CN113005076A

CN113005076A - 未成熟卵母细胞体外培养液及其应用

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Publication number: CN113005076A
Application number: CN202110494244.XA
Authority: CN
Inventors: 马龙; 崔毓桂; 刘嘉茵; 蔡令波; 严正杰
Original assignee: Jiangsu Province Hospital
Current assignee: Jiangsu Province Hospital
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2021-06-22

Abstract

本发明提供未成熟卵母细胞体外培养液及其应用，属于胚胎培养领域。本发明未成熟卵母细胞体外培养液，是在商品化IVM液中添加辅酶Q10后所得。本发明还提供辅酶Q10在IVM培养中的应用以及含有辅酶Q10用于促进高龄患者未成熟卵成熟、改善卵母细胞质量的药物。采用本发明提供的体外培养液或方法，得到的卵母细胞成熟率较高，质量较好，发育潜能高。

Description

未成熟卵母细胞体外培养液及其应用

技术领域

本发明属于胚胎培养领域，具体来说是涉及未成熟卵母细胞体外培养液及其应用。

背景技术

近些年来，胚胎移植技术已在动物引种和改良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转基因和克隆动物实现的应用技术。在体外受精、转基因、克隆以及试管婴儿等胚胎生物技术中，经常会涉及到未成熟卵母细胞体外成熟培养 (IVM)。现有未成熟卵IVM培养，大多在基础培养液中添加激素类、血清类及生长因子类(EGF)等。但是，体外培养的卵母细胞与体内成熟的卵母细胞，在成熟率和卵母细胞质量上都存在较大差异，与促排卵周期体内成熟卵母细胞相比， IVM周期的妊娠率明显降低，这主要归因于IVM周期卵母细胞成熟率较低，形成的卵母细胞质量较差，发育潜能低，在高龄患者更是如此。

因此如何提高未成熟卵体外培养成熟率一直是胚胎培养领域的关注焦点。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供辅酶Q10在IVM培养中的应用，采用该方法得到的卵母细胞成熟率较高，质量较好，发育潜能高。

本发明还提供未成熟卵母细胞体外培养液，采用该培养液培养时，卵母细胞成熟率较高，质量较好，发育潜能高。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

本发明提供辅酶Q10在IVM培养中的应用。

本发明还提供用于促进高龄患者未成熟卵成熟、改善卵母细胞质量的药物，含有辅酶Q10。

本发明还提供未成熟卵母细胞体外培养液，是在商品化IVM液中添加辅酶 Q10后所得。

优选的技术方案中，所述体外培养液中辅酶Q10的浓度为40-60μM。

优选的技术方案中，所述未成熟卵母细胞体外培养液还含有0.06-0.08IU/ml 的FSH、0.06--0.08IU/ml的LH。

优选的技术方案中，辅酶Q10采用无水乙醇配制成5-15mM的溶液，然后添加至商品化IVM液中。

本发明还提供一种IVM培养未成熟卵的方法，包括采用所述未成熟卵母细胞体外培养液在37℃、6％CO₂、5％O₂和饱和湿度条件下，培养未成熟卵24-48 小时的步骤。

优选的技术方案中，所述未成熟卵母细胞来源于人类。

在本发明中，所述未成熟卵母细胞来源于大于或等于38岁的女性。

在本发明中使用的辅酶Q10可以通过多种方式获得，例如可以通过烟叶中分离提纯获得或者通过辅酶Q10转基因的微生物发酵提取。

本发明的有益效果在于：本发明提供辅酶Q10在IVM培养中的应用，采用该方法得到的卵母细胞成熟率较高，质量较好，发育潜能高。采用本发明提供的未成熟卵母细胞体外培养液，培养高龄患者未成熟卵24-48小时后，所得卵母细胞成熟率较高，降低非整倍体率，从而改善卵母细胞质量并延缓卵母细胞老化，因此卵母细胞的发育潜能高，从而提高妊娠率。

附图说明

图1为未成熟卵母细胞体外培养、卵母细胞线粒体功能检测、极体染色体分析的流程图。

图2为高龄患者GV期卵母细胞体外培养后成熟率图，纵坐标为成熟率，1 为对照组小皿，2为实验组小皿。其中“*”，表示与对照组小皿中成熟率相比， p<0.05。

图3(A)为各组成熟卵母细胞经

Red FM试剂染色后，卵母细胞线粒体分布图；图3(B)对照组小皿和实验组小皿中培养成熟的卵母细胞经

Red FM试剂染色后，线粒体荧光强度平均值图，纵坐标为线粒体荧光强度平均值；“*”，表示与对照组小皿中成熟卵母细胞线粒体荧光强度平均值相比，p<0.05。其中1是对照组小皿，2是实验组小皿。

图4为各组小皿中所得成熟卵母细胞第一极体非整倍体率图。“*”，表示与对照组小皿中成熟卵母细胞第一极体非整倍体率相比，p<0.05。

图5为各组小皿所得成熟卵母细胞产生的第一极体二代测序(NGS)结果示例图；其中，A：正常染色体核型B：异常染色体核型(-4)C：异常染色体核型(+15)。注：横坐标表示染色体位置，单位：Mb；纵坐标表示拷贝数；+/- 表示染色体重复/缺失；“chr+数字”表示染色体。

具体实施方式

实施例1未成熟卵母细胞体外培养液的组成及其应用

1.采用的主要仪器和设备

移液器：Eppendorf；

CO2培养箱：ASTEC APM-30D；

体视显微镜：尼康SMZ1500；

倒置相差显微镜：Nikon TE2000-S；

倒置荧光显微镜：Nikon TE2000-U；

取卵针：COOK；

负压吸引器：COOK K-MAR-5200；

彩色多普勒超声：mindray；

超净工作台：ORIGIO Fortuna IVF Clean Air；

水浴锅：Grant SUB Aqua 5Plus；

培养皿；

2.主要试剂

辅酶Q10：购自Sigma公司的分析标准品，产品编号：07386。

实验组未成熟卵母细胞体外培养液(缩写为实验体外培养液)的组成：在商品化IVM液(IVM Media Kit,SAGE,CT 06611)中添加终浓度为0.075IU/ml 的FSH(卵泡刺激素)、0.075IU/ml的LH(黄体生成素)和50μM的辅酶Q10 (Sigma，产品编号：07386)。具体配制方法如下：购于Sigma公司的辅酶Q10 (07386，MW 863.34)10mg溶解在1.16ml无水乙醇(MW46.07)中，其浓度为10mM，充分混匀并分装后避光储存于-20℃备用；配制实验体外培养液前，先将冻存的辅酶Q10乙醇溶液取出，在49℃水浴中融化，然后取2μl辅酶Q10 乙醇溶液加入398μl商品化IVM培养液中，另外再添加终浓度为0.075IU/ml 的FSH(卵泡刺激素)、0.075IU/ml的LH(黄体生成素)，充分混匀，即得实验体外培养液。

对照组未成熟卵母细胞体外培养液(缩写为对照体外培养液)的组成：在商品化IVM液(IVM Media Kit,SAGE,CT 06611)中添加终浓度为0.075IU/ml 的FSH和0.075IU/ml的LH后所得。

3.未成熟卵母细胞体外培养液的应用

将45名高龄患者(≥38岁，女性)12mm以下卵泡中GV期的卵丘-卵母细胞复合物(GV-COCs)，在超声引导下用取卵针(COOK)取出后。共获得92 枚GV-COCs，每个患者获卵数≥2枚。采用如下方法培养GV-COCs，并进行检测 (图1)。

(1)设置对照组小皿和实验组小皿。在对照组小皿中滴加8滴对照体外培养液，上盖2.5ml矿物油防蒸发。在实验组小皿中滴加8滴实验体外培养液，上盖2.5ml矿物油防蒸发。然后将各小皿置于37℃、6％CO₂、5％O₂的CO₂培养箱中平衡4h。其中，每滴培养液的体积为20ul。

(2)将获得的92枚GV-COCs转移至80U/ml的透明质酸酶(SAGE)溶液中，剥除部分卵丘细胞(CCs)，高倍镜下再次确认这些卵母细胞均为GV期。将上述92枚GV-COCs随机分为组1和组2，每组46枚。

(3)高倍镜下，用巴斯德吸管吸取组1中的GV-COCs，置于对照组小皿中，每个小皿放置1枚；吸取组2中GV-COCs，置于实验组小皿中，每个小皿放置 1枚。然后，将各小皿置于37℃、6％CO₂、5％O₂、100％湿度的CO2培养箱中，培养48小时。当培养时间为24小时，实验组小皿更换新配制的实验体外培养液，对照组小皿更换新配制的对照体外培养液。

(4)在培养期间，观察对照组小皿和实验组小皿中卵母细胞的成熟度，选择成熟的带有部分颗粒细胞的COCs(卵丘-卵母细胞复合物)转移至80U/ml透明质酸酶溶液中，完全剥除卵丘细胞，即可见成熟的MII期卵母细胞(排出完整第一极体)，计算对照组小皿和实验组小皿中的卵母细胞成熟率。成熟率是各组成熟的MII期卵母细胞总数与各组初始培养的GV期卵总数的比值。

(5)在培养期间，将对照组小皿和实验组小皿中MII期卵母细胞排出的完整的第一极体进行活检，应用NGS(二代测序)技术分析各组第一极体的染色体情况。

(6)在培养期间，将对照组小皿和实验组小皿中的MII期卵母细胞(又称为成熟卵母细胞)应用

Red FM(Sigma)试剂进行染色，卵母细胞线粒体内含巯基蛋白被染成红色，可以观察到卵母细胞内线粒体分布状态，根据线粒体蛋白染色后荧光强度，分别分析采用对照体外培养液和实验体外培养液培养的卵母细胞线粒体质量。

结果：通过上述实验研究，发现：添加了辅酶Q10的实验体外培养液对于 38岁以上高龄女性未成熟卵母细胞质量的改善尤为明显。来源于45名高龄患者的92枚GV-COCs，采用添加了辅酶Q10的实验体外培养液培养，卵母细胞成熟率显著提高，且成熟的卵母细胞线粒体质量明显改善，卵母细胞非整倍体率显著下降。

表1显示了参与实验研究的高龄患者基础特征(共45名患者)。

表1为参与实验研究高龄患者基础特征

注：BMI为体重指数；AMH为抗苗勒氏管激素；FSH为促卵泡激素；LH为黄体生成素；E2为雌二醇。

从图2可以看到，通过对高龄患者(≥38岁)GV期卵母细胞IVM培养48 小时，对照组小皿中采用不含有辅酶Q10的对照体外培养液培养48h后，卵母细胞成熟率为63.0％(29/46)，实验组小皿中采用含有辅酶Q10的实验体外培养液培养48h后，卵母细胞的成熟率为82.6％(38/46)，因此，实验组小皿中卵母细胞的成熟率显著高于对照组小皿(p<0.05)。由此可见，高龄患者未成熟卵IVM培养液中添加辅酶Q10显著提高未成熟卵母细胞的成熟率。

如图3(A)所示，通过

Red FM试剂对IVM培养成熟的各组高龄患者卵母细胞线粒体染色，添加有辅酶Q10的实验体外培养液培养所得成熟的卵母细胞中线粒体荧光强度明显高于不含有辅酶Q10的对照体外培养液。

如图3(B)所示，通过

Red FM试剂对IVM培养成熟的各组高龄患者卵母细胞线粒体染色，采用不含有辅酶Q10的对照体外培养液培养的成熟卵母细胞线粒体荧光强度平均值153±75，采用添加有辅酶Q10的实验体外培养液培养的成熟卵母细胞线粒体荧光强度平均值231±113，后者卵母细胞线粒体荧光强度明显高于前者(p<0.05)。由此可见，高龄患者未成熟卵IVM培养液中添加辅酶Q10明显提高卵母细胞线粒体蛋白的浓度，即提高了卵母细胞的质量和发育潜能，从而提高妊娠率。

如图4所示，将各组小皿培养后产生的第一极体进行染色体分析，结果发现，采用不含有辅酶Q10的对照体外培养液培养所得成熟卵母细胞第一极体非整倍体率为65.5％(14/38)，采用含有辅酶Q10的实验体外培养液培养所得成熟卵母细胞第一极体非整倍体率为36.8％(19/29)，实验组小皿中成熟卵母细胞第一极体非整倍体率明显低于对照组小皿(p<0.05)。由此可见，高龄患者未成熟卵IVM培养液中添加了辅酶Q10后明显降低了卵母细胞第一极体的非整倍体率，提高了卵母细胞的质量和发育潜能，从而提高妊娠率。

由图5可见，A图表示卵母细胞第一极体正常的染色体核型，图B、图C表示第一极体染色体非整倍体。B图表示4号染色体缺失，C图表示15号染色体重复。

Claims

1.辅酶Q10在IVM培养中的应用。

2.用于促进高龄患者未成熟卵成熟、改善卵母细胞质量的药物，其特征在于含有辅酶Q10。

3.未成熟卵母细胞体外培养液，其特征在于是在商品化IVM液中添加辅酶Q10后所得。

4.根据权利要求3所述未成熟卵母细胞体外培养液，其特征在于所述体外培养液中辅酶Q10的浓度为40-60 μM。

5.根据权利要求4所述未成熟卵母细胞体外培养液，其特征在于所述未成熟卵母细胞体外培养液还含有 0.06-0.08 IU/ml的FSH、0.06--0.08 IU/ml的LH。

6.根据权利要求5所述未成熟卵母细胞体外培养液，其特征在于辅酶Q10采用无水乙醇配制成5-15 mM的溶液，然后添加至商品化IVM液中。

7.一种IVM培养未成熟卵的方法，其特征在于包括如下步骤：包括采用权利要求3所述未成熟卵母细胞体外培养液在37 ℃、6% CO₂、5% O₂和饱和湿度条件下，培养未成熟卵24-48小时的步骤。

8.根据权利要求7所述IVM培养未成熟卵的方法，其特征在于所述未成熟卵母细胞来源于人类。

9.根据权利要求7所述IVM培养未成熟卵的方法，其特征在于所述未成熟卵母细胞来源于大于或等于38岁的女性。