CN109694848A - 一种促进附植前胚胎体外发育和提高胚胎移植效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进附植前胚胎体外发育和提高胚胎移植效率的方法，所述方法为将胚胎在含有α‑酮戊二酸的培养液中培养，或在胚胎的培养过程中添加α‑酮戊二酸。通过在体外胚胎培养液中添加α‑酮戊二酸能够提高体外发育胚胎的囊胚率、孵化囊胚率、囊胚内细胞团细胞数和占细胞总数的比例，进而显著提高了胚胎移植的妊娠率。本发明提供的促进胚胎体外发育的方法，操作工艺简单易行，成本低廉，为进一步提高哺乳动物胚胎的体外培养和发育以及辅助生殖技术的发展提供了有效的方法和新的思路。

Description

一种促进附植前胚胎体外发育和提高胚胎移植效率的方法
技术领域
本发明涉及动物遗传育种领域，具体涉及一种促进附植前胚胎体外发育和提高胚胎移植效率的方法。
背景技术
胚胎移植作为目前快速发展的动物繁殖技术，可使性能优异的动物最大限度地发挥在品种改良和育种工作中潜力和作用，提高繁殖效率，加速品种改良，扩大良种动物群，应用和发展前景非常广阔。胚胎的体外培养是胚胎移植技术的关键环节，体外培养胚胎的质量和移植的妊娠率是影响动物胚胎移植效率的关键因素。如何提高胚胎的体外发育效率和质量，进而提高体外培养胚胎的移植效率，一直是科研和技术人员的研究热点。
α-酮戊二酸(α-KG)是机体内三羧酸循环以及其它多种代谢通路的重要中间产物，具有结构稳定、不易降解、无毒安全等特点。目前，α-酮戊二酸已被应用于运动功能性保健品以及运动饮料添加剂，帮助运动员迅速恢复体能和增加肌肉活力。作为谷氨酰胺的前体物质，α-酮戊二酸在临床上可以促进烧伤病人伤口的恢复。已有研究表明，α-酮戊二酸可以缓解仔猪腹泻、促进体重增加和骨骼发育，日粮中添加α-酮戊二酸还可以促进肉仔鸡的生长发育。此外α-酮戊二酸还具有提高血浆中胰岛素水平，提高应激状态下骨钙素的水平，改善术后病人的负氮平衡和肌肉异化等功能。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种促进附植前胚胎体外发育和提高胚胎移植效率的方法。
α-酮戊二酸是机体重要的中间代谢物，在体内具有重要的生理功能，现有技术对于α-酮戊二酸的功能的研究较多，但没有α-酮戊二酸与胚胎发育存在作用关系的研究报道。发明人长期致力于动物遗传育种方面的研究，在进行体外胚胎的培养和发育相关的研究中，发明人偶然发现，在培养液中添加α-酮戊二酸能促进胚胎的发育，显著提高胚胎移植的效率。
首先，本发明提供α-酮戊二酸在促进胚胎体外发育或提高胚胎移植效率中的应用。
具体地，所述应用为将所述胚胎在含有α-酮戊二酸的培养液中培养，或在所述胚胎的培养过程中添加α-酮戊二酸。
发明人进一步发现，α-酮戊二酸对于胚胎发育的影响作用在胚胎发育的初始阶段即胚胎附植前尤为重要和显著。
优选地，所述添加为在胚胎附植前的体外培养阶段添加。
更优选地，所述添加为在胚胎发育的原核期至囊胚期之间添加。
作为本发明的优选实施方式，所述添加为在胚胎的体外发育开始时添加。
发明人进一步发现，α-酮戊二酸为一定的添加浓度时对于胚胎发育的影响作用尤为显著。
具体地，所述α-酮戊二酸在所述胚胎的培养液中的浓度为0.1～5mM；优选为0.1～3mM。
本发明中，所述的胚胎来源为哺乳动物。
本领域技术人员应当理解，哺乳动物胚胎的体外发育的过程和机制十分相似，本发明提供的利用α-酮戊二酸促进胚胎体外发育的方法，同样适用于鼠等小型哺乳动物、牛、猪、马等中型或大型哺乳动物的体外胚胎培养。
本发明中，所述的胚胎优选来源于非人哺乳动物，更优选来源于鼠、牛、猪、羊、马、鹿、貂、狐狸中的任意一种。
作为本发明的优选实施方式，当所述胚胎来源于小鼠时，α-酮戊二酸在所述胚胎的培养液中的浓度为0.1～2mM；优选为0.1～1mM；更优选为0.1～0.3mM。
当所述胚胎来源于牛时，α-酮戊二酸在所述胚胎的培养液中的浓度为0.15～1mM；优选为0.15～0.5mM。
另一方面，本发明还提供一种促进胚胎体外发育的方法，为将所述胚胎在含有α-酮戊二酸的培养液中培养，或在所述胚胎的培养过程中添加α-酮戊二酸。
发明人经过大量实验验证，证明α-酮戊二酸对于动物胚胎发育的促进作用为α-酮戊二酸独立发挥作用，并不依赖于与特定的培养液或特定的物质配合使用。因此，本领域技术人员应当理解，本发明提供的利用α-酮戊二酸促进动物胚胎发育的方法中，所采用的培养液可以为适用于各种动物胚胎的现有技术公开的各种培养液或其它未公开的培养液，包括但不限于常用的培养液如KSOM、M16、PZM-3等。
优选地，所述添加为在胚胎附植前的体外培养阶段添加。
更优选地，所述添加为在胚胎发育的原核期至囊胚期胚胎之间添加。
作为本发明的优选实施方式，所述添加为在胚胎体外培养的开始时添加。
具体地，所述α-酮戊二酸在所述胚胎的培养液中的浓度为0.1～5mM；优选为0.1～3mM。
作为本发明的优选实施方式，当所述胚胎来源于小鼠时，α-酮戊二酸在所述胚胎的培养液中的浓度为0.1～2mM，优选为0.1～1mM；更优选为0.1～0.3mM。
当所述胚胎来源于牛时，α-酮戊二酸在所述胚胎的培养液中的浓度为0.15～1mM；优选为0.15～0.5mM。
本发明所述的促进胚胎体外发育的方法包括如下步骤：
(1)原核期胚胎的采集：采用自然交配或人工授精的方式，得到原核期的胚胎；所述胚胎来源为哺乳动物；
(2)胚胎的体外培养：将所述原核期胚胎置于含有浓度为0.1～3mM的α-酮戊二酸的培养液中进行胚胎的体外培养，或在所述原核期胚胎培养至囊胚期之前添加α-酮戊二酸至终浓度为0.1～3mM。
此外，本发明还提供一种胚胎的体外培养液，所述培养液中含有α-酮戊二酸。
优选地，所述α-酮戊二酸的浓度为0.1～5mM。
更优选地，所述α-酮戊二酸的浓度为0.1～3mM。
优选地，所述培养液中还含有无机盐、碳水化合物、必需氨基酸、非必需氨基酸中的一种或多种。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次发现，在体外胚胎培养液中添加α-酮戊二酸能够显著提高鼠、牛等动物体外发育胚胎的囊胚率、孵化囊胚率、囊胚内细胞团细胞数及其占囊胚细胞总数的比例，进而显著提高了胚胎移植的妊娠率(提高了150％)、产仔率(提高了60％)和幼仔的初生体重(提高了47％)。
(2)本发明提供的促进胚胎体外发育的方法中，使用的α-KG对动物没有毒性作用，使用安全；溶解性能优越，易溶于水和有机溶质，不需要其它溶剂介质(如二甲基亚砜，丙二醇等)帮助促进溶解；且物理性质稳定、见光不易分解，在溶液中也不易降解，非常易于实践使用过程中的操作。
(3)本发明提供的促进胚胎体外发育的方法中，使用的α-KG可以选择直接添加在胚胎培养液中，全程培养，中间无需换液，避免了换液对胚胎发育的不良影响。
(4)本发明提供的促进胚胎体外发育的方法，对于胚胎发育的促进效果显著、操作工艺简单易行，成本低廉，为进一步提高小鼠、家畜等哺乳动物的体外胚胎的培养和发育及其辅助生殖技术的发展提供了有效的方法和新的思路。
附图说明
图1为实施例2中α-KG对囊胚基因表达的影响；其中Control代表未添加α-KG的对照组，αKG代表添加α-KG的实验组。
图2为实施例2中α-KG对囊胚的细胞凋亡率的影响；其中Control代表未添加α-KG的对照组，α-KG代表添加α-KG的实验组。
图3实施例4中α-KG对囊胚细胞的线粒体功能的影响，其中，a为ATP水平；b为线粒体拷贝数；c为线粒体膜电位；Control代表未添加α-KG的对照组，α-KG代表添加α-KG的实验组。
图4为实施例5中α-KG对囊胚细胞的甲基化水平的影响，其中，a为囊胚中5-hmC荧光染色的图片；b为5-hmC在对照组(Control，未添加α-KG)、α-KG处理的实验组(α-KG)和体内胚胎(In vivo)的含量分析；c为Tet1基因的表达水平分析(FPKM)；d为Tet2基因的表达水平分析(FPKM)；e为Tet3基因的表达水平分析(FPKM)；f为对照组(Control)和α-KG处理的实验组(α-KG)胚胎的Tet1和Tet2基因的相对表达水平。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所有试验数据均采用SPSS软件进行统计分析。
实施例1原核期胚胎的采集
6-7周龄的ICR雌鼠经过1～2周的适应性饲养后，腹腔注射PMSG(10IU)，间隔48h注射hCG(10IU)进行超数排卵。注射hCG的雌鼠即刻与性成熟同系公鼠合笼。在隔日早晨(约注射hCG16h后)检查阴道栓，有栓雌鼠在注射hCG的24h后进行颈椎脱臼处死。用提前预热的M2操作液冲洗输卵管，收集形态正常的原核期胚胎。操作在25℃室温环境下、37℃的恒温台上进行。
实施例2 α-酮戊二酸对胚胎发育的影响
在35mm培养皿中制作60μL的胚胎培养液的培养滴，胚胎培养液分别为KSOM培养液及KSOM培养液分别添加终浓度为100μM、150μM、200μM、300μM的α-酮戊二酸，以不添加α-酮戊二酸的KSOM培养液为对照组，添加100μM、150μM、200μM、300μMα-酮戊二酸的组别为实验组；放入培养箱(37℃，5％CO2)中进行预平衡。在每个培养滴中放入20-30枚实施例1采集的原核期胚胎，置于培养箱中进行培养(实验组和对照组共计5组，每组入孵的胚胎数如表1所示，共培养了1326枚原核胚胎)。
将原核胚在培养箱内培养24h，统计卵裂率。在培养箱内培养天3.5～4天后统计囊胚率和孵化囊胚率。
结果如表1所示，添加α-酮戊二酸培养得到的原核期胚胎的卵裂率与对照组没有显著差异，但囊胚率和孵化囊胚率较对照组均显著提高。其中，添加100、150、200和300μM的α-酮戊二酸培养的原核胚的囊胚率分别为62.64±5.19％、69.90±2.51％、64.56±5.06％和61.33±8.46％，都显著高于对照组(53.82±4.58％)(p＜0.05)；添加100、150、200和300μM的α-酮戊二酸培养的原核胚的孵化囊胚率分别为27.60±2.67％、30.60±1.56％、32.22±3.33％和35.17±1.42％，均显著高于对照组19.82±3.14％。
表1添加α-KG对囊胚率与孵化囊胚率的影响
注：表中肩注不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，标注相同小写字母者表示无显著差异(p>0.05)。
囊胚率是衡量胚胎发育效率的关键指标，上述结果表明，添加终浓度为100-300μM的α-酮戊二酸对于胚胎的体外发育都具有促进作用，其中添加150μM时的促进效果最佳，因此后续实验选择终浓度为150μM的α-酮戊二酸的添加量进行。
收集上述囊胚并将其转移至4％的多聚甲醛中，置于4℃，固定过夜，采用Triton打孔，BSA封闭，孵育一抗(Oct4抗体)，清洗，孵育二抗，清洗，DAPI染色，置于荧光显微镜下激发拍照。Oct4荧光阳性的细胞标记为内细胞团，DAPI荧光标记胚胎总细胞数。结果如表2所示，添加150μM的α-酮戊二酸的胚胎的内细胞团(ICM)的细胞数和ICM占总细胞数的比例分别为25.50±3.46和38.25±5.85％，显著高于对照组的16.87±1.87和27.61±2.96％(p＜0.05)。
表2添加α-KG后对囊胚细胞数及内细胞团数影响
注：表中肩注不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，标注相同小写字母者表示无显著差异(p>0.05)。
ICM是干细胞的主要来源，因此，采用qRT-PCR法检测对照组和α-KG添加的实验组中与胚胎的多能性相关的基因的表达情况。结果如图1所示，对照组和α-酮戊二酸组的胚胎多能性相关基因Oct4、Sox2、Nanog的表达量的差异不显著(p>0.05)，但α-KG处理组的多能性相关基因的表达量表现出明显的上升趋势(图1)。
细胞凋亡是影响胚胎质量的重要因素之一，因此，对细胞凋亡率进行检测。TUNEL染色显示，150μM的α-KG处理的囊胚的凋亡率为6.26％±0.66％，与对照组(7.42％±1.02％)相似，说明α-KG不会引起胚胎细胞凋亡(图2)。
实施例3 α-酮戊二酸对移植胚胎的妊娠和产仔效率的影响
为考察α-KG处理的胚胎的质量，将实施例2中150μM的α-KG处理的胚胎移植至小鼠体内，分析胚胎移植后的妊娠和产仔情况。将添加α-KG(150μM)的实验组和对照组(不添加α-KG)的培养3.5天的囊胚移植到受体小鼠中，正常饲养小鼠，检查小鼠的妊娠和产仔情况。结果表明，α-KG(150μM)实验组的妊娠率、分娩率和初生体重分别为62.5％、25.0％和1.46g，均显著高于对照组(25.0％、15.6％、0.99g)，α-KG(150μM)实验组的妊娠率提高了150％，产仔率提高了60％，初生体重提高了47％。
表3 α-KG培养胚胎的移植后妊娠和产仔情况
组别 妊娠率(％) 产仔率(％) 初生体重(g)
Control 25.0％(2/8)<sup>b</sup> 15.6％(15/96)<sup>b</sup> 0.99±0.05<sup>b</sup>
150μM 62.5％(5/8)<sup>a</sup> 25.0％(24/96)<sup>a</sup> 1.46±0.07<sup>a</sup>
注：表中肩注不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)，不标注或者标注相同小写字母者表示无显著差异(p>0.05)。
实施例4 α-酮戊二酸对线粒体功能的影响
为分析胚胎的线粒体功能，分别检测反映线粒体功能最直接的指标：ATP、线粒体膜电位和线粒体拷贝数。结果如图3所示，与对照组相比，150μM的α-KG处理显着降低了胚胎的ATP水平(实验组为0.12±0.02，对照组为0.29±0.03；p＜0.05)(图3的a)，显著增加线粒体膜电位(实验组为3.93±0.60，对照组为1.34±0.20；p＜0.05)(图3的c)。实验组和对照组的线粒体拷贝数没有显着差异(实验组为487.7±137.3，对照组为531.9±116.2；p＞0.05)(图3的b)。
实施例5 α-酮戊二酸对早期胚胎发育表观遗传的影响
α-KG和Fe(II)是活化Tet酶家族的辅助因子，Tet家族是重要的表观遗传修饰酶，能够将5-甲基胞嘧啶(5-mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)。因此，检测体外和体内囊胚的5hmc水平和Tet基因的表达水平，分析α-KG处理对胚胎甲基化水平的影响。添加α-KG(150μM)的实验组的体外发育胚胎的5-hmC比值平均荧光强度(MFI)水平(1814.21±338.63)显著高于未添加α-KG的对照组的体外发育胚胎(184.19±61.13；p<0.05)，但显著低于体内发育胚胎组(4250.78±738.64；p<0.05)(图4的a和b)。添加α-KG的实验组胚胎的Tet1和Tet2基因的相对表达水平较对照组略有提高，但Tet1，Tet2和Tet3的表达水平没有显著差异(图4的c、d、e和f)。结果表明，α-KG处理能够降低胚胎的DNA甲基化水平，但并未显著改变Tet的基因表达。
实施例6 α-酮戊二酸对牛体外受精胚胎发育的影响
从屠宰场获取牛卵巢，抽取卵泡液，在体视镜下分拣出卵丘卵母细胞复合体，加入牛胚胎体外成熟培养液，在38.5℃饱和湿度的5％CO2培养箱内进行体外成熟培养44h后，用吸卵针脱去卵丘细胞，进行体外受精10h，将假定受精的卵母细胞用牛前期胚胎发育液洗涤3遍，并转移至添加了0.15mMα-KG且预平衡2h的牛前期胚胎发育液滴中，每滴20-25枚，在38.5℃饱和湿度的5％CO2培养箱的发育48h后，转移至牛胚胎后期发育液内，每48小时半换液一次，以牛前期胚胎发育液中不添加α-KG组为对照组。期间统计胚胎的卵裂率和囊胚发育率(胚胎发育第8天)并对囊胚进行DAPI荧光染色，对其细胞数进行计数。
上述牛胚胎体外成熟培养液的配方如下：M199培养液加入10％FBS(胎牛血清)，10μg/mL FSH(卵泡刺激素)，1μg/mL LH(促黄体生成素)，1μg/mL E2(雌二醇)，100μg/m青霉素，100μg/mL链霉素。
上述牛前期胚胎发育液的配方如下：CR1aa+3mg/mLBSA。其中，CR1aa的配方如下(100mL)：0.67g NaCl，0.023g KCl，0.22g NaHCO3，0.002g乳酸钠，100μL酚红；将上述药品加入90mL超纯水中充分溶解后，加入0.055g半乳糖酸钙，调节pH为7.4，定容至100mL。使用当天，在每1mL的CR1aa中加入3mg无脂肪酸的BSA，20μL必需氨基酸(50x浓储)，10μL非必需氨基酸(100x浓储)和10μL的L-Glutamine(100x浓储)，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
上述牛胚胎后期发育液的配方如下：CR1aa+6％FBS；其中CR1aa的配方如下(100mL)：0.67g NaCl，0.023g KCl，0.22g NaHCO3，0.002g乳酸钠，100μL酚红。
结果表明，与实施例2中α-酮戊二酸对于小鼠的胚胎体外发育的促进作用类似，在牛体外受精胚胎培养液中添加α-酮戊二酸也同样能够显著提高牛胚胎发育的囊胚率、孵化囊胚率以及内细胞团数和内细胞团数占囊胚细胞数的比例。
尽管以上具体实施方式中仅提供了α-KG对于小鼠和牛的体外胚胎发育的实施例，但哺乳动物胚胎体外发育的过程和机制十分相似，α-KG促进胚胎体外发育和辅助生殖的机制，同样适用于家畜等大型哺乳动物的体外胚胎培养和辅助生殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.α-酮戊二酸在促进胚胎体外发育或提高胚胎移植效率中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为将所述胚胎在含有α-酮戊二酸的培养液中培养，或在所述胚胎的培养过程中添加α-酮戊二酸；
优选地，所述添加为在胚胎附植前的体外培养阶段添加。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述α-酮戊二酸在所述胚胎的培养液中的浓度为0.1～5mM；优选为0.1～3mM。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述胚胎来源为哺乳动物。
5.一种促进胚胎体外发育的方法，其特征在于，为将所述胚胎在含有α-酮戊二酸的培养液中培养，或在所述胚胎的培养过程中添加α-酮戊二酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述添加为在胚胎附植前的体外培养阶段添加；
优选地，所述添加为在胚胎发育的原核期至囊胚期之间添加。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述α-酮戊二酸在所述胚胎的培养液中的浓度为0.1～5mM；优选为0.1～3mM。
8.根据权利要求5～7任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)原核期胚胎的采集：采用自然交配或人工授精的方式，得到原核期的胚胎；所述胚胎来源为哺乳动物；
(2)胚胎的体外培养：将所述原核期的胚胎置于含有浓度为0.1～3mM的α-酮戊二酸的培养液中进行胚胎的体外培养，或在胚胎附植前添加α-酮戊二酸至终浓度为0.1～3mM。
9.一种胚胎的体外培养液，其特征在于，所述培养液中含有α-酮戊二酸；优选地，所述α-酮戊二酸的浓度为0.1～5mM。
10.根据权利要求9所述的体外培养液，其特征在于，所述培养液中还含有无机盐、碳水化合物、必需氨基酸、非必需氨基酸中的一种或多种。
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