KR101107329B1

KR101107329B1 - 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 포유동물 수정란 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR101107329B1
Application number: KR1020080093739A
Authority: KR
Inventors: 구덕본; 이경광; 김지수; 이규선; 송봉석
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-09-24
Filing date: 2008-09-24
Publication date: 2012-01-20
Also published as: KR20100034542A

Abstract

본 발명은 포유동물 수정란의 배반포 발달률 향상을 위한 체외배양용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 수정란 대량 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 체외배양용 배지 조성물 및 체외수정란 또는 복제수정란 배양시 상기 배지 조성물을 이용하여 질적으로 개선된 포유동물 수정란을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

타우로우루소데옥시콜산, 수정란, 체외배양용 배지, 돼지

Description

타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 포유동물 수정란 대량 생산 방법 {A composition for culturing mammalian embryos and a method for mass production of mammalian embryos using thereof}

본 발명은 포유동물 수정란의 체외배양용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 대량 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포유동물 수정란의 배반포 발달률 향상을 위한 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 체외배양용 배지 조성물, 상기 조성물을 이용한 수정란 체외배양방법 및 질적으로 개선된 수정란의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

전통적으로 포유동물에 사용된 종자개량 방법은 1 개체 간의 교배에 의존하여 우수한 형질을 가진 가축을 육종하는 것으로, 이는 교배시점까지 가축을 성장시켜야 하므로 육종에 장기간 시간이 소요될 뿐만 아니라 그에 따른 개량 속도도 매우 낮은 문제점을 가지고 있었다. 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 우수한 형질을 나타내는 개체로부터 유래된 수정란 이식 기법이 개발되었다.

포유동물 수정란 이식 기법은 종자 개량 및 대량 생산이라는 목적으로 개발되었다. 소 및 돼지의 개량은 지난 30년간 종모우 및 종모돈의 정액을 이용한 인공수정 기법에 의해 수행되었고, 그 결과 우수한 수소의 이용을 통한 개량이 진행되었으나 우수한 암소의 능력은 가축 개량에 이용되지 못함으로 인해 개량 속도가 상당 부분 지연되었다. 그러나, 포유동물 수정란 이식기술을 이용하게 되면 인공수정 기술보다 개량 속도가 약 3배 이상 빠르고, 특히 우량 송아지 및 우량 돼지를 조기에 대량 생산이 가능하다. 이미 선진국에서는 우량 종축 생산에 포유동물 수정란 이식기술을 이용하고 있다.

현재까지 포유동물 체외수정란 생산은 암소에 성선자극호르몬을 투여하여 난자의 다배란을 유도한 다음 비외과적 방법으로 채란하여 신선한 상태로 수정란을 이식하거나 또는 동결 보존 방법을 사용하여 왔다. 상기 기법은 우량한 유전능력의 수정란을 생산할 수 있는 장점이 있으나, 높은 생산원가와 개체의 차이로 다량의 수정란 생산에 문제가 있어 실용화에 주요한 걸림돌이 되어왔다.

포유동물의 수정란을 체외에서 배양할 수 있다는 것은 가축 등의 포유동물 증식 및 개량에 있어서 매우 유용한 기술이 된다. 특히 최근에는 동물 형질전환기술 및 복제동물 생산 기술의 유용성이 전 세계적으로 인정되면서 포유동물의 수정란을 체외에서 조작하는 것이 필수적인 과정이 되었다. 상기 체외조작은 체외배양을 전제로 하여 이루어지는 과정이기에, 보다 간편하고 안정적인 체외배양기법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히, 포유동물 수정란 생산율을 증대시킬 수 있는 배양 조건을 확립하고자 다양한 연구들이 진행되어 왔다. 많은 연구자들이 산소의 농도, 난구세포의 유무, 난자의 크기 차이에 따른 배 발달률 조사를 수행하였는데, 이는 배양이 되는 외부 환경 차이에 따라서도 배 발생률의 차이가 나기에 적합한 조건을 확립하고자 하는데 그 목적이 있다(Khurana, NK. and Niemann, H., Theriogenology. 15;54 (5):741-756, 2000). 돼지 난소피질 세포를 이용하여 공배양 동안에 체외 성숙률과 수정률, 발달률을 조사한 실험이 수행되었다(Xiao-Yu Cheh. Effect of ovarian cortex cell co-culture during in vitro maturation on porcine oocytes maturation, fertilization and embryo development. Animal Reproduction Science, 2006 January 22; 11-22).

수정란의 발달률을 높이기 위해 첨가되는 수많은 인자들이 있겠지만 체외수정란 생산에 있어서 각각의 단계에 첨가되는 물질들은 각기 다를 것이다. 또한 여러 가지 배양방법 및 배양액의 각각의 물질들에 대한 여러 가지 실험들이 수행되었다. 성숙시기에 헥소시스(glucose, fructose, galactose)를 배양액에 첨가해 돼지 수정란의 배 발달률을 향상시키는 실험이 수행되었다(Wongsrikeao P. et al ., Effect of hexoses on in vitro oocyte maturation and embryo development in pigs. Theriogenlogy. 2006 January;(65):332-343). 이에 따라, 각각의 단계에서 첨가되는 물질들에 대한 하기와 같은 여러 가지 방법들이 수행되었다. 성숙시기에 재조합된 인간성장 호르몬(recombinant human growth hormone)을 배양액에 첨가해 배 발달률을 향상시키는 방법(Pozzobon, SE. et al ., Reprod Domest Anim . 40(1):19-22, 2005), 소의 난소에서 채취된 난포액을 첨가하여 배 발달률을 조사하는 방법(Ali, A., et al., Theriogenology. 62(9):1596-1606, 2004), 체외 배양단계에서 배 발달률을 향상시키기 위해 쥐의 태아세포와 공배양함으로써 수정란의 발달률을 향상시키는 방법(Park, JS. et al ., Anim . Repord. Sci . 59:13-22, 2000), hLIF(Human leukemia inhibitory factor) 처리를 통한 상실기배와 배반포기의 배 생산 방법(Kaye, PL. and Harvey MB. Prog . Growth Factor Res . 6:1-24, 1995), 수정란에 레티놀(retinol)을 첨가하여 발달률을 증가시키는 방법(Livingston, T. et al., Reprod Biol Endocrinol. 21;2(1):83, 2004) 및 인슐린(Insulin)을 첨가하여 발달률을 향상시키는 방법(Augustin, R. Reproduction 126,91-99, 2003) 등이 있다. 또한, 발달 시기가 다른 배반포를 이식함으로써, 얻어지는 산자의 생산율도 변한다는 것을 확인하는 연구도 있었는데, 발달시기가 빠른 배반포기를 이식할수록 높은 산자생산율을 얻을 수 있음이 확인되었다(Kubisch, HM., et al ., Reprod Domest Anim . 39:120-124, 2004).

또한, 일반적으로 체외에서 수정된 정상적인 수정란이 형질전환용 포유동물의 자궁저부에 착상하기 위해서는 수정후 착상전에 충분한 난분할을 지속하여 배반포기에 이르러야 하는데, 이는 배반포의 세포막인 영양막(trophoblast)의 노출된 세포 내에만 자궁저부의 세포에 착상하는데 필요한 단백질 효소를 충분히 함유하고 있기 때문이다. 그러나, 체외수정된 수정란은 4 내지 8세포 주기에 이르면 그 난분열을 멈추게 되어 형질전환용 동물의 자궁저부에 착상이 불가능하게 된다. 그러므로, 수정란 체외배양시 수정란 배반포의 발달률을 증대시켜 세포 내 영양막 세포의 확보가 중요하다.

그러나 상기와 같은 많은 연구들에도 불구하고, 수정란의 체외배양환경을 최적화시켜 배반포 발달률을 증대시키는 미지의 발달 인자들이 완전하게 밝혀지지 않은 상태이다. 그러므로, 보다 개선된 수정란 배양조건을 확립하여 배반포 발달률이 향상된 수정란을 대량생산하는 방법이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 타우로우루소데옥시콜산을 체외수정란 배양 배지에 처리한 경우, 수정란의 배반포기 발달률이 증대되고 내부세포괴 및 영양막 세포수가 증가할 뿐만 아니라, 수정란의 세포사멸이 억제되어 세포사멸이 일어나는 배반포가 양적으로 감소된다는 것을 밝힘으로써, 타우로우루소데옥시콜산을 질적으로 개선된 수정란의 대량 생산에 이용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 포유동물 수정란의 체외배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 체외배양용 배지 조성물에서 포유동물 수정란을 배양하는 단계를 포함하는 수정란의 체외배양방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 체외배양용 배지 조성물을 이용한 포유동물 체외수정란의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포유동물 수정란의 체외 배양에 있어서, 기본 배지에 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 것을 특징으로 하는 체외 배양용 배지 및 이를 이용한 수정란의 배반포 발달률이 증대되도록 하는 수정란 체외배양방법을 제공한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 포유동물 수정란의 체외배양용 배지 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "체외배양"이란 수정란이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내 자궁의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것으로, 본 발명의 배지 조성물은 이러한 체외배양에 최적화된 배지 조성물이다.

본 발명의 배지 조성물을 적용시킬 수 있는 포유동물 수정란은 인간을 제외한 포유동물의 수정란, 바람직하게는 가축, 더욱 바람직하게는 돼지 또는 소의 수정란이다. 또한, 체외에서 배양될 수 있는 수정란이라면, 특별히 제한되지 않으나, 체외배양시 배발생정지현상을 보이는 수정란을 대상으로 할 수 있으며, 체외수정란 또는 복제수정란 모두에 적용이 가능하고, 바람직하게는 초기 성숙란을 수정시켜 만든 체외수정란을 대상으로 할 수 있다. 여기서 "체외 수정란"이란 난자와 정자를 채취하여 체외에서 수정시킨 것을 말하고, "복제 수정란"은 체세포 공여핵을 유전물질이 제거된 수핵 난자에 주입한 후 물리적 또는 화학적 방법으로 융합시킨 것을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 "타우로우루소데옥시콜산 (tauroursodeoxycholic acid, TUDCA)"은 담즙산의 일종이며 우로소데옥시콜린산의 유사체로서 간경변 치료에 이용될 수 있음이 알려져 있다. 본 발명의 배지 조성물에 포함되는 타우로우루소데옥시콜산은 수정란에 대해 동등한 작용을 나타내는 한, 이들 화합물뿐만 아니라, 이의 염 또는 이의 유도체를 사용할 수 있으며, 타우로우루소데옥시콜산은 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있다.

본 발명에 따른 배지 조성물은 타우로우루소데옥시콜산을 10 내지 300μM 농도로 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 돼지 수정란의 경우에는 150 내지 250μM, 가장 바람직하게는 200μM, 소 수정란의 경우에는 10 내지 100μM, 가장 바람직하게는 50μM로 포함할 수 있다.

본 발명의 배지 조성물은 타우로우루소데옥시콜산을 통상적인 포유동물 수정란 배양에 이용되는 기본 배지에 첨가시켜 이용할 수 있다. 본 발명에서 "기본 배지"는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민(BSA) 및 보조인자 등을 기본적으로 포함하는 포유동물 초기 배아세포 배양용 배지로서, 당업자들에게 잘 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다. 특히 바람직하게, 상기 배지는 무기염류로서 NaCl, KCl 및 NaHCO₃ 등을 포함하고, 탄소원으로서 글루코즈, 나트륨 피루베이트 및 젖산칼슘염 등을 포함하며, 아미노산으로서 글루타민을 비롯한 필수아미노산 및 비필수아미노산을 포함하며, 보조인자로서 기타 미량원소 및 완충액 등을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배지는 또한 항생제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예로서 상기 기본 배지로는 포유동물세포 배양용으로 공지되어 상업화된 여러 배지, 예를 들어, NCSU-23 (North Carolina State University medium; Petters and Wells, J. Reprod. Fert., Suppl. 48:61-73., 1993), CR1-aa (Rosenkrans, CF Jr., et al., Biol. Reprod., 49(3);459-462, 1993), TCM(tissue culture medium of medium199, Gibro, USA; Yue, C., et al ., Development , 121:2645-2654, 1995), CZB (Chatot -Ziomek-Bavister medium; Chatot, C.L., et al ., J. Reprod . Fert ., 86:679-688, 1989) 등을 그대로 사용할 수 있으며, 돼지의 경우 NCSU-23, 소의 경우 CR1-aa를 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 포유동물 수정란의 체외배양용 배지 조성물은 수정란 배반포의 세포사멸(apoptosis) 억제활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 세포사멸 억제활성은 Bax 유전자 발현 감소 또는 Bcl-xl 유전자 발현 증가에 의해 달성될 수 있다.

본 발명에서 용어 "배반포"는 수정란이 난할을 거듭하여 자라는 과정에서 치밀화된 상실배 이후에 배반포강을 형성하여 태아로 분화할 내세포괴(inner cell mass)와 태반으로 분화할 영양막세포(trophectoderm)로 구분이 될 정도로 발육된 상태의 수정란을 의미한다.

체외수정란이 자궁에 착상하기 위해서는 배반포의 세포막인 영양막 세포에 존재하는 착상관련 단백질 효소가 필요한데, 통상적인 체외수정란이 난분열을 조기에 멈추게되어 착상이 어렵게 되므로, 수정란의 배반포 세포사멸을 억제시킴으로써 발달을 증대시키고, 세포 내 영양막 세포를 확보하면, 좀 더 용이하게 자궁 착상이 유도될 수 있게 된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기와 같은 본 발명의 체외배양용 배지 조성물에서 포유동물 수정란을 배양하는 단계를 포함하는 수정란의 체외배양방법에 관한 것이다.

본 발명의 수정란 체외배양방법은 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 포유동물 수정란의 체외배양용 배지 조성물에서 포유동물의 수정란을 배양시켜 수정란의 배반포기 발달률을 증대시킴으로써, 수정란 이식이 용이하도록 개선되도록 할 수 있다. 본 발명의 체외배양방법을 통해 배양될 수 있는 포유동물 수정란은 체외에서 배양될 수 있는 수정란이라면, 특별히 제한되지 않으나, 체외배양시 배발생정지현상을 보이는 수정란을 대상으로 할 수 있으며, 체외수정란 또는 복제수정란 모두 가능하다. 또한 이러한 체외배양방법은 특히 체외수정란의 대량생산에 이용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 체외배양용 배지 조성물을 이용한 포유동물 체외수정란의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로 1) 인간을 제외한 포유동물로부터 난포란을 채취하는 단계; 2) 단계 1에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계; 3) 상기 회수된 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계; 4) 단계 3에서 성숙된 난자와 정자를 체외 수정시키는 단계; 및 5) 단계 4에서 제작된 체외수정란을 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 포유동물 체외수정란의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 이러한 대량 생산 방법의 일련의 과정을 도 2에 도시하였다.

본 발명의 상기 체외수정란의 대량 생산 방법에서 사용되는 상기 배지는 상기에서 상술한 바와 같이, 공지의 기본 배지에 타우로우루소데옥시콜산을 포함시킨 배지이다. 타우로우루소데옥시콜산의 배지 내 농도는 돼지의 경우 100μM 에서 300μM 농도이고, 소의 경우 10μM 에서 100μM 농도가 바람직하다.

또한, 본 발명의 포유동물 수정란의 체외배양방법 및 포유동물 체외수정란의 대량 생산 방법에서 수정란의 배양시간은 수정란이 배반포기 상태로 충분히 발달될 정도이면, 특별히 제한되지 않으나, 돼지의 경우에는 타우로우루소데옥시콜산 및 0.4% BSA를 포함한 NCSU-23 배지에서 약 6일간 배양하는 것이 바람직하고, 소의 경우에는 타우로우루소옥시콜산 및 0.3% BSA를 포함한 CR1-aa 배지에서 3일간 배양한 후, 타우로우루소옥시콜산, 10% FBS를 포함한 CR1-aa 배지에서 4일간 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 돼지 및 소 난소로부터 미성숙 난자를 회수하여 체외 성숙시키고 수정시켜 체외 수정란을 준비하였다. 돼지 체외 수정란의 경우, 회수한 난자를 약 44시간 동안 성숙 배양시키며 소의 체외 수정란의 경우, 회수한 난자를 약 22시간 동안 성숙 배양시킨 후, 제 1 극체가 방출되는 성숙 난자를 준비하였다. 이후 동결된 정액을 해동시켜 수정배양액 상에서 체외 수정시켰다. 이렇게 준비한 체외 수정란을 배양한 후 배반포기의 배를 각 발육 단계별로 회수하여 발생률을 체크하였다.

본 발명자들은 타우로우루소데옥시콜산이 돼지 및 소 체외 수정란의 배 발달 및 세포괴사에 미치는 영향을 조사하였다. 돼지 수정란에서 타우로우루소데옥시콜산을 농도별로 첨가하여 체외 배양 6일째 형성된 배반포를 확인한 결과 대조군(22.2%)에 비해서 200μM 처리군(32.8%)에서 배반포로의 발달률이 향상됨을 확인하였다(표 1 참조). 마찬가지로 타우로우루소데옥시콜산이 소 체외 수정란의 발달에 미치는 영향을 조사하였다. 조사 결과 대조군 (21.9%)에 비해 50μM 처리군(34.3%)에서 배반포 형성 정도가 증가됨을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 돼지 및 소 체외 수정란 유래 배반포를 대상으로 이중 염색을 통하여 타우로우루소데옥시콜산 처리군에서 체외 수정란의 질적 향상 여부를 조사하였다. 이중 염색시 내세포괴(inner cell mass)는 푸른색으로 영양막(trophoblast)은 붉은 색으로 염색되므로 전체 세포수와 내세포괴 및 영양막 세포수를 측정하였다. 그 결과, 돼지 체외 수정란의 경우 대조군의 전체세포수는 평균 35.6개로 조사 되었으며, 타우로우루소데옥시콜산 처리군에서는 전체 세포수가 39.5개로 대조군보다 높게 관찰되었다(표 3 참조). 또한, 소 체외 수정란의 경우 대조군의 전체 세포수는 평균 81.8개로 조사되었으며 처리군에서 103.5개로 대조군에 비해 전체 세포수가 증가함을 확인할 수 있었다(표 4 참조). 이를 통해 타우로 우루소데옥시콜산이 배반포의 전체 세포수 및 영양막 세포수를 증가시켜 체외 수정란의 질적 측면을 개선시킨다는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 배반포를 이용한 또 다른 질적 측면을 조사하기 위해 세포사멸을 확인하였다. 이는 세포사멸이 일어난 부분의 형광염색을 이용하여 타우로우루소데옥시콜산을 처리한 배반포의 질적 측면에 미치는 효과를 조사하였다. 이중 염색시 세포사멸(TUNEL)는 녹색으로, 핵(Nuclear)은 붉은 색으로 염색되므로, 정확히 핵에서 세포사멸이 일어나면 노란색으로 보이며 이것을 계수하여 확인하였다. 이 결과 돼지의 경우 타우로우루소데옥시콜산을 체외 배양액에 처리후 6일째 배반포를 염색하여 확인하였을 때 대조군에서는 평균 6개의 세포괴사수를 보이는 반면 처리군에서는 평균 3.2개의 세포사멸 수를 확인 할 수 있었다(표 5 참조). 또한 소의 배반포를 조사한 결과, 대조군에서는 평균 6.2개를 확인하였으며 실험군에서는 평균 4.4개로 확인되었다(표 6 참조). 이를 통해 타우로우루소데옥시콜산을 체외 배양액에 처리함으로써 수정란 배반포의 세포사멸을 완화시켜 질적으로 향상된 배반포를 얻을 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 체외배양용 배지 조성물은 체외수정란의 배반포 발달률을 증대시키고, 수정란 세포의 세포사멸을 억제시켜 내부세포괴 영양막 세포를 포함한 전체 세포수를 증가시킴으로써 배양된 포유동물 수정란을 질적으로 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 돼지 및 소의 난포란의 체외 성숙

1-1. 돼지 및 소 체외성숙 난포란의 준비

도축장에서 암퇘지 및 암소의 난소를 적출 후 25℃, 0.9% 생리식염수에 보관하여 실험실로 옮긴 다음, 18 게이지 주사기를 사용하여 직경 2 ~ 6 mm 난포로부터 난포란을 회수하였고, 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 TL-Hepes 배양액(Voelkel, S.A., and Hue, Y.X. Theriogenology 37:1117-1131, 1992)에 희석하여 실체 현미경(SZ60, OLYMPUS, JAPAN) 하에서 미성숙 난포란을 선별하였다. 선별 기준은 세포질이 고루 분포하고 3겹 이상의 난구세포층이 치밀하게 붙어있는 미성숙 난포란이다.

상기 선별한 미성숙 난포란의 체외성숙 시 소는 10% 소 태아 혈청이 함유된 TCM-199 배양액(Gibro, USA; Yue, C., et al ., Development 121:2645-2654, 1995)에 1㎍/㎖ 에스트라디올(estradiol; Sigma, USA)과 1㎍/㎖ FSH-P(Schering-Plough Animal Health, USA)를 첨가하여 사용하며 4 웰 디쉬에 한 웰 당 500㎕씩 분주하여 38.5℃, 5% CO₂ 배양기에서 22시간 배양하였다. 돼지의 경우에는 NCSU-23 배양액에 10% 돼지 난포액을 첨가하고 1㎍/㎖ 에스트라디올(estradiol; Sigma, USA)과 임마혈청성 성선자극호르몬(PMSG; Sigma, USA) 및 임부태반융모성 성선자극호르몬(hCG; Sigma, USA)를 각각 1㎍/㎖ 를 첨가하여 22시간 동안 성숙시킨 후 호르몬이 제거된 NCSU-23 배양액에서 추가적으로 22시간 동안 50개씩의 난포란을 4 웰 디쉬에 한 웰 당 500㎕씩 분주하여 39℃, 5% CO₂ 배양기에서 체외성숙을 유도하였다.

실시예 2. 돼지 및 소 체외 수정란 생산

2-1. 돼지 체외 수정란 준비

상기 실시예 1에서 44시간 동안 체외 성숙된 난자를 체외 수정용 mTBM(modified Tris-buffered medium)에 0.1% 소 혈청 알부민(BSA: Bovine Albumin Serum, Sigma, USA)이 첨가된 용액으로 3회 세척 후 48㎕ 소적(medium droplets)당 15개씩의 난자를 첨가하여 준비하였다.

냉장 16℃에서 보관된 돼지의 액상정액을 정자 세척액(0.1% BSA가 함유된 PBS)과 각각 7ml씩 섞은 후 2,000 rpm, 3분간 3회 원심분리하여 세척을 실시하였다. 이후 활력이 뛰어난 정자만을 분리하기 위해 다시 정자 세척액 2ml을 정자 위에 올리고 15분 후 상층액을 회수하여 1,000 rpm, 2분간 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후 침지한 정자만을 회수하여 체외 수정용 mTBM 배양액에 희석시켜 난자 15개씩 들어있는 소적(medium droplets)당 1.2×10⁵/ml의 농도로 주입하여 6시 간 동안 공배양에 의해 체외 수정을 유도하였다.

2-2. 소 체외 수정란 준비

실시예 1에서 22시간 동안 체외 성숙된 난자는 0.6% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma, USA)과 10 ㎍/㎖ 헤파린(heparin, Sigma, USA)이 함유된 체외 수정용 Fert-TALP (http://www.specialtymedia.com/5Resources/ Protocols/ivfprotocol.htm)으로 3회 세척 후, 44㎕ 소적(medium droplets)당 15개씩을 첨가하여 준비하였다.

액체질소에서 보관된 소의 동결 정액이 든 관(straw)을 공기 중에서 10초간 방치 후 37℃ 항온수조에서 20초간 해동시켰다. 해동된 정액을 37℃로 보관된 90%와 45%의 농도 구배된 퍼콜(percoll, Sigma, USA) 용액 위에 올리고 2,000 rpm, 20분간 원심분리하여 정자와 그 외의 부분과 분리하였다. 이후 정자만을 분리하기 위하여 피펫을 이용하여 퍼콜 용액을 제거한 후, 정자를 세척할 수 있는 Sp-TALP(sperm-Tyrode's medium with albumin, lactate and pyruvate: http://www.specialtymedia.com /05Resources/Protocols/ ivfprotocol. htm) 5㎖의 용액에 가라앉은 정자 50㎕를 첨가하여 1,000 rpm, 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 침지한 정자만을 회수하여 난자 15개씩 들어있는 소적(medium droplets)당 1×10⁶/ml 농도로 주입하여 20시간 동안 공배양에 의해 체외수정을 유도하였다.

실시예 3. 돼지 및 소 체외 수정란 배발달 조사

3-1. 돼지 배반포로의 발달률 조사

상기 실시예 2-1에서 제작한 돼지 체외수정란을 타우로우루소데옥시콜산이 100μM 에서 300μM 함유되고 0.4% 소 혈청 알부민(BSA)이 첨가된 NCSU-23 배양액에 6일 동안 39℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 수정 7일 후에 배반포기 형성이 관찰되었으며, 표 1과 같은 체외 발달률을 확인하였다.

하기 표 1에서 보는 바와 같이, 타우로우루소데옥시콜산(200μM)이 처리된 배양액에서 돼지 수정란이 배반포기까지의 발달률이 32.8%로 관찰되는 반면, 처리하지 않은 대조군에서는 22.2%의 발달률이 확인되었다. 표 1에서 타우로우루소데옥시콜산을 각각 100μM, 200μM 및 300μM 농도로 처리하면 발달률이 증가하는 것으로 관찰되었으나 200μM에서 가장 좋은 결과를 관찰할 수 있었다. 상기 결과는 통계처리프로그램 (SAS: Statistical Analysis System)에 의해 두 실험의 결과가 유의적 차이가 있음을 보여 주었다. 이를 통해 타우로우루소데옥시콜산(200μM)이 체외수정란의 발달을 증진시키는 효과를 확인하였다.

타우로우루소옥시콜산 처리 농도에 따른 체외 돼지 수정란에 발달에 미치는 영향

구분(처리농도별)	사용된 난자 수	난할된 난자 수	평균 배반포율 ± 표준편차(수)
대조군	144	114	22.2±2.5^a(32)
실험군(100μM)	140	111	26.2±3.9^ab(37)
실험군(200μM)	149	126	32.8±4.5^b(49)
실험군(300μM)	145	118	23.3±3.6^ab(34)

^ab P<0.05

3-2. 소 배반포로의 발달률 조사

상기 실시예 2-2 에서 제작한 체외 수정란을 0.3% 소혈청 알부민(BSA) 및 타우로우루소데옥시콜산(TUDCA 0, 10, 50, 100μM)이 첨가된 CR1-aa 배양액에서 배양하였다. 3일 동안 배양 후, 분열된 수정란들을 상기와 동일한 조건으로 CR1aa-FBS(10% FBS: Fetal Bovine Serum 첨가) 용액에서 4일 동안 38.5℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 수정 7일 후에 배반포기 배의 형성이 관찰되었으며, 표 2와 같은 체외 발달률을 확인하였다.

하기 표 2에서 보는 바와 같이, 타우로우루소데옥시콜산(50μM)이 처리된 배양액에서 배양된 수정란이 배반포기까지의 발달률이 34.4%로 관찰된 반면, 처리하지 않은 대조군에서는 21.9%의 발달률이 관찰되었다. 상기 결과는 통계처리프로그램(SAS: Statistical Analysis System)에 의해 두 실험의 결과가 유의적 차이가 있음을 확인하였다. 이를 통해 타우로우루소데옥시콜산(50μM)이 소 체외 수정란의 배 발달 또한 증진시키는 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

타우로우루소옥시콜산 처리 농도에 따른 체외 소 수정란에 발달에 미치는 영향

구분(처리농도별)	사용된 난자 수	평균 난할률 ± 표준편차	평균 배반포율 ± 표준편차
대조군	117	76.7± 2.7	21.9± 2.4^a
실험군(10μM)	120	80.7± 3.1	20.2± 3.7^a
실험군(50μM)	123	80.7± 2.5	34.3± 2.4^b
실험군(100μM)	120	81.5± 3.3	19.1± 2.9^a

^ab P<0.05

실시예 4. 돼지 및 소 체외수정란 유래 배반포의 내부세포괴 및 영양막 세포 수 조사

4-1. 돼지 및 소 배반포의 내부세포괴 및 영양막 세포 수 비교

돼지 및 소 체외 수정란을 각각의 배양액에서 6일 또는 7일 동안 배양한 후 배반포로 발달한 배만을 선별해 이중염색법을 통해 내부세포괴(inner cell mass : 이하 ICM이라 칭함)와 영양막(trophoblast : 이하 TE라 칭함)의 세포수를 조사하여 질적인 측면에서 조사하였다. 각각의 배반포기의 배는 0.5% 프로나아제(pronase)에 1분간 처리하여 투명대를 제거하였다. 처리 후 1㎎/㎖ 폴리비닐 알코올(PVA)이 함유된 PBS 용액을 이용하여 3회 세척하였다. 투명대가 제거된 배를 TL-Hepes(Tyrodes lactate)와 1:5의 비율로 희석된 항 돼지 전체 혈청(anti-pig whole serum)을 이용하여 38.5℃, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 처리하였다. 이후 처리된 배를 PBA-PBS 완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 상기 배를 10㎍/㎖ PI(propidium iodide), 10㎍/㎖ 비스벤즈아미드(bisbenzimide)와 기니아 피그 보체(guinea pig complement)가 함유된 TL-Hepes 배양액과 1:5의 비율로 희석된 완충액에서 1시간 동안 처리하였다. 1 시간 동안 처리된 배반포를 0.1% PVA-PBS 완충용액으로 3회 이상 세척한 후 형광현미경 하에서 세포 수를 조사하였다. ICM은 푸른색으로 염색되며 TE는 붉은 색으로 염색이 된다. 조사된 각각의 세포 수의 결과를 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.

돼지 체외 수정란 유래 배반포

하기 표 3은 돼지 체외 수정란을 타우로우루소데옥시콜산이 첨가된 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포와 일반 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포의 ICM과 TE 세포의 세포 수를 조사한 결과이다. 하기의 결과와 같이, 돼지 배반포에서 세포 수의 증가를 가져왔다. 타우로우루소데옥시콜산을 처리한 실험군(200μM)에서는 세포 수가 39.5±0.9개로 처리하지 않은 대조군 35.6±1.9 개에 비해 평균 4개 정도의 세포수를 증가시키는 것을 확인하였다. 이를 통해 돼지 수정란의 문제점이었던 비정상적인 세포수가 타우로우루소옥시콜산의 첨가를 통해 세포 수를 증가시킴으로써 배반포의 질적 개선이 이루어짐을 확인하였다.

타우로우루소옥시콜산 처리농도에 따른 체외 돼지 수정란에 질적 향상에 미치는 영향

구분 (처리농도별)	사용된 배반포 수	세포 수
구분 (처리농도별)	사용된 배반포 수	평균 내부세포 ± 표준편차	평균 영양막 세포 ± 표준편차	평균 전체 세포 ± 표준편차
대조군	32	4.7±1.0	30.8±1.4	35.6±1.9^a
실험군(100μM)	37	5.4±1.6	32.9±1.4	38.3±2.6^ab
실험군(200μM)	49	6.4±0.4	33.0±0.5	39.5±0.9^b
실험군(300μM)	34	4.9±1.1	30.7±1.1	35.6±2.2^ab

^ab P<0.05

소 체외수정란 유래 배반포

하기 표 4는 소 체외 수정란을 타우로우루소데옥시콜산 (50 μM)이 첨가된 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포와 일반 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포의 ICM, TE 및 전체 세포 수를 조사한 결과를 나타낸 것이다. 타우로우루소데옥시콜산(50 μM)이 첨가된 배양액에서 생산된 배반포의 세포 수는 평균 103.5±5.2개로 관찰되었고, 대조군 배반포의 세포 수는 평균 81.8±5.3 개로 관찰되었다. 돼지에서와 마찬가지로 처리군에서 배반포의 전체 세포 수가 증가함을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 배양액에 타우로우루소데옥시콜산(50μM)을 첨가함으로써 배반포의 질적 수준이 증가되었음을 알 수 있었다.

타우로우루소옥시콜산 처리농도에 따른 체외 소 수정란에 질적 향상에 미치는 영향

구분 (처리농도별)	사용된 배반포 수	세포 수
구분 (처리농도별)	사용된 배반포 수	평균 내부세포 ± 표준편차	평균 영양막 세포 ± 표준편차	평균 전체 세포 ± 표준편차
대조군	14	38.6± 4.1	43.2± 4.3^a	81.8± 5.3^a
실험군(50μM)	15	44.5± 3.8	59.0± 4.6^b	103.5± 5.2^b

^ab P<0.05

실시예 5. 돼지 및 소 체외 수정란 유래 배반포에서 세포사멸 조사

5-1. 돼지 및 소 배반포에서 세포사멸 조사

돼지 및 소 체외 수정란을 각각의 배양액에서 6일 또는 7일 동안 배양한 후 배반포가 형성된 배를 선별해 TUNEL(Terminal uridine deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)이라는 세포사멸 염색을 통해 전체 세포 수에서 세포사멸이 일어난 세포의 수를 조사하였다.

각각의 배반포기의 배를 PVA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척한 후 PVA-PBS 완충용액에 4% Paraformaldehyde가 첨가된 고정액을 이용하여 1시간 동안 실온에서 보관한 후 PVA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 세정된 배반포를 PVA-PBS 완충용액에 Triton X-100이 0.5% 첨가된 침투 용액을 이용하여 38.5℃, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 배양하고 PVA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 다시 항체반응을 확인하기 위해 TUNEL assay kit을 이용 하는데 이때 38.5℃, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 배양한 후 세포사멸이 일어나는 부분은 녹색으로 염색되며 다시 PVA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 이후에 전체 세포수를 확인하고 세포에 정확하게 세포사멸이 일치하는지 확인하기 위해 핵 염색을 하는데 이때 PI(propidium iodide)를 이용하여 38.5℃, 5% CO₂ 조건에서 1시간동안 배양한 후 확인하였으며 빨강색으로 염색 된다. 이후 PVA-PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하고 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 형광 현미경에서 빨강색으로 관찰되는 부분은 세포이며 녹색으로 관찰되는 부분은 세포괴사가 일어난 부분이다. 이것을 한 장에 사진으로 겹쳐서 확인할 때 정확하게 일치하는 부분은 색의 혼합에 의해 노란색으로 나타난다.

돼지 체외 수정란 세포사멸 형광염색 조사

하기 표 5는 돼지 체외 수정란을 타우로우루소데옥시콜산이 첨가된 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포와 일반 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포의 세포사멸 수를 조사한 결과를 나타낸 것이다. 하기의 결과와 같이, 타우로우루소데옥시콜산이 첨가되지 않은 군에서 생산된 배반포의 세포사멸 수가 증가됨을 알 수 있었다. 타우로우루소데옥시콜산을 처리한 실험군(200μM)에서는 3.2±0.5개로 나타났으며 처리하지 않은 대조군 6.0±0.4개에 비해 평균 3개 정도의 세포사멸 수가 감소됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해 돼지 수정란의 문제점이었던 배반포에서 많이 일어나는 세포사멸 수가 타우로우루소데옥시콜산의 첨가를 통해 완화됨으로써 배반포의 질적 개선이 이루어짐을 확인하였다.

타우로우루소옥시콜산 처리 가 체외 돼지 수정란 유래 배반포의 세포사멸에 미치는 영향

구분 (처리농도)	사용된 난자 수	평균 배반포율 ±표준편차(수)	세포사멸 수
구분 (처리농도)	사용된 난자 수	평균 배반포율 ±표준편차(수)	평균 전체 세포 ± 표준편차	평균 세포사멸 ± 표준편차
대조군	150	22.0± 0.9^a (33)	31.9± 2.1	6.0± 0.4^a
실험군(200μM)	155	31.0± 0.5^b (48)	36.9± 2.5	3.2± 0.5^b

^ab P<0.05

소 체외 수정란 세포사멸 형광염색 조사

하기 표 6은 소 체외 수정란을 타우로우루소데옥시콜산이 첨가된 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포와 일반 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포의 세포사멸 수를 조사한 결과를 나타낸 것이다. 하기의 결과와 같이, 타우로우루소데옥시콜산이 첨가되지 않은 군의 소 배반포에서 세포사멸 수가 증가되었다. 타우로우루소데옥시콜산을 처리한 실험군(50μM)에서는 4.1±1.3개로, 처리하지 않은 대조군 6.2±2.0개에 비해 평균 2개의 세포사멸 수가 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 이를 통해 소 배반포에서 일어나는 세포사멸 수가 타우로우루소데옥시콜산의 첨가를 통해 완화됨으로써 배반포의 질적 개선이 이루어짐을 확인하였다.

타우로우루소옥시콜산 처리 가 체외 소 수정란 유래 배반포의 세포사멸에 미치는 영향

구분 (처리농도)	사용된 배반포 수	평균 전체 세포 수 ± 표준편차	평균 세포사멸 수 ± 표준편차
대조군	18	87.9± 4.6^a	6.2± 2.0^a
실험군(50μM)	17	107.0± 6.2^b	4.4± 1.3^b

^ab P<0.05

5-2. 돼지 배반포에서 정량적 PCR 을 이용한 세포사멸 관련 유전자의 발현 조사

돼지 체외 수정란을 각각의 배양액에서 6일 동안 배양한 후 배반포로 발달한 배를 선별해 Real-Time RT-PCR이라는 정량적 중합효소반응법이라는 실험방법을 이용하여 세포사멸에 관련된 유전자의 발현을 확인하는 방법이다. 중합효소반응법에 의해 배반포에 함유되어 있는 mRNA를 이용하여 원하는 유전자의 특정 영역을 시험관내에서 대량으로 증폭하여 확인하는 기술이며 이런 방법은 여러 분야에서 이용되고 있다. 각 처리군의 배반포를 회수하여 배반포내의 messenger RNA(mRNA)를 이용하여 상보적 DNA(complementary DNA)를 합성한 후 중합효소반응에 사용하였으며, 조사하고자 하는 유전자는 각각의 프라이머를 설계하여 SYBR Green과 반응시켜 실시간 중합효소반응 (Real-Time RT-PCR) 기계로 유전자의 발현양을 상대적 비교방법에 의해 결과를 분석하였다.

유전자는 세포사멸에 관련되어 있는 두 가지의 유전자를 이용하여 확인하였는데 Bax와 Bcl-xl 이다. 유전자는 미국국립보건원 유전자은행에 등록되어있는 유전자 사용 하였다. Bax 유전자는 세포사멸에 관련되어 있는 유전자로서 세포사멸을 유도하는 유전자이며 Bcl-xl은 세포사멸을 억제하는 유전자이다.

Bax (genebank number : AJ001204) 유전자의 프라이머 서열은 순방형으로는 F’-GGCACAAATCTGATGTTTGCA (서열번호 1), 역방향으로는 R’-TGGTTCTTTCCCTTAGTGAAAGC (서열번호 2)이다. Bcl-xl(genebank number : AF216205) 유전자의 프라이머 서열은 순방향 F’-GAAACCCCTAGTGCCATCAA (서열번호 3), 역방향 R’-GGGACGTCAGGTCACTGAAT (서열번호 4)이다. 또한, 두 개의 서로 다른 배반포에서의 유전자가 동일한량이 존재하여야 함으로 동일한량의 유전자가 존재하는지 확인하기 위해 β-actin (genebank number : U07786) 유전자를 사용하였으며 프라이머 서열은 순방향 F’-GGTAAGGCTGGGAAGGACTC (서열번호 5), 역방향은 R’-CGGTGAGGTACTCCAGGATG (서열번호 6)이다. 프라이머 서열을 설계하기 위해서 바이오니아 라는 사이트를 사용하였으며 반응온도는 60℃로 하여 실험하였다(Mol Reprod Dev. 2007 Dec;74(12):1557-67).

돼지 체외 수정란에서 세포사멸 관련 유전자 발현 양상 분석

하기 도 6에서 돼지 체외 수정란을 타우로우루소데옥시콜산이 첨가된 배양액에서 발달한 배반포와 일반 배양액에서 발달한 배반포의 세포사멸 관련 유전자의 발현을 조사한 결과를 나타낸 것이다. 하기 결과와 같이 2개의 서로 다른 세포사멸에 관련된 유전자를 조사하였다. 유전자중 Bax라고 알려진 유전자는 세포사멸이가 일어나면 강하게 발현하는 유전자로써 도 6에서 보면 타우로우루소데옥시콜산이 첨가한 군의 배반포에서 보다 처리하지 않은 군의 배반포에서의 Bax 유전자의 발현이 높게 나타난 것을 확인할 수 있다. 반면 유전자중 Bcl-xl 이라는 유전자는 세포사멸이 일어나지 않도록 억제 해주는 유전자로써 도 6에서 보면 타우로우루소데옥시콜산을 첨가한 군의 배반포보다 처리하지 않은 군의 배반포에서 Bcl-xl 유전자가 낮게 발현 됨을 확인 할 수 있었다. 이를 통해 돼지 체외수정란 유래 배반포에서 세포사멸과 관련된 유전자의 발현이 타우로우루소옥시콜산의 첨가를 통해 영향을 받음으로써 배반포의 질적 개선이 이루어짐을 확인하였다.

실시예 6. 통계적 분석 조사

본 명세서 및 도면중의 데이터는 평균±SD으로 표현한다. 이원 분산 분석법(ANOVA)을 사용하여 매개변수적으로 통계적 비교를 수행하였으며, 단일 비교군의 경우 일원 ANOVA는 Student t-검정을 수행하였다. 통계적 유의 수준은 P<0.05로 설정하였다.

본 발명의 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 체외배양용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용한 포유동물 수정란의 체외배양방법 및 대량 생산 방법은 체외 수정란의 배반포 발달률을 증대시키고, 수정란 세포의 세포사멸을 억제시켜 내부세포괴 영양막 세포를 포함한 전체 세포수를 증가시키는바, 질적으로 개선된 체외 수정란의 대량 생산 체제의 확립 및 형질전환 복제 수정란의 생산 기반을 구축하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 포유동물 수정란 대량 생산 방법은 아직까지 미비한 수준에 머물고 있는 체외 수정란의 배 발생 제고와 배반포의 질적 향상을 도모할 수 있으 며, 포유동물 수정란 이식에 의한 산자 및 복제 산자의 효율적 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 타우로우루소데옥시콜산(tauroursodeoxycholic acid)의 분자구조식을 나타낸 것이다.

도 2는 포유동물 체외 수정란의 대량 생산 방법의 개략도이다.

도 3은 타우로우루소데옥시콜산 처리에 의한 돼지 및 소 수정란의 발달률을 조사한 그래프이다.

도 4는 타우로우루소데옥시콜산 처리에 의한 돼지 및 소 배반포기 수정란의 세포 수를 조사한 사진이다.

도 5는 타우로우루소데옥시콜산 처리에 의한 생산된 돼지 및 소 배반포기 수정란의 세포사멸을 조사한 사진이다.

도 6은 타우로우루소데옥시콜산 처리에 의한 생산된 돼지 배반포기의 세포괴사에 관련된 유전자 발현 조사 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A composition for culturing mammalian embryos and a method for mass production of mammalian embryos using thereof <130> PA080399/KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying bax gene <400> 1 ggcacaaatc tgatgtttgc a 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying bax gene <400> 2 tggttctttc ccttagtgaa agc 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying Bcl-xl gene <400> 3 gaaaccccta gtgccatcaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying Bcl-xl gene <400> 4 gggacgtcag gtcactgaat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying beta-actin gene <400> 5 ggtaaggctg ggaaggactc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying beta-actin gene <400> 6 cggtgaggta ctccaggatg 20

Claims

타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 포유동물 수정란의 체외배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 무기염류, 탄소원, 아미노산, 및 소 혈청 알부민으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 타우로우루소데옥시콜산의 배지 내 농도는 10 내지 300μM인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지 또는 소인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제4항에 있어서, 상기 포유동물이 돼지이고, 상기 타우로우루소데옥시콜산의 배지 내 농도는 150 내지 250 μM 인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제4항에 있어서, 상기 포유동물이 소이고, 상기 타우로우루소데옥시콜산의 배지 내 농도는 10 내지 100 μM 인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 포유동물의 수정란은 체외수정란 또는 복제수정란인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 타우로우루소데옥시콜산은 수정란 배반포의 세포사멸 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제8항에 있어서, 상기 세포사멸 억제 활성은 Bax 유전자 발현 감소 또는 Bcl-xl 유전자 발현 증가에 의한 것임을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 포유동물 수정란을 배양하는 단계를 포함하는 수정란의 체외배양방법.
다음의 단계를 포함하는 포유동물 체외수정란의 대량 생산 방법:

1) 인간을 제외한 포유동물로부터 난포란을 채취하는 단계;

2) 단계 1에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계;

3) 상기 회수된 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계;

4) 단계 3에서 성숙된 난자와 정자를 체외 수정시키는 단계; 및

5) 단계 4에서 제작된 체외수정란을 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 배지에서 배양하는 단계.
제10항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지 또는 소인 것을 특징으로 하는 수정란의 체외배양방법.
제10항에 있어서, 상기 포유동물 수정란은 타우로우루소데옥시콜산에 의해 세포사멸이 억제되는 것을 특징으로 하는 수정란의 체외배양방법.