JP4997510B2 - 魚類胚の作製方法 - Google Patents
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Description
未受精卵に魚類の細胞核を移植して魚類胚を作製する工程を備え、
該魚類胚の作製工程は、前記未受精卵に対して物理的及び/又は化学的なストレスを付与する処理工程を含む、
魚類胚の作製方法が提供される。また、形態においては、前記処理工程は、発生を開始した未受精卵に染色体二倍体化を生じさせるか又はそれと同等の物理的及び/又は化学的ストレスを付与することを含む工程とすることができる。また、前記処理工程は、前記未受精卵に対してその第二極体の放出を阻止するか又は抑制する物理的及び/又は化学的ストレスを付与することを含む工程としてもよい。さらに、前記物理的及び/又は化学的ストレスは少なくとも前記未受精卵の環境温度についてのストレスを含むものとすることができる。
内在性核を有する未受精卵に対し、該未受精卵を活性化する刺激と発生を開始した未受精卵に染色体二倍体化を生じさせるか又はそれと同等の物理的及び/又は化学的なストレスとを付与する処理工程と、
該処理工程後の未受精卵に魚類の体細胞又は培養細胞の細胞核を移植する核移植工程と、
を備える、魚類胚の作製方法も提供される。
上記いずれかの魚類胚の作製方法によって得られる魚類胚も提供される。
上記いずれかに記載の魚類胚の作製方法における各工程と、
作製された前記魚類胚を孵化まで発生させる工程と、
を備える、魚類個体の作製方法が提供される。この形態においては、前記魚類個体を繁殖させる工程を備えることもできる。
上記した魚類個体の作製方法によって得られる魚類個体が提供される。さらにまた、第5の形態によれば、この魚類個体の細胞が提供される。
魚類細胞に外来DNAを導入して染色体上に外来DNAを有する魚類細胞を得る工程と、
未受精卵に前記外来DNAが染色体上に導入された魚類細胞核を移植して魚類胚を作製する工程と、
該魚類胚を孵化まで発生させる工程と、
を備え、
前記魚類胚の作製工程は、前記未受精卵に対して物理的及び/又は化学的なストレスを付与する処理工程を含む工程である、
トランスジェニック魚類の作製方法が提供される。
魚類胚の倍数性の調整方法であって、
前記魚類胚は、未受精卵を活性化する刺激を付与し、その後前記未受精卵に対して物理的及び/又は化学的なストレスを付与した後、魚類の細胞核を移植して魚類胚を作製するのに先立って、
前記未受精卵を活性化後から前記物理的及び/又は化学的ストレスの付与まで前記未受精卵の保存条件を設定する工程を備える、調整方法も提供される。
本発明において魚類胚とは、魚類個体を構築しうる遺伝物質を保持し、かつ魚類個体の孵化に至るまでの全ての段階にあるものをいう。また、ここで魚類個体とは、成魚のほか、一旦孵化したものは幼魚であっても個体というものとする。本発明は少なくとも魚類に適用される。魚類としては特に限定しないが、例えば、研究又は実験用途として、ゼブラフィッシュ、メダカ、キンギョ、ドジョウが挙げられる。また、鑑賞用途としては、コイ、フナ、メダカ、キンギョ等が挙げられる。さらに、食用としては、サケ、マス、ニジマス、ヤマメ、アマゴ、ウナギ、ブリ、コイ、ヒラメ、マダイ、ティラピア等が挙げられる。なかでも、特開2001−346480号公報に開示される透明メダカなどを含むメダカ属又はその近縁に属する魚類は各種のモデル魚など研究用途の他鑑賞用途にも適している。さらに、本発明を適用する魚類は、天然変異又は既に人工的に遺伝子が修飾された魚類も包含しており、これらの改変魚類の遺伝的性質を維持しあるいはさらに改変する場合にも有用である。
本発明における未受精卵は、核移植による魚類胚作製にあたり、魚類胚に細胞質を提供するレシピエント細胞となることができる。本発明において用いる未受精卵は、第二減数分裂のメタフェーズで停止した未受精卵(いわゆる成熟した未受精卵)であることが好ましい。こうした未受精卵は、成熟した雌の個体の卵巣等から採取することもできるし、卵母細胞をインビトロで培養し第二減数分裂のメタフェーズを到来させることにより得ることもできる。
未受精卵への魚類の細胞核の供給細胞(以下、単にドナー細胞という。)は、レシピエント細胞である未受精卵へ核を提供する。ドナー細胞としては、少なくとも個体の発生に必要な染色体セットを有していれば特に限定されないで、胚性細胞、幼生及び成体の体細胞のいずれかを用いることができる。また、細胞核が提供されるのに適した時期も特に限定されず、ドナー細胞は二倍体であっても四倍体であってもよいが、二倍体が好ましい。なお、本明細書において、胚性細胞は、受精卵から孵化に到達するまでの全ての発生段階にある細胞を包含している。また、胚性細胞には、胚性幹細胞、始原生殖細胞から誘導した胚性細胞も包含される。以上のことから明らかなように、ドナー細胞は、未分化の細胞のみならず分化した細胞も包含している。また、ドナー細胞は、融合細胞に由来する細胞であってもよい。さらに、ドナー細胞は培養細胞であることが好ましく、体細胞の培養細胞であることがより好ましい。
未受精卵に供給される細胞核は、ドナー細胞本来の内在性染色体DNAを含む。ドナー細胞の染色体には天然の又は人工的に導入された変異を備えていてもよい。人工的変異は化学的又は物理的な処理のほか、相同組換えにより導入されていてもよい。また、ドナー染色体には、外来性のDNAを備えていてもよい。外来DNAとしては所望のタンパク質をコードするDNAや選択マーカーをコードするDNAのほかプロモーター、エンハンサー等の各種調節領域をコードするDNA、RNA干渉を生じさせるRNAに対応するDNA等が挙げられる。これらの外来DNAは、染色体上にランダムに導入されていてもよいが、相同組換えにより染色体上に導入されていることが好ましい。
(未受精卵への活性化刺激の付与)
図1には、本発明の魚類胚の作製方法における典型的なスキームを示す。図1に示すように、未受精卵への物理的及び/又は化学的なストレスの付与前に、活性化刺激を付与しておくことができる。活性化刺激は、未受精卵に発生を開始させることができるものであればよい。こうした刺激としては、未受精卵において一般に雌性発生を開始させることができるような刺激から適宜選択して用いることができる。刺激付与方法としては、例えば、DCパルスなどによる電気的刺激、紫外線、γ線、X線による照射等によって不活性化した精子による受精、精子抽出液との接触、エタノール処理、カルシウム濃度の調整等が挙げられる。これらの刺激は単独で又は二種類以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、電気的刺激が好ましい。電気的刺激は操作性がよいとともに、刺激付与の後段で物理的及び/又は化学的ストレスを付与する場合、これらのストレス付与ステップへ容易に移行できる。電気的刺激は、例えば、25℃、5V、50マイクロ秒間を2回など、適宜設定することができる。
未受精卵に対する物理的及び/又は化学的ストレスは、未受精卵における発生開始の過程に抑制的に作用する物理的及び/又は化学的刺激を包含している。発生の開始の過程に抑制的に作用する刺激は、発生を開始した未受精卵に染色体二倍体化を生じさせるか又はそれと同等の物理的及び/又は化学的ストレスを含んでいる。より具体的には、発生を開始した未受精卵において染色体二倍体化を生じさせるか、染色体二倍体化を生じさせないにしても染色体の半減化を抑制ないし遅延するなど染色体二倍体化よりも低い程度で正常な発生開始の過程を抑制するような物理的及び/又は化学ストレスを含んでいる。なお、ここでいう「発生」とは単為発生を含んでいる。こうしたストレスは、好ましくは、染色体の半減化を抑制又は遅延させて二倍体化を促進するようなストレスである。より好ましくは、二倍体化を生じさせるストレスである。
(1)核移植を伴わない活性化刺激後に、ストレスを付与しそれとともにあるいはその後核移植を行う。
(2)核移植を伴わない活性化刺激後に核移植を行い、その後ストレスを付与する。
(3)核移植を伴う活性化刺激後あるいはそれとともにストレスを付与する。
こうした各種の組み合わせのなかでも、上記(1)の組み合わせ、特に、核移植を伴わない活性化刺激の付与後に上記ストレスを付与し、その後に細胞核を移植すること(図1のスキーム参照)が、未受精卵の発生初期段階を効果的に調節して、正常な倍数性の魚類胚を構築するのに最も有効である。
正しい又は意図した倍数性の魚類胚を得るには、未受精卵を活性化する刺激付与後上記ストレス付与までの保存条件が影響する場合がある。すなわち、未受精卵に対する活性化刺激付与後からストレス付与までの保存工程における保存条件の調整により、得られる魚類胚の倍数性を効果的に制御できる。したがって、保存条件のの適切な設定により、正しい又は意図した倍数性の魚類胚を効率的に得ることができる。本発明を拘束するものではないが、刺激付与後ストレスを付与するまでの保存条件が、ストレス付与による第二極体の放出の抑制や第一卵割の阻止又は抑制の効果に影響するものと推測される。
魚類胚は、未受精卵にドナー細胞の細胞核を移植することによって作製する。未受精卵に対するドナー核の移植タイミングは、上記のように各種のタイミングで可能であり、未受精卵の活性化刺激の付与と同時であってもよいが、ドナー核の移植を伴わない未受精卵の活性化刺激の付与後に移植することが好ましい。さらに好ましくは、細胞核の移植を伴わない活性化刺激の付与及びストレス付与後である。こうすることで、正しい染色体の倍数性を保持した魚類胚を効率的に得ることができるとともに、ドナー細胞の染色体を優勢的に有する細胞を高率で保持する魚類胚及び個体を得ることができる。
こうして得られた魚類胚は、魚種に応じた条件下で孵化するまで発生させる。孵化まで発生させるための培養条件は、魚種に応じて適宜選択することができる。例えば、メダカの場合には、核移植後から24時間程度は18℃程度で培養し、その後は、26℃程度の温度で培養することができる。培養液は、メチレンブルーを含む平衡塩類溶液(BSS)などを用いることができる。こうして魚類胚を孵化させることで魚類個体を得ることができる。得られた魚類個体は、魚種に応じた方法で飼育することができる。また、交配または染色体操作によりさらなる遺伝的改変が可能である。
(ドナー)
ドナーのβ−アクチン−カセット−EGFP系統はメダカβ−アクチン遺伝子の翻訳開始点より上流約2050bpとトレーラー配列(終止コドン直後より約800bp)との間にEGFP遺伝子を挿入した融合遺伝子をORに導入して得られた系統で導入遺伝子についてホモ接合体である。遺伝子導入は以下のようになされている。
act3’-FW : CTGTAGCGGCCGCACAGACTTTCTCCTCCCCAG(配列番号1)
act3’-RV : TGCGTCTAGACGCATATGTTAAGCTTTAAAGAATCAATGGA(配列番号2)
act5’-FW : TATGGCATGCCATATGGTGAATGTATAGTAGCGTA(配列番号3)
act5’-RV : TCAAGGTACCAAGAATTCGGCTAAACTGGAAAAGAACA(配列番号4)
実験1および実験2では、いずれも、レシピエントとして、遺伝子導入を行っていないORを用いた。ORは、体色が緋色の異系交配系のメダカであり、また、1.5ヶ月で性的に成熟する。
上記ドナー及びレシピエントの飼育は、14時間の明期と10時間の暗期からなる明暗周期により照明を調節した26℃の飼育室内の水槽内で行った。飼料は、ブラインシュリンプ幼生(Ocean Star International,Snowville,NH,USA)と粉末飼料(おとひめβ1、ニッシン飼料製)を与えた。
本核移植では、ドナー細胞として、実験1では胚の4体節期細胞を、実験2では成体尾ひれ培養細胞をそれぞれ用いた。4体節期細胞は、同期胚体を、0.03%トリプシン−0.04%EDTAを含むカルシウム−マグネシウム不含リン酸緩衝塩類溶液(CMF−PBS)中でピペッティングすることによって乖離し、得られた細胞浮遊液を遠心分離することにより得た。また、成体尾ひれ培養細胞は、ドナーの成体尾ひれを採取し、細切し、ゼラチンコーティングしたプラスチック培養皿でライボビッツL−15培地に牛胎児血清を20%添加した培養液を用いて25℃、空気中で6〜10日間培養することによって得た。培養細胞は、CMF−PBSですすいだ後、0.1%トリプシンと0.01%EDTAを含むCMF−PBS処理を施し、単一の細胞に分離した。得られた細胞懸濁液を50×gで5分間、4℃で遠心分離した。
毎日産卵していた雌性魚を、実験前日に隔離タンクに移して隔離した。実験当日、明期の開始時から1〜2時間以内にそれらを解剖し、卵巣から成熟した未受精卵(未受精卵)を回収し、懸濁培養用の35mmのプラスチック皿(ファルコン(商品名),ベクトン-ディッキンソン,Lincoln Park, NJ, USA)中で18℃で使用時まで維持した。この培養皿は、100U/mLのペニシリンと100μg/mLのストレプトマイシンを添加したメダカ用の平衡塩類溶液(以下、BSSと称す)を含む[Iwamatsu,T.,J.Exp.Zool.228,83(1983)]。
(1)未受精卵を、BSSを満たしたガラス製の電極間に載置し、25℃で5V、50マイクロ秒間の電気的刺激を2回繰り返すことによって活性化した。
(2)活性化後2〜4分後に、付活卵をBSS中41.5℃で2分間、熱処理した。
(3)2分間経過後、直ちにBSS中に室温で5分間〜20分間維持した。
(4)5分間経過後、核移植まで10℃に維持した。
核移植は、従来の方法と基本的に同様な方法を用いて核移植を行った[B. Juら、Develop. Growth Differ.(2003)45,168-169, K.Niwaら,Develop.Growth Differ,41,163(1999)、K.Niwaら,Cloning2,23(2000)]。移植は、倍率が80倍の実体顕微鏡下(MZAPO,Leica,Heerbrugg,スイス)で行った。
(1)実体顕微鏡のステージに配置した冷却板上(Thermo Plate;東海ヒット)に前記プラスチック皿を載置し、寒天プレートの温度を約10℃に維持した。
(2)調製した移植床のV字溝に調製した未受精卵を動物極が移植針の方向に向くように固定した。
(3)核ドナー細胞も同じ寒天プレート上に分散した。
(4)三次元マイクロマニプレーターに接続した油圧インジェクター(CellTram Oil,エッペンドルフ,ハンブルグ、ドイツ)により、胚に細胞を移植する方法(Wakamatsu,Y.,Hashiomoto,H.,Kinoshita,M.らMol.Mar.Biol.Biotechnol.2,325(1993))を一部変更した方法により、前記マイクロピペット中に1つの核ドナー細胞を吸引した。なお、
(5)未受精卵の動物極の細胞質中に前記マイクロピペットを突き刺して、核ドナー細胞を未受精卵に移植した。
2ppmのメチレンブルーを含むBSSを満たした24穴のプラスチックプレート(スミロン、住友ベークライト社)に、施術した卵を1個ずつ移した。始めの24時間は18℃で、次に26℃で前記プレートをインキュベートし、孵化するまで、毎日、観察を行った。孵化した稚魚は、若松らの方法(Wakamatsu,Y.(1993)前掲を参照されたい)により飼育した。
(GFP蛍光の検出)
GFP蛍光の検出は、全ての核移植個体及びF1世代について行った。GFPの検出は、蛍光装置を具備した実体顕微鏡(FLII,Leica)を使用して胚および魚におけるGFPの蛍光を観察することにより行った。蛍光イメージは、当該実体顕微鏡に装着したデジタルカメラ(浜松フォトニクス社製)を使用して撮影した。
GFP遺伝子の検出は、各核移植体およびINT2とORとのF1世代の2例及び2NT1〜2NT3とORとのF1世代の各2例の計14例について試験した。
GFP遺伝子の検出は、以下のように行った。まず、ブリンおよびスタッフォードの方法[N.BlinおよびD.M.Stafford,Nucleic Acid Res.3,2303(1976)]を変更した方法により、ゲノムDNAを成体鰭または孵化した稚魚から抽出し、その20〜30ngを核PCR増幅の鋳型に使用した。プライマーとして、のβ−アクチン−カセット−EGFP遺伝子に特異的な以下のプライマー(配列番号5、6)を利用して検出した(予想サイズ717bp)。なお、PCRは、0.5ユニットのExTaqDNA(タカラ)を用いた。
PR1:5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3’(配列番号5)
PR2:5’-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG -3’(配列番号6)
PR3:5’-CAGGACGTCTACAAAATCGG-3’(配列番号7)
PR4:5’-AGCTCGTTGAACTTGCAGGCG-3’(配列番号8)
染色体数は、全ての核移植体について評価した。染色体数は、成体の尾ひれの組織片を細切し、0.1%ゼラチン溶液によりコートした4穴プラスチックプレート(Nunc社製)中で20%ウシ胎児血清及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを含むライボヴイッツL−15培地(Leiboviz’sL-15medium,Gibco社)で培養した。培養開始5日後に0.01%コルヒチン溶液で6時間処理した後、標準的な方法に従い、染色体標本を作製した[T.LadyginaおよびY.Wakamatsu,Fish Biol.J.MEDAKA.10,33(1999)]。なお、分裂中期にある10〜20個の細胞について染色体数を調べた。
成体となった各核移植魚をORと交配し、それらの繁殖能を調べた。毎日、雌性魚の腹部から卵を回収し、得られた卵を、0.5ppmのメチレンブルーを含有する蒸留水を満たした60mmのプラスチックディッシュ中で26℃でインキュベートした。それらの胚発生を、孵化段階まで実体顕微鏡下で毎日観察した。ORにおける胚発生を対照とした。以下、核移植魚とORとの交配の結果得られた交配第1世代をF1と示す。
(核移植個体及び繁殖能力)
表1に実験1及び実験2におけるGFP蛍光を示す核移植個体の発生結果を示す。表1に示すように、実験1(4体節期胚)において核移植が施された250個のうち2個体(0.8%)が孵化し成魚となった。また、実験2(成体尾ひれ由来培養細胞)において核移植が施された1236個のうち4個体(0.3%)が孵化し成魚となった。いずれも雌であった。これらの個体については、目視観察によれば特段奇形も認められなかった。なお、実験1では、1NT2のみが孵化後1.5ヶ月で性的に成熟した。また、1産卵あたり、約20個の卵を有しており正常な1腹サイズであり、正常な繁殖能力を有し、正常なF1世代を産出した。INT1は生殖能力を有さなかった。したがって、実験1においては、繁殖能力のある核移植個体としては1個(0.4%)であった。実験2において得られた核移植個体は、いずれも孵化後1.5ヶ月で性的に成熟した。また、1産卵あたり、約20個の卵を有しており正常な1腹サイズであり、正常な繁殖能力を有し、正常なF1世代を産出した。なお、各核移植個体から200個以上採卵し、95〜97%が正常に孵化し、そのうち30個体を育成し、その90%以上が成魚期に達した。
表1
表2に、核移植魚およびそのF1世代における各種評価結果を示す。表2に示すように、全ての核移植個体においてGFP蛍光が観察されGFP遺伝子も検出された。GFP蛍光は、ドナー系統と同様に全身で強く発現した。また、INT2のF1世代については、ドナー系統と同様のGFP蛍光が観察されるとともにGFP遺伝子が検出された。また、2NT1〜2NT3のF1世代においてドナー系統と同様のGFP蛍光が観察されるとともにGFP遺伝子が検出された。なお、。内在性EF−1α−A遺伝子の検出により、全てのPCR分析が適切に行われたことを示していた。
表2
全ての核移植個体について、染色体数を調べて倍数性を評価したところ、表2に示すように、1NT1が76の3倍体であった以外は48の二倍体であった。
毎日産卵しているヒメダカの成熟した雌を、実験前日に隔離水槽に移した。実験当日、明期開始後の1〜2時間以内に解剖し、卵巣から成熟未受精卵を回収した。他方、雄を解剖して、精巣を摘出し、BSS中で組織を潰すことによって、精子浮遊液を得た。エッペンドルフチューブ中の50μlのBSSに未受精卵を入れ、精子浮遊液を添加することで媒精した。チューブを一定時間、25℃に保ち、その後、37℃または41℃のウオーターバス中に移し、一定時間、設定温度に保った。この処理の後、卵をプラスチック培養皿のBSS中に移し、26℃の恒温機中で5?7日間発生させた。これらの胚から卵膜をピンセットで取り除き、1mlのイーグルMEM培地中で胚体をゆるくピペッティングして細胞浮遊液を調製した。これらの細胞の核を4-6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)で染色し、フローサイトメーター(Ploidy Analyser、Partec社製、ドイツ)にかけ、細胞の倍数性を解析した。
表3
毎日産卵しているヒメダカの成熟した雌を実験前日に、隔離タンクに移した。実験当日、明期開始後の1?2時間以内に解剖し、卵巣から成熟未受精卵を回収した。他方、雄を解剖して、精巣を摘出し、BSS中で組織を潰すことによって、精子浮遊液を得た。エッペンドルフチューブ中の50μlのBSSに未受精卵を入れ、精子浮遊液を添加することで媒精した。その後、チューブを一定時間、25℃に保ち、その後、直ちに氷上に移し、一定時間0℃に保った。この処理の後、卵をプラスチック培養皿のBSS中に移し、26℃の恒温機中で5〜7日間発生させた。これらの胚から卵膜をピンセットで取り除き、1mlのイーグルMEM培地中で胚体をゆるくピペッティングして細胞浮遊液を調製した。これらの細胞の核を4-6- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)で染色し、フローサイトメーター(Ploidy Analyser、Partec社製、ドイツ)にかけ、細胞の倍数性を解析した。
表4
本実施例では、まず、レシピエント卵を付活後、高温処理(41℃、2分間)を施す最適タイミングを見出すため、無処理の精子で未受精卵を媒精後1分30秒から3分30秒までの間(温度は25℃)のいろいろなタイミングで高温処理を行った。これ以外は、実施例2と同様にして、第二極体の放出抑制による2倍体化(無処理の精子で媒精しているため実験上は3倍体化)の成功率を調べた。
次いで、成体尾ひれ培養細胞の細胞核をドナーとし、レシピエントの未受精卵を上記した付活〜高温処理までの保持時間及び温度(2分45秒、25℃)の保存状態で保持した後に、高温処理を実施し、高温処理後は25℃で20分間維持し、次いで、核移植まで10℃で維持した。これ以外は、実施例1と同様にして核移植により魚類胚を作製し、孵化、交配させた。実験3における核移植個体の発生結果を表6に示す。また、実施例1の実験2で得られた核移植個体(個体番号2N1〜2N4)及び実験3で得られた核移植個体(3N1〜3N7)の性質及びこれらの個体のF1世代における評価結果を表7及び表8に示す。
Claims (14)
- 内在性核を有する未受精卵に対し、該未受精卵に雌性発生を開始可能な活性化刺激を付与する活性化工程と、
前記未受精卵に対して第二極体の放出を阻止又は抑制可能に環境温度ストレスを付与する処理を行う処理工程と、
前記処理後の前記未受精卵に魚類の細胞核を移植する移植工程と、
を備え、
前記活性化工程後前記処理工程に先立って、前記未受精卵を、その保存する温度及び時間に関して所定の保存条件で保存する保存工程、
を、備えることにより、二倍数性の魚類胚を作製する方法。 - 前記保存工程は、活性化後の前記未受精卵を、前記時間に関して2分以上3分以下保存する工程である、請求項1に記載の魚類胚の作製方法。
- 前記保存工程は、活性化後の前記未受精卵を、前記温度に関して25℃で保存する工程である、請求項2に記載の魚類胚の作製方法。
- 前記保存工程は、活性化後の前記未受精卵を、25℃で2分30秒以上2分45秒以下保存する工程である、請求項1〜3のいずれかに記載の魚類胚の作製方法。
- 前記活性化刺激は、電気刺激である、請求項1〜4のいずれかに記載の魚類胚の作製方法。
- 前記細胞核を供給する細胞は、体細胞及び培養細胞から選択される、請求項1〜5のいずれかにに記載の魚類胚の作製方法。
- 前記細胞核を供給する細胞は、胚細胞から選択される、請求項1〜6のいずれかに記載の魚類胚の作製方法。
- 移植された前記細胞核にのみ由来する染色体を保持している、請求項1〜7のいずれかに記載の魚類胚の作製方法。
- 前記魚類はメダカ及びその近縁に属する魚類から選択される、請求項1〜8のいずれかに記載の魚類胚の作製方法。
- 魚類個体の作製方法であって、
請求項1〜9のいずれかに記載の魚類胚の作製方法における各工程と、
作製された前記魚類胚を孵化まで発生させる工程と、
を備える、魚類個体の作製方法。 - 前記魚類を繁殖させる工程を備える、請求項10に記載の魚類個体の作製方法。
- 魚類胚の倍数性の調整方法であって、
前記魚類胚は、未受精卵を活性化する刺激を付与し、その後未受精卵に対して第二極体の放出を阻止又は抑制可能に環境温度ストレスを付与した後、魚類の細胞核を移植して魚類胚を作製するのに先立って、
前記未受精卵の活性化後から前記環境温度ストレス付与までの前記未受精卵を保存する温度及び時間に関する保存条件を設定する工程を備える、方法。 - 前記活性化する刺激を無処理精子による媒精とし、その後前記環境温度ストレスを付与した後核移植することなく胚発生させて得られる魚類胚の倍数性に基づいて前記保存条件を設定する、請求項12に記載の調整方法。
- 前記保存条件を、3倍体の魚類胚の取得率に基づいて設定する、請求項13に記載の調整方法。
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