superficie) en placas de 96 pocillos (Packard ViewPlates; PerkinElmer; n.° de cat 6005182) revestidas con factor de crecimiento reducido MATRIGEL (BD Biosciences; 356231) utilizando volumenes de 100 pl / pocillo. Se permitio que las celulas se unieran y luego se recupero el crecimiento de la fase logantmica durante un periodo de tiempo de 1 a 3 dfas, alimentando diariamente con medio acondicionado MEF suplementado con 8 ng / ml de bFGF (R & D Systems; n.° de cat. 233-FB). Las placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % de CO2 en una caja humidificada a lo largo de la duracion del ensayo.
Preparacion de los compuestos: La deteccion selectiva se realizo utilizando una unica biblioteca comercial de inhibidores de quinasas de molecula pequena (BioMol Intl; N.° de cat. 2832A (V2,2) como se define en la Tabla 1. Los compuestos de esta biblioteca se pusieron a disposicion como reservas de 10 mM en formato de placas 96 pocillos, solubilizados en DMSO al 100 % y almacenados a -80 °C. Los compuestos de la biblioteca se diluyeron adicionalmente a una concentracion intermedia de 2,5 mM en DMSO al 100 % (Sigma, N.° de cat.D2650), tambien se almacenaron a -80 °C hasta su uso. El dfa del ensayo, los compuestos se diluyeron a 1:12,5 en medio DMEM rico en glucosa, para producir una reserva de trabajo de 200 pM en DMSO al 8 % y, a continuacion, se diluyeron a 1:80 en cada pocillo de ensayo para una concentracion final de 2,5 pM del compuesto y DMSO al 0,1 %.
Ensayo de diferenciacion y deteccion selectiva: La etapa 1 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante tres dfas, alimentando diariamente aspirando el medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (100 pl). El primer dfa de ensayo, los pocillos se alimentaron usando medio RPMI-1640 (Invitrogen; n.° de cat. 22400) que contema 2 % de fraccion V de albumina bovina, sin acidos grasos (FAF BSA) (Proliant Inc.; N.° de cat.:
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La etapa 2 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante dos dfas. Las celulas se alimentaron diariamente aspirando el medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (100 jl) de medio DMEM: F12 (Invitrogen, N.° de cat.11330-032) que contema 2 % de FAF BSA, 50 ng / ml de FGF7 (PeproTech; 100 - 19), y 250 nM de KAAD - ciclopamina (Calbiochem; N.° de cat. 239804). Todos los pocillos se alimentaron y trataron de forma identica.
La etapa 3 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante cinco dfas. Se alimento a las celulas en dfas alternos por medio de aspiracion del medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (200 jl) de DMEM rico en glucosa (Invitrogen, N.° de cat.10569) suplementado con Albumax al 0,1 % (Invitrogen; n.° de cat.: 11020-021), 0,5x Insulina-Transferrina-Selenio (ITS-X; Invitrogen; n.° de cat. 51500056), 50 ng/ml de FGF7, 100 ng/ml de Noggin (R&D Systems; n.° de cat -NG), KAAD-ciclopamina 250 nM, acido todo-trans retinoico 2 pM (RA) (Sigma-Aldrich; 2 pM r2625), 30 ng/ml de activina A y tricostatina A100 nM (TsA; Sigma; n.° de cat. T8552). Durante la etapa 3, se anadieron muestras de ensayo de inhibidores de quinasa a pocillos individuales los dfas 2 y 4. En cada placa, se trato un total de 16 pocillos de control con una cantidad equivalente de DMSO al 0,1 % sin ningun compuesto de ensayo.
La etapa 4 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante tres dfas. Se alimento diariamente a las celulas, aspirando el medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (200 jl) de DMEM rico en glucosa suplementado con 0,1 % de Albumax, 0,5x de Insulina-Transferrina- Selenio, 100 ng / ml de Noggin y 1 jM de inhibidor de Alk 5 (Axxora; N.° de cat.ALX-270-445) y 1 ug/ml de DAPT (Sigma; n.° de cat. D5942). Durante la etapa 4, se anadieron muestras de ensayo de inhibidores de quinasas a pocillos individuales el primer dfa junto con tricostatina A 100 nM, despues se omitieron ambas muestras de ensayo de inhibidores de quinasas y TsA durante la alimentacion los dfas 2 y 3. En cada placa, se trato un total de 16 pocillos de control con una cantidad equivalente DMSO al 0,1 % sin ningun compuesto de ensayo.
Analisis de alto contenido: Al final de la etapa 4, se aspiro el medio de todos los pocillos, seguido de fijacion a temperatura ambiente durante 20 minutos con paraformaldehudo al 4 % (Sigma-Aldrich; N.° de cat.158127) diluido en PBS sin cationes divalentes (Invitrogen; N.° de cat.14190), lavando despues una vez con PBS. Los pocillos de muestra se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % (VWR n.° de cat. VW3929-2) durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con PBS y se bloquearon con suero de burro al 5 % (Jackson ImmunoResearch; N.° de cat.017- 000-121) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios (anti-NGN3 de oveja, R & D Systems, AF3444 o anti-NKX6.1 de raton, Universidad de Iowa, N.° de cat. F55A12) se diluyeron (1:300 para anti-NGN3, 1:500 para anti-NKX6.1) en 5 % de suero de burro y se anadio a cada pocillo durante una hora a temperatura ambiente. Despues de lavar dos veces en PBS, se diluyo a 1:100 el anticuerpo secundario anti-oveja de burro Alexa Fluor 647 (Invitrogen; n.° de cat. A21448) y el anticuerpo secundario de burro anti-raton Alexa Fluor 488 (Invitrogen; n.1 de cat. A21202) (ambos anticuerpos secundarios) se anadieron a cada pocillo de muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en PBS. Para la tincion de contraste de los nucleos, se anadieron 4 pg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen; N.° de cat. H3570) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 jl / pocillo de PBS para la obtencion de imagenes.
La obtencion de imagenes se realizo utilizando un Analizador celular IN 1000 (GE Healthcare) utilizando el dicroico 51008bs para celulas tenidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488 y Alexa Flour 647. Los tiempos de exposicion se optimizaron a partir de pocillos de control positivo tenidos con cada anticuerpo secundario individual. Se adquirieron imagenes de 15 campos por pocillo para compensar cualquier perdida celular durante el bioensayo y los procedimientos de tincion posteriores. Las mediciones para el numero total de celulas y la intensidad total de NGN3 o NKX6.1 se obtuvieron de cada pocillo utilizando el software Cell Developer Toolbox 1,7 (GE Healthcare). La segmentacion de los nucleos se determino en base a los niveles de escala de grises (rango de base 100-300) y el tamano nuclear. La expresion total de la protema NGN3 o NKX6.1 se informo como la intensidad total o la intensidad integrada, definida como la fluorescencia total de la celula multiplicada por el area de la celula. Se elimino el fondo basandose en criterios de aceptacion de rangos de escala de grises entre 200 y 3500. Los datos de intensidad total se normalizaron dividiendo las intensidades totales para cada pocillo por la intensidad total media para el control positivo.
Los resultados de esta deteccion selectiva se resumen en la Tabla 5, la Tabla 6 y la Tabla 7. Los datos de la Tabla 5 representan una relacion representativa de la tincion de NGN3 y NKX6.1 para cada pocillo tratado con un compuesto individual con respecto a la tincion promedio en pocillos con DMSO solo. Ademas, tambien se muestra el orden de rangos para el efecto de cada compuesto sobre la expresion de protemas para NGN3 o NKX6.1. En la Tabla 6 se enumeran los rangos ordenados para los 16 primeros resultados que tienen un efecto positivo en la expresion de NGN3 y / o NKX6.1. En la Tabla 7 se resumen los objetivos y vfas de transduccion de senal que corresponden a estos resultados principales. Las vfas con multiples resultados de esta deteccion selectiva parecen tener mayor
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validez por tener un impacto en la expresion de estos dos factores de transcripcion cnticos para la determinacion del destino endocrino.
Ejemplo 3
Confirmaciones para los analogos de molecula pequena que participan en la expresion de NGN3 y NKX6.1
La expresion de NKX6.1 junto con NGN3 se requiere durante la progresion de las celulas progenitoras hacia un destino celular endocrino. Se repitio una deteccion selectiva de inhibidores de quinasas para determinar si cualquier compuesto de molecula pequena podna regular por aumento la expresion de uno o ambos marcadores durante la diferenciacion. En este ejemplo, tambien se incluyo en el protocolo de diferenciacion el inhibidor de HDAC Tricostatina A para modular la remodelacion de la cromatina y, posiblemente, potenciar la transcripcion genica.
Preparacion de celulas para el ensayo: Se mantuvieron cultivos maestros de celulas madre embrionarias humanas (lmea de celulas madre embrionarias humanas H1) en un estado pluripotencial no diferenciado en placas revestidas con factor de crecimiento reducido MATRIGEL (BD Biosciences, n.° de cat. 356231 1) en medio acondicionado MEF con pases promedio cada cuatro dfas. El pase se realizo exponiendo los cultivos de celulas a una solucion de 1 mg / ml de dispasa (Invitrogen, n.° de cat. 17105-041) durante de 5 a 7 minutos a 37 °C, seguido de lavado de la monocapa con medio de cultivo acondicionado MEF y raspado suave para recuperar los grupos de celulas. Los grupos se centrifugaron a velocidad baja para recoger un sedimento de celulas y eliminar la dispasa residual. Los grupos de celulas se dividieron en una proporcion 1:3 o 1:4 para el cultivo de mantenimiento rutinario. Todas las lmeas de celulas madre embrionarias humanas se mantuvieron en numeros de pase inferiores a 50 y se evaluaron rutinariamente para el cariotipo normal y ausencia de micoplasma. Para las detecciones selectivas en formato de ensayo miniaturizado, se recogieron grupos de celulas madre embrionarias humanas H1 del cultivo con tratamiento con dispasa, tal como se describe, y se sembraron con dispersion uniforme en una proporcion de 1:2 (area de superficie) en placas de 96 pocillos (Packard ViewPlates; PerkinElmer; n.° de cat 6005182) revestidas con factor de crecimiento reducido MATRIGEL (BD Biosciences; 356231) utilizando volumenes de 100 pl / pocillo. Se permitio que las celulas se unieran y luego se recupero el crecimiento de la fase logantmica durante un periodo de tiempo de 1 a 3 dfas, alimentando diariamente con medio acondicionado MEF suplementado con 8 ng / ml de bFGF (R & D Systems; n.° de cat. 233-FB). Las placas se mantuvieron a 37 °C, 5 % de CO2 en una caja humidificada a lo largo de la duracion del ensayo.
Preparacion de los compuestos: La deteccion selectiva de confirmacion se realizo utilizando una unica biblioteca comercial de inhibidores de quinasas de molecula pequena (BioMol Intl; N.° de cat. 2832A (V2,2) como se define en la Tabla 1. Los resultados de compuestos de esta biblioteca se pusieron a disposicion como reservas de 10 mM en formato de placas 96 pocillos, solubilizados en DMSO al 100 % y almacenados a -80 °C. Los compuestos individuales de interes de la biblioteca se diluyeron adicionalmente a una concentracion intermedia de 2,5 mM en DMSO al 100 % (Sigma, N.° de cat.D2650), tambien se almacenaron a -80 °C hasta su uso. El dfa del ensayo, estos compuestos individuales de interes se diluyeron a 1:12,5 en medio DMEM rico en glucosa, para producir una reserva de trabajo de 200 pM en DMSO al 8 % y, a continuacion, se diluyeron a 1:80 en cada pocillo de ensayo para una concentracion final de 2,5 pM del compuesto y DMSO al 0,1 %.
Ensayo de diferenciacion y deteccion selectiva: La etapa 1 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante tres dfas, alimentando diariamente aspirando el medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (100 pl). El primer dfa de ensayo, los pocillos se alimentaron usando medio RPMI-1640 (Invitrogen; n.° de cat. 22400) que contema 2 % de fraccion V de albumina bovina, sin acidos grasos (FAF BSA) (Proliant Inc.; N.° de cat.: SKU 68700), 100 ng/ml de activina A (PeproTech; N.° de cat.120-14), 20 ng/ml de Wnt3a (R&D Systems; N.° de cat. 1324-WN/CF) y 8 ng/ml bFGF (R&D Systems; N.° de cat. 233-FB). Al segundo y tercer dfa del ensayo, los pocillos se alimentaron con el mismo medio excepto que se retiro Wnt3a. Todos los pocillos se alimentaron y trataron de forma identica.
La etapa 2 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante dos dfas. Las celulas se alimentaron diariamente aspirando el medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (100 pl) de medio DMEM: F12 (Invitrogen, N.° de cat.11330-032) que contema 2 % de FAF BSA, 50 ng / ml de FGF7 (PeproTech; 100 - 19), y 250 nM de KAAD - ciclopamina (Calbiochem; N.° de cat. 239804). Todos los pocillos se alimentaron y trataron de forma identica.
La etapa 3 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante cuatro dfas. Se alimento a las celulas en dfas alternos por medio de aspiracion del medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (200 pl) de DMEM rico en glucosa (Invitrogen, N.° de cat.10569) suplementado con Albumax al 0,1 % (Invitrogen; n.° de cat.: 11020-021), 0,5x de Insulina-Transferrina-Selenio (ITS-X; Invitrogen; n.° de cat. 51500056), 50 ng/ml de FGF7, 100 ng/ml de Noggin (R&D Systems; n.° de cat. 3344-NG), KAAD-ciclopamina 250 nM, acido todo-trans retinoico 2 pM (RA) (Sigma-Aldrich; n.° de cat. R2625) y 20 ng/ml de activina A. Durante la etapa 3, se anadieron muestras de ensayo por triplicado de inhibidores de quinasa en el momento de la alimentacion los dfas 1 y 3. En cada placa se trato un total de 16 pocillos control con una cantidad equivalente de DMSO al 0,1 % sin ningun compuesto de ensayo.
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La etapa 4 del protocolo de diferenciacion se llevo a cabo durante cuatro dfas. Se alimento a las celulas en d^as alternos, aspirando el medio de cada pocillo y reemplazandolo con una alfcuota fresca (200 jl) de DMEM rico en glucosa suplementado con 0,1 % de Albumax, 0,5x de Insulina-Transferrina- Selenio, 100 ng / ml de Noggin y 1 jM de inhibidor de Alk 5 (Axxora; N.° de cat.ALX-270-445). Durante la etapa 4, las muestras de ensayo por triplicado de inhibidores de quinasa se anadieron a los pocillos en el momento de la alimentacion los dfas 1 y 3. En cada placa, se trato un total de 16 pocillos de control con una cantidad equivalente de DMSO al 0,1 % sin ningun compuesto de ensayo.
Analisis de alto contenido: Al final de la etapa 4, se aspiro el medio de todos los pocillos, seguido de fijacion a temperatura ambiente durante 20 minutos con paraformaldetndo al 4 % (Sigma-Aldrich; N.° de cat.158127) diluido en PBS sin cationes divalentes (Invitrogen; N.° de cat.14190), lavando despues una vez con PBS. Los pocillos de muestra se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % (VWR n.° de cat. VW3929-2) durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con PBS y se bloquearon con suero de burro al 5 % (Jackson ImmunoResearch; N.° de cat.017- 000-121) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios (anti-NGN3 de oveja, R & D Systems, AF3444 o anti-NKX6.1 de raton, Universidad de Iowa, N.° de cat. F55A12) se diluyeron (1:300 para anti-NGN3, 1:500 para anti-NKX6.1) en 5 % de suero de burro y se anadio a cada pocillo durante una hora a temperatura ambiente. Despues de lavar dos veces en PBS, se diluyo a 1:100 el anticuerpo secundario anti-oveja de burro Alexa Fluor 647 (Invitrogen; n.° de cat. A21448) y el anticuerpo secundario de burro anti-raton Alexa Fluor 488 (Invitrogen; n.1 de cat. A21202) (ambos anticuerpos secundarios) se anadieron a cada pocillo de muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en PBS. Para la tincion de contraste de los nucleos, se anadieron 4 pg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen; N.° de cat. H3570) durante diez minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez con PBS y se dejaron en 100 jl / pocillo de PBS para la obtencion de imagenes.
La obtencion de imagenes se realizo utilizando un Analizador celular IN 1000 (GE Healthcare) utilizando el dicroico 51008bs para celulas tenidas con Hoechst 33342 y Alexa Fluor 488 y Alexa Flour 647. Los tiempos de exposicion se optimizaron a partir de pocillos de control positivo tenidos con cada anticuerpo secundario individual. Se adquirieron imagenes de 15 campos por pocillo para compensar cualquier perdida celular durante el bioensayo y los procedimientos de tincion posteriores. Las mediciones para el numero total de celulas y la intensidad total de NGN3 o NKX6.1 se obtuvieron de cada pocillo utilizando el software Cell Developer Toolbox 1,7 (GE Healthcare). La segmentacion de los nucleos se determino en base a los niveles de escala de grises (rango de base 100-300) y el tamano nuclear. La expresion total de la protema NGN3 o NKX6.1 se informo como la intensidad total o la intensidad integrada, definida como la fluorescencia total de la celula multiplicada por el area de la celula. Se elimino el fondo basandose en criterios de aceptacion de rangos de escala de grises entre 200 y 3500. Los datos de intensidad total se normalizaron dividiendo las intensidades totales para cada pocillo por la intensidad total media para el control positivo.
Los resultados de estos estudios se muestran en la Tabla 8. Dos compuestos (kenpaulona y BML-259) no se confirmaron y no tienen efectos potenciadores sobre la expresion de NGN3 o NKX6.1 en relacion con un tratamiento de control. Los compuestos restantes en este ensayo muestran un impacto positivo en uno o ambos factores de transcripcion, confirmando resultados anteriores y subrayando la importancia de estas vfas de senalizacion asociadas.
Tabla 1: BIBLIOTECA DEL INHIBIDOR DE LA QUINASA BioMol (n.° de cat. 2832, v2.2)
LOCALIZACION DE LA PLACA
N.° CAS NOMBRE DEL COMPUESTO O NUMERO ID. P.M. DIANA
B1
167869-21-8 PD-98059 267,3 MEK
B2
109511-58-2 U-0126 380,5 MEK
B3
152121-47-6 SB-203580 377,4 p38 MAPK
B4
84477-87-2 H-7 364,3 PKA, PKG, MLCK, and PKC.
B5
84468-17-7 H-9 324,3 PKA, PKG, MLCK, and PKC.
B6
62996-74-1 Estaurosporina 466,5 Espedfico de Pan
B7
133550-35-5 AG-494 280,3 EGFRK,PDGFRK
B8
AG-825 397,5 HER1-2
B9
125697-92-9 Lavendustina A 381,4 EGFRK
B10
136831-49-7 RG-14620 274,1 EGFRK
B11
118409-57-7 Tirfostina 23 186,1 EGFRK
B12
118409-58-8 Tirfostina 25 202,1 EGFRK
C1
122520-85-8 Tirfostina 46 204,2 EGFRK, PDGFRK
C2
122520-86-9 Tirfostina 47 220,2 EGFRK
C3
122520-90-5 Tirfostina 51 268,2 EGFRK
C4
2826-26-8 Tirfostina 1 184,2 Control negativo para los inhibidores de tirosina quinasa
C5
116313-73-6 Tirfostina AG 1288 231,2 Tirosina quinasas
C6
63177-57-1 Tirfostina AG 1478 315,8 EGFRK
C7
71897-07-9 Tirfostina AG 1295 234,3 Tirosina quinasas
C8
10537-47-0 Tirfostina 9 282,4 PDGFRK
C9
HNMPA (acido hidroxi-2- naftalenilmetilfosforico) 238,2 IRK
C10
120685-11-2 PKC-412 570,6 Inhibidor de PKC
C11
10083-24-6 Piceatannol 244,3 Syk
C12
172889-26-8 PP1 281,4 Familia Src
D1
133550-35-3 AG-490 294,3 JAK-2
D2
AG-126 215,2 IRAK
D3
AG-370 259,3 PDGFRK
D4
AG-879 316,5 NGFRK
D5
154447-36-6 LY 294002 307,4 PI 3-K
D6
19545-26-7 Wortmannina 428,4 PI 3-K
D7
133052-90-1 GF 109203X 412,5 PKC
D8
548-04-9 Hipericina 504,4 PKC
D9
138489-18-6 Ro 31-8220 553,7 PKC
D10
123-78-4 Esfingosina 299,5 PKC
D11
127243-85-0 H-89 519,2 PKA
D12
84478-11-5 H-8 338,3 PKA, PKG
E1
91742-10-8 HA-1004 329,8 PKA, PKG
LOCALIZACION DE LA PLACA
N.° CAS NOMBRE DEL COMPUESTO O NUMERO ID. P.M. DIANA
E2
103745-39-7 HA-1077 327,8 PKA, PKG
E3
HDBA (acido 2-hidroxi-5-(2,5- dihidroxibencilamino)benzoico) 275,3 EGFRK, CaMK II
E4
127191-97-3 KN-62 721,9 CaMK II
E5
KN-93 501 CaMK II
E6
109376-83-2 ML-7 452,7 MLCK
E7
105637-50-1 ML-9 361,3 MLCK
E8
452-06-2 2-Aminopurina 135,1 p58 PITSLRE beta1
E9
158982-15-1 N9-Isopropil-olomoucina 326,4 CDK
E10
101622-51-9 Olomoucina 298,3 CDK
E11
101622-50-8 iso-Olomoucina 298,4 Control negativo para olomoucina.
E12
186692-46-6 Roscovitina 354,5 CDK
F1
24386-93-4 5-lodotubercidina 392,2 ERK2, adenosina quinasa, CK1, CK2,
F2
62004-35-7 LFM-A13 360 BTK
F3
152121-30-7 SB-202190 331,3 p38 MAPK
F4
172889-27-9 PP2 301,8 Familia Src
F5
208260-29-1 ZM 336372 389,4 cRAF
F6
5812-07-7 SU 4312 264,3 Flk1
F7
146535-11-7 AG-1296 266,3 PDGFRK
F8
220904-83-6 GW 5074 520,9 cRAF
F9
6865-14-1 Palmitoil-DL-carnitina Cl 436,1 PKC
F10
82-08-6 Rotlerina 516,6 PKC delta
F11
446-72-0 Genistema 270,2 Tirosina quinasas
F12
486-66-8 Daidzema 254,2 Control negativo para genistema
G1
63177-57-1 Analogo de erbstatina 194 EGFRK
G2
6151-25-3 Quercetina dihidrato 338,3 PI3-K
G3
SU1498 390,5 Flk1
G4
4452-06-6 ZM 449829 182,2 JAK-3
G5
195462-67-7 BAY 11-7082 207,3 V^a de IKK
G6
53-85-0 DRB (5,6-dicloro-1-b-D- ribofuranosllbenCimidazol) 319,1 CK II
G7
HBDDE (eter dimetflico de 2,2',3,3',4,4'- Hexahidroxi-1,1'-bifenil-6,6'-dimetanol) 338,4 PKC alfa, PKC gamma
G8
129-56-6 SP600125 220,2 JNK
G9
479-41-4 Indirubina 262 GSK-3beta, CDK5
G10
160807-49-8 lndirubin-3'-monoxima 277,3 GSK-3beta
G11
146986-50-7 Y-27632 338,3 ROCK
G12
142273-20-9 Kenpaulona 327,2 GSK-3beta
H1
121-40-4 Acido terreico 154,1 BTK
LOCALIZACION
N.° CAS NOMBRE DEL COMPUESTO O NUMERO P.M. DIANA
DE LA PLACA
ID.
H2
35943-35-2 Triciribina 320,3 Via de senalizacion de Akt
H3
BML-257 326,4 Akt
H4
s.c.-514 224,3 IKK2
H5
BML-259 260,4 Cdk5/p25
H6
520-36-5 Apigenina 270,2 CK-II
H7
BML-265 (analogo de erlotinib) 305,4 EGFRK
H8
53123-88-9 Rapamicina 914,2 mTOR
Tabla 2: BIBLIOTECA DEL INHIBICOR DE QUINASA EMD Calbiochem (n.° de cat. 539745)
LOCALIZACION DE LA PLACA
N.° CAS NOMBRE DEL COMPUESTO O NUMERO ID. P.M.
A2
127191-97-3 KN-62 721,9
A3
587871-26-9 Inhibidor de quinasa ATM 395,5
A4
905973-89-9 Inhibidor de quinasa ATM/ATR 555,8
A5
237430-03-4 Alsterpaulona 293,3
A6
852527-97-0 Alsterpaulona, 2-Cianoetilo 346,3
A7
496864-16-5 Aloisina A, RP107 267,3
A8
496864-15-4 Aloisina, RP106 281,4
A9
220792-57-4 Aminopurvalanol A 403,9
A10
866405-64-3 Inhibidor de AMPK, compuesto C 399,5
A11
879127-16-9 Inhibidor de la Aurora quinasa III 413,4
B2
443797-96-4 Inhibidor de Aurora quinasa/Cdk 435,4
B3
160807-49-8 lndirubin-3'-monoxima 277,3
B4
19542-67-7 BAY 11-7082 207,2
B5
189232-42-6 Bohemina 340,4
B6
220749-41-7 Inhibidor de Cdk1 294,7
B7
190654-01-4 Inhibidor de Cdk1, CGP74514A 385,9
B8
443798-55-8 Inhibidor III de Cdk1/2 425,4
B9
40254-90-8 Inhibidor de Cdk1/5 185,2
B10
301836-43-1 Inhibidor I de la casema quinasa, D4476 398,4
B11
934358-00-6 Inhibidor III de casema quinasa III, TBCA 463,8
C2
546102-60-7 Inhibidor de Cdk4 404,2
C3
141992-47-4 Inhibidor II de Cdk4, NSC 625987 271,3
C4
265312-55-8 Inhibidor III de Cdk4 284,3
C5
300801-52-9 Inhibidor de quinasa similar a Cdc2, TG003 249,3
C6
516480-79-8 Inhibidor II de Chk2 363,8
C7
212779-48-1 Compuesto 52 346,8
C8
199986-75-9 Inhibidor III de Cdk2 400,5
C9
444723-13-1 Inhibidor IV de Cdk2, NU6140 422,5
C10
784211-09-2 Inhibidor de Cdk/Crk 473,4
C11
Inhibidor III de ERK 318,3
D2
146986-50-7 Inhibidor de ROCK, Y-27632 338,3
D3
865362-74-9 Inhibidor II de ERK, FR180204 327,3
D4
Inhibidor II de ERK, control negativo 328,3
D5
Fascaplisina, sintetico 306,8
D6
Inhibidor I de GSK-3b 222,3
D7
478482-75-6 Inhibidor II de GSK-3b 395,2
D8
487021-52-3 Inhibidor VIII de GSK-3b 308,3
D9
667463-62-9 Inhibidor IX de GSK-3 356,2
D10
Inhibidor X de GSK-3 398,2
D11
626604-39-5 Inhibidor XI de GSK-3b 349,3
LOCALIZACION DE LA PLACA
N.° CAS NOMBRE DEL COMPUESTO O NUMERO ID. P.M.
E2
330161-87-0 SU6656 371,5
E3
404828-08-6 Inhibidor XIII de GSK-3 301,4
E4
244148-46-7 Isogranulatimida 276,3
E5
186611-52-9 IC261 311,3
E6
507475-17-4 Inhibidor IV de IKK-2 279,3
E7
Derivado de indirubina E804 365,4
E8
129-56-6 Inhibidor II de JNK 220,2
E9
Inhibidor de JNK, control negativo 234,2
E10
345987-15-7 Inhibidor V de JNK 372,5
E11
312917-14-9 Inhibidor IX de JNK 350,4
F2
41179-33-3 Inhibidor de MK2a 349,4
F3
894804-07-0 Inhibidor VIII de JNK 356,4
F4
97161-97-2 K-252a, Nocardiopsis sp. 467,5
F5
142273-20-9 Kenpaulona 327,2
F6
139298-40-1 KN-93 501,0
F7
Inhibidor I de MEK 374,5
F8
623163-52-0 Inhibidor II de MEK 289,7
F9
305350-87-2 Inhibidor de MEK1/2 335,4
F10
522629-08-9 Inhibidor de MNK1 244,2
F11
545380-34-5 Inhibidor de la activacion de NF-kB 356,4
G2
581098-48-8 Inhibidor III de la p38 MAP quinasa 404,5
G3
219138-24-6 Inhibidor de la p38 MAP quinasa 365,8
G4
167869-21-8 PD 98059 267,3
G5
152121-53-4 PD 169316 360,3
G6
165806-53-1 SB220025 338,4
G7
212844-53-6 Purvalanol A 388,9
G8
Inhibidro XII de GSK3b, TWS119 318,3
G9
127243-85-0 H-89, Dihidrocloruro 519,3
G10
SB 202474, Control negativo para los estudios de inhibicion de p38 MAPK 279,3
G11
152121-30-7 SB202190 331,3
H2
152121-47-6 SB 203580 377,4
H3
103745-39-7 HA 1077, Fasudil diclorhidrato 364,3
H4
135897-06-2 SB 218078 393,4
H5
318480-82-9 s.c.-68376 236,3
H6
72873-74-6 SKF-86002 297,4
H7
Inhibidor de la esfingosina quinasa 339,2
H8
62996-74-1 Estaurosporina, Streptomyces sp. 466,5
H9
52029-86-4 STO-609 374,4
H10
666837-93-0 SU9516 241,3
H11
871307-18-5 Inhibidor de TpI2 quinasa 404,8

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo in vitro para aumentar la expresion de NGN3 y NKX6.1 en una poblacion de celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, que comprende las etapas de:
    a) cultivar las celulas madre pluripotenciales
    b) diferenciar las celulas madre pluripotenciales en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo en un medio que comprende activina A,
    c) diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico, complementando el medio utilizado para diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632, y ML-7, y
    d) diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico comprende tratar las celulas con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, wortmanina, SB-203580, SB-202190, Tirfostina 25, Tirfostina, AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7.
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el compuesto seleccionado del grupo que consiste en H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, wortmannina, SB-203580, SB-202190, tirfostina 25, tirfostina AG1478, tirfostina 46, GW 5074, kenpaulona, HNMPA, AG490, Y27632 y ML-7 se usa a una concentracion final de aproximadamente 2,5 pM.
  4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de diferenciar las celulas madre pluripotenciales en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo comprende cultivar las celulas madre pluripotenciales en medio que contiene activina Ay un ligando Wnt en ausencia de suero, eliminar a continuacion el ligando Wnt y cultivar las celulas con activina A y suero.
  5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico comprende ademas tratar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo con un factor de crecimiento de fibroblastos y el inhibidor de la via de senalizacion hedgehog KAAD-ciclopamina, eliminar despues el medio que contiene el factor de crecimiento de fibroblastos y KAAD-ciclopamina y, posteriormente, cultivar las celulas en medio que contiene acido retinoico, un factor de crecimiento de fibroblastos y KAAD-ciclopamina.
  6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico que comprende ademas tratar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico definitivo con acido retinoico y al menos un factor de crecimiento de fibroblastos.
  7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico comprende, ademas, cultivar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en medio que contiene exendina 4, retirar a continuacion el medio que contiene exendina 4 y cultivar posteriormente las celulas en medio que contiene exendina 1, IGF-1 y HGF.
  8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, comprende, ademas, cultivar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en medio que contiene DAPT y exendina 4.
  9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, comprende, ademas, cultivar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en medio que contiene exendina 4.
  10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de diferenciar las celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endodermico pancreatico en celulas que expresan marcadores caractensticos del linaje endocrino pancreatico, comprende, ademas, tratar las celulas que expresan marcadores
    5
    10
    15
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    35
    40
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    50
    55
    60
    65
    caractensticos del linaje endodermico pancreatico con un factor que inhibe la v^a de senalizacion de Notch.
  11. 11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las celulas madre pluripotenciales expresan uno o mas de los siguientes marcadores: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXINa43, Connexina45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
  12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las celulas caractensticas del linaje endodermico definitivo expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, protema homeobox similar a Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2.
  13. 13. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las celulas caractensticas del linaje endodermico pancreatico expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1, HNF1 beta, PTF1 alpha, HNF6, HB9 y PROX1.
  14. 14. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las celulas caractensticas del linaje endocrino pancreatico expresan al menos uno de los siguientes marcadores: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 y PTF-1 alfa.
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WO (1) WO2011079018A2 (es)
ZA (1) ZA201205488B (es)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
DK2185693T3 (da) 2007-07-31 2019-09-23 Lifescan Inc Differentiering af humane embryoniske stamceller
RU2551772C2 (ru) 2008-02-21 2015-05-27 Сентокор Орто Байотек Инк. Способы, поверхностно-модифицированные носители и композиции для иммобилизации, культивирования и открепления клеток
EP2310492B1 (en) 2008-06-30 2015-07-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
RU2547925C2 (ru) 2008-11-20 2015-04-10 Сентокор Орто Байотек Инк. Способы и композиции для закрепления и культивирования клеток на плоских носителях
US20100124781A1 (en) 2008-11-20 2010-05-20 Shelley Nelson Pluripotent Stem Cell Culture on Micro-Carriers
AU2010276438B2 (en) 2009-07-20 2015-06-11 Janssen Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
RU2610176C2 (ru) 2009-12-23 2017-02-08 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
WO2011109279A2 (en) 2010-03-01 2011-09-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
WO2011140441A2 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
CA2809300A1 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CN103890167A (zh) 2011-06-21 2014-06-25 诺沃—诺迪斯克有限公司 自多潜能干细胞有效诱导定形内胚层
CA2860107C (en) 2011-12-22 2021-06-01 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells
RU2018108850A (ru) 2012-06-08 2019-02-26 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в панкреатические эндокринные клетки
EP2893000B1 (en) 2012-09-03 2019-04-10 Novo Nordisk A/S Generation of pancreatic endoderm from pluripotent stem cells using small molecules
USD1009775S1 (en) 2014-10-15 2024-01-02 Maxeon Solar Pte. Ltd. Solar panel
USD933584S1 (en) 2012-11-08 2021-10-19 Sunpower Corporation Solar panel
JP6307515B2 (ja) * 2012-11-28 2018-04-04 コーニング インコーポレイテッド 肝細胞機能の増強のための細胞培養培地
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
KR102036780B1 (ko) 2012-12-31 2019-10-25 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Hb9 조절제를 사용하는 인간 배아 줄기세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
RU2768963C2 (ru) 2012-12-31 2022-03-25 Янссен Байотек, Инк. Культивация эмбриональных стволовых клеток человека в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки
US10377989B2 (en) 2012-12-31 2019-08-13 Janssen Biotech, Inc. Methods for suspension cultures of human pluripotent stem cells
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
US10081609B2 (en) 2013-03-15 2018-09-25 The Broad Institute, Inc. Compounds for inducing proliferation and differentiation of cells, and methods of use thereof
SG10201810739VA (en) * 2014-05-16 2019-01-30 Janssen Biotech Inc Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells
CA2949834A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 James Macormack Wells Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
USD999723S1 (en) 2014-10-15 2023-09-26 Sunpower Corporation Solar panel
USD913210S1 (en) 2014-10-15 2021-03-16 Sunpower Corporation Solar panel
USD933585S1 (en) 2014-10-15 2021-10-19 Sunpower Corporation Solar panel
USD896747S1 (en) 2014-10-15 2020-09-22 Sunpower Corporation Solar panel
JP6804438B2 (ja) 2014-10-17 2020-12-23 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 多能性幹細胞を使用するヒト小腸のｉｎ ｖｉｖｏモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法
WO2016104541A1 (ja) * 2014-12-24 2016-06-30 国立大学法人京都大学 内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、肝臓細胞の誘導促進キット、膵臓細胞の誘導促進キット、およびマイクロ流体デバイス
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
CA3016641A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Children's Hospital Medical Center Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same
WO2018106628A1 (en) 2016-12-05 2018-06-14 Children's Hospital Medical Center Colonic organoids and methods of making and using same
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
KR102244910B1 (ko) 2018-03-16 2021-04-26 주식회사 엘지화학 세리아-탄소-황 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 양극 및 리튬-황 전지
EP3801638A1 (en) * 2018-06-08 2021-04-14 Novartis AG Cell-based assay for measuring drug product potency
US10724052B2 (en) 2018-09-07 2020-07-28 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US20220233298A1 (en) 2019-05-31 2022-07-28 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
JP2022534546A (ja) 2019-05-31 2022-08-01 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 生体適合性メンブレン複合体
AU2020283056B2 (en) 2019-05-31 2023-06-08 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
JP7328362B2 (ja) 2019-05-31 2023-08-16 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティド 制御された酸素拡散距離を伴う細胞カプセル化デバイス
US11104918B2 (en) 2019-09-05 2021-08-31 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US11116797B2 (en) 2019-09-05 2021-09-14 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CN111057677B (zh) * 2019-12-27 2021-08-03 浙江大学 一种软骨祖细胞培养基及其制备方法和应用
AU2021414617A1 (en) 2020-12-31 2023-08-10 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
EP4330376A1 (en) * 2021-04-28 2024-03-06 Shandong University Methods for improving early embryo development
CN113234664B (zh) * 2021-05-11 2024-05-10 澳门大学 一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用

Family Cites Families (188)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) * 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US5804178A (en) 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
SU1767433A1 (ru) * 1989-11-27 1992-10-07 Пермский государственный медицинский институт Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
US5795965A (en) 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (es) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
JP4079461B2 (ja) 1994-12-29 2008-04-23 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを含んでなる抗腫瘍剤の作用増強剤
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
IL132318A0 (en) 1997-04-24 2001-03-19 Ortho Mcneil Pharm Inc Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
AU8476698A (en) 1997-07-03 1999-01-25 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
US6521427B1 (en) 1997-09-16 2003-02-18 Egea Biosciences, Inc. Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
ZA9811898B (en) 1997-12-29 2000-06-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Anti-Inflammatory Compounds.
WO1999047163A2 (en) 1998-03-18 1999-09-23 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) * 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
NZ513598A (en) 1999-01-21 2001-09-28 Vitro Diagnostics Inc Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
EP1240518A4 (en) 1999-12-13 2006-05-17 Scripps Research Inst MARKERS FOR THE IDENTIFICATION AND INSULATION OF PRE-GENERIC CELLS OF A AND B PANCREAS ISOLATED CELLS
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
JP4621410B2 (ja) 2000-06-26 2011-01-26 Ｎｃメディカルリサーチ株式会社 神経細胞へ分化しうる細胞分画の調製方法及び神経変性疾患治療薬の製造方法
MXPA03003612A (es) 2000-10-23 2003-06-19 Smithkline Beecham Corp Compuestos novedosos.
DE60112611T2 (de) 2000-12-08 2006-06-14 Ortho Mcneil Pharm Inc Makroheterocyclische verbindungen als kinase inhibitoren
MXPA03005140A (es) 2000-12-08 2004-10-15 Johnson & Johnson Compuestos de pirrolina sustituidos con indazolilo como inhibidores de cinasa.
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
US20040121460A1 (en) 2001-01-24 2004-06-24 Lumelsky Nadya L Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
PT1355910E (pt) 2001-01-25 2011-03-24 Us Of America Represented By The Secretary Dept Of Health And Human Services Formulação de compostos do ácido borónico
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
US20050054102A1 (en) 2001-04-19 2005-03-10 Anna Wobus Method for differentiating stem cells into insulin-producing cells
JP4296781B2 (ja) 2001-04-24 2009-07-15 味の素株式会社 幹細胞及びその分離方法
CA2447015A1 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
WO2003014313A2 (en) 2001-08-06 2003-02-20 Bresagen, Ltd. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) * 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
WO2003033697A1 (en) 2001-10-18 2003-04-24 Ixion Biotechnology, Inc. Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
US8021876B2 (en) 2001-11-15 2011-09-20 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
KR100811995B1 (ko) 2001-12-07 2008-03-10 사이토리 테라퓨틱스, 인크. 처리된 리포애스퍼레이트 세포로 환자를 치료하기 위한시스템 및 방법
CA2470539C (en) 2001-12-07 2011-10-04 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells
WO2003054169A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
JPWO2003087349A1 (ja) 2002-04-17 2005-08-18 大塚製薬株式会社 間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
JP2005529918A (ja) 2002-05-08 2005-10-06 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 置換されたピロリンキナーゼ阻害剤
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
US20040127406A1 (en) 2002-05-28 2004-07-01 Presnell Sharon C. Methods for in vitro expansion and transdifferentiation of human pancreatic acinar cells into insulin-producing cells
RU2004135382A (ru) 2002-06-05 2005-06-27 Янссен Фармацевтика Н.В. (Be) Замещенные пирролины в качестве ингибиторов киназы
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
WO2004011621A2 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Es Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
AU2003262628A1 (en) 2002-08-14 2004-03-03 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
AU2003268534A1 (en) 2002-09-06 2004-03-29 Amcyte Inc. Cd56 positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
US20060252150A1 (en) 2002-11-08 2006-11-09 Linzhao Cheng Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004050827A2 (en) 2002-12-05 2004-06-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
EP1572984B8 (en) 2002-12-16 2016-06-01 Technion Research & Development Foundation Ltd. Feeder-free, xeno-free culture system for human embryonic stem cells
RU2359671C2 (ru) * 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
WO2004073633A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
WO2005045001A2 (en) 2003-02-14 2005-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070020242A1 (en) 2003-03-27 2007-01-25 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
CA2530255C (en) 2003-06-27 2015-12-08 Ethicon, Incorporated Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells
IL161903A0 (en) * 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
US7569385B2 (en) 2003-08-14 2009-08-04 The Regents Of The University Of California Multipotent amniotic fetal stem cells
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
US20070212732A1 (en) 2003-08-27 2007-09-13 Nobuko Uchida Enriched Pancreatic Stem Cell and Progenitor Cell Populations, and Methods for Identifying, Isolating and Enriching for Such Populations
EP1696899A1 (en) 2003-12-17 2006-09-06 Allergan, Inc. Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
MX2009009225A (es) 2003-12-23 2009-09-28 Cythera Inc Endodermo definitivo.
WO2005116073A2 (en) 2004-04-27 2005-12-08 Cythera, Inc. Pdx1 expressing endoderm
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
WO2005065354A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
US20070298453A1 (en) 2004-02-12 2007-12-27 University Of Newcastle Upon Tyne Stem Cells
JP2008500809A (ja) * 2004-03-09 2008-01-17 ライフスキャン・インコーポレイテッド インスリン産生細胞を発生させるための方法
CA2558486A1 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Alberto Hayek Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
JP4491014B2 (ja) 2004-04-01 2010-06-30 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 幹細胞の内胚葉および膵臓系統への分化
CA2573283C (en) 2004-07-09 2023-03-14 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
KR20070083559A (ko) 2004-08-13 2007-08-24 더 유니버시티 오브 죠지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 인간 배아 줄기세포에서의 자가재생 및 분화를 위한 조성물및 방법
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
US7449334B2 (en) 2004-09-08 2008-11-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Medium containing pipecholic acid and gamma amino butyric acid and culture of embryonic stem cells
GB2432835B (en) 2004-09-08 2009-04-08 Wisconsin Alumni Res Found Culturing human embryonic stem cells
AU2006210955A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
JP5265204B2 (ja) 2005-03-04 2013-08-14 ライフスキャン・インコーポレイテッド 成人膵臓由来間質細胞
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
ATE553198T1 (de) 2005-04-15 2012-04-15 Geron Corp Behandlung von krebs durch die kombinierte hemmung der proteasom- und telomeraseaktivitäten
US20080208351A1 (en) 2005-04-26 2008-08-28 Aarhus Universitet Biocompatible Material for Surgical Implants and Cell Guiding Tissue Culture Surfaces
RU2007147917A (ru) 2005-06-10 2009-07-20 Айрм Ллк (Bm) Соединения, поддерживающие плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
US20080199959A1 (en) 2005-06-21 2008-08-21 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method For Cell Culture
AU2006265205B2 (en) 2005-06-30 2011-06-30 Janssen Pharmaceutica N.V. Cyclic anilino - pyridinotriazines
AU2006274438A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
EP1943334A1 (en) 2005-09-02 2008-07-16 Agency for Science, Technology and Research Method of deriving progenitor cell line
GB2444686B (en) 2005-09-12 2010-08-25 Es Cell Int Pte Ltd Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins
JP2009511061A (ja) 2005-10-14 2009-03-19 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 膵臓表現型を有する細胞への非胚性幹細胞の分化
CN101351547A (zh) 2005-10-27 2009-01-21 赛瑟拉公司 表达pdx1的背侧和腹侧前肠内胚层
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
SG10202109176RA (en) 2006-02-23 2021-09-29 Viacyte Inc Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
EP4112718A1 (en) 2006-03-02 2023-01-04 ViaCyte, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
ES2725601T3 (es) 2006-04-28 2019-09-25 Lifescan Inc Diferenciación de células madre embriónicas humanas
US20070259423A1 (en) 2006-05-02 2007-11-08 Jon Odorico Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US7964402B2 (en) 2006-05-25 2011-06-21 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
CA2893679C (en) 2006-06-26 2018-10-30 Lifescan, Inc. Conditioned medium for pluripotent stem cell culture
US8968994B2 (en) 2006-07-06 2015-03-03 Jeremy Micah Crook Method for stem cell culture and cells derived therefrom
WO2008013664A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
US20080091234A1 (en) 2006-09-26 2008-04-17 Kladakis Stephanie M Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
CA2666789C (en) 2006-10-18 2016-11-22 Yong Zhao Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
WO2008086005A1 (en) 2007-01-09 2008-07-17 University Of South Florida Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
CA2676044C (en) 2007-01-30 2019-10-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc)
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
US7839480B2 (en) * 2007-04-25 2010-11-23 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Photomask haze reduction via ventilation
CN105176919A (zh) 2007-07-18 2015-12-23 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
DK2185693T3 (da) 2007-07-31 2019-09-23 Lifescan Inc Differentiering af humane embryoniske stamceller
WO2009027644A2 (en) 2007-08-24 2009-03-05 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Composition
KR101592182B1 (ko) 2007-11-27 2016-02-05 라이프스캔, 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
RU2551772C2 (ru) 2008-02-21 2015-05-27 Сентокор Орто Байотек Инк. Способы, поверхностно-модифицированные носители и композиции для иммобилизации, культивирования и открепления клеток
EP2271747B1 (en) 2008-03-17 2016-09-07 Agency for Science, Technology And Research Microcarriers for pluripotent stem cell culture
AU2008355123B2 (en) 2008-04-21 2014-12-04 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US7939322B2 (en) * 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
WO2009137844A2 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Vistagen Therapeutics, Inc. Pancreatic endocrine progenitor cells derived from pluripotent stem cells
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
EP2310492B1 (en) 2008-06-30 2015-07-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
CA2742268C (en) 2008-10-31 2020-02-18 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
BR112012001564A2 (pt) 2009-07-20 2015-09-01 Janssen Biotech Inc Diferenciação de células tronco embrionárias humanas.
US20120322152A1 (en) 2010-03-02 2012-12-20 Michael Raghunath Culture Additives To Boost Stem Cell Proliferation And Differentiation Response

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