CN102703377A - 一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法。本发明方法通过向胚胎发育培养液中添加I型干扰素进行胚胎的体外培养，能显著的提高孤雌激活胚胎与体外受精胚胎的发育能力，比常规培养液培养下的囊胚率提高7％～13％，囊胚孵化率也显著高于常规培养液培养下的囊胚孵化率。本发明方法提高了牛、羊体外胚胎早期发育能力，从而提高了牛、羊胚胎体外生产效率，为以牛羊胚胎为材料的科研和生产领域提供高质量的胚胎。

Description

一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法

技术领域

本发明涉及动物繁殖育种领域，具体地涉及一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法。 

背景技术

胚胎体外生产技术不仅能提高动物的繁殖力，还能降低生产成本，并为以胚胎为对象的研究提供大量材料。但是，如何提高囊胚发育率是此技术的难点。目前，国内外提高牛体外囊胚发育率技术主要从改进培养液成分和培养环境两方面入手。例如，在卵母细胞成熟培养液中添加胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸纳(ITS)或者在常规胚胎培养液中添加白血病生长抑制因子(LIF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)和褪黑素(MT)等都可以提供牛的囊胚发育率。因此，市场上不断出现新的胚胎培养液，如美国Millipore和Caisson公司推出不同的SOF和KSOM。目前国内外有关提高体外囊胚发育率方法的技术有：(1)一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法:通过向培养液中添加10μL/mL和20μL/mL胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)进行体外成熟、体外培养能提高水牛卵母细胞的体外成熟率和囊胚发育率；(2)一种犊牛体外胚胎培养液：在商品化的胚胎培养液G2.5的基础上加入1000u/mL的白血病生长抑制因子和10ng/mL的碱性成纤维生长因子，能够显著提高人废弃胚胎的囊胚发育率和胚胎干细胞的建系效率；早期胚胎体外发育培养液对犊牛体外胚胎进行培养，可以获得较高的囊胚发育率。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法。 

本发明的另一目的在于提供一种动物胚胎发育培养液。 

本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法，是在动物胚胎发育培养液中添加I型干扰素。 

具体地，本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法，是在动物胚胎发育培养液中添加rbIFN-τ。 

所述的rbIFN-τ是本发明前期自行研制的重组蛋白，其制备方法已公开在专利号为200710121136.8的中国发明专利中，授权公告号为CN101116640B。 

所述的动物胚胎发育培养液为本领域常用的胚胎发育培养液，如孤雌激活的胚胎发育培养液采用SOFaa+8mg/mLBSA的培养液或SOFaa+8mg/mL BSA；体外受精胚胎发育培养液选用CR1aa，其配方参见本申请附录或文献【Ushijima H,Yamakawa H,Nagashima H.Cryopreservation of bovine pre-morula-stage in vitro matured/in vitro fertilized embryos after delipidation and before use in nucleus transfer.Biol Reprod 1999,60:534-539.】。 

本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法是在孤雌胚胎激活后的第4天或体外受精卵受精后的第4天的胚胎发育培养液中添加rbIFN-τ。 

进一步地，添加rbIFN-τ的终浓度为100~200ng/mL。 

优选地，在胚胎发育培养液中添加终浓度为100ng/mL的rbIFN-τ。 

其中，开始添加rbIFN-τ后，每隔48h更换体积百分比为原培养液50%的含rbIFN-τ培养液。 

进一步地，上述培养条件为38.5℃，5%CO₂和100%湿度。 

本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法适用动物为牛、羊。 

本发明还提供了一种含有rbIFN-τ的动物胚胎发育培养液。 

进一步地，上述动物胚胎发育培养液的rbIFN-τ的有效浓度为100~200ng/mL。 

进一步地，上述动物胚胎发育培养液的rbIFN-τ的有效浓度为100ng/mL。 

本发明提供了rbIFN-τ在动物体外胚胎培养中的应用。 

本发明通过向胚胎发育培养液中添加rbIFN-τ进行胚胎的体外培养，能显著的提高孤雌激活胚胎与体外受精胚胎的发育能力，本发明方法比常规培养液培养下的囊胚率提高7%~13%，囊胚孵化率也显著高于常规培养液培养下的囊胚孵化率。本发明提供的提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法能够显著提高了牛体外胚胎早期发育能力，从而提高了牛胚胎体外生产效率，降低了生产成本，同时为以胚胎为材料的研究和生产提供了大量优质的胚胎。 

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中使用的试剂除特别说明外，均为市售。 

实施例1  rbIFN-τ对牛卵母细胞孤雌激活胚胎发育的影响 

1、牛卵母细胞的采取与体外成熟培养 

从屠宰场收集牛卵巢，将其置于含有27±2℃的生理盐水的保温瓶内。到实验室之后用37℃预热的灭菌生理盐水洗涤卵巢3遍，然后用注射器抽吸卵巢上面2-8mm卵泡内的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，将具有完整卵丘细胞层或部分致密卵丘细胞在的洗卵液中洗涤2次，然后在成熟液中洗涤3次，将洗净的卵母细胞移入100μL卵母细胞体外成熟培养微滴中，每个微滴放入15~20个卵母细胞，最后置入38.5℃、5%CO₂和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24 小时。 

2、牛卵母细胞的孤雌激活 

将成熟24小时的卵母细胞放入含有0.1％透明质酸酶管内，用移液枪反复吹打1分钟去除卵丘细胞，然后用含10% FBS的H199液洗涤3遍，将形态完整、细胞质均匀的卵母细胞在5μmol/L离子霉素中激活5分钟后，移入含有2.0mmol/L 6-DMAP(二甲基嘌呤)的SOFaa+8mg/mL BSA培养液中培养4小时。然后用SOFaa+8mg/mLBSA洗3遍，转到预平衡4小时的SOFaa+8mg/mL BSA微滴中，每滴15-20枚，置于38.5℃，5% CO₂和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，孤雌激活后48小时检查卵裂率，继续培养6天，作为对照组。统计囊胚率(详见表1)。每隔48小时换半液，即换去50%的SOFaa+8mg/mLBSA的胚胎发育培养液，加入50%的新的SOFaa+8mg/mLBSA胚胎发育培养液。 

3、rbIFN-τ对牛孤雌激活胚胎发育的影响 

从屠宰场取屠宰牛的卵巢吸取2-8mm直径卵泡的COCs，经IVM 24小时后进行孤雌激活，然后将其置于SOFaa+8mg/mLBSA中培养，每隔48小时换液1/2体积【培养条件：38.5℃，5% CO₂和饱和(100%)湿度】，第2天观察卵裂率，第8天观察囊胚率。在孤雌激活后的第4天换半液开始添加rbIFN-τ使整个培养液中rbIFN-τ终浓度为100ng/mL。实验重复3次(详见表1)。 

表1  rbIFN-τ对牛孤雌激活胚胎发育的影响 

注:^a,b相同栏内上标不同表示差异显著(p<0.05)。S.E.M.为标准误。 

卵裂率=卵裂数/总卵子数；囊胚率=囊胚数/卵裂数；囊胚孵化率=孵化的囊 胚数/囊胚数 

本实施例从屠宰场取回卵巢约经3个小时送到实验室，经过体外成熟培养24小时后，进行孤雌激活，然后进行体外培养，于第4天放入含有100ng/mL rbIFN-τ的胚胎发育液中继续培养6天，每48小时换半液，并设对照组，即按照常规培养方法培养，不添加含有100ng/mL rbIFN-τ的胚胎发育液，只添加常规的胚胎发育液。结果发现，本发明方法对孤雌激活胚胎发育的囊胚率为66.96%，常规方法中囊胚率为53.5%。 

实施例2  rbIFN-τ对牛卵母细胞体外受精胚胎发育的影响 

1、牛卵母细胞的体外受精 

(1)成熟卵母细胞体外受精前的准备 

牛卵母细胞的采取与体外成熟培养参见实施例1中第1项。将体外成熟培养24小时的卵母细胞移入预先平衡BO受精液(38.5℃、5% CO₂的培养箱)中洗涤3次，然后移入预平衡的60mm培养皿中的50μL受精液微滴中置入38.5℃、5% CO₂的培养箱中等待体外受精，每个受精微滴15-20枚成熟卵母细胞。 

(2)精子的准备 

将冻精在37℃水浴中解冻后，取0.25μL精液小心置于含有7mLBO获能液灭菌的10mL离心管中，然后离心(1800转/分钟,5分钟)洗涤两次，然后在显微镜下用BO获能液调整精子浓度为2×10⁶个/mL。 

(3)体外受精 

取50μL浓度为2×10⁶个/mL的精子悬液加入到50μL受精液微滴中，将成熟卵母细胞与精子在38.5℃，5% CO₂和饱和湿度的二氧化碳培养箱中共孵育6小时。 

(4)胚胎的体外培养 

将成熟的卵母细胞与精子共培养6小时后从受精微滴中挑出， 用脱卵针将颗粒细胞吹打掉，然后用CR1aa(含3mg/mL BSA)将受精卵洗涤3遍，转到预平衡4小时的后期发育液(含3mg/mL BSA)微滴中，每滴15-20枚受精卵，置于38.5℃，5% CO₂和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，受精后48小时检查卵裂率，将卵裂的受精卵从后期发育液微滴中挑出用CR1aa(含10% FBS)洗涤3遍，然后将洗涤完的卵裂的受精卵转到CR1aa(10% FBS)微滴中，继续培养6天，统计囊胚率，每隔48小时换半液。 

2、rbIFN-τ对牛体外受精胚胎发育的影响 

从屠宰场取屠宰牛的卵巢吸取2-8mm直径卵泡的COCs，经成熟液(IVM)24小时后进行体外受精6小时，形成的受精卵在后期发育液培养液中培养，每隔48小时换液1/2(培养条件：38.5℃，5% CO₂和饱和湿度)，第2天检测卵裂率，第8天观察囊胚率。在受精后的第4天开始添加rbIFN-τ并使培养液中rbIFN-τ浓度为100ng/mL。实验重复3次(详见表2)。 

表2  rbIFN-τ对牛体外受精胚胎发育的影响 

注:^a，b相同栏内上标不同表示差异显著(p<0.05)。 

卵裂率=卵裂数/总卵子数；囊胚率=囊胚数/卵裂数；囊胚孵化率=孵化的囊胚数/囊胚数。 

本实施例从屠宰场取回卵巢约经3个小时送到实验室，经过体外成熟培养24小时后，进行体外受精，然后进行体外培养，于第4天放入含有100ng/mL rbIFN-τ的胚胎发育液中继续培养6天，每48小时换半液，并设对照组，即按照常规培养方法培养，不添加含有100ng/mL rbIFN-τ的胚胎发育液，只使用常规的胚胎发育液。统计 结果发现，本发明方法对体外受精胚胎发育的囊胚率为57.0%，常规方法中囊胚率为50.2%。 

本发明还发现，于第4天放入含有200ng/mL rbIFN-τ的胚胎发育液，其他条件同本实施例2记载的，其培养的体外受精胚胎发育的囊胚率为55.0%，也高于常规方法中体外受精胚胎的囊胚率。 

附录 

本发明实施例所用的液体配方： 

1、抽卵液：H199+2%FBS+肝素(10μg/mL) 

H199配方： 

配制是先将袋装TCM199溶解，依次加入上述药品定容至1L，过滤即可。 

2、成熟液(IVM)： 

E2(β-雌二醇)：1μg/mL 

EGF(表皮生长因子)：10ng/mL 

L-cysteine(L-半胱胺酸)：0.1g/3mL 

FSH(促卵泡素)：10μg/mL 

LH(促黄体生成素)：10μg/mL 

FBS(胎牛血清)：10μg/mL 

TCM199：900μl/ml 

3．L-cysteine(L-半胱氨酸)配制： 

规格：L-cysteine C-252910g  批号75h02525，终浓度为0.01g/mL, 即0.1mg/mL 

每4mL成熟液中加12μL，即浓贮液浓度为0.1g/3mL.配时称0.1gL-cysteine溶于3mL生理盐水中。 

4．EGF浓贮液： 

表皮生长因子EGF E-9644 0.2mg将0.2mg EGF溶于10mL生理盐水中，浓度为20μg/mL，分装成1mL/管。取1mL的浓贮液稀释5倍，浓度为4μg/mL，用时10μL加入到4mL成熟液中，终浓度为10ng/mL。 

5．LH浓贮液: 

LH用M199溶解，配成1mg/mL的stock,每1.5mL加入15μL，终浓度为10μg/mL。 

6．FSH浓贮液: 

称50mg溶于5mL TCM199中，浓度为10mg/mL，取1mL稀释到10mL，浓度为1mg/mL，用时1.5mL加15μL，终浓度为10μg/mL。 

7．BO液(10×)配方： 

8．BO液(1×)配方： 

先加入BO(10×)再加入Na-Pyruvate，NaHCO₃单独溶解，搅拌滴加，倒入容量瓶，加入100μL酚红，定容100mL。 

9．受精液：(20mL) 

10．洗精液:(80mL) 

11．发育液：CR1aa: 

Penicilin-G(青霉素)、Streptomycin(链霉素)、KCl(氯化钾)、Na-Pyruvate、和MgCl₂.6H₂O可以配成100×浓贮液，用时100mL加1mL。定容后弃掉3mL液，再加入EAA(50×)2mL和NEAA(100×) 1mL，依次称Sodium citrate tribasic dehydrate(柠檬酸钠)、L-glutamine(谷氨酰胺)、Myo-inositol(肌醇)，充分溶解后再加入BSA。过滤即得。 

SOFaa培养液： 

NaCl 6.29g,KCl 0.534g,CaCl₂·2H₂O 0.347g,MgSO₄·7H₂O 0.182g,KH₂PO₄ 0.162g,NaHCO₃ 0.42g,丙酮酸钠0.0357g,乳酸钠0.6mL,调pH至7.5,定容1L,用0.22μm滤器过滤灭菌，并用15mL无菌离心管分装，每管10mL，4℃保存。 

使用时SOF+2% EAA+1% NEAA+500μg/mL肌醇+30μg/mL谷氨酰胺+0.05mg/mL链霉素+0.065mg/mL青霉素+8mg/mLBSA，用0.22μm滤器过滤灭菌，并用1.5mL无菌离心管分装，每管1.0mL，4℃保存。 

Claims (10)

1.一种提高动物体外胚胎囊胚发育率的方法，其特征在于，在动物胚胎发育培养液中添加I型干扰素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在动物胚胎发育培养液中添加rbIFN-τ。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在孤雌胚胎激活后的第4天或体外受精卵受精后的第4天的胚胎发育培养液中添加rbIFN-τ。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在动物胚胎发育培养液中添加终浓度为100～200ng/mL的rbIFN-τ。

5.如权利要求2～4任一所述的方法，其特征在于，每隔48h更换体积百分比为原培养液50％的含rbIFN-τ的培养液。

6.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，培养条件为38.5℃，5％CO₂和100％湿度。

7.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述的动物为牛或羊。

8.权利要求1～7任一所述的方法在体外胚胎培养中的应用。

9.一种动物胚胎发育培养液，其特征在于，含有rbIFN-τ。

10.rbIFN-τ在动物体外胚胎培养中的应用。