KR100860082B1

KR100860082B1 - 프로스타싸이클린 유사체 처리에 의한 포유동물 수정란대량 생산 방법

Info

Publication number: KR100860082B1
Application number: KR1020070005400A
Authority: KR
Inventors: 한용만; 구덕본; 이경광; 송봉석; 김지수; 박정선
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-05-29
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2008-09-24
Also published as: KR20070114624A

Abstract

본 발명은 포유동물 미성숙란의 발달률 향상 또는 포유동물 수정란의 배반포 발달률 향상을 위한 체외 배양용 배지 및 상기 배지를 이용한 수정란 대량 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 프로스타싸이클린 유사체를 포함하는 체외 배양용 배지 및 포유동물의 체외 미성숙란, 수정란 또는 복제 수정란 배양시 상기 배지를 이용하여 질적으로 개선된 포유동물 수정란을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

프로스타싸이클린 유사체, 체외 성숙란, 체외 수정란, 복제 수정란, 대량 생산

Description

프로스타싸이클린 유사체 처리에 의한 포유동물 수정란 대량 생산 방법{The massproduction method of mammalian embryos by treatment of Prostacyclin analog}

도 1은 프로스타싸이클린의 생합성과정과 분자구조식을 나타낸 것이다.

도 2는 아일로프로스트(Iloprost)의 분자구조식이다.

도 3은 포유동물 체외 성숙란의 대량 생산 방법의 개략도이다.

도 4는 포유동물 체외 수정란의 대량 생산 방법의 개략도이다.

도 5는 포유동물 복제 수정란의 대량 생산 방법의 개략도이다.

도 6은 아일로프로스트 처리에 의한 소 배반포기의 발달 단계를 조사한 그래프이다.

본 발명은 프로스타싸이클린 유사체를 포함하는 체외 배양용 배지 및 상기 배지를 이용하여 포유동물 성숙란 또는 수정란을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 체외 미성숙란 및 체외 수정란 또는 복제 수정란 배양시 프로스타싸이클린 유사체를 처리함으로써 질적으로 개선된 성숙란 및 수정란을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

전통적으로 포유동물에 사용된 종자개량 방법은 1 개체 간의 교배에 의존하여 우수한 형질을 가진 가축을 육종하는 것으로, 이는 교배시점까지 가축을 성장시켜야 하므로 육종에 장기간 시간이 소요될 뿐만 아니라 그에 따른 개량 속도도 매우 낮은 문제점을 가지고 있었다. 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 우수한 형질을 나타내는 개체로부터 유래된 수정란 이식 기법이 개발되었다.

포유동물 수정란 이식 기법은 종자 개량 및 대량 생산이라는 목적으로 개발되었다. 소 및 돼지의 개량은 지난 30년간 종모우 및 종모돈의 정액을 이용한 인공수정 기법에 의해 수행되었고, 그 결과 우수한 수소의 이용을 통한 개량이 진행되었으나 우수한 암소의 능력은 가축 개량에 이용되지 못함으로 인해 개량 속도가 상당 부분 지연되었다. 그러나, 포유동물 수정란 이식기술을 이용하게 되면 인공수정 기술보다 개량 속도가 약 3배 이상 빠르고, 특히 우량 송아지 및 우량 돼지를 조기 에 대량 생산이 가능하다. 이미 선진국에서는 우량 종축 생산에 포유동물 수정란 이식기술을 이용하고 있다.

현재까지 포유동물 체외 수정란 생산은 암소에 성선자극호르몬을 투여하여 난자의 다배란을 유도한 다음 비외과적 방법으로 채란하여 신선한 상태로 수정란을 이식하거나 또는 동결 보존 방법을 사용하여 왔다. 상기 기법은 우량한 유전능력의 수정란을 생산할 수 있는 장점이 있으나, 높은 생산원가와 개체의 차이로 다량의 수정란 생산에 문제가 있어 실용화에 주요한 걸림돌이 되어왔다.

또한, 포유동물 수정란의 생산율을 결정지을 여러 가지 요인 중 수정란의 배양 조건이 있는데, 이를 확립하고자 하기와 같은 연구들이 진행이 되어 오고 있다. 많은 연구자들은 산소의 농도, 난구세포의 유무, 난자의 크기 차이에 따른 배 발달률 조사를 수행하였는데, 이는 배양이 되는 외부 환경 차이에 따라서도 배 발생률의 차이가 나기에 적합한 조건을 확립하고자 하는데 그 목적이 있다 (Khurana, NK. and Niemann, H., Theriogenology. 15;54 (5):741-756, 2000). 돼지 난소피질 세포를 이용하여 공배양 동안에 체외 성숙률과 수정률, 발달률을 조사한 실험이 수행되었다 (Xiao-Yu Cheh. Effect of ovarian cortex cell co-culture during in vitro maturation on porcine oocytes maturation, fertilization and embryo development. Animal Reproduction Science, 2006 January 22; 11-22). 수정란의 성숙률 및 발달률을 높이기 위해 첨가되는 수많은 인자들이 있겠지만 체외수정란 생산에 있어서 각각의 단계에 첨가되는 물질들은 각기 다를 것이다. 또한 여러 가지 배양방법 및 배양액의 각각의 물질들에 대한 여러 가지 실험들이 수행되었다. 성숙시기에 헥소시스(glucose, fructose, galactose)를 배양액에 첨가해 돼지 난포란의 체외 성숙률 및 수정란의 배 발달률을 향상시키는 실험이 수행되었다 (Wongsrikeao P et al., Effect of hexoses on in vitro oocyte maturation and embryo development in pigs. Theriogenlogy. 2006 January;(65):332-343). 이에 따라, 각각의 단계에서 첨가되는 물질들에 대한 하기와 같은 여러 가지 방법들이 수행되었다. 성숙시기에 재조합된 인간성장 호르몬(recombinant human growth hormone)을 배양액에 첨가해 배 발달률을 향상시키는 방법(Pozzobon, SE., et al., Reprod Domest Anim. 40(1):19-22, 2005), 소의 난소에서 채취된 난포액을 첨가하여 배 발달률을 조사하는 방법(Ali, A., et al., Theriogenology. 62(9):1596-1606, 2004), 체외 배양단계에서 배 발달률을 향상시키기 위해 쥐의 태아세포와 공배양함으로써 수정란의 발달률을 향상시키는 방법(Park, JS. et al., Anim. Repord. Sci. 59:13-22, 2000), hLIF(Human leukemia inhibitory factor) 처리를 통한 상실기배와 배반포기의 배 생산 방법(Kaye, PL. and Harvey MB. Prog. Growth Factor Res. 6:1-24, 1995), 수정란에 레티놀(retinol)을 첨가하여 발달률을 증가시키는 방법(Livingston, T. et al., Reprod Biol Endocrinol. 21;2(1):83, 2004) 및 인슐린(Insulin)을 첨가하여 발달률을 향상시키는 방법(Augustin, R. Reproduction 126,91-99, 2003) 등이 있다. 또한, 발달 시기가 다른 배반포를 이식함으로써, 얻어지는 산자의 생산율도 변한다는 것을 확인하는 연구도 있었는데, 발달시기가 빠른 배반포기를 이식할수록 높은 산자생산율을 얻을 수 있음이 확인되었다(Kubisch, HM., et al., Reprod Domest Anim. 39:120-124, 2004).

그러나 상기와 같은 많은 연구들에도 불구하고, 수정란의 체외 배양시 발달에 필요한 미지의 발달인자를 정확히 알 수 없었다. 그러므로 여러 가지 발달인자를 확인하여 보다 효과적인 수정란 생산을 위한 배양조건을 확립하여 수정란을 대량생산하는 방법이 필요하다. 상기 미지의 발달인자를 통해 질적으로 개선된 성숙란 및 수정란 배양방법이 핵이식 기법을 통한 복제 수정란의 생산에 적용된다면, 질적으로 향상된 복제 수정란의 생산을 통한 산자를 생산할 수 있으며, 이를 통한 치료용 단백질을 생산하는 동물생체 반응기(animal bioreactor)를 생산함으로써 높은 부가 가치를 창출하여 경제적으로 큰 이익을 가져올 것이다.

프로스타싸이클린(prostacyclin: 이하 "PGI2"라 칭함)은 2개의 5각형 탄소 고리와 고리에 연결된 긴 곁사슬을 포함하는 C₂₀ 카르복시산으로, 아라키돈산(Arachidonic acid)이 세포 내의 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase: 이하 "COX"라 칭함)에 의해서 대사되는 과정에서 만들어지는 프로스타글란딘(prostaglandin)의 일종이다(도 1참조). PGI2는 수란관액에 존재하며, 혈액과 혈관 항상성 유지에 관여한다. 최근 연구에서는 COX-2 녹아웃(knock-out) 마우스에서 자궁 내막의 탈락막화(decidualization)가 상실되었으나(Lim, H., et al., Cell 91:197-208, 1997), 외인성 PGI2 유사체를 처리했을 때 탈락막화 기능이 회복되었다(Lim, H., et al., Genes Dev. 13:1561-1574, 1999). 배아의 발달에 PGI2이 미치는 영향은 정확히 밝혀진바 없다. PGI2 수용체 녹아웃 마우스의 경우 수정시 배아 의 크기가 정상 마우스보다 작음이 관찰되었다(Murata, T., et al., Nature 388:678-682, 1997). 상기 PGI2 유사체인 아일로프로스트(iloprost : 6.9α-methylene-11α,15S-dihydroxy-16 -methyl-prosta-5E-dien-18-yn-1-oic acid) (도 2참조)는 ADP, 트롬빈(thrombin), 콜라겐 유도에 의한 인간 혈소판의 응집을 저해하고, 포유동물 전체에서는 혈관 확장제, 혈압 강하제, 항이뇨제로서 역할을 한다. 또한 말초혈관 폐색증과 레이노 현상(Raynaud’s phenomenon: 손, 발, 코, 귀 등 말초 조직의 동맥이 추위나 진동, 스트레스에 노출되었을 경우 과도하게 혈관(동맥)의 수축이 일어나거나 말초 동맥이 막혀 말초부위로 피가 통하지 않으면서, 손, 발, 코, 귀 등의 색깔이 하얗게 되었다가 더 오래 노출되면 파란색으로 변하고, 다시 따뜻한 곳으로 돌아오면 혈관 확장이 일어나 빨간 색으로 변하는 현상)에 효과적이다(Golino P, et al., Adv Prostaglandin Thromboxane Leukot Res. 17A:377-380, 1987).

본 발명자들은 프로스타싸이클린 유사체를 체외 미성숙란 및 수정란 또는 복제 수정란의 배양액에 처리한 결과, 성숙란이 증가하고 수정란의 배반포기까지의 발달률 및 발달 속도가 증가하며 내세포괴와 영양막 세포수가 증가하는 양적 및 질적 개선을 관찰하여 프로스타싸이클린 유사체를 수정란 대량 생산에 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 체외 배양에서의 포유동물 미성숙란 발달률의 향상 또는 포유동물 수정란의 배반포 발달률의 향상을 위한 체외 배양용 배지를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 체외 배양용 배지를 이용한 포유동물 체외 성숙란의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 체외 배양용 배지를 이용한 포유동물 체외 수정란의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 체외 배양용 배지를 이용한 포유동물 복제 수정란의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포유동물 미성숙란 및 수정란의 체외 배양에 있어서, 기본 배지에 프로스타싸이클린 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 체외 배양용 배지 및 상기 체외 배양용 배지에서 배양하여 초기 성숙란을 수정란으로 만들어 배반포기배로 배양하는 것을 특징으로 하는 수정란 대량 생산 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 하나의 양태로서, 포유동물 미성숙란 및 수정란의 체외 배양용 배지로서, 기본 배지에 프로스타싸이클린 유사체를 포함한 것을 특징으로 하는 체외 배양용 배지를 제공한다.

본 발명에서 "포유동물 미성숙란"이란 제1극체가 생성되지 않은 상태의 난자를 말하며, '미성숙란', '미성숙한 난자' 및 '미성숙한 난포란'과 같은 용어를 동일한 의미로 사용한다. 본 발명의 구체적인 양태에서, 미성숙란은 세포질이 고루 분포하고 3겹 이상의 난구세포층이 치밀하게 붙어있는 미성숙란을 선별하였다.

본 발명에서 "포유동물 수정란"은 체외 배 발생정지현상을 보이는 인간을 제외한 포유동물의 수정란인 것이 바람직하며, 소 및 돼지의 수정란인 것이 가장 바람직하다. 또한, 초기 성숙란에 수정시켜 만든 체외 수정란 또는 복제 수정란인 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 "체외 수정란"이란 난자와 정자를 채취하여 체외에서 수정시킨 것을 말하고, "복제 수정란"은 체세포 공여핵을 유전물질이 제거된 수핵 난자에 주입한 후 물리적 또는 화학적 방법으로 융합시킨 것을 의미한다.

본 발명에서 "기본 배지"는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민(BSA) 및 보조인자 등을 기본적으로 포함하는 포유동물 초기배아 세포 배양용 배지로서, 당업자들에게 잘 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다. 특히 바람직하게, 상기 배지는 무기염류로서 NaCl, KCl 및 NaHCO₃등을 포함하고, 탄소원으로서 글루코즈, 나트륨 피루베이트, 젖산칼슘염 등을 포함하며, 아미노산으로서 글루타민을 비롯한 필수아미노산 및 비필수아미노산을 포함하며, 보조인자로서 기타 미량원소 및 완충액 등을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배지는 또한 항생제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예로서 상기 기본배지로는 포유동물세포 배양용으로 공지되어 상업화된 여러 배지, 예를 들어, NCSU-23 (North Carolina State University medium; Petters and Wells, J. Reprod. Fert., Suppl. 48:61-73., 1993), CR1-aa (Rosenkrans, CF Jr., et al., Biol. Reprod., 49(3);459-462, 1993), TCM(tissue culture medium of medium199, Gibro, USA; Yue, C., et al., Development, 121:2645-2654, 1995), CZB (Chatot -Ziomek-Bavister medium; Chatot, C.L., et al., J. Reprod. Fert., 86:679-688, 1989) 등을 그대로 사용할 수 있으며, 돼지의 경우 NCSU-23을 사용하는 것이 특히 바람직하며 소의 경우 CR1-aa를 사용하는 것이 좋다.

본 발명에서 "프로스타싸이클린 유사체"는 도2에 나타낸 아일로프로스트(iloprost), ZK36374(Schror K, Darius H, Matzky R et al., Arch Pharmacol, 316:252-255, 1981) 및 15(R)-아일로프로스트(아일로프로스트의 C-15 에피머)로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 배지는 프로스타싸이클린 유사체로서 아일로프로스트를 0.1 내지 10 μM 농도로 포함하는 것이 바람직하며, 1 μM로 포함하는 것이 가장 바람직하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 1) 난포란을 채취하는 단계; 2) 단계 1에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계; 3) 상기 회수된 미성숙 난자를 본 발명에 따른 프로스타싸이클린 유사체를 포함하는 기본 배지에서 배양하여 성숙시키는 단계를 포함하는 포유동물 체외 성숙란의 대량 생산 방법을 제공한다 (도 2 참조). 상기 배지는, 상술한 바와 같이, 공지의 기본 배지에 프로스타싸이클린 유사체로서 아일로프로스트를 0.1 내지 10 μM 농도로 포함시킨 배지이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 1) 난포란을 채취하는 단계; 2) 단계 1에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계; 3) 상기 회수된 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계; 4) 동결 정자를 해동하여 단계 3에서 성숙된 난자에 체외 수정시키는 단계; 및 5) 단계 4의 체외 수정란을 프로스타싸이클린 유사체를 처리한 기본 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 포유동물 체외 수정란의 대량 생산 방법을 제공한다 (도 3 참조). 상기 배지는, 상술한 바와 같이, 공지의 기본 배지에 프로스타싸이클린 유사체로서 아일로프로스트를 0.1 내지 10 μM 농도로 포함시킨 배지이다. 본 발명에서 성숙시간은 돼지의 경우 약 44시간, 소의 경우 약 20시간 동안 성숙시키며, 수정란의 배양 시간은 7일이 바람직하다. 소의 경우 아일로프로스트 및 0.3% BSA를 포함하는 CR1-aa 배지에서 약 3일간 배양한 후, 아일로프로스트 및 10% FBS를 포함한 CR1-aa 배지에서 약 4일간 더 배양하는 것이 가장 바람직하다. 돼지의 경우에는 아일로프로스트 및 0.4% BSA를 포함한 NCSU-23 배지에서 약 7일간 배양하는 것이 바람직하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 1) 난포란을 채취하는 단계; 2) 단계 1에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계; 3) 상기 회수된 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계; 4) 단계 3의 수핵란에서 제핵하는 단계; 5) 체세포를 단계 4의 수핵란에 이식하여 세포 융합시키는 단계; 6) 단계 5의 융합한 복제 수정란을 자극하여 활성화시키는 단계; 및 7) 단계 6의 복제 수정란을 프로스타싸이클린 유 사체를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 포유동물 복제 수정란의 대량 생산 방법을 제공한다 (도 4 참조). 상기 배지는, 상술한 바와 같이, 공지의 기본 배지에 프로스타싸이클린 유사체로서 아일로프로스트를 0.1 내지 10 μM 농도로 포함시킨 배지이다.

본 발명의 구체적인 양태에서, 본 발명자들은 포유동물의 난소로부터 미성숙 난자를 회수하여 체외 성숙시킨 후 수정시킨 체외 수정란과 복제 수정란을 준비하였다. 포유동물 체외 수정란의 경우, 회수한 난자를 소의 경우 약 20시간 동안 성숙 배양시키며 돼지의 경우 약 44시간동안 성숙 배양시킨 후, 제 1 극체가 방출되는 성숙 난자를 준비하였다. 이후 동결된 정액을 해동시켜 수정배양액 상에서 체외 수정시켰다. 또한 복제 수정란의 경우, 상기 체외 성숙시킨 난자 중 제 1 극체가 도출된 난자를 선별하여 수핵 난자로 사용하였다. 미리 준비된 체세포를 제핵된 난자의 위란강 내로 하나씩 주입하고 직류 전압을 통전하여 난자의 세포질과 공여 세포를 융합하고, 융합된 복제 수정란을 활성화하였다. 이렇게 준비한 체외 수정란과 복제 수정란을 배양한 후 배반포기의 배를 각 발육 단계별로 회수하여 발생률을 체크하였다.

본 발명자들은 아일로프로스트가 소 체외 수정란의 발달에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 소 체외 수정란의 경우 아일로프로스트가 처리된 배양액에서 배양된 수정란의 배반포기까지의 발달률은 28.3%로 관찰되었으며, 아일로프로스트를 처리하지 않은 대조군의 경우 20.9%로 관찰되었다(표 1 참조). 이를 통해 아일로프로스트가 소 체외 수정란의 발달을 증진시키는 효과를 가짐을 확인하였다. 이 후, 아일로프로스트가 소 체외 수정란의 배반포기의 배반포 발달 속도에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 배양 7일째 형성된 배반포기의 발달 단계에서 대조군의 단계는 고르게 분포되었으나 아일로프로스트를 처리한 실험군에서는 특히 후기 단계의 배반포가 45%를 차지함으로 높은 비율을 보이며, 대조군에 비해 배반포율이 15% 정도 높음이 관찰되었다(표 2 및 도 4 참조). 빠르게 발달하는 수정란일수록 느리게 발달하는 수정란에 비해 발달하는 능력 및 생존률이 높으며, 배반포의 형성이 일찍 일루어지는 배반포와 배반포의 혈성은 이루어지나 조금 늦게 이루어지는 배반포를 대리모에 이식했을 때, 함께 배양되었던 배반포일지라도 발달 속도가 느린 배반포에 비하여 발달 속도가 빠른 배반포에서의 산자 획득 결과가 높음이 보고된 바 있다(Hasler, JF., et al., Theriogenology 43:141-152, 1995). 이를 통해 발달 속도가 빠른 배반포가 질적으로 우수하다는 것을 알 수 있다. 본 발명의 대량 생산 방법에 있어서, 아일로프로스트를 처리하면 체외 수정란의 발달 속도를 증가시키며, 체외 수정란의 배반포가 질적으로 향상됨을 알 수 있다.

본 발명자들은 아일로프로스트가 소 복제 수정란의 발달에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 아일로프로스트가 첨가된 배지에서 배양된 복제 수정란의 배반포기 발달률은 48.7%로 관찰되었으며, 아일로프로스트가 첨가되지 않은 배지에서 배양된 복제 수정란의 배반포기 발달률은 28.5%로 관찰되었다.(표 3 참조). 이를 통해 아일로프로스트가 복제 수정란에 미치는 영향이 체외 수정란에 미치는 영향과 유사한 양상을 보임을 확인하였고, 체외 수정란의 경우와 마찬가지로 아일로프로스트를 처리하면 복제 수정란의 발달 속도를 증가시켜 복제 수정란의 배반포가 질적 으로 향상됨을 알 수 있다.

본 발명자들은 아일로프로스트가 돼지 난포란의 체외성숙에 미치는 영향을 조사였다. 그 결과, 아일로프로스트가 첨가된 배지에서 배양된 난포란은 제2감수분열 중기(Metaphase Ⅱ)까지의 성숙률이 90%로 관찰되었으며, 아일로프로스트가 첨가되지 않은 배지에서 배양된 난포란은 제2감수분열 중기(Metaphase Ⅱ)까지의 성숙률이 65.7%로 관찰되었다(표 4 참조). 이를 통해 아일로프로스트가 돼지 난포란의 체외성숙을 증진시키는 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

본 발명자들은 아일로프로스트가 돼지 체외 수정란의 배발달에 미치는 영향을 조사하였다. 체외배양 7일째 형성된 배반포 단계의 수정란을 조사한 결과, 아일로프로스트를 처리한 실험군에서는 28.3%로 아일로프로스트를 처리하지 않은 대조군(20.9%)에 비해 배반포로의 발달률이 향상됨을 확인하였다(표 5 참조).

본 발명자들은 포유동물 체외 수정란 및 복제 수정란의 배반포 이중 염색을 통하여 아일로프로스트가 체외 수정란 및 복제 수정란의 질적 향상에 미치는 효과를 조사하였다. 이중 염색시 내세포괴(inner cell mass)는 푸른색으로, 영양막(trophoblast)은 붉은 색으로 염색되므로, 전체 세포수와 내세포괴 및 영양막 세포수를 계수하였다. 그 결과, 소 체외 수정란의 경우 아일로프로스트를 처리한 배양액에서 배양한 배의 전체 세포수가 대조군보다 높으며, 내세포괴 및 영양막 세포수 또한 대조군보다 높게 관찰되었다(표 6 참조). 또한, 돼지 체외 수정란의 경우 배반포 단계에서도 질적 측면을 조사한 결과 전체 세포수, 내세포괴 및 영양막 세포수가 대조군에 비하여 증가함이 관찰되었다(표 7 참조). 소 복제 수정란의 경우 역시 체외 수정란과 같이 전체 세포수, 내세포괴 및 영양막 세포수가 대조군에 비하여 증가함이 관찰되었다(표 8 참조). 이를 통해 아일로프로스트 처리를 통해 체외 수정란과 복제 수정란의 질적 개선이 달성됨을 확인하였다. 본 발명의 아일로프로스트를 처리하여 수정란을 대량 생산하는 방법은 복제 수정란의 문제점인 전체 세포수에 대한 내세포수의 비정상적인 비율 문제를 극복할 수 있다(Deog-Bon Koo et al., Biology of Reproduction 67:487-492, 2002).

그러므로 본 발명의 포유동물 수정란 대량 생산 방법을 사용하면, 아직까지 미비한 수준에 머물고 있는 체외 수정란의 배 발생 제고와 복제 동물 생산시 문제되고 있는 복제 배반포의 세포수와 비율을 조절하여 그 실패 요인들을 극복할 수 있다. 또한, 본 발명의 포유동물 수정란 대량 생산 방법은 소 및 돼지 수정란 이식, 산자 및 복제 산자의 생산 최대화에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 포유동물 미성숙란의 체외 성숙

도축장에서 암소 및 암퇘지의 난소를 적출 후 25℃, 0.9% 생리식염수에 보관하여 실험실로 옮긴 다음, 18 게이지(gage) 주사기를 사용하여 직경 2 ~ 6 mm 난포 로부터 난포액을 회수하였고, 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 TL-Hepes 배양액(Voelkel, S.A., and Hue, Y.X. Theriogenology 37:1117-1131, 1992)에 희석하여 실체 현미경(SZ60, OLYMPUS, JAPAN) 하에서 미성숙 난포란을 선별하였다. 선별 기준은 세포질이 고루 분포하고 3겹 이상의 난구세포층이 치밀하게 붙어있는 미성숙 난포란이다. 상기 선별한 미성숙 난포란의 체외 성숙시 소는 10% 소 태아 혈청이 함유된 TCM-199 배양액(Gibro, USA; Yue, C., et al., Development 121:2645-2654, 1995)에 1 ㎍/㎖ 에스트라디올(estradiol; Sigma, USA)과 1 ㎍/㎖ FSH-P(Schering-Plough Animal Health, USA)를 첨가하여 사용하며 4 웰 디쉬에 한 웰 당 500 ㎕씩 분주하여 38.5℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였고, 돼지의 경우에는 NCSU-23 배양액(North Carolina State University, Petters, et al., J. Reprod. Fert.,48:61-73.,1993)에 10% 돼지 난포액을 첨가하고 1 ㎍/㎖ 에스트라디올(estradiol; Sigma, USA)과 임마혈청성 성선자극호르몬(PMSG; Sigma, USA) 및 임부태반융모성 성선자극호르몬(hCG; Sigma, USA)을 각각 10 IU/ml를 첨가하여 22시간동안 성숙 시킨 후 NCSU-23에 임마혈청성 성선자극호르몬(PMSG; Sigma, USA)과 임부태반융모성 성선자극호르몬(hCG; Sigma, USA)을 제거하고 10% 돼지난포액 및 1 ㎍/㎖의 에스트라디올(estradiol; Sigma, USA)을 첨가하여 22시간 동안 4 웰 디쉬에 한 웰 당 500 ㎕씩 분주된 배양액에 50개씩의 난포란을 투여하여 38.5℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실시예 2. 포유동물 체외 수정란 및 복제 수정란 제작

2-1. 소 체외 수정란 준비

실시예 1에서 20시간 동안 체외 성숙된 난자는 0.6% 소 혈청 알부민(BSA: Bovine Albumin Serum, Sigma, USA)과 10 ㎍/㎖ 헤파린(heparin)(Sigma, USA)이 함유된 체외 수정용 Fert-TALP (http://www.specialtymedia.com/5Resources/ Protocols/ivfprotocol.htm)으로 3회 세척 후, 44 ㎕ 소적(medium droplets)당 15개씩을 첨가하여 수정 전까지 준비하였다. 액체질소에서 보관된 소의 동결 정액이 든 관(straw)을 공기 중에서 10초간 방치 후 37℃ 항온수조에서 20초간 해동시켰다. 해동된 정액을 37℃로 가열한 90%와 45%의 농도 구배된 퍼콜(percoll) 용액(Sigma, USA) 위에 올리고 2,000 rpm, 20분간 원심분리하여 정자와 그 외의 부분과 분리하였다. 이후 정자만을 분리하기 위하여 피펫을 이용하여 퍼콜 용액을 제거한 후, 정자를 세척할 수 있는 Sp-TALP(sperm-Tyrode's medium with albumin, lactate and pyruvate: http://www.specialtymedia.com /05Resources/Protocols/ ivfprotocol. htm) 5 ㎖의 용액에 가라앉은 정자 50 ㎕를 첨가하여 1,000 rpm, 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 침지한 정자만을 회수하여 난자 15개씩 들어있는 소적(medium droplets)당 1×10⁶/ml 농도로 주입하여 20시간 동안 공배양에 의해 체외 수정을 수행하였다.

2-2. 돼지 체외 수정란 준비

실시예 1에서 44시간 동안 체외 성숙된 난자를 체외 수정용 mTBM(modified Tris-buffered medium)에 0.1% 소 혈청 알부민(BSA: Bovine Albumin Serum, Sigma, USA)과 11 ㎍/㎖ 글루코스(glucose)(Sigma, USA)를 처리하여 3회 세척 후 48 ㎕ 소적(medium droplets)당 15개씩의 난자를 첨가하여 수정 전까지 준비하였다. 냉장 16℃에서 보관된 돼지의 액상정액이 든 15ml 튜브를 37℃로 인큐베이션(incubation)한 정자 세척액(0.1% BSA가 함유된 PBS)을 7ml씩 섞은 후 2,000 rpm, 3분간 3회 원심분리하여 정자와 그 외의 부분과 분리하였다. 이후 정자만을 분리하기 위해 다시 정자 세척액 2ml를 정자 위에 올리고 15분 후 상층액을 회수하여 1,000 rpm, 2분간 원심분리하였다. 원심분리 후 침지한 정자만을 회수하여 체외 수정용 mTBM 배양액에 희석시켜 난자 15개씩 들어있는 소적(medium droplets)당 1.2×10⁵/ml의 농도로 주입하여 6시간 동안 공배양에 의해 체외 수정을 유도하였다.

2-3. 소 복제 수정란 준비

실시예 1에서 20시간 체외 성숙된 난자를 0.1% 히아루니다제 (hyaluronidase)(Sigma, USA)가 포함된 500 ㎕ TL-Hepes 배지로 처리하여 강한 피펫팅을 수행하여 난자의 난구세포를 제거하였다. 이후 Tsunoda 등의 방법대로 난구세포가 제거된 난자의 투명대를 정교한 유리 침을 사용하여 부분적으로 절개하였다(Tsunoda et al., J Exp Zool., 240(1);119-125, 1986). 핵 제거와 세포 삽입과 같은 난자 조작은 도립현미경(Leitz, Ernst Leitz Wetzlar GmbH, Germany)이 장착된 미세조작기(micromanipulator)를 통해 수행하였다. 조작을 위해 사용된 배양액으로 7.5 ㎍/㎖ 사이토칼라신 B(cytochalasin B)을 포함하고 있는 TL-Hepes를 사용하였다. 첫 번째 극체와 제 2중기(metaphaseⅡ) 염색체를 포함하고 있는 부분의 세포질을 20 ㎛ 직경을 가진 마이크로피펫을 이용하여 제거하였다. 준비된 체세포를 각각 핵이 제거된 난자의 위란강 내에 삽입하였다. 세포-세포질체 (cell-cytoplast) 복합체를 10 내지 20초 동안 50 ㎕ 세포 융합 배양액 안에 방치한 후, 세포 융합 배양액이 덮인 2개의 전극 1 mm 간격(electrodes 1mm apart)으로 구성된 융합용기에 옮겼다. 세포 융합 배양액은 0.3 M 만니톨(mannitol), 0.5 mM Hepes, 0.01% BSA, 0.1 mM CaCl₂ 및 0.1 mM MgCl₂으로 조성하였다. 세포-세포질체 복합체를 Electro Cell Manipulator 2001(BTX, San Diego, USA)을 이용하여 각각 20×10^-6 초 동안 직류 전장 1.6 kV/cm를 흐르도록 하여 1회의 펄스로 상온에서 융합을 유도하였다. 체세포가 보이지 않는 재구성된 수정란은 융합 펄스 이후 1시간 되었을 때 융합된 수정란으로 결정되었다. 전기적 융합 이후, 2시간 후 융합된 수정란을 5분 동안 5 μM 이노마이신(ionomycin)을 처리한 후, 0.3% 소혈청 알부민 및 2.5 mM 6-디메틸-아미노퓨린(6-DMAP)을 포함하는 CR1aa 배지(Rosenkrans, CF Jr., et al., Biol. Reprod. 49(3);459-462, 1993)에서 38.5℃, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 배양하여 활성화를 유도하였다.

실시예 3. 포유동물 체외 수정란 및 복제 수정란의 배발달 조사

3-1. 소 배반포로의 발달 여부 조사

소 체외 수정란

상기 실시예에서 제작한 체외 수정란과 복제 수정란을 1 mM 글루타민, 0.2 mM 피루베이트 및 아일로프로스트(iloprost 1 μM)가 첨가된 0.3% 소혈청 알부민(BSA)-CR1-aa 배양액에서 배양하였다. 3일 동안 배양 후, 분열된 수정란들을 아일로프로스트(iloprost 1 μM)가 첨가된 CR1aa-FBS(10% FBS: Fetal Bovine Serum 첨가)가 있는 50 ㎕ 체외 배양액 소적(medium droplets)에서 4일 동안 38.5℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 수정 7일 후에 배반포기 배의 형성이 관찰되었으며, 표 1과 같은 체외 발달률을 나타냈다. 하기 표 1에서 보이는 것과 같이, 아일로프로스트(1 μM)가 처리된 배양액에서 배양된 수정란의 배반포기까지의 발달률이 28.3%로 관찰된 반면, 처리하지 않은 대조군에서는 20.9%의 발달률이 관찰되었다. 상기 결과는 통계처리프로그램(SAS: Statistical Analysis System)에 의해 두 실험의 결과가 유의적 차이가 있음을 확인하였다. 이를 통해 아일로프로스트(1 μM)가 체외 수정란의 발달을 증진시키는 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

이후 발명자들은 아일로프로스트가 첨가된 배양액과 첨가되지 않은 배양액에서의 각각 7일간 배양한 후, 형성되어진 배반포기의 배반포 발달 단계를 조사하였으며 그 결과는 하기 표 2와 같다. 빠르게 발달하는 수정란일수록 느리게 발달하는 수정란에 비해 발달하는 능력 및 생존률이 높으며, 배반포의 형성이 일찍 이루어지는 배반포와 배반포의 형성은 이루어지나 조금 늦게 이루어지는 배반포를 대리모에 이식했을 때 함께 배양되었던 배반포일지라도 발달속도가 느린 배반포에 비해 발달속도가 빠른 배반포에서의 산자획득결과가 높은 것이 보고되었다(Hasler, JF., et al., Theriogenology 43:141-152, 1995). 이를 통하여 발달속도가 빠른 배반포가 질적으로 우수하다는 것을 알 수 있다. 하기 표 2에서와 같이, 배양 7일째 형성된 배반포기의 발달단계에서 대조군의 단계는 고르게 분포되었으나, 아일로프로스트를 처리한 실험군에서는 특히 후기단계의 배반포가 45%를 차지함으로써 높은 비율을 차지함을 알 수 있고, 대조군에 비해 배반포률이 15% 정도 높음을 알 수 있다. 이를 통해 아일로프로스트가 수정란의 발달에 영향을 미침을 확인하였다(도 4).

소 복제 수정란

본 발명자들은 복제 수정란이 아일로프로스트(1 μM)가 첨가된 배양액에서의 배반포까지의 발달률을 조사하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다. 아일로프로스트(1 μM)가 첨가된 실험군에서 배양된 복제 수정란의 배반포기 발달률은 48.7%로 관찰되었으며, 아일로프로스트가 첨가되지 않은 대조군에서는 28.5%의 배반포기 발달률이 관찰되었다. 이를 통해 아일로프로스트가 첨가된 배양액에서의 복제 수정란 배양 결과 역시 체외 수정란에서의 결과와 유사한 양상을 나타냄을 알 수 있었다.

아일로프로스트가 소 체외 수정란의 발달에 미치는 영향

구분	사용된 난자수	난할률 평균±표준오차(수)	배반포률 평균±표준오차(수)
대조군	438	81.7±2.8(358)	20.92±2.55(93)^a
실험군	425	82.82±1.91(352)	28.39±2.14(114)^b

^ab P<0.05

아일로프로스트가 소 체외 수정란의 발달속도에 미치는 영향

구분	조사된 배반포수	배양 7일째 조사된 배반포기의 발달단계 %(수)
구분	조사된 배반포수	초기	중기	후기	부화기
대조군	162	30(48)	33(54)	31(51)	6(9)
실험군	195	21(41)	18(35)	45(80)	5(10)

아일로프로스트가 소 복제 수정란의 발달에 미치는 영향

구분	대조군	실험군
사용된 난자수	667
제핵된 난자수	630
융합된 난자수	214
미융합 난자수	305
배양된 난자수	105	84
난할률 평균 ± 표준오차(수)	85.8 ± 2.9(50)	80.4 ± 4.4(58)
배반포기 발달률 평균 ± 표준오차(수)	28.5 ± 3.4(31)	48.7 ± 4.8(37)

3-2. 돼지 배반포로의 발달 여부 조사

돼지 체외 성숙란

하기 표 4에서 보이는 것과 같이, 체외 미성숙란을 아일로프로스트(1 μM)가 첨가된 배양액에서 배양한 후 난자의 성숙률을 확인하기 위해 제2감수분열까지의 발달률을 조사한 것이다. 아일로프로스트가 처리된 배양액에서의 발달률은 90%가 관찰 되었으며, 처리되지 않은 배양액에서의 발달률은 65.9%로 관찰되었다. 이 결과는 통계처리프로그램(SAS : Statistical Analysis System)에 의해 두 실험의 결과가 유의적으로 차이가 나는 것을 확인 할 수 있었다. 이를 통해 배양액에 아일로프로스트를 첨가함으로 전체적인 성숙란의 수가 증가되었음을 알 수 있다.

돼지 체외 수정란

상기 실시예 2-2에서 제작한 돼지 체외 수정란을 0.4% 소 혈청 알부민(BSA)이 첨가된 NACU-23 배양액에 7일 동안 38.5℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 수정 7일 후에 배반포기 형성이 관찰되었으며, 표 5와 같은 체외 발달률을 나타냈다. 하기 표 5에서 보이는 것과 같이, 아일로프로스트(1 μM)가 처리된 배양액에서 배양된 수정란의 배반포기까지의 발달률을 28.3%로 관찰되는 반면, 처리하지 않은 대조군에서는 20.9%의 발달률이 관찰되었다. 상기 결과는 통계처리프로그램(SAS: Statistical Analysis System)에 의해 두 실험의 결과가 유의적 차이가 있음을 보여 주었다. 이를 통해 아일로프로스트(1 μM)가 체외 수정란의 발달을 증진시키는 효과를 얻었으므로, 아일로프로스트가 수정란의 발달에 영향을 미침을 확인하였다.

아일로프로스트가 체외 돼지 성숙란에 미치는 영향

구분	조사된 난자수	배양 2일째 조사된 성숙란 단계 (평균 ± 표준오차)
구분	조사된 난자수	난핵포	난핵포붕괴	제1감수분열	제2감수분열
대조군	210	15.2 ± 1.1	10.5 ± 0.5	10.0 ± 4.7	65.7 ± 1.4^a
실험군	209	3.8 ± 0.7	2.4 ± 0.8	4.8 ± 4.0	90.0 ± 2.6^b

^ab P<0.05

아일로프로스트 처리농도에 따른 체외 돼지 수정란 발달에 미치는 영향

구분	사용된 난자수	난할률 평균±표준오차(수)	배반포률 평균±표준오차(수)
대조군	438	81.7 ± 2.8 (358)	20.9 ± 2.5 (93)^a
실험군	425	82.8 ± 1.9 (352)	28.3 ± 2.1 (114)^b

^ab P<0.05

3-3. 포유동물 내부세포괴 및 영양막 세포수 조사

체외 수정란 및 복제 수정란을 각각의 배양액에서 7일 동안 배양한 후 7일째 배반포가 형성된 배만을 선별해 이중염색법을 통해 내부세포괴(inner cell mass : 이하 “ICM”이라 칭함)와 영양막(trophoblast : 이하 “TE”라 칭함)의 세포수를 조사하여 질적인 측면에서 조사하였다. 각각의 배반포기의 배는 0.5% 프로나아제(pronase)에 1분간 처리하여 투명대를 제거하였다. 처리 후 1 ㎎/㎖ 폴리비닐 알코올이 함유된 TL-Hepes 배양액을 이용하여 세척하였다. 투명대가 제거된 배를 TL-Hepes(Tyrodes lactate)와 1:5의 비율로 희석된 항 돼지 전체 혈청(anti-pig whole serum)을 이용하여 38.5℃, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 처리하였다. 이후 처리된 배를 TL-Hepes 배양액으로 5회 세척하였다. 세척 후 상기 배를 10㎍/㎖ PI(propidium iodide)와 10㎍/㎖ 비즈벤즈아미드(bisbenzimide)가 첨가된 기니아 피그 보체(guinea pig complement)가 TL-Hepes 배양액과 1:5의 비율로 희석된 완충액에서 1시간 동안 처리하였다. 1 시간 동안 처리된 배반포를 0.1% PVA-PBS 완충용액으로 3회 이상 세척한 후 형광현미경 하에서 세포의 수를 조사하였다. ICM은 푸른색으로 염색되며 TE는 붉은 색으로 염색이 된다. 조사된 각각의 세포수 결과를 하기 표 6과 표 7 및 표 8에 나타내었다.

소 체외수정란

하기 표 6은 소 체외 수정란을 아일로프로스트(1 μM)가 첨가된 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포와 일반 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포의 ICM과 TE의 세포수를 조사한 결과를 나타낸다. 아일로프로스트(1 μM)가 첨가된 배양액에서 배양된 배의 세포수는 165.1 ± 6.1개로 관찰되었고, 대조군 배반포의 세포수는 146.1 ± 5.7개로 관찰되었다. 전체 세포수에 대한 ICM 세포수의 비율은 42 ± 3.0%와 실험군인 42 ± 3.0%로서 유의적인 차이는 없었다. 이를 통해, 배양액에 아일로프로스트를 첨가함으로써 전체 세포수가 증가되었음을 알 수 있다.

돼지 체외 수정란

하기 표 7은 돼지 체외 수정란을 아일로프로스트(1 μM)가 첨가된 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포와 일반 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포의 ICM과 TE 세포의 세포수를 조사한 결과를 나타낸다. 하기의 결과와 같이, 돼지 수정란에서 세포 수의 증가를 가져왔다. 아일로프로스트(iloprost 1μM)를 처리한 실험군에서는 35.6 ± 1.4 개로, 아일로프로스트를 처리하지 않은 대조군 29.0 ± 2.5 개에 비해 평균 6개 정도의 세포수를 증가시키는 것을 확인하였다. 이를 통해 돼지 수정란의 문제점이었던 비정상적인 세포수가 아일로프로스트의 첨가를 통해 세포수를 증가시킴으로써 배반포의 질적 개선이 이루어짐을 확인하였다.

아일로프로스트 처리가 소 체외 수정란 유래 배반포의 세포수 증가에 미치는 영향

구분		대조군	실험군
사용된 배반포수		18	15
배반포의 세포수 (평균±표준오차)	내부세포	61.3 ± 4.2	69.4 ± 4.9
	영양막	84.6 ± 5.1	95.7 ± 4.8
	전체세포수	146.1 ± 5.7	165.1 ± 6.1
내부세포/전체세포수 (평균±표준오차)		42 ± 3.0	42 ± 3.0

아일로프로스트 처리가 돼지 체외 수정란 유래 배반포의 질적 향상에 미치는 영향

구분		대조군	실험군
사용된 배반포수		53	82
배반포의 세포수 (평균)	내부세포	2.5 ± 0.2	4.1 ± 0.2
	영양막	26.6 ± 2.2	31.5 ± 1.6
	전체세포수	29.0 ± 2.5	35.6 ± 1.4

소 복제 수정란

하기 표 8은 소 복제 수정란을 아일로프로스트(1 μM)가 첨가된 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포와 일반 배양액에서 배양시켜 형성된 배반포의 ICM과 TE 세포의 세포수를 조사한 결과를 나타낸다. 하기의 결과와 같이, 복제 수정란에서도 체외 수정란의 세포 수 증가 효과와 동일하게, 아일로프로스트(iloprost 1μM)를 처리한 실험군에서는 96.6 ± 2.9 개로, 처리하지 않은 대조군 90.8 ± 7.0 개에 비해 평균 6개 정도의 세포수를 증가시키는 것을 확인하였다. 이를 통해 복제 수정란의 문제점이었던 전체 세포수에 대한 내부세포수의 비정상적인 비율이 아일로프로스트의 첨가를 통해 영양막의 세포수를 증가시킴으로써 배반포의 질적 개선이 이루어짐을 확인하였다(Koo DB et al ., Biology of Reproduction 67:487-492, 2002).

아일로프로스트 처리가 소 복제 수정란 유래 배반포의 질적 향상에 미치는 영향

구분		대조군	실험군
사용된 배반포수		5	6
배반포의 세포수 (평균 ± 표준편차)	내부세포	41.6 ± 6.0	31.0 ± 4.2
	영양막	49.2 ± 4.0	65.1 ± 5.4
	전체세포수	90.8 ± 7.0	96.6 ± 2.9
내부세포/전체세포수 (평균 ± 표준오차)		39.5 ± 4.1	32.2 ± 2.9

본 발명의 프로스타싸이클린 유사체를 포함하는 체외 배양용 배지 및 상기 배지를 이용한 포유동물 수정란의 대량 생산 방법은 체외 수정란 및 복제 수정란의 배반포까지의 배 발생률과 배반포기의 발달 속도 및 내부세포괴와 영양막 세포를 포함한 전체 세포수를 증가시킴으로써, 질적으로 개선된 체외 수정란의 대량 생산 체제의 확립 및 복제 및 형질전환 복제 수정란의 생산 기반을 구축하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

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다음의 단계를 포함하는 포유동물 체외 성숙란의 대량 생산 방법:

1) 인간을 제외한 포유동물로부터 난포란을 채취하는 단계;

2) 단계 1에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계; 및

3) 상기 회수된 미성숙 난자를 프로스타싸이클린 유사체를 포함하는 배지에서 배양하여 성숙시키는 단계.
다음의 단계를 포함하는 포유동물 체외 수정란의 대량 생산 방법:

1) 인간을 제외한 포유동물로부터 난포란을 채취하는 단계;

2) 단계 1에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계;

3) 상기 회수된 미성숙 난자를 프로스타싸이클린 유사체를 포함하는 배지에서 배양하여 체외 성숙시키는 단계;

4) 동결 정자를 해동하여 단계 3에서 성숙된 난자에 체외 수정시키는 단계; 및

5) 단계 4에서 제조된 체외 수정란을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 배지에서 배양하는 단계.
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다음의 단계를 포함하는 포유동물 복제 수정란의 대량 생산 방법:

1) 인간을 제외한 포유동물로부터 난포란을 채취하는 단계;

2) 단계 1에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계;

3) 상기 회수된 미성숙 난자를 프로스타싸이클린 유사체를 포함하는 배지에서 배양하여 체외 성숙시키는 단계;

4) 단계 3의 수핵란에서 제핵하는 단계;

5) 체세포를 단계 4의 수핵란에 이식하여 세포 융합시키는 단계;

6) 단계 5의 융합한 복제 수정란을 자극하여 활성화시키는 단계; 및

7) 단계 6의 복제 수정란을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 배지에서 배양하는 단계.
제9항, 제10항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3) 의 배지는 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민 및 기타 통상적인 보조인자들과 함께 프로스타싸이클린 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지인 방법.
제9항, 제10항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3) 의 프로스타싸이클린 유사체는 아일로프로스트(iloprost), ZK 36374 및 15(R)-아일로프로스트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항, 제10항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3) 의 배지는 프로스타싸이클린 유사체로서 아일로프로스트를 0.1 내지 10 μM 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항, 제10항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 3) 의 배지는 아일로프로스트를 1 μM 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.