KR100500412B1 - 핵이식에 의한 동물의 복제란 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동물의 복제란 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 난자의 핵을 염색하지 않고 제 1 극체와 10 내지 20%의 세포질을 흡입(suction)하여 난자의 핵을 제거하는 단계; 제 1 극체와 핵을 제거한 상기 난자의 위란강에 체세포를 주입하여 난자-체세포 복합체를 제조하는 단계; 및 ⅲ) 0.5 내지 2 ㎸/㎝, 6 내지 150 ㎲로 1 내지 3회 시행하는 전기적 자극으로 상기 난자-체세포 복합체를 세포융합 및 활성화시키는 단계를 포함하는 동물의 복제란 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 복제란 제조방법은 고효율의 제핵률을 나타낼 뿐만 아니라 복제과정을 단순화시킴으로써 다양한 생물의 체세포를 복제하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 핵이식에 의한 동물의 복제란 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 난자의 제 1 극체와 핵을 제거하고, 난자의 위란강에 체세포를 주입하여 세포융합 및 활성화를 시키는 단계를 포함하는 복제란을 제조하는 방법에 관한 것이다.
복제(cloning)는 유전적으로 동일한 개체를 만드는 것으로써 핵이식(nuclear transfer)은 진핵생물에 있어서의 복제의 한 방법으로 최근 분자생물학의 급격한 발달로 새로이 주목받게된 기술이다. 초기의 핵이식은 핵의 공급원으로 수정란의 할구를 이용하였으나(Prather, et al., Biol. Reprod., 1987, 37:856-866; Prather, et al., Biol. Reprod., 1989, 41:414-418), 최근에는 체세포의 핵을 이용하게 되었다.
체세포 복제는 분화된 체세포를 핵이 제거된 난자에 넣어 활성화시킨 다음에 일반 수정란과 동일한 방법으로 발생시키는 기술이다. 이와 같은 복제기술은 발생생물학 분야를 비롯한 기초과학 분야의 연구에 널리 이용될 수 있을 뿐만 아니라 유용 단백질의 생산, 질환 모델의 개발 및 장기 이식 분야 등 다양한 의학 및 의약 분야에 크게 기여할 것으로 예상되어 그 산업적 이용성이 매우 크다고 할 수 있다.
최초의 체세포 복제 동물인 돌리(Willmut, I. et al., Nature, 1997, 385:810-813) 양이 탄생한 이후, 체세포 복제 분야는 많은 발전을 거듭하여 소(Cibelli, JB. et al., Science, 1998, 280:1256-1258; Wells, DN. et al., Reprod. Fertil. Dev., 1998, 10:369-378), 생쥐(Wakayama, T. et al., Nature, 1998, 394:369-374), 산양(Bagusi, A. et al., Nat. Biotechnol., 1999, 17:456-461) 등의 복제에 성공을 하게 되었다. 그러나, 돼지는 다른 종에 비하여 수정란에 대한 연구가 상대적으로 적게 이루어졌고, 최소한 4마리의 태아가 자궁에 착상해야만 임신이 유지되는 생리적 특성 등 여러 가지 어려움 때문에 주요 가축 중에서는 늦게 복제에 성공을 하게 되었다(Poleajaeva, IA. et al., Nature, 2000, 407:86-90; Onishi, A. et al., Science, 2000, 289:1188-1190; Betthauser, J. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18:1055-1059). 그 후, 돼지 체세포에 외부 유전자를 주입시켜 복제에 성공함으로써 최초의 형질전환 복제 돼지가 탄생하였고(Park, KW. et al., Anim. Biotechnol., 2001, 12:173-181), 특정유전자를 체세포에서 유전자결손(knockout)시킨 복제돼지도 성공하였다(Lai, L. et al., Nat. Biotechnol., 2002 Mar, 20(3):251-255). 그러나, 돼지 체세포 복제 분야의 급속한 발전에도 불구하고 아직도 복제의 효율은 1-5%로 낮아 효율을 개선시키기 위한 많은 연구가 진행중이다.
체세포 복제 기술 중에서 핵심이 되는 기술은 핵이식 과정에서 체세포를 난자의 위강란에 주입하기에 앞서서, 난자의 핵을 제거하는 과정에 있다. 난자의 핵을 제거하기 위해서는 헥스트(hoechst) 33342라는 형광염색을 일반적으로 이용하고 있다. 즉, 난자를 헥스트 33342로 염색한 후 자외선(UV) 하에서 난자의 핵을 제거한다. 이때, 상기 형광염색이나 자외선에의 노출은 핵이식란의 발생에 영향을 줄 가능성이 높으며(Tao, T. et al., Zygote, 2000, 8:69-77), 이러한 복잡한 과정은 복제를 하는 연구자에게도 많은 피로를 야기시켜 복제란의 제조 효율을 감소시키는 요인이 되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 형광염색 및 자외선을 이용하지 않고도 핵을 제거하고 난자와 체세포의 융합 이후에 부가적인 활성화 자극 없이도 복제란을 활성화시킴으로써 핵이식 과정을 단순화시킬 수 있는 고효율의 체세포 복제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ) 난자의 핵을 염색하지 않고 제 1 극체와 10 내지 20%의 세포질을 흡입(suction)하여 난자의 핵을 제거하는 단계; ⅱ) 제 1 극체와 핵을 제거한 상기 난자의 위란강에 체세포를 주입하여 난자-체세포 복합체를 제조하는 단계; 및 ⅲ) 0.5 내지 2 ㎸/㎝, 6 내지 150 ㎲로 1 내지 3회 시행하는 전기적 자극으로 상기 난자-체세포 복합체를 세포융합 및 활성화시키는 단계를 포함하는 동물의 복제란 제조방법을 제공한다.
상기에서 "극체"는 난자가 수정 전 제2 감수분열에 의하여 난세포질의 일부가 분열하여 나온 돌기를 가리키며(도 1 참조),"위란강"은 난자의 투명대와 난세포질 사이의 공간을 가리킨다. 또한, "난자-체세포 복합체"는 난자의 핵을 제거한 후 체세포를 위란강에 주입하고 세포융합이 일어나기 전 단계를 가리키며, "복제란"은 전기적 자극에 의하여 난자와 체세포가 융합된 단계를 가리킨다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 복제란 제조방법은 ⅰ) 난자의 핵을 염색하지 않고 제 1 극체와 10 내지 20%의 세포질을 흡입하여 난자의 핵을 제거하는 단계; ⅱ) 제 1 극체와 핵을 제거한 상기 난자의 위란강에 체세포를 주입하여 난자-체세포 복합체를 제조하는 단계; 및 ⅲ) 0.5 내지 2 ㎸/㎝, 6 내지 150 ㎲로 1 내지 3회 시행하는 전기적 자극으로 상기 난자-체세포 복합체를 세포융합 및 활성화시키는 단계를 포함한다.
상기에서 단계 ⅰ)의 흡입은 직경 20-40 ㎛, 30-60°의 선단 구조인 유리관을 사용하여 유압 차를 이용하여 이루어지는 것이 바람직하다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에서와 같이 먼저 난자의 극체를 1시 방향으로 고정시키고 30-60°로 날카롭게 연마한 미세유리관을 극체가 있는 방향으로 찔러 넣는다. 유압을 이용하여 극체와 극체 주위의 세포질을 약 10 내지 20% 정도 흡입한다. 이때, 대부분의 핵은 극체 주위에 위치해 있으므로 상기 과정에서 난자의 핵의 대부분이 제거된다.
또한, 단계 ⅰ)에 있어서 복제란을 제조하기 위한 난자는 인간을 제외한 포유동물로부터 채취되는 것이 바람직하고, 돼지, 소, 산양, 생쥐(mouse), 큰쥐(rat), 토끼, 개, 고양이로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 종인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 복제 대상인 체세포는 인간을 제외한 포유동물로부터 채취되는 것이 바람직하고, 돼지, 소, 산양, 생쥐, 큰쥐, 토끼, 개, 고양이로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 종인 것이 더욱 바람직하며, 돼지인 것이 가장 바람직하다.
또한, 단계 ⅱ)에 있어서 난자의 핵을 제거한 후 1분 내에 체세포를 주입하는 것이 바람직하다.
종래기술에서는 핵이식에 사용될 모든 난자의 핵을 제거한 후 체세포 주입에 들어가므로, 난자의 핵을 제거하는 데 소요되는 시간이 약 1-3시간 이 소요된 이후에 체세포의 주입에 들어간다. 그러나, 본 발명은 난자의 핵 제거 후 바로 체세포 주입과정을 진행하므로 그 시간을 1분 내로 줄일 수 있다.
아울러, 단계 ⅲ)에 있어서 상기 전기적 자극은 1.0 내지 1.2 ㎸/㎝, 30 ㎲로 2회 시행하는 것이 바람직하다.
상기 ⅰ), ⅱ) 단계에서 핵이 제거된 난자의 위란강에 주입된 체세포를 본 단계에서 전기적 자극으로 난자와 체세포를 융합시키며(Poleajaeva, IA. et al., Nature, 2000, 407:86-90; Betthauser, J. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18:1055-1059; Park, KW. et al., Anim. Biotechnol., 2001, 12:173-181), 융합 후에는 전기적 자극 또는 화학적 자극을 통하여 복제란의 활성화를 유도할 수 있다.
본 발명의 복제란 제조방법은 체세포의 핵이식 과정 등을 단순화함으로써 복제 과정을 단순화시킬 뿐만 아니라 그 생산효율을 증진시키는 것으로 그 특징은 다음과 같다.
첫째, 난자의 핵을 제거할 때 종래에 일반적으로 사용되는 형광염색을 위한 DNA 특이 형광물질을 사용하지 아니하며, 상기 방법으로도 높은 제핵률을 나타낸다. 일반적으로 난자의 핵을 제거할 때는 종래에는 통상적으로 DNA 특이 형광염색 물질인 헥스트를 널리 사용하여 왔다. 그러나, DNA가 염색된 형광염색체는 난자에 악영향을 줄 수 있으며(Tao, T. et al., Zygote, 2000, 8:69-77), 또한 상기 형광염색체를 검사하기 위하여 조사되는 자외선 또한 난자에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다. 본 발명에서는 상기 과정을 생략하면서도 난자로부터 효율적으로 핵을 제거시킨다.
둘째, 난자의 핵을 제거한 후 바로 체세포를 주입한다. 종래에는 일반적으로 먼저 전체 난자의 핵을 하나씩 제거하여 모든 난자의 핵을 제거한 후, 체세포를 주입하였다. 상기 제핵 방법은 체세포 주입시에 난자의 제핵시에 생성된 구멍을 다시 찾아야 하며, 만일 체세포 주입을 위하여 난자에 새로운 구멍을 만든다면 제핵시에 형성된 구멍을 통하여 난자의 세포질 성분이 유출될 위험이 있으므로, 일반적으로 제핵시에 생성된 구멍을 통하여 체세포를 주입하였다. 이때, 난자에서 제핵시의 구멍을 찾는 것은 쉽지 않아 상당한 시간을 필요로 할 뿐만 아니라 복제란에게도 상당한 스트레스를 주게 된다. 따라서, 100개 이상의 다량의 복제란을 제조하는 경우에, 본 발명에서와 같은 제핵 후에 바로 체세포를 주입하는 방법은 상기와 같은 불편을 덜어주고, 상당한 시간을 절약할 수 있다.
셋째, 한번의 전기 충격으로 세포융합과 활성화를 유도한다. 핵이식란에서 난자와 체세포는 일반적으로 전기적 자극으로 세포융합된다(Poleajaeva, IA. et al., Nature, 2000, 407:86-90; Betthauser, J. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18:1055-1059; Park, KW. et al., Anim. Biotechnol., 2001, 12:173-181). 상기 세포융합 후 일정 시간이 경과한 후에 또 한번의 전기적 자극 또는 화학적 자극을 통하여 복제란의 활성화를 유도하는데(Poleajaeva, IA. et al., Nature, 2000, 407:86-90; Betthauser, J. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18:1055-1059), 종래에는 이러한 세포융합 후 부가적인 활성화를 유도하는 경우에 배반포("수정란이 수회의 분할을 거쳐 세포수가 증가하고 포배강이 형성되어 자궁에 착상되기 전 단계"를 가리킨다)까지의 발생률은 7 내지 10%가 일반적이다(Betthauser, J. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18:1055-1059; Koo, D-B. et al., Biol Reprod., 2000, 63:986-992). 그러나, 본 발명에서는 활성화 자극을 주지 않더라도 배반포까지의 발생률이 14.6 내지 16.6%로 높은 발생률을 나타낸다(도 1 참조). 본 발명에 있어서, 종래기술과 같이 융합 후 1 내지 2시간의 추가적인 전기적 자극에 의한 배반포까지의 발생률은 상기 발생률과 큰 차이를 나타내지 아니하였다.
이러한 복제 과정의 단순화는 난자 및 복제란의 체외조작 시간을 극소화할 뿐만 아니라 형광염색 및 복제란의 활성화를 위한 추가적인 자극을 없앰으로써 난자 및 복제란에 미치는 자극을 최소화하는 이점이 있다. 또한, 복제란에 미치는 손상의 최소화와 더불어 복제란 제조자의 노동시간을 감소시켜 제조자의 피로 등에 의한 복제란의 제조 효율의 감소를 최소화하는 부가적 효과도 발생된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 난자의 채취
도축장에서 미경산돈의 난소를 채취하여 35 내지 39℃, 0.9% 생리적 식염수에 보관하였다. 10 ㎖ 주사기에 18 게이지 바늘을 연결하여 상기 난소의 직경 2 내지 6 ㎜ 난포에서 난포액을 흡입하여 난자를 채취하였다. 상기 난자를 성숙배양액에서 세척하고, 500 ㎕ 배양액에 50 내지 60개의 난자를 넣어 42 내지 46시간 동안 배양하였다.
이때, 상기 성숙 배양액은 TCM 199(31100035; Gibco, Grand Island, NY)에 0.1% 폴리비닐알콜(polyvinyalcohol), 3.05 mM 포도당(D-glucose), 0.91 mM 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 0.5 ㎍/㎖ LH(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0.5 ㎍/㎖ FSH(Sigma), 10 ng/㎖ 표피성장인자(epidermal growth factor, Sigma), 75 ㎍/㎖ 페니실린 G 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가하여 제조되었다.
<실시예 2> 체세포의 배양
임신 30 내지 35일 된 임신돈을 도축하여 돼지 태아를 체취한 후 얼음에 넣어 실험실로 운반했다. 돼지태아를 가위로 잘게 자른 후, 돼지 체세포를 0.05% 트립신 및 0.5 mM EDTA가 첨가된 PBS(phosphate buffered saline; 인산완충식염수)에서 30분간 배양하였다. 원심분리로 상층액을 제거한 후, 10% FCS(fetal calf serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modifided Eagle medium) 배양액(BioWhittaker)에서 2-3일간 배양하였다. 바닥의 80%를 세포가 덮을 때까지(80% confluency) 배양시킨 후, 트립신 처리 후 계대배양하여 세포의 일부는 핵이식에 이용하고 나머지 세포는 동결 보존하였다.
<실시예 3> 미세조작(micromanipulation)
실시예 1에서 채취된 난자를 미세조작용 배양액에서 5 내지 10 분간 배양한 후, 실시예 2에서 배양된 체세포를 상기 배양액에 첨가하였다. 이때, 미세조작용 배양액은 TCM 199에 0.3% BSA 및 7.5 ㎍/㎖ CB(cytochalasin B)를 첨가하여 제조되었다.
난자의 핵을 제거하기 위하여, 선단이 30-60°로 날카롭게 연마된 직경 30 ㎛의 미세유리관을 준비하였다. 먼저 난자의 극체를 1시 방향으로 고정시키고, 상기 미세유리관을 극체가 있는 방향으로 찔러 넣었다. 유압을 이용하여 극체와 극체 주위의 세포질을 약 10-20% 정도 흡입하였고, 대부분의 핵은 극체 주위에 위치해 있으므로 상기 과정에서 대부분의 난자의 핵이 제거되었다. 그 후에 상기 미세유리관을 이용하여 실시예 2에서 제조된 돼지 체세포를 흡입하고 상기 미세유리관을 핵이 제거된 난자의 위란강에 위치시킨 후 유압을 이용하여 체세포를 난자의 위란강에 주입시켰다(도 1).
<실시예 4> 난자 핵의 염색
상기 실시예 3 이후에 참고적으로 난자의 제핵 정도를 확인하기 위하여, 일부 난자는 핵을 제거시킨 후 체세포를 주입하지 않고 헥스트 33342(Sigma)로 형광염색하여 제핵률을 검사하였다(도 2).
이것은 종래 기술에서 제핵에 앞서서 형광염색하는 것과는 달리, 본 발명에서는 제핵이 완료된 후 제핵 정도를 판별하기 위하여 형광염색을 하였다. 그 결과, 제핵률은 350번의 반복 시행에서 86.3%에 이르렀으므로, 본 발명의 방법을 사용함으로써 제핵에 앞서서 형광염색을 이용하지 않고서도 높은 효율로 난자로부터 핵을 제거시킬 수 있음을 확인하였다. 따라서, 이후의 실시에서는 전혀 형광염색 없이 실시예 3의 제핵 후, 바로 실시예 5의 단계를 수행하였다.
<실시예 5> 세포융합, 활성화 및 복제란의 배양
<5-1> 세포융합 및 활성화
실시예 3의 미세조작이 끝나면 핵이식란을 활성화 배양액에 넣은 후 간격이 1 ㎜ 떨어진 백금 전기선 사이에 난자-체세포 복합체를 위치시키고, 융합기(BTX Electro-Cell Manipulation 2001)로 1.0 내지 1.2 ㎸/㎝, 30 ㎲의 DC 펄스를 2회 가하여 세포융합 및 활성화를 유도하였다. 전기 자극을 가한 후 0.5 내지 1시간 후에 융합률을 검사하였다. 이때, 미세조작을 하지 않은 난자에 동일 조건의 전기 자극을 준 경우를 대조군으로 설정하였으며, 상기 활성화 배양액은 0.3 M 만니톨(mannitol)에 1 mM CaCl2ㆍH2O, 0.1 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 0.5M HEPES 완충액을 첨가하여 제조되었다.
<5-2> 복제란의 배양 및 발생
실시예 <5-1>에서 제조된 융합 복제란을 선별한 후, 500 ㎕의 발생 배양액이 들어 있는 4-웰 용기에서 20 내지 30개의 복제란을 6일 동안 배양하였다. 배양완료 후에 5 ㎍/㎖의 헥스트 33342로 염색하고, 형광현미경 하에서 복제란과 단위 발생란("난자가 수정현상을 거치지 않고 외부의 자극에 의해 활성화되어 수정란과 동일하게 난분할을 하는 난"을 가리킨다)의 핵수를 검사하였다. 이때, 미세조작을 하지 않은 단위 발생란을 동일한 방법으로 배양한 경우를 대조군으로 설정하였으며, 상기 발생 배양액은 NCSU-23(북캐롤리나주립대-23; Petters, RM. and Wells, KD., J. Reprod. Fertil. Suppl., 1993, 48:61-73) 배지에 0.4% BSA를 첨가하여 제조되었다.
그 결과, 1.0 ㎸/㎝ 전기 자극 처리군이 66.1%, 1.1 ㎸/㎝ 처리군이 81.5%, 그리고 1.2 ㎸/㎝ 처리군이 78.5%의 융합률을 나타내어, 상대적으로 1.0 ㎸/㎝ 처리군의 융합률이 유의적으로 낮았다. 그러나, 분할률에서는 67.2 내지 68.6%, 배반포 생산률에서는 14.6 내지 16.6%, 그리고 배반포 세포수에서는 22.1 내지 24.5로 나타나, 전압을 달리한 처리구 사이에서 차이를 나타내지 않았다(표 1)
| 처리 | 전압(㎸/㎝) | 난자의 수 | 융합률(%) | 분할률(%) | 배반포 발생률(%) | 배반포 생산수(범위) |
| 대조군 | 1.0 | 118 | 68.4 ±5.5 | 17.4 ±2.5 | 26.3 ±2.3 (13-54) | |
| 1.1 | 141 | 84.0 ±5.0 | 12.7 ±2.3 | 25.3 ±2.5 (26-56) | ||
| 1.2 | 230 | 75.2 ±4.1 | 19.9 ±1.9 | 27.9 ±1.6 (14-68) | ||
| 핵이식란 | 1.0 | 190 | 66.1 ±3.1 | 67.6 ±5.0 | 16.6 ±2.3 | 22.1 ±2.3 (17-38) |
| 1.1 | 224 | 81.5 ±3.1 | 68.6 ±5.0 | 15.8 ±2.3 | 23.8 ±2.0 (10-40) | |
| 1.2 | 299 | 78.5 ±2.7 | 67.2 ±4.3 | 14.6 ±2.0 | 24.5 ±1.9 (14-41) |
상기 표 1에서,
,
,
을 나타낸다.
상기 결과로부터, 본 발명의 복제란 제조방법은 종래의 방법에 비하여 융합률 및 분할률이 현저히 높음을 알 수 있으며, 따라서 융합 유무를 확인하기 위한 핵염색 과정을 생략할 수 있음을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 복제란 제조방법은 돼지의 복제 과정을 단순화하여 고효율의 복제란을 제조할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 멸종위기 동물의 보존, 유용 단백질의 생산, 질환 모델의 개발 및 부족한 장기의 공급 등을 위한 복제란의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 형광염색을 통하지 않고 난자에서 핵을 제거하는 방법을 보여주는 사진이고,
ⓐ 난자의 극체를 1시 방향으로 고정,
ⓑ 극체를 중심으로 약 10 내지 20% 세포질의 제거,
ⓒ 핵을 제거하고 체세포를 위란강에 삽입,
ⓓ 체세포가 위강란에 삽입된 모습
도 2는 복제란을 6일간 배양한 후 핵을 염색한 사진이다.
ⓐ 일반 현미경 사진,
ⓑ 형광염색 후의 형광현미경 사진
Claims (17)
- ⅰ) 인간을 제외한 포유류 유래의 난자의 핵을 염색하지 않고 제 1 극체와 10 내지 20%의 세포질을 흡입하여 난자의 핵을 제거하는 단계;ⅱ) 제 1 극체와 핵을 제거한 상기 난자의 위란강에 인간을 제외한 포유류 유래의 체세포를 주입하여 난자-체세포 복합체를 제조하는 단계; 및ⅲ) 0.5 내지 2 ㎸/㎝, 6 내지 150 ㎲로 1 내지 3회 시행하는 전기적 자극만으로 상기 난자-체세포 복합체를 세포융합 및 활성화시키는 단계를 포함하는, 동물의 복제란 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 난자는 i)난소를 채취하는 단계; ii) 난소의 직경 2 내지 6mm 난포에서 난포액을 흡입하여 채취하는 단계; 및 iii) 난자는 배양액에서 배양하여 성숙시키는 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 2항에 있어서, 배양액은 TCM 199에 0.1% 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 3.05 mM 포도당(D-glucose), 0.91 mM 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 0.5 ㎍/㎖ LH, 0.5 ㎍/㎖ FSH, 10 ng/㎖ 표피성장인자, 75 ㎍/㎖ 페니실린 G 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가하여 제조하는 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 체세포는 i) 돼지 태아의 체세포를 채취하여 배양시키는 단계; ii) 원심분리하여 상등액을 제거한 후 배양시키는 단계; 및 iii) 세포가 바닥의 80% 정도를 덮을 때까지 배양시킨 후 트립신 처리 후 계대배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 4항에 있어서, 단계 i)의 배양액은 0.05% 트립신 및 0.5mM EDTA가 첨가된 PBS(Phosphate Buffered Saline)인 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 4항에 있어서, 단계 ii)의 배양액은 10% FBS(Fetal Bovine Serum)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)인 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 난자와 체세포는 동일한 미세조작용 배양액에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 7항에 있어서, 난자를 먼저 미세조작용 배양액에서 5-10분간 배양한 후, 체세포를 가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 8항에 있어서, 미세조작용 배양액은 TCM 199에 0.3% BSA 및 7.5 ㎍/㎖ CB(cytochalasin B)가 첨가된 것임을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 흡입은 직경 20-40 ㎛, 30-60°의 선단 구조인 유리관인 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 흡입은 유압차를 이용하는 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 i)은 난자의 극체를 1시 방향으로 고정시키고, 미세유리관을 극체가 있는 방향으로 찔러 제1극체와 10~20%의 세포질을 흡입하여 핵을 제거하는 것을 특징을 하는 복제란의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 단계 ii)는 미세유리관을 이용하여 체세포를 흡입하고 상기 미세관을 핵이 제거된 난자의 위란강에 위치시킨 후 유압을 이용하여 체세포를 난자의 위란강에 주입하는 것을 특징을 하는 복제란의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 인간을 제외한 포유동물은 돼지, 소, 산양, 생쥐, 큰쥐, 토끼, 개, 고양이로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 종인 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 i) 단계 이후에 1분 내에 상기 체세포를 주입하는 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 1.0 내지 2.0 ㎸/㎝, 30 ㎲로 2회 전기적 자극을 시행하는 것을 특징으로 하는 복제란의 제조방법.
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Cited By (2)
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| WO2014178485A1 (ko) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | 건국대학교 산학협력단 | Ｃｍｐ-아세틸뉴라미닌산 히드록실라아제 타겟팅 벡터, 그 벡터가 도입된 이종간 이식용 형질전환 동물 및 그 제조방법 |
| KR102055580B1 (ko) | 2019-07-29 | 2019-12-13 | 주식회사 엠케이바이오텍 | 교체가 용이한 백금선을 이용한 체세포 핵이식란 생산용 전기 융합 바늘 |
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| KR102520269B1 (ko) * | 2020-12-04 | 2023-04-13 | 대한민국 | microRNA-29b 직접 주입을 통한 돼지 체세포 핵치환란의 발달율 향상 방법 |
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- 2003-03-06 KR KR10-2003-0014132A patent/KR100500412B1/ko active IP Right Grant
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