CN111073848B

CN111073848B - 一种卵裂期胚胎培养组合物及卵裂期胚胎培养液

Info

Publication number: CN111073848B
Application number: CN202010003060.4A
Authority: CN
Inventors: 曾玉洁; 胡威; 姜永存; 赵衡斌; 陈烨; 周星宇; 吴秀芝; 吴文林
Original assignee: Foshan Fukang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Fukang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-01-02
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2040-01-02
Also published as: CN111073848A

Abstract

本发明提供了一种卵裂期胚胎培养组合物及卵裂期胚胎培养液，所述卵裂期胚胎培养组合物包含以下组分：褪黑素0.01‑100nmol/L；辅酶Q10 0.5‑2.0mg/L；IGF‑2 0.1‑300nmol/L。所述卵裂期胚胎培养液包含基础培养液、上述卵裂期胚胎培养组合物和人血清白蛋白。含有所述卵裂期胚胎培养组合物的卵裂期胚胎培养液具有很好的保护细胞、清除自由基、促进有丝分裂及细胞发育的效果。

Description

一种卵裂期胚胎培养组合物及卵裂期胚胎培养液

技术领域

本发明涉及辅助生殖技术领域，具体涉及一种卵裂期胚胎培养组合物及卵裂期胚胎培养液。

背景技术

辅助生殖技术是人类辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）的简称，指采用医疗辅助手段使不育夫妇妊娠的技术，包括人工授精（ArtificialInsemination，AI）和体外受精-胚胎移植（In Vitro Fertilization and EmbryoTransfer，IVF-ET）及其衍生技术两大类。其中体外受精-胚胎移植（IVF-ET）,是指将患者双方的卵子与精子取出后，在体外进行受精，然后再将受精卵或者胚胎移植回母体子宫内发育成胎儿。体外培养人胚胎的目的是为了使胚胎保持持续性的活力，并使其在一定时间内达到最佳的发育阶段，一个优化的培养系统可以支持有活力的胚胎在体外正常的分裂，并发育为优质的卵裂期胚胎及囊胚。

IVF体外培养通常分为两种培养液系列：单一培养液和序贯培养液。单一培养液的研发基于“让胚胎自行选择”的理念，让胚胎在生长发育过程中自行从这一培养液里面取舍所需的营养物质。序贯培养液的研发基于“接近自然”的理念，研究不同发育阶段对营养物质的不同需求及其在生殖道内的自然生理环境而完成。因从受精卵到囊胚的培养是一个动态变化的过程，其中不仅仅是受精卵的分裂发育是动态的，更因为胚胎由输卵管到子宫的位移同样是一个动态变化的过程，因此IVF的体外培养更应遵循“接近自然”的理念，不同的胚胎发育时期采用不同成分的胚胎培养液。

在IVF中使用的培养基在过去30年中经历了一些进化。然而，大多数还是旨在改善胚胎培养基的核心构成或大部分培养基的碳水化合物能源，氨基酸和盐/缓冲剂等。目前，人们越来越关注将不同的具有生物活性的物质和生长因子纳入培养基中。

在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）中，卵母细胞的质量是获得良好子代胚胎的关键因素，而线粒体是决定卵母细胞质量的核心因素之一。线粒体的数量、分布及 mtDNA拷贝数对于卵母细胞的发育成熟、受精后的胚胎发育潜能都起到决定性得作用。线粒体是人体细胞中制造能量的细胞器，它在利用氧分子的同时也会不断地受到氧毒性的伤害，线粒体产生能量供卵母细胞分裂时染色体均等分离，同时会释放大量的自由基，当线粒体损伤超过一定限度，细胞就会衰老死亡。目前越来越多的研究表明，褪黑素和辅酶Q10同样具有抗氧化、抗衰老、清除自由基等作用，在卵母细胞发生和胚胎发育的过程中发挥重要作用。

褪黑素发挥抗氧化作用的具体机制包含两条途径：（1）不依赖受体途径：褪黑素有高的亲脂性，能够自由进出细胞膜性结构，与活性氧物质(ROS)分子直接结合并进行清除，而且褪黑素与活性氧物质（ROS）反应的代谢产物还具有活性氧清除功能。（2）依赖受体途径：褪黑素与细胞膜上的褪黑素受体结合，向细胞内传递抗氧化信号，通过级联放大效应激活细胞内的抗氧化酶类 (SOD、GPx、CAT、PRDX等)的表达从而发挥抗氧化的保护功能。通过两种途径，最终有效减少活性氧物质（ROS）的含量，从而促进动物胚胎的发育。

辅酶Q是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，不同来源的辅酶Q其侧链异戊烯单位的数目不同，人类和哺乳动物是10个异戊烯单位，故称辅酶Q10，是一种重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂。辅酶 Q10 作为电子载体，是线粒体呼吸链中重要的参与者，对ATP合成至关重要。在人体细胞器中，线粒体中辅酶 Q10 的含量是最多的，大约为 40% ~50%，说明辅酶Q10对线粒体功能具有重要影响。作为质子载体分子，辅酶Q10可以激活解偶联蛋白，消除线粒体内膜两侧的跨膜质子浓度差，调节膜电位，减慢氧化磷酸化过程，抑制活性氧产生。

胰岛素样生长因子-2（Insulin-like growth factor-2，IGF-2）是一种促进有丝分裂的细胞因子，与IGF受体结合，能够调节多种组织的生长，如神经组织、淋巴组织、生殖组织、平滑肌、内皮细胞和骨骼等。越来越多的研究表明IGF -2对胚胎的发育起着推动作用，在培养液中加入外源性IGF-2能显著促进胚胎的生长，减少胚胎细胞的凋亡，增加了发育到囊胚的比例和内细胞团的数目。

发明内容

基于此，本发明提供一种卵裂期胚胎培养组合物，所述卵裂期胚胎培养组合物具有保护细胞、清除自由基、促进有丝分裂及细胞发育的作用。

具体技术方案为：

一种卵裂期胚胎培养组合物，所述卵裂期胚胎培养组合物包含以下组分：

褪黑素 0.01-100nmol/L；

辅酶Q10 0.5-2.0mg/L；

IGF-2 0.1-300nmol/L。

在其中一些实施例中，所述卵裂期胚胎培养组合物包含以下组分：

褪黑素 0.1-10nmol/L；

辅酶Q10 0.75-1.5mg/L；

IGF-2 1-100nmol/L。

褪黑素 1nmol/L；

辅酶Q10 1mg/L；

IGF-2 50nmol/L。

本发明的另一目的在于提供上述卵裂期胚胎培养组合物的用途。

具体技术方案为：

上述卵裂期胚胎培养组合物在制备卵裂期胚胎培养液中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种卵裂期胚胎培养液，

具体技术方案为：

一种卵裂期胚胎培养液，所述卵裂期胚胎培养液包含基础培养液、上述卵裂期胚胎培养组合物和人血清白蛋白。

在其中一些实施例中，所述基础培养液包含无机盐缓冲液、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸，且所述无机盐缓冲液、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸的摩尔比为（94.25-160.4）:（0.1-6）:（1-22）:（0.01-1.1）:（0.07-4.2）:（0.01-2.2）:（0.01-0.6）:（0.001-0.05）。

在其中一些实施例中，所述基础培养液包含无机盐缓冲液、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸，且所述无机盐缓冲液、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸的摩尔比为（112.5-134.6）:（0.4-0.7）:（9-11）:（0.3-0.4）:（0.63-1.05）:（0.8-1.2）:（0.08-0.12）:（0.008-0.012）。

在其中一些实施例中，所述无机盐缓冲液包含氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙，且所述氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙的摩尔比为（80-110）:（3.5-8）:（0.05-1.2）:（0.2-3.2）:（10-35）:（0.5-3）。

在其中一些实施例中，所述无机盐缓冲液包含氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙，且所述氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙的摩尔比为（85-95）:（5-6）:（0.2-0.4）:（0.8-1.2）:（20-30）:（1.5-2）。

在其中一些实施例中，所述氨基酸包含丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸，且所述丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸的摩尔比为（0.01-0.16）:（0.01-0.16）:（0.01-0.16）:（0.01-0.16）:（0.01-0.16）:（0.01-0.16）:（0.01-0.16）。

在其中一些实施例中，所述氨基酸包含丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸，且所述丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸的摩尔比为（0.09-0.11）:（0.09-0.11）:（0.09-0.11）:（0.09-0.11）:（0.09-0.11）:（0.09-0.11）:（0.09-0.11）。

在其中一些实施例中，所述人血清白蛋白在所述卵裂期胚胎培养液中的浓度为1-10g/L。

在其中一些实施例中，所述人血清白蛋白在所述卵裂期胚胎培养液中的浓度为4.5-5.5g/L。

在其中一些实施例中，所述人血清白蛋白在所述卵裂期胚胎培养液中的浓度为5g/L。

在其中一些实施例中，所述卵裂期胚胎培养液还包含杀菌剂。

在其中一些实施例中，所述杀菌剂选自青霉素、链霉素、庆大霉素的其中一种或多种。

在其中一些实施例中，所述杀菌剂为庆大霉素。

在其中一些实施例中，所述庆大霉素在所述卵裂期胚胎培养液中的浓度为20-100mg/L。

在其中一些实施例中，所述庆大霉素在所述卵裂期胚胎培养液中的浓度为40-60mg/L。

在其中一些实施例中，所述庆大霉素在所述卵裂期胚胎培养液中的浓度为50mg/L。

本发明还提供了上述卵裂期胚胎培养液在体外培养卵裂期胚胎的方法。

具体技术方案为：

一种卵裂期胚胎培养液在体外培养卵裂期胚胎的方法，包括以下步骤：

（1）采用微滴法培养：将上述卵裂期胚胎培养液制作成液体微滴，在培养器皿中的液体微滴表面覆盖培养用油，并在CO₂培养箱内平衡4-18小时；

（2）将胚胎置于经步骤（1）平衡的培养液中，于37°C，6% CO₂，饱和湿度的培养箱中培养。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明卵裂期胚胎培养组合物包含褪黑素、辅酶Q10和IGF-2，三种组分相辅相成，可协同增效，使得所述卵裂期胚胎培养组合物具有很好的清除自由基、抗氧化和促进有丝分裂的作用。尤其是当组合物中褪黑素、辅酶Q10和IGF-2的含量分别为1nmol/L、1mg/L和50nmol/L时，可取得更好的效果。

2、本发明卵裂期胚胎培养液中含有所述的卵裂期胚胎培养组合物、基础培养液和人血清白蛋白（HSA）。发明人经过研究发现，所述卵裂期胚胎培养组合物在本发明基础培养液和HAS环境中能更好地发挥保护细胞、清除自由基、促进有丝分裂及细胞发育的效果。

附图说明

图1为实施例1所述卵裂期胚胎培养液培养得到的胚胎图片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例一种卵裂期胚胎培养液，包含基础培养液、卵裂期胚胎培养组合物、人血清白蛋白和杀菌剂，具体如表1所示：

表1 实施例1卵裂期胚胎培养液配方

实施例2

本实施例一种卵裂期胚胎培养液，包含基础培养液、卵裂期胚胎培养组合物、人血清白蛋白和杀菌剂，具体如表2所示：

表2 实施例2卵裂期胚胎培养液配方

实施例3

本实施例一种卵裂期胚胎培养液，包含基础培养液、卵裂期胚胎培养组合物、人血清白蛋白和杀菌剂，具体如表3所示：

表3 实施例3卵裂期胚胎培养液配方

实施例4

本实施例一种卵裂期胚胎培养液，包含基础培养液、卵裂期胚胎培养组合物、人血清白蛋白和杀菌剂，具体如表4所示：

表4 实施例4卵裂期胚胎培养液配方

对比例1

本对比例一种卵裂期胚胎培养液除了不含辅酶Q10外，其他均与实施例1相同，具体如表5所示：

表5对比例1卵裂期胚胎培养液配方

对比例2

本对比例一种卵裂期胚胎培养液除了不含褪黑素外，其他均与实施例1相同，具体如表6所示：

表6对比例2卵裂期胚胎培养液配方

对比例3

本对比例一种卵裂期胚胎培养液除了不含IGF-2外，其他均与实施例1相同，具体如表7所示：

表7对比例3卵裂期胚胎培养液配方

对比例4

本对比例一种卵裂期胚胎培养液除了用市售成品丹麦Vitrilife公司的卵裂期培养液G-1.5替换本发明配方基础培养液外，其他均与实施例1相同（因G-1.5已含有杀菌剂，故不再额外添加杀菌剂），具体如表8所示：

表8对比例4卵裂期胚胎培养液配方

上述实施例和对比例中卵裂期胚胎培养液的制备方法，包括以下步骤：

1）在百级无尘超净台条件下配制，按比例依次准确称量物料添加到超纯水中，混合后得溶液I；

2）将步骤1）配置好的溶液I用0.2um的滤膜过滤除菌后，无菌分装，得到卵裂期胚胎培养液。

人血清白蛋白（HSA）可提前加入溶液I中，或不加HSA，待使用时再按相应的比例加入HSA混合。

对上述实施例和对比例中卵裂期胚胎培养液对体外胚胎的培养效果进行检测：

1、检测方法

将正常的卵子与优选的精子加入到受精培养液中进行受精。受精完成后，将明确观察到双原核的正常受精的受精卵分别放入上述实施例和对比例的卵裂期胚胎培养液中。将各组胚胎放置到温度为37°C、=6%CO₂的培养箱中继续培养，分别观察受精后第二天及第三天的胚胎发育情况。

胚胎的评分标准采用Garnder评分系统，具体如下：（1）第二天受精卵优胚：细胞数量为3-5个卵裂球细胞，卵裂球形态大小正常均一或有轻微不均，无无核碎片或碎片比例小于细胞团块体积1/3；（2）第三天的受精卵优胚：细胞数量为7-10个卵裂球细胞，卵裂球形态大小正常均一或有轻微不均，无无核碎片或碎片比例小于细胞团块体积1/3。

2、检测结果

具体检测结果如表9所示：

表9上述实施例和对比例的卵裂期胚胎培养液对胚胎的培养检测结果

从表9可以看出，本发明含褪黑素、辅酶Q10 和IGF-2组合物的实施例1-4卵裂期胚胎培养液培养的卵裂期胚胎在卵裂率方面与对比例无差别，但是在第二天、第三天优质卵裂率方面有明显的效果提升，其中，实施例1卵裂期胚胎培养液优质卵裂率最高（图1为实施例1所述卵裂期胚胎培养液培养得到的胚胎）。说明含本发明卵裂期胚胎培养组合物的卵裂期胚胎培养液具有很好的清除自由基、抗氧化、促进有丝分裂和细胞发育的作用。

与实施例1相比，对比例1卵裂期胚胎培养液中缺少辅酶Q10，对比例2卵裂期胚胎培养液中缺少褪黑素，对比例3卵裂期胚胎培养液中缺少IGF-2，对比例1-3卵裂期胚胎培养液对胚胎的培养效果明显差于实施例1。本发明卵裂期胚胎培养组合物包含褪黑素、辅酶Q10和IGF-2，三种组分相辅相成，可协同增效，使得所述卵裂期胚胎培养组合物具有很好的清除自由基、抗氧化和促进有丝分裂的作用，缺少其中任何一种组分均会影响卵裂期胚胎的培养效果。

与实施例1相比，对比例4中卵裂期胚胎培养液使用现有常规卵裂期培养液替换本发明配方的基础培养液，其对卵裂期胚胎的培养效果相应下降。说明本发明卵裂期胚胎培养组合物在本发明基础培养液环境中能更好地发挥保护细胞、清除自由基、促进有丝分裂及细胞发育的效果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种卵裂期胚胎培养液，其特征在于，所述卵裂期胚胎培养液包含基础培养液、卵裂期胚胎培养组合物、人血清白蛋白和杀菌剂；

所述卵裂期胚胎培养组合物包含以下组分：

褪黑素 0.5-5nmol/L；

辅酶Q10 0.5-1.3mg/L；

IGF-2 40-65nmol/L；

所述基础培养液包含无机盐缓冲液、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸；

所述无机盐缓冲液包含氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙，且所述氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸氢钠和氯化钙的摩尔比为(90-90.08)：(5.45-5.5)：0.25：1：25：(1.8-1.9)；

所述葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸和四元羧酸乙二胺四乙酸的摩尔比为(0.45-0.5)：10.5：(0.32-0.35)：0.1：1：0.1：0.01；

所述氨基酸包含丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸，且所述丙氨酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸的摩尔比为0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1；

所述人血清白蛋白在所述卵裂期胚胎培养液中的浓度为4-5g/L；

所述杀菌剂为45-50mg/L的庆大霉素。

2.根据权利要求1所述的卵裂期胚胎培养液，其特征在于，所述卵裂期胚胎培养组合物包含以下组分：

褪黑素 1nmol/L；

辅酶Q10 1mg/L；

IGF-2 50nmol/L。

3.根据权利要求1所述的卵裂期胚胎培养液，其特征在于，所述人血清白蛋白在所述卵裂期胚胎培养液中的浓度为5 g/L。

4.根据权利要求1所述的卵裂期胚胎培养液，其特征在于，所述庆大霉素在所述卵裂期胚胎培养液中的浓度为50mg/L。