KR20190052542A - 난자의 체외배양을 위한 난포액 대체용 배지 및 이의 이용 - Google Patents

난자의 체외배양을 위한 난포액 대체용 배지 및 이의 이용 Download PDF

Info

Publication number
KR20190052542A
KR20190052542A KR1020170148307A KR20170148307A KR20190052542A KR 20190052542 A KR20190052542 A KR 20190052542A KR 1020170148307 A KR1020170148307 A KR 1020170148307A KR 20170148307 A KR20170148307 A KR 20170148307A KR 20190052542 A KR20190052542 A KR 20190052542A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
medium
oocyte
oocytes
vitro
culture
Prior art date
Application number
KR1020170148307A
Other languages
English (en)
Inventor
이병천
안규리
김건아
이상훈
김군학
진여경
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020170148307A priority Critical patent/KR20190052542A/ko
Publication of KR20190052542A publication Critical patent/KR20190052542A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C12N2501/392—Sexual steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 핵이식 기술에 따른 핵이식란 또는 체외수정란 등의 생산에 있어서 효율적인 체외배양체계에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 난자의 체외성숙에 이용되는 배지로 난포액 대체제로 KSR을 첨가하는 배지의 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.
본 발명에 의한 배지 조성물 및 배양방법에 의할 경우 배아발달 및 배반포 형성에 뛰어난 효능을 갖는 성숙된 난자를 얻을 수 있다.

Description

난자의 체외배양을 위한 난포액 대체용 배지 및 이의 이용{A follicular fluid replacement medium for in vitro Maturation of oocytes and The Use thereof}
본 발명은 미성숙 난자의 체외배양을 위한 배양 배지에 관한 것으로, 특히 난포액을 대체하기 위해 KSR(Knockout serum replacement)이 첨가된 배지 및 이의 이용에 관한 것이다.
생명공학 또는 유전자 조작기술의 발달에 따라 원하는 형질들로 조합한 다양한 재조합 생명체들의 여러가지 생산 성공사례가 발표되어 왔고, 최근에는 예컨대 양 등과 같은 복제 동물들의 생산에 성공한 사례들이 속속 보고되었다.
체세포 핵 이식을 통한 포유동물 복제기술은 영국 로슬린연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577).
복제 동물을 생산하는 기술은 상업적 유용성뿐 아니라, 생체의학과 생물학 연구에 있어서도 그 중요성은 압도적이다. 복제 동물 생산기술의 산업적 적용분야는 고품질의 축산식품 생산, 고부가가치의 약리활성물질 생산, 각종 병원균에 대한 생체저항력 향상동물 생산, 질환 모델 동물의 생산 및 유전자치료 분야에 이르기까지 매우 광범위하다.
복제 동물의 다양한 용도 중에서도, 인간과 생리학적으로 유사성을 가진 복제돼지를 이용하여 질병치료의 새로운 시스템 개발 관한 관심도는 증가하고 있다.
체외 성숙 시스템이 배란이 없는 다낭성난소 및 다낭성난소 증후군 환자들에게 이상적인 후보가 되었다는 것은 이미 알려져 있다 (Coticchio et al., 2012, Guzman et al., 2013 , Lim et al., 2013).
일반적으로 체외 성숙시에 난포액(follicular fluid: FF) (Jin et al., 2016), 소태아혈청(fetal bovine serum:FBS) (Suzuki et al., 2006),발정암소혈청(estrous cow serum)(Puri et al., 2015), 발정암퇘지혈청(estrous gilt serum)(Son et al., 2013), 비발정기암소혈청(anestrous cow serum)(Sutton et al., 2003), 소혈청알부민(bovine serum albumin:BSA) (Del Collado et al., 2015)과 같은 조성이 명확지 않은 첨가제가 사용되며, 인간을 위한 체외성숙시에는 자가환자혈청(Chian et al., 1999)과 인간혈청알부민(human serum albumin: HSA) (Coticchio et al., 2013)이 사용된다.
이러한 첨가제는 비타민, 성장인자, 영양소, 호르몬 및 항산화 화합물의 공급으로 인해 난자의 핵과 세포질 성숙에 유익한 효과가 있다(Barnes and Sato, 1980, Zhang et al., 2007).
그럼에도 불구하고, 이러한 화합물은 조성이 명확히 밝혀지지 않은 첨가제에 해당되고 오염의 위험이 존재한다. 최근 몇 년 동안의 추세는 배지에서 배지간(batch-to-batch)의 일정한 조성 또는 오염의 리스크가 없는 조성이 밝혀진 화합물을 사용하는 추세이다.
따라서, 본 발명자들은 난자의 체외배양용 배지로 조성이 알려진 화합물인 KSR을 난포액 대체제로 사용하여 효율적인 난자를 배양할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
1. Barnes D, Sato G. Methods for growth of cultured cells in serum-free medium. Anal Biochem 1980;102: 255-270. 2. Chian RC, Buckett WM, Too LL, Tan SL. Pregnancies resulting from in vitro matured oocytes retrieved from patients with polycystic ovary syndrome after priming with human chorionic gonadotropin. Fertil Steril 1999;72: 639-642. 3. Coticchio G, Dal-Canto M, Guglielmo MC, Mignini-Renzini M, Fadini R. Human oocyte maturation in vitro. Int J Dev Biol 2012;56: 909-918. 4. Coticchio G, Guglielmo MC, Dal Canto M, Fadini R, Mignini Renzini M, De Ponti E, Brambillasca F, Albertini DF. Mechanistic foundations of the metaphase II spindle of human oocytes matured in vivo and in vitro. Hum Reprod 2013;28: 3271-3282. 5. Del Collado M, Saraiva NZ, Lopes FL, Gaspar RC, Padilha LC, Costa RR, Rossi GF, Vantini R, Garcia JM. Influence of bovine serum albumin and fetal bovine serum supplementation during in vitro maturation on lipid and mitochondrial behaviour in oocytes and lipid accumulation in bovine embryos. Reprod Fertil Dev 2015. 6. Downs SM, Mosey JL, Klinger J. Fatty acid oxidation and meiotic resumption in mouse oocytes. Mol Reprod Dev 2009;76: 844-853. 7. Dumollard R, Duchen M, Carroll J. The role of mitochondrial function in the oocyte and embryo. Curr Top Dev Biol 2007;77: 21-49. 8. Dunning KR, Russell DL, Robker RL. Lipids and oocyte developmental competence: the role of fatty acids and beta-oxidation. Reproduction 2014;148: R15-27. 9. Guzman L, Ortega-Hrepich C, Polyzos NP, Anckaert E, Verheyen G, Coucke W, Devroey P, Tournaye H, Smitz J, De Vos M. A prediction model to select PCOS patients suitable for IVM treatment based on anti-Mullerian hormone and antral follicle count. Hum Reprod 2013;28: 1261-1266. 10. Jin JX, Kang JD, Li S, Jin L, Zhu HY, Guo Q, Gao QS, Yan CG, Yin XJ. PXD101 significantly improves nuclear reprogramming and the in vitro developmental competence of porcine SCNT embryos. Biochem Biophys Res Commun 2015;456: 156-161. 11. Jin JX, Lee S, Khoirinaya C, Oh A, Kim GA, Lee BC. Supplementation with spermine during in vitro maturation of porcine oocytes improves early embryonic development after parthenogenetic activation and somatic cell nuclear transfer. J Anim Sci 2016;94: 963-970. 12. Jin JX, Lee S, Taweechaipaisankul A, Kim GA, Lee BC. Melatonin regulates lipid metabolism in porcine oocytes. J Pineal Res 2017a;62: e12388. 13. Jin JX, Lee S, Taweechaipaisankul A, Kim GA, Lee BC. The HDAC Inhibitor LAQ824 Enhances Epigenetic Reprogramming and In Vitro Development of Porcine SCNT Embryos. Cell Physiol Biochem 2017b;41: 1255-1266. 14. Kang JT, Kwon DK, Park SJ, Kim SJ, Moon JH, Koo OJ, Jang G, Lee BC. Quercetin improves the in vitro development of porcine oocytes by decreasing reactive oxygen species levels. J Vet Sci 2013;14: 15-20. 15. Lee S, Jin JX, Taweechaipaisankul A, Kim GA, Ahn C, Lee BC. Melatonin influences the sonic hedgehog signaling pathway in porcine cumulus oocyte complexes. J Pineal Res 2017: e12424. Accepted Author Manuscript. doi:12410.11111/jpi.12424. 16. Lee S, Kim E, Hyun SH. Toxicity evaluation of ethanol treatment during in vitro maturation of porcine oocytes and subsequent embryonic development following parthenogenetic activation and in vitro fertilization. Int J Mol Med 2014;34: 1372-1380. 17. Lim KS, Chae SJ, Choo CW, Ku YH, Lee HJ, Hur CY, Lim JH, Lee WD. In vitro maturation: Clinical applications. Clin Exp Reprod Med 2013;40: 143-147. 18. Moon H-J, Shim J-H, Hwang I-S, Park M-R, Kim D-H, Ko Y-G, Park C-K, Im G-S. Effects of FBS (Feta1 Bovine Serum) and pFF (Porcine Follicular Fluid) on In Vitro Maturation and Development of Porcine Parthenogenetic and Nuclear Transfer Embryos. Reproductive & developmental biology 2009;33: 85-91. 19. Muller T, Fleischmann G, Eildermann K, Matz-Rensing K, Horn PA, Sasaki E, Behr R. A novel embryonic stem cell line derived from the common marmoset monkey (Callithrix jacchus) exhibiting germ cell-like characteristics. Hum Reprod 2009;24: 1359-1372. 20. Paczkowski M, Schoolcraft WB, Krisher RL. Fatty acid metabolism during maturation affects glucose uptake and is essential to oocyte competence. Reproduction 2014;148: 429-439. 21. Puri G, Chaudhary SS, Singh VK, Sharma AK. Effects of fetal bovine serum and estrus buffalo serum on maturation of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes in vitro. Vet World 2015;8: 143-146. 22. Sakurai M, Suzuki C, Yoshioka K. Effect of knockout serum replacement supplementation to culture medium on porcine blastocyst development and piglet production. Theriogenology 2015;83: 679-686 e671. 23. Son J, Malaweera DB, Lee E, Shin S, Cho J. Development of in vitro produced porcine embryos according to serum types as macromolecule. J Vet Sci 2013;14: 315-321. 24. Sritanaudomchai H, Ma H, Clepper L, Gokhale S, Bogan R, Hennebold J, Wolf D, Mitalipov S. Discovery of a novel imprinted gene by transcriptional analysis of parthenogenetic embryonic stem cells. Hum Reprod 2010;25: 1927-1941. 25. Sutton ML, Gilchrist RB, Thompson JG. Effects of in-vivo and in-vitro environments on the metabolism of the cumulus-oocyte complex and its influence on oocyte developmental capacity. Hum Reprod Update 2003;9: 35-48. 26. Suzuki M, Misumi K, Ozawa M, Noguchi J, Kaneko H, Ohnuma K, Fuchimoto D, Onishi A, Iwamoto M, Saito N et al. Successful piglet production by IVF of oocytes matured in vitro using NCSU-37 supplemented with fetal bovine serum. Theriogenology 2006;65: 374-386. 27. Vanderhyden BC, Caron PJ, Buccione R, Eppig JJ. Developmental pattern of the secretion of cumulus expansion-enabling factor by mouse oocytes and the role of oocytes in promoting granulosa cell differentiation. Dev Biol 1990;140: 307-317. 28. Wang WH, Abeydeera LR, Cantley TC, Day BN. Effects of oocyte maturation media on development of pig embryos produced by in vitro fertilization. J Reprod Fertil 1997;111: 101-108. 29. Zalmanova T, Hoskova K, Nevoral J, Adamkova K, Kott T, Sulc M, Kotikova Z, Prokesova S, Jilek F, Kralickova M et al. Bisphenol S negatively affects the meotic maturation of pig oocytes. Sci Rep 2017;7: 485. 30. Zhang ZG, Zhao JH, Wei ZL, Cong L, Zhou P, Cao YX. Human umbilical cord blood serum in culture medium on oocyte maturation In vitro. Arch Androl 2007;53: 303-307.
미성숙 난자의 체외 성숙 과정을 위해 난포액이나 소태아혈청 등과 같은 다양한 미정제된 첨가제가 이용되고 있다. 이러한 혈청형의 제재들은 조성이 명확하지 않아 감염성 질환과 오염의 위험성이 크다. 또한, 난포액의 경우 난포의 크기에 따라 각 성분의 함유량이 달라질 수 있는 등 배지간 이동 시(batch to batch)에 일정한 조성의 유지가 어렵고 이로 인해 배지의 질적인 컨트롤이 힘들다는 문제점이 존재하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 이러한 문제점을 해결하기 위해 난포액이 포함되지 않은 난자의 체외배양용 배지를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 또한 상기 배지를 이용한 배양 방법에 의해 체외수정 및 배아형성의 효율이 좋은 성숙된 난자를 제공하는 데에 있다. 본 발명의 또 다른 목적으는 상기 성숙된 난자를 이용하여 체외수정을 통한 수정란 및/또는 체세포핵이식법에 의한 핵이식란을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적으로는 상기 수정란 또는 핵이식란을 이용하여 동물모델로 사용될 수 있는 산자를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적으로는 상기 난자의 체외 배양 배지 및 이를 이용한 체외배양 방법을 통해 불임 및 난임환자 특히, 다낭성 난소 증후군 환자에게 적용하는 데에 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
체외성숙 된 난자를 얻기 위한 체외배양용 배지를 제공한다.
상기 체외배양용 배지는 난포액(follicular fluid)을 포함하지 않는 것을 일 특징으로 한다.
또한, 상기 체외배양용 배지는 KSR(Knockout serum replacement)을 포함하는 것을 일 특징으로 한다.
본 발명은 난포액은 포함하지 않으면서, 기본 배지 및 KSR(Knockout serum replacement)을 포함하는 난자의 체외배양용 배지를 제공한다.
상기 기본 배지는 TCM-199(tissue culture medium-199), DMEM(dulbecco modified eagle medium), M199(Medium 199), PZM-5 (Porcine zygote medium) 및 PZM-3으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 기본 배지는 TCM-199(tissue culture medium-199)일 수 있다.
본 발명의 상기 난자의 체외배양용 배지는, KSR(Knockout serum replacement)을 총 배지 조성물 부피의 5~10%의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 KSR 은 바람직하게는 총 배지 조성물 부피의 5% 또는 10%의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 난자의 체외배양용 배지는 성장인자(growth factor)를 포함할 수 있다.
상기 성장인자는, 유사인슐린 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth fac-tor, FGF) 및 형질전환 성장 인자(trans-forming growth factor, TGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 성장인자는 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF)일 수 있다.
본 발명의 상기 난자의 체외배양용 배지는 성선호르몬을 포함할 수 있다.
상기 성선호르몬은 난포자극호르몬(follicle stimulating hormone: FSH), 황체형성호르몬(luteinizing hormone:LH), 인간융모성생식선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin : hCG) , 말 융모막 성선자극 호르몬(equine chorionic gonadotropin: eCG) 및 임신마 혈청 성선자극호르몬(pregnant mare serum gonadotropin:PMSG)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 성선호르몬은 인간융모성생식선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin : hCG)일 수 있다.
본 발명의 상기 난자 체외 배양용 배지는 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션(insulin-transferrin-selenium solution : ITS-A) 및 시스테인(cysteine) 중 어느 하나 이상을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 난자의 체외배양용 배지는 소듐피루베이트, 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션, 시스테인, 표피성장인자, 인간융모성생식선자극호르몬, 말 융모막 성선자극 호르몬 및 KSR을 포함하는 TCM-199 기반 배지일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 난자의 체외배양용 배지의 조성은 0.91 mM 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 5 ㎕/mL 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션(insulin-transferrin-selenium solution : ITS-A), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 10 ng/mL 표피성장인자(epidermal growth factor : EGF, 10 IU/mL 인간융모성생식선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin : hCG) , 10 IU/mL 말 융모막 성선자극 호르몬(equine chorionic gonadotropin: eCG) 및 5~10% KSR (Knockout serum replacement)을 포함하는 TCM-199 (tissue culture medium-199)기반 배지일 수 있다.
또한, 본 발명은 난자의 체외성숙을 위한 난자 배양방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 상기의 난자 체외 배양용 배지를 이용하여 미성숙된 난자를 배양할 수 있다.
본 발명은 상기의 난자 체외 배양용 배지를 이용하여 난구세포-난자 복합체를 배양할 수 있다.
본 발명은 상기의 난자 체외배양용 배지를 이용하여 미성숙된 난자를 배양하는 난자 배양방법을 제공할 수 있다.
상기의 난자 체외배양용 배지를 이용하여 배양한 성숙 난자는 배아의 형성 및 배반포로의 발달 효율이 뛰어난 특징이 있다.
본 발명은 상기의 난자 체외배양용 배지를 이용하여 난구세포-난자 복합체(Cumulus-oocyte-complexes:COCs)를 배양하는 난자 배양 방법을 제공할 수 있다.
상기의 난자 체외배양용 배지를 이용하여 배양한 난구세포-난자 복합체(Cumulus-oocyte-complexes:COCs)는 난자의 성숙 및 난구세포가 확장될 수 있다. 특히, 난구세포의 확장효과가 뛰어나다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배지를 이용한 배양은 두 단계로 이루어질 수 있다.
상기 배양단계 중 1단계는 상기 성선호르몬을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
상기 배양 단계 중 2단계는 상기 성선호르몬을 배제한 배지에서 배양할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양단계 중 1단계는 38.5, 5% CO2, 95% 습도의 조건에서 20~24시간 배양될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양단계 중 2단계는 상기 1단계의 배양 이후에, 추가적으로 상기의 난자 체외배양용 배지에 의해 20~24시간 배양될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배양 배지 및 이를 이용한 배양방법에 의해 배양된 난구세포-난자 복합체를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 배양 배지 및 이를 이용한 배양방법에 의해 배양된 성숙된 난자를 제공할 수 있다.
본 발명에 의해 개시되는 바에 의하면, 상기 배양배지 및 이를 이용한 배양방법에 의해 배양된 확장된 난구세포를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 난자 체외 배양용 배지 및 배양방법에 의해 성숙된 난자를 이용하여 체외 수정란 또는 체세포핵이식기법을 이용한 핵 이식란을 제공할 수 있다.
또한, 상기 체외 수정란을 이용한 동물모델 또는 핵 이식란을 이용한 복제동물을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 난포액을 사용하지 않는 난자의 체외성숙을 위한 난자 체외 배양 배지 및 이를 이용하는 난자의 체외배양방법을 제공한다.
또한, 상기 배지 및 배양방법을 통해 성숙된 난자 및 난구세포-난자 복합체를 얻을 수 있다.
상기의 성숙된 난자를 이용한 체외수정란, 핵 이식란 또한 제공할 수 있고 이를 이용한 동물 모델 등을 이용하여 불임, 난임 환자 특히, 다낭성 난소증후군 환자에게 적용할 수 있을 것이다.
본 발명은 미성숙난자의 체외 배양 배지를 통해 성숙된 난자를 이용하여 지질대사 관련 유전자의 발현 및 대사물의 양적, 질적 모두 향상된 난자를 제공함으로써, 성공적인 핵이식 효율 및 체외 수정란을 안정적으로 생산할 수 있게 한다.
따라서, 본 발명을 이용하여 동물의 우량 품종의 번식, 보존, 이종장기 이식, 질환 모델동물 생산 등에 기여할 수 있다. 또한, 다낭성난소증후군(polycystic ovarian syndrome)등의 질환을 갖고 있는 환자의 난자 채취 및 이의 배양 등에 적용 가능한 기술로 수의학, 인류학 및 의학연구 분야의 발달에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 난구세포-난자 복합체를 KSR이 포함된 배지 및 난포액이 포함된 배지에서 체외 배양한 이후, 난구세포의 확장을 나타낸 것이다.
도 2(A)는 배양 배지에 따른 난구세포 확장관련 유전자 및 세포자살 유전자의 발현 정도를 나타낸 것이며, 도 2(B)는 배양 배지에 따른 난자 발달관련 유전자 및 세포자살 유전자의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 3은 배지의 추가 물질에 따른 돼지 난자의 핵 성숙 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 돼지 난자에서의 GDF9, BMP15 및 GSH 발현의 형광분석 결과이다.
도 5는 돼지 난구세포에서의 지질 대사관련 인자들의 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 6은 돼지 난자에서의 지질 대사관련 인자들의 발현 정도를 나타낸 결과이다.
도 7은 돼지 난자에서의 BODIPY-LD, BODIPY-FA 및 BODIPY-ATP 발현의 형광분석 결과이다.
본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
본 발명에 사용된 용어 '배양'은 생물체나 생물체의 일부(기관 조직 세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일로써, 이 경우 외적 조건으로 온도 습도 빛 기체상의 조성(이산화탄소나 산소의 분압) 등이 중요하며, 그 밖에 배양되는 생물체에 가장 중요한 직접적인 영향을 주는 것은 배지(배양기)로, 그 생물체의 직접적인 환경인 동시에 생존이나 증식에 필요한 각종 영양소의 공급장이다.
본 발명에 사용된 용어 '체외배양'이란 세포 등이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것으로, 본 발명의 배지 조성물은 난자의 체외배양에 최적화된 배지 조성물이다.
본 발명에 사용된 용어 '체외성숙'(in vitro maturation: IVM)이란 세포 등이 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내의 환경과 유사한 조건으로 배양되어 미성숙된 세포를 성숙시키는 것으로, 본 발명에서 미성숙 난자를 체외에서 특수한 배양액에서 성숙시켜 제 2차 감수분열 중기(Metaphase II)의 난자로 배양하는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 '배지' 또는 '배지 조성물'은 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외에서 세포 등의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 난자의 체외성숙을 위한 배지로 기본배지 및 KSR을 포함하는 배지일 수 있으며, 이때 기본배지의 일 구체예로 TCM-199배지를 사용할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 '난자'란 동물 암컷의 생식 세포를 의미하는 것으로 난소라고 하는 생식샘에서 생산되며, 포유동물의 경우 모든 난자는 태어날 때부터 이미 가지고 있으며, 난자형성 과정을 통해 성숙된다. 본 발명의 난자는 난원세포, 제1난모세포, 제2난모세포, 제1 극체 또는 제2 극체를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 '난포'란 난세포 또는 난자를 둘러싸고 있는 세포성 막 또는 난자와 난자를 둘러싼 난포상피세포의 복합체를 의미한다. 성주기가 시작되면 난포는 발달단계에 따라 성장하며 배란 후 황체로 변화한다. 본 발명의 난포는 원시난포, 제1차 난포, 제2차 난포, 제3차 난포 또는 그라프난포(graafian follicle)를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 '난포액(follicular fluid; FF)' 또는 '여포액'은 난자를 둘러싸고 있는 포상난포 내에 있는 알부민 유사 액체를 의미한다. 일반적으로 난자의 체외성숙을 위한 배양 배지에 첨가되는 물질의 하나로 사용된다. 본 발명에서는 이를 대체할 물질로 KSR을 사용하며 난포액은 배양배지에 첨가하지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 '대체제' 또는 '대체'란 유사한 기능 또는 효능을 가진 물질로 대체하여 사용 할 수 있다는 의미로, 본 발명의 난포액 대체제는 난자의 체외배양시 사용되던 난포액을 대체할 수 있는 화합물을 의미한다. 본 발명의 일 구체예로 녹아웃혈청대체제는(Knockout serum replacement, KSR) 난자 체외배양시 사용되던 배지의 첨가물질인 난포액을 대신하여 사용하는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 용어 'KSR(knockout serum replacement)', 'KOSR' 또는 '녹아웃혈청대체제'는 혈청(serum)이 포함되지 않은 물질로 세포 배양시 배양 배지에 첨가되는 물질이다. 상기 KSR은 단백질원 등으로 사용될 수 있으며 기존의 FBS(소태아혈청)을 대체할 수 있는 물질로 알려져 있다. 본 발명에서는 난자의 체외성숙을 위한 배양 배지에 첨가되는 물질로 사용된다.
본 발명에 사용된 용어 '약'이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, '함유하다' 및 '포함하다'란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 난자의 체외성숙 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 난자의 체외성숙을 위한 배양 배지에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 난포액을 첨가제로 포함하던 배양 배지를 난포액 외의 화합물로 대체할 수 있는 난자의 체외배양용 배지에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배지는 기본 배지에 KSR(Knockout serum replacement)을 포함할 수 있다.
또한, 다른 관점에서, 본 발명은 상기 배양 배지를 이용한 난자의 체외배양 방법에 관한 것이다.
체외수정을 통한 불임환자의 치료 또는 복제 동물의 생산을 위해서는 성숙된 난자가 필요하나 체내에서 성숙된 난자를 선별하여 수득하는 과정에서는 많은 수의 난포들이 각각 다른 속도로 자라고 있어 채취했을 때의 성숙도가 각기 다르다는 문제가 있었다.
따라서, 미성숙한 상태의 난자를 채취하여 체외에서 성숙시키는 방법이 주로 사용되고 있다.
그러나 이 역시 성숙란으로의 발달률이 비교적 낮은 편이고, 특히 사람 및 돼지에서 의 체외 난자 성숙 및 배아로의 발달율이 매우 낮다는 문제점이 있다.
결국 성숙된 난자를 얻기 위해서는 배양 조건이 중요하므로 체외 수정란 및 핵 이식란으로부터 배아로의 발달이 효율적으로 될 수 있는 성숙된 난자를 얻을 수 있는 배양 배지 및 이를 이용한 배양 방법을 개발하게 되었다.
본 발명에 사용되는 배지는 난포액을 첨가제로 사용하지 않는다는 점을 일 특징으로 하고 있다.
난포액은 난자의 체외 성숙에 필요한 물질에 해당되지만 그 개개의 조성이 명확하지 않아 감염의 위험과, 난포의 크기에 따라 각 성분의 함유량이 달라질 수 있다는 문제점이 존재하였다.
따라서, 본 발명은 상기 난포액을 대체하여 녹아웃혈청대체제(Knockout serum replacement, KSR)를 사용하는 것을 일 특징으로 한다.
상기 KSR은 IVM(체외배양) 시스템에서 밝혀지지 않은 영향을 피하기 위해 조성이 알려진 것을 사용할 수 있다. 즉, 조성이 밝혀지지 않은 성장 인자 또는 분화 촉진 인자는 포함되지 않는 것을 특징으로 한다
본 발명자들은 미성숙난자의 체외배양을 위한 배양 배지로 KSR(Knockout serum replacement)가 첨가된 배지를 사용함으로써 효율적인 난자를 배양할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 구현예에 따른, 난자의 체외 성숙배양, 난자의 체외배양을 위한 배양배지 및 이를 이용한 배양방법에 관해 설명한다
난자의 체외성숙 배양
난자의 체외배양은 미성숙 난자를 제 2차 감수분열 중기(Metaphase II)까지 체외에서 성숙시키는 과정으로, 체내 성숙란의 경우 회수가 어렵고 회수 난자의 수 한정으로 난자의 체외성숙기술(In vitro maturation: IVM)을 사용한다.
일반적인 난자의 체외배양 방법은
체내에서 미성숙 난자를 채취하는 단계; 및
체외배양 배지에서 상기 난자를 성숙시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 체외배양을 통해 성숙난자를 얻는 방법은
(a) 체내에서 난원세포를 채취하는 단계; 및
(b) 체외배양 배지에서 상기 난원세포를 제 2차 감수분열 중기까지 성숙시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 (a)단계의 난원세포는 제1 난모세포; 제2 난모세포; 제 1 극체;및 제 2 극체 중 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 (a)단계의 난원세포는 원시난포; 1차난포; 2차난포;및 3차난포 중 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 (a)단계의 난원세포는 난자-난구세포 복합체 일 수 있다.
또한, 일반적인 동물의 난자의 체외배양을 통해 성숙된 난자를 얻는 방법은 다음과 같다.
(A) 동물의 난소를 회수하는 단계;
(B) 상기 회수된 난소에서 미성숙된 난자 또는 난구세포에 싸여진 난구세포-난자 복합체를 회수하는 단계;
(C) 상기 미성숙된 난자 또는 난구세포-난자 복합체를 배양하는 단계; 및
(D) 상기 배양된 난자에서 성숙된 난자를 확보 또는 난구세포-난자 복합체에서 난구세포를 제거하는 단계를 포함하여 성숙된 난자를 확보하는 것으로 알려져 있고, 각 단계에 관하여는 당업계에서 일반적으로 사용하는 방법으로 이루어진다.
본 발명의 일 구체예로 체외배양을 통해 성숙된 난자를 얻는 방법은
(1) 동물의 난소를 회수하는 단계;
(2) 상기 회수된 난소에서 난구세포-난자 복합체를 회수하는 단계;
(3) 상기 난구세포-난자 복합체를 상기 배지를 통해 배양하는 단계;
(4) 상기 배양된 난구세포-난자 복합체에서 난구세포를 제거하는 단계; 및
(5) 상기 성숙된 난자를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
특히, 본 발명에서는 상기의 방법 중 (3)난구세포-난자 복합체를 배양하는 단계에서 사용되는 배양 배지 및 배양 방법에 관한 것으로, 본 발명의 배지 또는 배양 방법에 의할 경우 양적, 질적으로 향상된 성숙된 난자를 제공할 수 있다.
배양되는 세포
본 발명은 일 태양으로 난자의 체외성숙을 위해 사용되는 배지 및 그 배양 방법을 제공한다.
난자의 체외 성숙은 일반적으로 난소에서 난구세포-난자 복합체(Cumulus-oocyte complexes; COCs)를 회수하여 난구세포-난자 복합체를 배양함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 상기 난자의 체외 성숙은 난자의 모든 성숙단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 난구세포-난자 복합체을 배양함으로써 난자를 제2차 감수분열 중기(Metaphase II)까지 체외에서 성숙시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 난구세포-난자 복합체를 배양함으로써 난자를 제1 극체까지 체외에서 성숙시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 분리된 난자를 제2차 감수분열 중기(Metaphase II)까지 체외에서 성숙시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 분리된 난자를 제 1극체까지 체외에서 성숙시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양 대상인 분리된 난자 또는 난구세포-난자 복합체의 난자는 난원세포; 제1 난모세포; 제2 난모세포; 제 1 극체; 및 제2 극체 중 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양 대상인 분리된 난자 또는 난구세포-난자 복합체의 난자는 원시난포; 1차난포; 2차난포; 및 3차난포 중 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 분리된 난자 주위 세포를 체외에서 배양시킬 수 있다.
일 구체예로, 상기 난자 주위 세포란, 난구세포, 투명대, 난포막 등일 수 있다.
또 다른 일 구체예로, 분리된 난구세포를 배양하여 체외에서 확장시킬 수 있다.
상기 난구세포(cumulus cell)는 난자의 투명대(zona pellucida)에 붙여있는 세포로 과립막세포에서 분화된 형태로, 상기 난구세포-난자 복합체의 배양에 의해 확장된 형태를 띄게 된다.
배지조성물
본 발명은 난자의 체외성숙을 위한 배양배지에 관한 것으로, 다음과 같은 조성을 가질 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 난포액을 포함하지 않는 것을 일 특징으로 한다.
일반적으로 난자의 체외성숙시에 사용되는 배지 조성물은 완전합성배지 또는 단순 배지 등에 소태아 혈청(FBS), 난포액(follicular fluid), 성선자극호르몬 (FSH, LH, E2), 성장 촉진인자(growth　factor)등을 첨가하여 사용한다.
다만, 난포액의 경우 미정제된 채로 사용되므로 비타민이나 성장촉진제, 영양분, 호르몬과 항산화제 등을 함유하고 있어 난자의 핵과 세포질 성숙에는 이로는 영향을 미치기는 하나 그 조성이 명확하지 않다는 점에 문제가 있다.
특히, 이렇게 조성이 명확하지 않은 첨가제를 사용할 경우 감염성 질환과 오염의 위험성이 크고, 난포의 크기에 따라 각 성분의 함유량이 달라질 수 있어 일정한 조성의 유지가 어렵다.
따라서, 본 발명은 난자의 체외 성숙시에 기존에 사용되었던 난포액을 사용하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 기본 배지를 포함하는 난자의 체외배양 배지일 수 있다.
본 발명은 상기 기본 배지에 필수적 성분으로 KSR을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배지에 필수적 성분으로 성선호르몬을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배지에 필수적 성분으로 성장호르몬을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 배지에 임의적 성분으로 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션(insulin-transferrin-selenium solution : ITS-A), 시스테인(cysteine) 중 선택되는 어느 하나를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예로, 상기 배지에 임의적 성분으로 항생제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배지에 임의적 성분으로 항응집제를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 기본배지, 필수성분 및 임의적 성분에 대하여 자세히 설명한다.
기본배지
본 발명에서 사용될 수 있는 기본 배지는, 난자의 체외 성숙을 위한 배양 배지로서, 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분만을 포함하는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)일 수 있다. 즉, 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함된 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 성장인자를 제외한 기본 배지이다.
에너지 공급원으로서 다당류(polysaccharides), 단당류(monosaccharides), 유기산(organic acid), 아미노산(amino acid), 알콜(alcohol), 다환식 함유물(polycyclic compounds), 세루로오스(cellurose), 헤미셀루로오스(hemicellurose), 리그닌(lignin) 등의 여러가지 탄소원을 이용할 수 있다. 상기 다당류로는 덱스트린, 스타치 등을, 이당류로는 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 만니톨 등을, 단당류로는 글루코스, 만노스, 프록토오스, 갈락토오스 등을 예로 들 수 있다.
본 발명의 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다.
상업적으로 제조된 배지는, TCM-199(tissue culture medium-199), DMEM(dulbecco modified eagle medium), M199(Medium 199) Ham's F-1 (Nutrient Mixture F-10(HAM), NCSU (North Carolina State University) 23, NCSU37, Porcine zygote medium (PZM)-5 또는 PZM-3 등 일 수 있으며, 바람직하게는 TCM-199 배지 일 수 있다.
필수성분
본 발명의 난자 체외성숙을 위한 체외 배양 배지는 난포액을 포함하지 않는 대신 KSR(knockout serum replacement)를 포함하는 것을 일 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 난자 체외성숙을 위한 체외배양배지는 KSR을 필수성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 KSR(knockout serum replacement)은 아미노산, 비타민/항산화제, 미량원소, 단백질 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 아미노산은 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-히드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 비타민/항산화제는 티아민, 환원형 글루타치온 (reduced-glutathione) 및 아스코르브산 2-PO4 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 미량원소는 Ag+, Al3 +, Ba2 +, Cd2 +, Co2 +, Cr3 +, Ge4 +, Se4 +, Br-, I-, F-, Mn2+, Si4 +, V5+, Mo6 +, Ni2 +, Rb+, Sn2 + 및 Zr4 + 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 단백질은 트랜스페린(iron-saturated), 인슐린 및 지방과립 알부민 (AlbuMAX) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 KSR은 상업적으로 판매하는 제품 중 Gibco 사의 KSR을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 KSR은 본 발명에 따른 배지에 총 배지 조성물의1~20 %의 양으로 함유될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 KSR은 본 발명에 따른 배지에 총 배지 조성물의5~10%의 양으로 함유될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 KSR은 본 발명에 따른 배지에 총 배지 조성물의 5% 또는 10%의 양으로 함유될 수 있다.
본 발명의 난자 체외성숙을 위한 체외 배양 배지는 필수성분으로 호르몬제를 포함할 수 있으며, 일 구체예로 상기 호르몬제는 성선자극 호르몬일 수 있다.
상기 성선자극 호르몬이란 뇌하수체전엽에서 생성되어, 분비되는 것으로 생식선(난소 또는 정소)을 자극하는 기능을 가진 호르몬을 의미한다.
상기 성선자극 호르몬은 난포자극호르몬(follicle stimulating hormone: FSH), 황체형성호르몬(luteinizing hormone:LH), 인간융모성생식선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin : hCG), 말 융모막 성선자극 호르몬(equine chorionic gonadotropin: eCG) 및 임신마 혈청 성선자극호르몬(pregnant mare serum gonadotropin:PMSG)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 성선자극 호르몬은 인간융모성생식선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin : hCG)일 수 있다.
본 발명의 난자 체외 성숙을 위한 체외 배양 배지는 필수성분으로 성장 촉진인자(growth　factor)를 포함할 수 있다.
상기 성장촉진 인자란 각종 세포분열이나 생장 및 분화를 촉진하는 폴리펩티드의 총칭으로 세포의 신호전달계에 관여한다.
상기 성장촉진 인자는 유사인슐린 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth fac-tor, FGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 형질전환 성장 인자(trans-forming growth factor, TGF), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF)및 뼈유래 성장 인자(bone-derived growth factor, BDF)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 성장촉진 인자는 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF)일 수 있다.
임의성분
본 발명의 난자 체외성숙을 위한 체외 배양 배지는 임의성분으로 다음의 물질을 포함할 수 있다.
상기 임의성분은 임의성분으로는 소듐피루베이트, 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션, 시스테인, 항생제, 중성완충제 또는 항응집제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 임의성분으로 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션(insulin-transferrin-selenium solution : ITS-A)및 시스테인(cysteine)중 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 임의 성분으로 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 또는 하이그로마이신(hygromycin) 등의 항생제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 임의 성분으로 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 일반적인 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)중에서 어느 하나 이상을 함유할 수도 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 임의성분으로 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항 응집제 (anti-clumping agent)를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 난자 체외배양용 배지는 예를 들어, 다음과 같은 조성을 가질 수 있다.
본 발명의 난자 체외배양용 배지 조성물은 기본 배지 및 필수성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 난자 체외배양용 배지 조성물은 기본 배지; 필수성분; 및 임의성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 배지 조성물은, 기본배지 및 KSR을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 배지 조성물은, 기본배지; KSR 및 성선호르몬을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 배지 조성물은, 기본배지; KSR 및 성장인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 배지 조성물은, 기본배지; KSR; 성선호르몬 및 성장인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 배지 조성물은 상기 기본배지; KSR; 성선호르몬; 성장인자를 포함하는 배지에 소듐피루베이트, 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션 및 시스테인 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 배지 조성물은, 기본배지; KSR; 성선호르몬; 성장인자; 및 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 배지 조성물은, 기본배지; KSR; 성선호르몬; 성장인자; 및 항 응집제를 포함할 수 있다.
상기 배지 조성물은 본 발명의 일 구체예이므로, 이에 한정되지 않는다.
배양방법
본 발명은 난자의 체외성숙을 위해 체외에서 배양하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 난자 체외 성숙 배양 방법의 일 예시는 다음과 같다.
(1) 난소를 회수하여 난구세포에 싸여진 난구세포-난자 복합체를 회수하는 단계;
(2) 상기 난구세포-난자 복합체를 상기의 배지를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 난자의 체외 배양 방법
본 발명은 상기에서 언급된 배양 배지를 사용하여 회수된 난구세포-난자 복합체를 배양하는 것을 특징으로 한다.
상기 방법에 의해 배양된 난구세포-난자 복합체(Cumulus-oocyte-complexes:COCs)는 난자의 성숙 및 난구세포가 확장될 수 있다. 특히, 난구세포의 확장 효과가 뛰어난 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예로, 난구세포-난자복합체의 배양은 상기의 배지에 의해 40~50시간 배양될 수 있다. 바람직한 일 구체예로, 상기 배양 시간은 44시간 일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 난구세포-난자 복합체의 배양은 두 단계에 거쳐 이루어 질 수 있다.
상기 배양 중 1차 배양은 일 예로, 38.5℃, 5% CO2, 95% 습도의 조건에서 20~24시간 배양될 수 있다. 바람직하게는 22시간 배양될 수 있다.
또한, 상기의 조건에서 1차 배양 이후에, 추가적으로 호르몬이 없는 조건에서, 상기 기재된 배양 배지에 의해 2차로 20~24시간 배양될 수 있다. 바람직하게는 22시간 배양될 수 있다.
즉, 1차 배양 이후에 배지를 옮겨 2차 배양과정을 추가할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 방법에 의해 미성숙 난자를 체외배양 함으로써, 성숙된 난자를 얻을 수 있다.
확장된 난구세포 및 성숙된 난자
본 발명에 의한 상기 배양 배지를 이용하여 성숙된 난자의 수득이 가능하다.
또한, 본 발명의 상기 배양 방법을 이용하여, 성숙된 난자를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지에 의해 배양된 난구세포-난자 복합체를 제공할 수 있다.
상기 배양된 난구세포-난자 복합체의 난자는 핵이 성숙된 형태일 수 있다.
또한, 상기 배양된 난구세포-난자 복합체의 난자는 세포질이 성숙된 형태일 수 있다.
상기 배양된 난자는 제2차 감수분열 중기 상태의 난자비율이 증가 될 수 있다.
상기 배양된 난자는 제2차 감수분열 중기 상태의 난자비율이 80%이상 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양된 난자는 난자 발달과 관련된 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
상기 배양된 난자는 GDF9 , BMP15 , Cyclin B1, C- Mos 및 Cdc2 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배양된 난자는 세포사멸과 관련된 유전자의 발현이 감소할 수 있다.
상기 배양된 난자는 Bax/Bcl2의 유전자 발현 비율이 감소할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 배양된 난자는 GSH의 발현 비율이 증가할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양된 난자는 지질대사(lipid metabolism)와 관련된 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배양된 난자는 지질생성(lipogenesis)과 관련된 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
상기 배양된 난자는 ACACA , FASN , FADS1 , PPAR -γ 및 SREBF1 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배양된 난자는 지질분해(lipolysis)과 관련된 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
상기 배양된 난자는 ATGL , HSL , PLIN2 및 MGL 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배양된 난자는 지방산 β- 산화(fatty acid β-oxidation)관련 유전자의 발현 비율이 증가할 수 있다.
상기 배양된 난자는 CPT1A , CPT1B , CPT2 및 ACADS 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구체예로, 상기 배양된 난자는 미토콘드리아 생합성(mitochondrial biogenesis)과 관련된 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
상기 배양된 난자는 PGC - 1α , PRDX2 및 PRDX2 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양된 난자는 지질 입자(lipid droplet), 지방산(fatty acid) 및 ATP 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현이 증가할 수 있다.
본 발명에 의한 배양배지 및 이를 이용한 배양방법에 의하면, 성숙된 난구세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양된 난구세포는 배양으로 인해 확장된 형태를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배양된 난구세포는 난구세포 확장과 관련된 유전자의 발현이 증가될 수 있다.
상기 배양된 난구세포는 Ptgs1 , Ptgs2 , Ptx -3, Has2 및 Tnfaip6 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가 될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배양된 난구세포는 세포사멸(apoptosis)과 관련된 유전자의 발현 비율이 감소될 수 있다.
상기 배양된 난구세포는 Bax/Bcl2의 유전자 발현 비율이 감소될 수 있다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 배양된 난구세포는 지질대사(lipid metabolism)와 관련된 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 배양된 난자는 지질생성(lipogenesis)과 관련된 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
상기 배양된 난구세포는 ACACA , FASN , FADS1 , PPAR -γ 및 SREBF1 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 감소 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 배양된 난구세포는 지질분해(lipolysis)과 관련된 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
상기 배양된 난자는 LPL , ATGL , CGL -58, HSL 및 PLIN2 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 배양된 난구세포는 지방산 β- 산화(fatty acid β-oxidation)관련 유전자의 발현 비율이 증가할 수 있다.
상기 배양된 난구세포는 CPT1A , CPT1B , CPT2 및 ACADS 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
본 발명의 배지 및 배양 방법에 의해 배양된 난구세포-난자 복합체는 난구세포의 확장 및 난자의 성숙 효과를 낼 수 있다.
특히, 상기 본 발명의 배지에 의해 배양된 난구세포는 지방생성보다 지방 분해 활성이 활발하여 충분한 에너지원을 생성함으로써 난구세포의 확장효과가 뛰어나다.
상기 배양된 난구세포-난자 복합체에서 난구세포의 제거를 통해 성숙된 난자를 회수할 수 있다.
상기 회수된 성숙된 난자의 경우, 성공적인 핵이식 효율을 가질 뿐 아니라 체외 수정란을 안정적으로 생산할 수 있게 한다.
본 발명은 상기 성숙된 난자를 이용하는 경우, 배아의 생성 및 배반포 생성 효율이 뛰어나 체외 수정란의 생산 또는 핵이식란의 생산에 고효율로 이용될 수 있다. 또한, 상기 체외 수정란 또는 핵이식란은 질병동물모델 및 체세포핵이식방법을 이용한 복제동물 생산 등에 유용하게 이용될 수 있다.
체외수정란 생산
본 발명은, 본 발명의 배지 또는 배양 방법에 의해 체외성숙 된 난자를 이용하여 체외수정란을 생산할 수 있다.
상기 체외수정란은 난소에서 채취한 난자를 시험관 내에서 정자와 혼합하여 수정시켜 생산한 수정란을 의미한다.
체외수정란의 생산 방법은 일반적으로
(a)채취한 난소에서 미성숙난자를 회수하는 단계;
(b)난자의 체외성숙을 위한 배양하는 단계; 및
(c)성숙한 난자를 동결-융해한 정액과 체외수정하는 단계를 거쳐 생산된다.
본 발명의 배지 또는 배양 방법은 상기 (b)단계에서 사용되는 것으로, 본 발명에 의해 체외성숙된 난자의 경우 체외수정란을 통한 배아의 형성 및 배반포로의 발달율이 높아 난자의 질 및 효율성이 뛰어난 특성을 가지고 있다.
본 발명의 체외수정란의 생산방법은,
(a)채취한 난소에서 난구세포-난자 복합체를 회수하는 단계;
(b)난자의 체외성숙을 위해 난구세포-난자 복합체를 난포액(follicular fluid)을 포함하지 않으면서, KSR(Knockout serum replacement)을 포함하는 난자의 체외배양용 배지로 배양하는 단계; 및
(c)상기 성숙한 난자를 채취하여 동결-융해한 정액과 체외수정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 체외수정란을 포함할 수 있다.
상기 체외수정란은 배아의 발달을 위한 세포분열 또는 배반포 형성율이 난포액을 사용한 경우와 유사한 효율을 보이므로, 난포액을 배지에 첨가한 경우와는 달리 감염의 위험이 없는 체외수정란을 원활히 생산할 수 있는 장점이 있다.
따라서 상기 생산된 체외수정란을 사용하여 질병치료를 위한 동물 모델 등 다양한 분야에 이용할 수 있을 것이다.
다낭성난소증후군 환자에의 이용
상기 방법에 의해 제작된 체외수정란은 다낭성난소증후군 환자에 적용하여 인공수정에 이용할 수 있을 것이다.
다낭성난소 증후군이란, 정상적인 여성이 성호르몬의 변동(flunctuation)으로 인해 월경 및 배란기를 겪게 되는 것과 달리, 성 호르몬 수치에 변동이 보이지 않고 일정하게(steady) 보여지면서 무배란증(anovulation)과 불임이 발생하게 되는 것을 의미한다.
특히 무배란증으로 인해 황체(corpus luteum)가 만들어 지지 않아 프로게스테론(Progesterone)호르몬의 생성 저하가 발생하게 되고 무저항성 여성호르몬(estrogen)이 보여지게 되어 이로 인한 비정상적 증상들이 나타난다. 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 호르몬 분비축의 교란으로 보고 있는 것이 일반적이다.
본 발명의 경우 이러한 다낭성난소증후군 환자의 난자를 채취하여 체외에서 성숙 및 체외수정란의 생산을 통해 인공수정을 통한 임신에 적용할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구체예로, 다낭성난소증후군 환자의 미성숙 난자를 채취하여 체외성숙을 위해 본 발명에 의해 개시되는 난자의 체외배양 배지를 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로, 다낭성난소증후군 환자의 미성숙 난자를 채취하여 체외성숙을 위해 본 발명에 의해 개시되는 배지를 이용한 배양 방법을 이용할 수 있다.
상기 배지 및 배양 방법에 의할 경우, 배아의 형성 및 배반포로의 발달 효율이 좋은 성숙된 난자를 얻을 수 있다.
따라서, 다낭성난소증후군 환자의 인공수정 성공확률을 증가시키는 데에 도움이될 수 있을 것이다.
핵 이식란 생산
본 발명은 본 발명에 의해 개시되는 배지 또는 배양 방법에 의해 체외성숙 된 난자를 이용하여 핵이식란을 생산할 수 있다.
상기 핵 이식은 탈핵된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술로 핵 이식란은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
상기 핵 공여 세포로는 체세포 또는 줄기세포 등을 사용할 수 있다.
상기 체세포로 사용될 수 있는 세포로는 예를 들면, 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 보다 바람직하게는, 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 난구세포일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
상기 줄기세포로 사용될 수 있는 세포로는 예를 들면, 배아 유래 또는 성체 유래의 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 핵 이식란의 생산방법은,
(1) 난자의 체외성숙을 위해 난구세포-난자 복합체를 난포액(follicular fluid)을 포함하지 않으면서, KSR(Knockout serum replacement)을 포함하는 난자의 체외배양용 배지로 배양하는 단계;
(2) 상기 배양된 난구세포-난자 복합체에서 성숙된 난자를 회수한 뒤, 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조하는 단계;
(2) 조직으로부터 분리한 체세포들에 세포 주기 동기화 유도물질을 첨가하여 배양하는 것을 포함하는 핵 공여 세포 제조단계;
(3) 상기 (1) 단계의 탈핵 난자에 (b) 단계의 핵 공여 세포를 미세주입하고 융합시키는 단계; 및
(4) 상기 (3) 단계에서 융합된 난자를 활성화시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 생산된 핵이식란을 포함할 수 있다.
상기 핵이식란은 배아의 발달을 위한 세포분열 또는 배반포 형성율이 난포액을 사용한 경우와 유사한 효율을 보이므로, 난포액을 배지에 첨가한 경우와는 달리 감염 및 오염의 위험이 없는 핵이식란을 원활히 생산할 수 있는 장점이 있다.
체세포핵이식 기술 이용한 복제동물 생산
본 발명은 상기 생산된 핵이식란을 사용하여 복제동물을 생산할 수 있다.
상기 복제는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술을 의미한다.
상기 복제동물은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고 자손을 탄생시키는 것으로 성체가 가진 배수체 보유 체세포 등을 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시킨다.
본 발명의 복제동물의 생산방법은,
상기의 핵이식란을 생산하는 방법에 다음의 단계를 추가로 포함할 수 있다.
(5) 상기 활성화된 난자를 대리모의 난관에 이식하는 단계.
또한, 복제동물의 생산 방법에 관한 각 단계에 관한 통상적 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래의 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제 동물의 제조방법 등을 참조하여 이해할 수 있다.
상기 생산된 복제동물은 우량품종의 번식, 보존 등에 이용될 수 있을 것이다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 돼지난자의 난구세포-난자 복합체의 수득 및 난자의 체외 성숙
돼지 난소는 도축장에서 사춘기 전의 암퇘지로부터 얻었고, 28-32℃실험실로 옮겨졌다.
3-6mm의 난포 내용물은 18게이지 바늘로 흡입하여 수득되었다. 난구세포-난자 복합체는 2 mM 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate), 10 mM 엔-피퍼라진-엔'-2-에탄설포닉산(N-piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid];HEPES), 5 mM 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide), 1% Pen-Strep (Invitrogen) 및 0.3% 폴리바이닐 알코올(polyvinyl alcohol; PVA)을 함유하고 있는 TCM-199 (tissue culture medium-199; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지에서 3번 세척하였다.
그 후에, 50개의 난구세포-난자 복합체(COCs)를 0.91 mM 소듐피루베이트 (sodium pyruvate), 5 μl/mL 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션(insulin-transferrin-selenium solution: ITS-A, 100X (Invitrogen)), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 10 ng/mL 상피성장인자(epidermal growth factor: EGF), 10 IU/mL 인간융모성생식선자극호르몬(human chorionic gonadotropin: hCG), 10 IU/mL 말 융모막 성선자극 호르몬(equine chorionic gonadotropin: eCG)에 10% 돼지난포액(porcine follicular fluid: vol/vol) 또는 5%/10% KSR (Gibco; vol/vol)을 첨가한 TCM-199 배지를 포함하는 체외성숙 배지(IVM medium)에 넣었다.
배지에 담겨진 난구세포-난자 복합체(COCs)는 체외성숙을 위해 38.5℃, 5% CO2, 95% 습도 조건에서 배양되었다.
이후, 호르몬을 첨가하여 22시간 성숙 후, 난구세포-난자 복합체(COCs)는 새로운 체외성숙배지로 두 번 세척 후 호르몬이 없는 체외성숙배지에서 추가적으로 22시간 동안 배양하였다.
실시예 2. 난자의 성숙 비율 및 난구세포 확장의 확인
2-1. 난자의 성숙비율 확인
난자의 성숙을 확인하기 위하여 돼지 난자의 핵 성숙도를 현미경으로 관찰하였고 이는 4회 반복하였다.
체외 성숙 44시간 이후, 난자성숙비율은 5%, 10% KSR 및 10% pFF (각각 75.7% vs. 86.0%, 81.7% 및 83.2%, P < 0.05) 과 비교할 때 대조군에서 유의하게 낮은 것을 볼 수 있었다(도 3). 따라서, KSR과 pFF를 첨가한 경우 난자성숙비율은 유사한 것으로 보였다.
게다가, 10% pFF를 첨가한 경우보다 오히려 5% KSR을 첨가한 경우에 난자 성숙비율이 높은 것을 볼 수 있었다.
2-2. 난구세포 확장의 확인
난구세포의 확장을 보이는 난자의 비율은 체외성숙 말기에 결정되는 것으로 난구세포의 확장 정도는 난구세포-난자 복합체의 형태로부터 확인할 수 있었다.
난구세포의 확장 정도는 0부터 4까지로 나누어 난구세포 확장 지수(Cumulus cell expansion index: CEI)로 표시하였다(표 1).
[표 1]
Figure pat00001
0의 정도는 확장이 일어나지 않음을 나타내었고, 난자로부터 난구세포가 분리되어 섬유아세포 같은 형태의 평편한 단층의 형태, 부분적으로 또는 완전히 벗겨진 난자로 떨어져 있는 형태를 하고 있는 특징이 있었다.
1의 정도는 확장은 일어나지 않았으나 난구세포는 구형이었고, 난자 주위에 압축된 채로 남아있었다. 2의 정도의 복합체는 난구세포의 가장 외부 층의 난구세포가 확장되어 있었고, 반면에 3정도의 복합체는 방선관(corona radiate: 난자와 가장 근접한 세포)를 제외한 모든 세포의 층에서 두드러지게 확장되었고, 4의 정도는 방선관을 포함하여 최대 확장된 정도를 보였다.
난구세포의 확장(도 1)을 살펴보면, 22시간 체외성숙배양(IVM) 이후에도 불구하고 난구세포 확장은 각 그룹마다 다르지 않았으며, CEI는 다른 그룹보다 10% pFF에서 유의하게 높았고, 대조군 그룹은 5% 및 10% KSR (각각 3.73 vs. 3.17 vs. 2.48 및 2.51, P < 0.05, 표1)와 비교했을 때 CEI 가 유의하게 증가한 것을 볼 수 있었다.
실시예 3. 정량적 real-time PCR을 이용한 난구세포 확장관련 유전자 및 난자의 발달관련 유전자 발현 분석
3-1. 정량적 real-time PCR을 이용한 유전자 발현분석
정량적 real-time PCR은 통상의 방법에 의해 수행하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 추출하고, 그 후에 총 RNA 농도를 NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)을 사용하여 정량화하였다. 상보적인 DNA (cDNA)는 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA)을 사용하여 제작하였다.
1 μL cDNA, 0.4 μL (10 pmol/μL) 정방향프라이머, 0.4 μL (10 pmol/μL) 역방향프라이머, 10 μL SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa, Otsu, Japan) 및 8.2 μL of Nuclease-free water (NFW; Ambion, Austin, TX, USA)를 첨가하여 PCR 플레이트 (Micro-Amp Optical 96-Well Reaction Plate, Singapore)을 제작한 후, StepOneTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)으로 증폭시켰다.
증폭 프로토콜은 95 ℃에서 10 분간의 초기 변성 단계를 포함하고 이어서 95 ℃에서 15 초 동안의 변성, 60 ℃에서 1분간 어닐링 및 72℃ 에서 1분간의 확장을 포함하는 40 사이클이 이어졌다. 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 표2와 같다. 각 표적 유전자의 발현은 내부 조절 유전자 (GAPDH)의 발현과 비교하여 R = 2－[Ct sample－Ct control]방정식을 사용하여 정량화하였다. 비교의 용이성을 위해, 대조군의 각 유전자의 평균 발현 수준을 1로 설정하였다.
[표 2]
Figure pat00002
Figure pat00003
3-2. 난구세포 확장 관련 유전자 발현양상
5%, 10% KSR 또는 10% pFF를 첨가하였을 때 IVM 중의 난구세포 확장 관련 유전자(Ptgs1, Ptgs2 , Ptx -3, Has2 및 Tnfaip6) 및 세포사멸관련 유전자(Bax/Bcl2 ratio)에 관한 효과에 대해 평가하였다. (도 2A)
난구세포의 확장과 관련 유전자(Ptgs1 , Ptgs2 , Ptx -3, Has2 , 및 Tnfaip6) 는 대조군 그룹에서 가장 낮은 전사 발현율을 보였다. 게다가, Bax/Bcl2 비율은 대조군이 가장 높았고 10% pFF, 10% KSR 및 5% KSR (P <0.05)순으로 점차 감소 되었다.
상기 실시예 2-2에서 보았듯이 KSR이 보충된 경우의 CEI가 보충되지 않은 대조군과 pFF 보충군에 비해 낮았다 하더라도 도 2A를 볼 때 난구세포의 확장 관련 유전자 중 Ptgs1, Has2 및 Tnfaip6에서 특히 10% pFF를 첨가한 군의 경우와 유전자 발현율이 유사하거나 더 높은 것을 볼 수 있었다.
즉, 난구세포 확장과 관련하여 난포액과 유사 수준의 효과를 확인할 수 있었다.
3-3. 난자발달 관련 유전자 발현양상
난자 발달관련 유전자들(GDF9 , BMP15 , Cyclin B1, C- Mos and Cdc2)의 발현에 대해 보았다 (도 2B). 난자 능력(질)과 관련된 유전자(GDF9 and BMP15) 의 발현은 다른 그룹보다 5% KSR and 10% pFF에서 유의하게 증가하였다. (P < 0.05)
게다가 Cyclin B1 and C-Mos는 10% KSR에서 가장 낮은 발현을 보였고, Cdc2는 다른 그룹보다 5% KS에서 유의하게 증가하였다. Bax/Bcl2의 비율에 관하여는 대조군이 가장 높았고 10% KSR, 5% KSR 및 10% pFF (P < 0.05) 순으로 점차 감소되었다.
도 2B의 결과를 보더라도 난자발달 관련 유전자 발현은 난포액과 KSR을 첨가한 경우에 큰 차이가 없어 KSR의 난포액 대체제로의 가능성을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 난자의 면역형광 염색 확인
면역형광 염색법은 기존의 방법에 의해 수행하였다. 돼지 난자를 0.2 % PVA를 포함한 PBS로 3회 세척하고, PBS 안에서 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)(w / v)로 30분간 고정시켰다. 모든 단계는 달리 명시되지 않는 실온에서 수행하였다. 난자는 1 % Triton X-100 (v / v)을 포함하는 PBS로 30분간 옮겼다.
4℃에서 밤새 PBS안에 2% 소혈청알부민(BSA)으로 비특이적인 부위를 차단한 후, 난자는 1차 항체 (rabbit polyclonal antibody against GDF9 (ab93892, Abcam) 및 BMP15와 (PA5-34401, Invitrogen) diluted 1:200, respectively) 함께 37℃에서 3시간 동안 배양하였다.
그 후에, 염소 항 토끼 형광 아이소티오시아네이트-결합(isothiocyanate-conjugated) 2차 항체(1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA)를 실온에서 3시간 동안 적용하였다. 염색된 난자는 그 다음에 유리 슬라이드 위에 올리고 같은 노출시간과 조건하에 형광 현미경(TE2000-S; Nikon)으로 관찰하였다. GDF9와 BMP15(녹색)의 강도는 Image J software (version 1.46r; National Institutes of Health, USA)로 배아 사진을 분석하여 측정하였다.
난자의 능력과 관련된 유전자(GDF9 and BMP15 )의 발현을 볼 때, GDF9 및 BMP15의 단백질 발현 레벨이 실시예 3-3의 난자 발달 관련 유전자 발현율과 유사한 패턴이었고, 다른 그룹들에 비해 대조군 그룹에서 유의하게 발현양이 적은 것을 볼 수 있었다. 난자의 질과 관련된 마커 중 하나인 GSH의 형광 레벨은 직접적으로 GDF9 및 BMP15의 레벨에 비례하였다(도 4). 상기 결과를 볼 때, 대조군과는 차이를 보이나, KSR를 첨가한 경우에는 pFF를 첨가한 경우와 GDF9, BMP15 및 GSH의 발현양상이 유사한 것을 볼 수 있었다.
실시예 5. 난구세포 및 난자 관련 지질대사 관련 인자 발현 확인
난구세포 및 난자에서 지질대사 관련 인자의 확인을 위해 지질생성, 지질분해 및 지방산 β-산화와 관련된 인자들의 발현 양상을 상기 실시예 3-1의 방법에 의해 측정하였다.
5-1. 난구세포 내 지질대사 관련 인자 발현양상
지방 생성과 관련된 유전자 (ACACA, FASN, FADS1, PPARγ 및 SREBF1)는 대조군에서 유의하게 증가되었지만, 지방분해관련 인자의 발현은 (LPL, ATGL, CGI-58, HSL 및 PLIN2)는 5 % KSR 및 10 % pFF (P <0.05)보다 대조군이 유의하게 낮았다. 또한, 지방산 β- 산화와 관련된 인자(CPT1A, CPT1B, CPT2 및 ACADS)는 pFF보다 5 % KSR 군에서 유의하게 증가하였다 (도 5).
상기 결과를 볼 때, 지방 생성은 적게 되나 지방 분해 활성이 활발하여, IVM 동안 지질 입자가 난구세포에 축적되지 않고, 지방 분해 활성으로 계속적으로 난구세포의 확장을 위한 에너지원을 생성함을 알 수 있었다.
또한, 난구세포내 지질대사 관련 인자의 발현은 난자 내에서 보다 그 양상을 명확히 볼 수 있었고, 이러한 지질대사와 관련된 인자의 발현양상은 KSR과 난포액(pFF)이 일치하는 것으로 보이므로 난포액 대체제로 역시 가능성을 확인할 수 있었다.
5-2. 난자 내 지질대사 관련 인자 발현양상
난자 내에서 지방 생성관련인자의 발현(ACACA, FASN, FADS1, PPARγ 및 SREBF1), 지방 분해 관련인자의 발현(ATGL, HSL, PLIN2 및 MGL), 지방산 β- 산화관련 인자의 발현(CPT1A, CPT1B, CPT2 및 ACADS) 및 미토콘드리아 생합성(mitochondrial biogenesis)관련 인자의 발현(PGC-1α와 PRDX2)은 대조군에 비해 5 % KSR 및 10% pFF에서 유의하게 증가 하였다 (P <0.05)(도 6).
비록 난구세포에서와 같이 지질분해와 관련해서 5%KSR에서 10%pFF와 뚜렷하게 비교되는 결과는 없었으나, 지질대사 관련 대부분의 인자에서 난포액과 KSR은 유사한 발현양을 보였다.
실시예 6. 난자에 함유된 지방 방울, 지방산 및 미토콘드리아 평가
난구세포가 제거된 난자는 4% PBS(paraformaldehyde-phosphate-buffered saline; Invitrogen)로 4시간 동안 실온에서 고정되었고, BODIPY-LD (BODIPY 493/503; D3922; Molecular Proves, Eugene, OR), BODIPY-FA (BODIPY 558/568 C12; D3835; Molecular Proves, Eugene, OR) 및 BODIPY-ATP (BODIPY FL ATP; A12410; Molecular Proves, Eugene, OR) 에 의해 염색하기 전에 PBS로 세척하였다. 그 후 10μg/mL BODIPY-LD, 6μM BODIPY-FA 및 500nM BODIPY-ATP가 첨가된 PBS에서 어두운 곳에서 실온 하에 1시간 동안 배양하였다.
염색 이후, 난자는 PBS로 3번 세척하였고 유리 슬라이드 위에 올리고 커버슬립으로 부드럽게 압축시켰다. 각 난자의 이미지는 형광현미경(TE2000-S; Nikon)을 사용하여 캡쳐하였다. 지방 방울의 형광의 강도 및 평균 크기는 Image J software (version 1.46r; National institutes of Health, USA)를 사용하여 측정하였다. 상기 결과는 도 7에 도시하였다.
BODIPY-LD, BODIPY-FA 및 BODIPY-ATP의 형광 강도는 5% KSR 및 10% pFF 모두에서 대조군과 유의한 차이가 있었다(P <0.05).
실시예 7. 단성생식활성을 통한 배아 발달
난구세포-난자 복합체(COCs)는 44시간의 체외성숙 후에, 0.1% 히알루로니다아제(hyaluronidase)로 피펫을 사용하여 벗겨내고 TALP 배지로 세척하였다. 벗겨진 난자와 동종의 세포질은 수득 되었고 그 후 점진적으로 0.28 M 만니톨(mannitol), 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgSO4 및 0.5 mM HEPES으로 구성되어있는 활성용액과 평형을 유지하였다.
난자는 활성화 용액으로 채워진 3.2 mm 떨어진 2개의 전극을 갖는 챔버로 옮겨졌고, BTX Electro-Cell Manipulator 2001(BTX Inc, San Diego, CA, USA)을 이용하여 60 μs 동안 1.5 kV/cm의 단일 직류(DC) 펄스로 전기 자극에 의해 활성화되었다. 활성화 된 난자는 pig-zyote medium-5 (PZM-5, Funakoshi Corporation, Tokyo, Japan)으로 3-4 회 세척하고, 500μL PZM-5가 포함된 웰로 옮겨 가습 조건의 5 % CO2, 5 % O2 및 90 % N2, 38.5℃ 하에서 7일간 배양하였다.
배반포의 총 세포수를 세기 위해, 7일째에 수집하여, Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS; Invitrogen)-PVA (DPBS-PVA)로 세척한 후 Hoechst 33342 25μg/mL로 10분간 염색하였다.
DPBS-PVA로 최종 세척한 후, 배반포를 100% 글리세롤 한 방울 넣은 유리 슬라이드에 올리고 커버 슬립으로 부드럽게 압축한 후 형광 현미경으로 관찰하였고 그 결과는 표 3에 도시하였다.
[표 3]
Figure pat00004
세포분열비율에 대한 그룹 간에 유의한 차이는 없었다. 배반포 형성비율은 대조군과 비교하여 10% KSR, 10% pFF 및 5% KSR (각각 28.3% 및 28.3% vs. 35.2% vs. 41.4%, P < 0.05)순으로 점차 증가하였다. 배반포의 총 세포수는 대조군과 비교할 때 5% KSR에서 유의하게 증가하였다(64.9 ± 7.3 vs. 46.3 ± 2.4, P < 0.05).
따라서, 상기 결과를 볼 때 단세포생식활성에 의한 배아의 발달 및 배반포의 형성은 난포액을 첨가하여 난자 체외배양을 한 경우보다 5% KSR을 첨가하였을 경우에 더 효율이 좋은 난자가 생성됨을 볼 수 있었다.
상기 결과에 따라, 이후의 체세포핵이식 및 체외수정에 관한 실험은 5% KSR 및 10% pFF을 처리한 그룹만을 가지고 대조군과 비교하였다.
실시예 8. 체세포핵이식(SNCT)을 통한 배아 발달
8-1. 체세포핵이식을 위한 공여세포 준비
돼지의 섬유아세포는 성인돼지의 귀조직으로부터 분리되었다. 조직을 작은 조각으로 절단하고 10% 태아 소 혈청 (FBS, Gibco, 배양 배지) (v/v), 1 mM 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 페니실린과 스트렙토마이신 각각 100IU/mL가 포함된 DMEM (Dulbecco's modied Eagle's medium; Gibco, culture medium)배지에서 38 ℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 3번에서 7번까지 계대배양한 세포가 SCNT(체세포핵이식)의 공여세포로 사용되었다. 단일 세포 현탁액은 SCNT 직전에 표준 트립신 처리 방법에 의해 제조하였다.
8-2. 체세포 핵이식
체외배양 이후, 0.1% 히알루로니다아제(hyaluronidase)로 피펫을 사용하여 벗겨내고 TALP 배지로 세척하였다. 벗겨진 난자는 5μg/mL Hoechst 33342 을 포함하는 TALP 배에서 10분간 배양 후, 형광 도립현미경(inverted microscope )으로 관찰하였다. 난자는 마이크로 피펫으로 잡아서 투명대를 미세 유리 바늘로 부분적으로 절개하여 제1극체 근처에 슬릿을 만들었다. 핵의 제거는 5μg/mL 사이토칼라신 B(cytochalasin B)가 포함된 TALP배지에서 흡입용 피펫에 의해 제1극체와 감수분열 중기의 염색체를 포함하는(metaphase II) 인접한 세포질의 흡입에 의해 수행하였다.
단일 공여 세포는 탈핵 된 난자세포의 난황주위 공간에 삽입되었고, 이식란은 융합용액(0.5mM HEPES 및 0.1mM MgSO4을 포함하는 0.28M 만니톨 용액) 내에서 평형화 시킨 후, 전기 펄스 장치(LF101; Nepa Gene, Chiba, Japan)를 사용하여 30μs 동안 1.2kV/cm의 단일 DC 펄스로 융합 용액 20㎕안에서 융합시켰다.
1시간 후, 융합된 이식은 활성용액(0.5mM HEPES, 0.1mM CaCl2 및 0.1mM MgSO4이 포함된 0.28M 만니톨 용액)으로 평형화시켰고, 그 다음에 활성화 용액으로 중첩 된 2개의 전극을 함유하는 챔버로 옮기고 BTX ElectroCell Manipulator 2001을 사용하여 1.5 kV / cm의 단일 DC 펄스를 30μs 동안 활성화시켰다.
체세포핵이식에 의해 생성된 배아는 새로운 배지 PZM-5로 3번 세척한 후, 미네랄 오일로 덮힌 30μL의 체외배양액(IVC)으로 옮긴 후, 38.5℃하, 5% CO2, 5% O2 및 90% N2의 습윤한 조건에서 배양하였다.
8-3. 배아 발달의 확인
배반포의 수를 세기 위하여 상기 실시예 8에서 언급한 방법에 의해 배아를 처리한 후 형광현미경으로 관찰한 결과는 표 4에 도시하였다.
[표 4]
Figure pat00005
상기 결과를 볼 때, 배아 발달의 경우 세포분열 비율 및 총 배아 세포수에 유의한 차이는 없었다. 다만, 5% KSR 및 10% pFF 를 처리한 경우 배반포 형성비율이 대조군에 비해 유의하게 높았다(각각 23.8% 및 22.6% vs. 11.1%, P < 0.05).
5% KSR 및 10% pFF을 처리한 경우를 비교해 볼 때, 배아의 발달 및 배반포 형성비율을 보았을 때 유사한 결과를 볼 수 있어, 난자의 체외성숙시에 난포액 대체제로 KSR을 사용가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 체외수정을 통한 배아 발달
9-1. 체외수정
체외수정은 일반적인 체외수정법에 의해 수행되었다.
난구세포-난자 복합체는 44시간의 체외성숙 이후에 0.1% 히알루로니다아제(hyaluronidase)로 피펫을 사용하여 부드럽게 벗겨내고 TALP 배지에서 3번 세척하였다. MII 단계에 있는 15개의 성숙된 난자 그룹은 랜덤하게 미리 데워진 미네랄 오일로 덮힌 35x10mm Petri dish 안의 40μL mTBM(modified Tris-buffered medium)배지 용액에 넣었다. 이어서, DARBY Corporation (경기도 안성 125-81-15252)에서 매주 공급 한 액상 정액을 사용 전 3일간 4℃에서 보관하였다.
정액 샘플을 2,000 rpm에서 2분간 원심 분리하여 0.1 % BSA가 첨가된 DPBS로 2회 세척하였다. 세척 후, 정자 펠릿을 mTBM안에서 재현탁 시켰다. 적절한 희석 후, 5㎕의 정자 현탁액을 40㎕의 배지용액 (mTBM)에 첨가하여 최종 정자 농도를 1x106 sperm/mL로 설정하였다.
수정 직전에, 정자의 운동성을 평가하였고, 80% 이상의 운동성 정자를 각 실험에 사용하였다. 난자는 정자와 함께 5% CO2 및 95% 공기의 습윤조건에서 39℃하에 20분 동안 공배양하였다. 정자와의 공배양 20분 후, 느슨하게 부착된 정자를 부드럽게 피펫을 이용하여 투명대(ZP)에서 제거하였다. 이어서, 난자를 mTBM배지로 3번 세척 후, 정자없이 5% CO2 및 95% 공기의 습윤조건에서 39℃하에 5-6 시간 동안 mTBM에서 배양하였다.
이후, 생식세포들은 배아 배양 배지로 3번 세척한 이후 PZM-5 배지의 25μL microdrops (10 gametes/drop)안에서 배양되었다. 용액에서 배양된 배아는 5% O2, 5% CO2 및 90% N2의 습윤조건에서 39℃하에 168시간 동안 배양하였다.
9-2. 체외수정에 의한 배아 발달의 확인
배반포의 수를 세기 위하여 상기 실시예 8에서 언급한 방법에 의해 배아를 처리한 후 형광현미경으로 관찰한 결과는 표 5에 도시하였다.
[표 5]
Figure pat00006
체외수정에 의한 배아 발생의 경우 세포분열비율 및 총 배아 세포 수에 유의한 차이는 없었다. 다만, 5% KSR 및 10% pFF를 처리한 경우 배반포 형성비율이 대조군에 비해 유의하게 높았다. (각각 20.2% 및 18.9% vs 12.1% in IVF, P < 0.05).
체세포 핵이식에 의한 결과와 유사하게 체외수정의 경우에도, 5% KSR 및 10% pFF을 처리한 경우를 비교해 볼 때, 난자의 체외성숙시에 KSR을 사용할 경우에도 난포액을 첨가하여 배양시킨 경우에 배아 및 배반포 형성율이 유사함을 확인할 수 있었다.

Claims (14)

  1. 난자의 체외배양을 위한 배지로,
    난포액(follicular fluid)을 포함하지 않으면서,
    기본 배지 및 KSR(Knockout serum replacement)을 포함하는 난자의 체외배양용 배지.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 기본 배지는 TCM-199(tissue culture medium-199), DMEM(dulbecco modified eagle medium), M199(Medium 199), PZM-5 (Porcine zygote medium) 및 PZM-3으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 난자의 체외배양용 배지.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 KSR(Knockout serum replacement)은 배지 조성물 총 부피의 5~10%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 난자의 체외배양용 배지.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 배지는 성장인자(growth factor)및 성선호르몬으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 난자의 체외배양용 배지.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 성선호르몬은 난포자극호르몬(follicle stimulating hormone: FSH), 황체형성호르몬(luteinizing hormone:LH), 인간융모성생식선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin : hCG) , 말 융모막 성선자극 호르몬(equine chorionic gonadotropin: eCG) 및 임신마 혈청 성선자극호르몬(pregnant mare serum gonadotropin:PMSG)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 난자의 체외배양용 배지.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 성장인자는 유사인슐린 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth fac-tor, FGF) 및 형질전환 성장 인자(trans-forming growth factor, TGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 난자의 체외배양용 배지.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 배지는 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션(insulin-transferrin-selenium solution : ITS-A) 및 시스테인(cysteine) 중 어느 하나 이상을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 난자의 체외배양용 배지.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 배지는 0.91 mM 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 5 ㎕/mL 인슐린-트랜스페린-셀레니움 솔루션(insulin-transferrin-selenium solution : ITS-A), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 10 ng/mL 표피성장인자(epidermal growth factor : EGF, 10 IU/mL 인간융모성생식선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin : hCG) , 10 IU/mL 말 융모막 성선자극 호르몬(equine chorionic gonadotropin: eCG) 및 5~10% KSR (Knockout serum replacement)을 포함하는 TCM-199 (tissue culture medium-199)기반 배지인 것을 특징으로 하는 난자의 체외배양용 배지.
  9. 제 1항 내지 8항 중 어느 한 항의 배지는 난구세포의 확장용인 것을 특징으로 하는 난자의 체외배양용 배지.
  10. 난구세포-난자 복합체의 체외배양을 위한 배지로,
    난포액(follicular fluid)을 포함하지 않으면서,
    기본 배지 및 KSR(Knockout serum replacement)을 포함하는 난구세포-난자 복합체의 체외배양용 배지.
  11. 난자의 체외성숙을 위해서,
    제 1항 내지 제 10항 중 어느 하나의 배지를 이용하여 난구세포-난자 복합체(Cumulus-oocyte-complexes:COCs)를 배양하는 것을 특징으로 하는 난자 배양 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 난자 배양 방법은
    난자의 성숙 또는 난구세포의 확장 효과를 특징으로 하는 난자 배양 방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 배양은 38.5℃, 5% CO2, 95% 습도의 조건에서 20~24시간 배양되는 것을 특징으로 하는 난자 배양 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 배양 이후에 추가적으로 호르몬이 없는 조건에서, 제 1항 내지 제 4항 및 제 6항 내지 제 10항의 배지 중 어느 하나의 배지에 의해 20~24시간 배양되는 것을 특징으로 하는 난자 배양 방법.
KR1020170148307A 2017-11-08 2017-11-08 난자의 체외배양을 위한 난포액 대체용 배지 및 이의 이용 KR20190052542A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170148307A KR20190052542A (ko) 2017-11-08 2017-11-08 난자의 체외배양을 위한 난포액 대체용 배지 및 이의 이용

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170148307A KR20190052542A (ko) 2017-11-08 2017-11-08 난자의 체외배양을 위한 난포액 대체용 배지 및 이의 이용

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190052542A true KR20190052542A (ko) 2019-05-16

Family

ID=66672277

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170148307A KR20190052542A (ko) 2017-11-08 2017-11-08 난자의 체외배양을 위한 난포액 대체용 배지 및 이의 이용

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20190052542A (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111548987A (zh) * 2020-05-14 2020-08-18 温氏食品集团股份有限公司 猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用
KR102158946B1 (ko) * 2019-12-27 2020-09-23 서울대학교산학협력단 피탄산을 통한 난모세포 내 퍼옥시좀의 역할
CN114908041A (zh) * 2022-03-31 2022-08-16 北京农学院 用于小鼠卵母细胞体外成熟的培养系统及方法

Non-Patent Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Barnes D, Sato G. Methods for growth of cultured cells in serum-free medium. Anal Biochem 1980;102: 255-270.
10. Jin JX, Kang JD, Li S, Jin L, Zhu HY, Guo Q, Gao QS, Yan CG, Yin XJ. PXD101 significantly improves nuclear reprogramming and the in vitro developmental competence of porcine SCNT embryos. Biochem Biophys Res Commun 2015;456: 156-161.
11. Jin JX, Lee S, Khoirinaya C, Oh A, Kim GA, Lee BC. Supplementation with spermine during in vitro maturation of porcine oocytes improves early embryonic development after parthenogenetic activation and somatic cell nuclear transfer. J Anim Sci 2016;94: 963-970.
12. Jin JX, Lee S, Taweechaipaisankul A, Kim GA, Lee BC. Melatonin regulates lipid metabolism in porcine oocytes. J Pineal Res 2017a;62: e12388.
13. Jin JX, Lee S, Taweechaipaisankul A, Kim GA, Lee BC. The HDAC Inhibitor LAQ824 Enhances Epigenetic Reprogramming and In Vitro Development of Porcine SCNT Embryos. Cell Physiol Biochem 2017b;41: 1255-1266.
14. Kang JT, Kwon DK, Park SJ, Kim SJ, Moon JH, Koo OJ, Jang G, Lee BC. Quercetin improves the in vitro development of porcine oocytes by decreasing reactive oxygen species levels. J Vet Sci 2013;14: 15-20.
15. Lee S, Jin JX, Taweechaipaisankul A, Kim GA, Ahn C, Lee BC. Melatonin influences the sonic hedgehog signaling pathway in porcine cumulus oocyte complexes. J Pineal Res 2017: e12424. Accepted Author Manuscript. doi:12410.11111/jpi.12424.
16. Lee S, Kim E, Hyun SH. Toxicity evaluation of ethanol treatment during in vitro maturation of porcine oocytes and subsequent embryonic development following parthenogenetic activation and in vitro fertilization. Int J Mol Med 2014;34: 1372-1380.
17. Lim KS, Chae SJ, Choo CW, Ku YH, Lee HJ, Hur CY, Lim JH, Lee WD. In vitro maturation: Clinical applications. Clin Exp Reprod Med 2013;40: 143-147.
18. Moon H-J, Shim J-H, Hwang I-S, Park M-R, Kim D-H, Ko Y-G, Park C-K, Im G-S. Effects of FBS (Feta1 Bovine Serum) and pFF (Porcine Follicular Fluid) on In Vitro Maturation and Development of Porcine Parthenogenetic and Nuclear Transfer Embryos. Reproductive & developmental biology 2009;33: 85-91.
19. Muller T, Fleischmann G, Eildermann K, Matz-Rensing K, Horn PA, Sasaki E, Behr R. A novel embryonic stem cell line derived from the common marmoset monkey (Callithrix jacchus) exhibiting germ cell-like characteristics. Hum Reprod 2009;24: 1359-1372.
2. Chian RC, Buckett WM, Too LL, Tan SL. Pregnancies resulting from in vitro matured oocytes retrieved from patients with polycystic ovary syndrome after priming with human chorionic gonadotropin. Fertil Steril 1999;72: 639-642.
20. Paczkowski M, Schoolcraft WB, Krisher RL. Fatty acid metabolism during maturation affects glucose uptake and is essential to oocyte competence. Reproduction 2014;148: 429-439.
21. Puri G, Chaudhary SS, Singh VK, Sharma AK. Effects of fetal bovine serum and estrus buffalo serum on maturation of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes in vitro. Vet World 2015;8: 143-146.
22. Sakurai M, Suzuki C, Yoshioka K. Effect of knockout serum replacement supplementation to culture medium on porcine blastocyst development and piglet production. Theriogenology 2015;83: 679-686 e671.
23. Son J, Malaweera DB, Lee E, Shin S, Cho J. Development of in vitro produced porcine embryos according to serum types as macromolecule. J Vet Sci 2013;14: 315-321.
24. Sritanaudomchai H, Ma H, Clepper L, Gokhale S, Bogan R, Hennebold J, Wolf D, Mitalipov S. Discovery of a novel imprinted gene by transcriptional analysis of parthenogenetic embryonic stem cells. Hum Reprod 2010;25: 1927-1941.
25. Sutton ML, Gilchrist RB, Thompson JG. Effects of in-vivo and in-vitro environments on the metabolism of the cumulus-oocyte complex and its influence on oocyte developmental capacity. Hum Reprod Update 2003;9: 35-48.
26. Suzuki M, Misumi K, Ozawa M, Noguchi J, Kaneko H, Ohnuma K, Fuchimoto D, Onishi A, Iwamoto M, Saito N et al. Successful piglet production by IVF of oocytes matured in vitro using NCSU-37 supplemented with fetal bovine serum. Theriogenology 2006;65: 374-386.
27. Vanderhyden BC, Caron PJ, Buccione R, Eppig JJ. Developmental pattern of the secretion of cumulus expansion-enabling factor by mouse oocytes and the role of oocytes in promoting granulosa cell differentiation. Dev Biol 1990;140: 307-317.
28. Wang WH, Abeydeera LR, Cantley TC, Day BN. Effects of oocyte maturation media on development of pig embryos produced by in vitro fertilization. J Reprod Fertil 1997;111: 101-108.
29. Zalmanova T, Hoskova K, Nevoral J, Adamkova K, Kott T, Sulc M, Kotikova Z, Prokesova S, Jilek F, Kralickova M et al. Bisphenol S negatively affects the meotic maturation of pig oocytes. Sci Rep 2017;7: 485.
3. Coticchio G, Dal-Canto M, Guglielmo MC, Mignini-Renzini M, Fadini R. Human oocyte maturation in vitro. Int J Dev Biol 2012;56: 909-918.
30. Zhang ZG, Zhao JH, Wei ZL, Cong L, Zhou P, Cao YX. Human umbilical cord blood serum in culture medium on oocyte maturation In vitro. Arch Androl 2007;53: 303-307.
4. Coticchio G, Guglielmo MC, Dal Canto M, Fadini R, Mignini Renzini M, De Ponti E, Brambillasca F, Albertini DF. Mechanistic foundations of the metaphase II spindle of human oocytes matured in vivo and in vitro. Hum Reprod 2013;28: 3271-3282.
5. Del Collado M, Saraiva NZ, Lopes FL, Gaspar RC, Padilha LC, Costa RR, Rossi GF, Vantini R, Garcia JM. Influence of bovine serum albumin and fetal bovine serum supplementation during in vitro maturation on lipid and mitochondrial behaviour in oocytes and lipid accumulation in bovine embryos. Reprod Fertil Dev 2015.
6. Downs SM, Mosey JL, Klinger J. Fatty acid oxidation and meiotic resumption in mouse oocytes. Mol Reprod Dev 2009;76: 844-853.
7. Dumollard R, Duchen M, Carroll J. The role of mitochondrial function in the oocyte and embryo. Curr Top Dev Biol 2007;77: 21-49.
8. Dunning KR, Russell DL, Robker RL. Lipids and oocyte developmental competence: the role of fatty acids and beta-oxidation. Reproduction 2014;148: R15-27.
9. Guzman L, Ortega-Hrepich C, Polyzos NP, Anckaert E, Verheyen G, Coucke W, Devroey P, Tournaye H, Smitz J, De Vos M. A prediction model to select PCOS patients suitable for IVM treatment based on anti-Mullerian hormone and antral follicle count. Hum Reprod 2013;28: 1261-1266.

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102158946B1 (ko) * 2019-12-27 2020-09-23 서울대학교산학협력단 피탄산을 통한 난모세포 내 퍼옥시좀의 역할
CN111548987A (zh) * 2020-05-14 2020-08-18 温氏食品集团股份有限公司 猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用
CN111548987B (zh) * 2020-05-14 2021-07-09 温氏食品集团股份有限公司 猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用
CN114908041A (zh) * 2022-03-31 2022-08-16 北京农学院 用于小鼠卵母细胞体外成熟的培养系统及方法
CN114908041B (zh) * 2022-03-31 2024-04-16 北京农学院 用于小鼠卵母细胞体外成熟的培养系统及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Araújo et al. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review
Paramio et al. Recent advances in in vitro embryo production in small ruminants
Abeydeera et al. Fertilization and subsequent development in vitro of pig oocytes inseminated in a modified tris-buffered medium with frozen-thawed ejaculated spermatozoa
Walker et al. Development of ovine embryos in synthetic oviductal fluid containing amino acids at oviductal fluid concentrations
Trounson et al. Current status of IVM/IVF and embryo culture in humans and farm animals
Funahashi et al. Effects of different serum supplements in maturation medium on meiotic and cytoplasmic maturation of pig oocytes
Songsasen et al. In vitro growth and steroidogenesis of dog follicles are influenced by the physical and hormonal microenvironment
Yoshioka Development and application of a chemically defined medium for the in vitro production of porcine embryos
Kharche et al. Parthenogenesis and activation of mammalian oocytes for in vitro embryo production: A review
Gil et al. Effect of the volume of medium and number of oocytes during in vitro fertilization on embryo development in pigs
Kharche et al. Factors influencing in-vitro embryo production efficiency of caprine oocytes: A review
Barakat et al. Antioxidant effect of green tea leaves extract on in vitro production of sheep embryos.
KR20190052542A (ko) 난자의 체외배양을 위한 난포액 대체용 배지 및 이의 이용
Davachi et al. The effect of conspecific ampulla oviductal epithelial cells during in vitro maturation on oocyte developmental competence and maturation-promoting factor (MPF) activity in sheep
Wang et al. Sonic Hedgehog promotes in vitro oocyte maturation and term development of embryos in Taiwan native goats
Das et al. Supplementation of insulin–transferrin–selenium to embryo culture medium improves the in vitro development of pig embryos
Aghaz et al. Enhanced in vitro developmental competence of sheep embryos following sericin supplementation of the in vitro maturation and in vitro culture media
EP1293561B1 (en) Monkey-origin embryonic stem cells
AU2003208232A1 (en) In vitro maturation of immature human oocytes
CN110577928A (zh) 一种卵母细胞体外成熟培养液及其应用
Mito et al. Transforming growth factor-α in a defined medium during in vitro maturation of porcine oocytes improves their developmental competence and intracellular ultrastructure
Ocampo et al. Effects of culture time, ovarian activity, cumulus cells and sera on the nuclear and cytoplasmic maturation of pig oocytes in vitro
KR101590615B1 (ko) 돼지 정원줄기세포를 체외 배양하기 위한 배양액 조성물 및 배양방법
García-Mengual et al. Oocyte activation procedures and influence of serum on porcine oocyte maturation and subsequent parthenogenetic and nuclear transfer embryo development
KR101107329B1 (ko) 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 포유동물 수정란 대량 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E601 Decision to refuse application