JP2003517317A

JP2003517317A - 培養細胞からクローン化胚及び成体を作製する方法

Info

Publication number: JP2003517317A
Application number: JP2001546247A
Authority: JP
Inventors: ペリー、アンソニー、シー．エフ．; モムバーツ、ピーター; テルヒコワカヤマ
Original assignee: ペリー、アンソニー、シー．エフ．; モムバーツ、ピーター; テルヒコワカヤマ
Priority date: 1999-12-20
Filing date: 2000-12-20
Publication date: 2003-05-27
Also published as: EP1241936A4; US20030213008A1; AU2279301A; US20090126032A1; EP1241936A1; CN1280412C; NZ519347A; MXPA02006094A; BR0016531A; CA2394812A1; IL150025A0; WO2001045500A1; CN1423522A

Abstract

(57)【要約】核ＤＮＡの全部またはその部分を脱核卵母細胞に注入する核移植法が提供された。この方法は種々のドナー細胞に、望ましくはＥＳ細胞に適している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野）インビトロで培養されている細胞から胚及び生きた子をクローン化する方法を
記述している。細胞は樹立細胞系が望ましく、胚性幹（ＥＳ）細胞がより望まし
い。また、クローン化胚から得た細胞株も開示されている。この方法が、核ドナ
ー細胞の細胞周期あるいはゲノム対に著しい依存はしないものであることを示す
、本発明の種々な態様を記述している。この方法は、目的突然変異を有するかあ
るいはそれがないクローン化組織及び器官を作製するのに潜在的な有用性を有す
る。先行技術では樹立細胞系の単細胞を出生まで胚の完全成長を維持することが
出来なかったので、その可能性は全く大きなものである。

【０００２】（発明の背景）哺乳動物は既に脱核卵母細胞と核ドナー細胞を融合することによりクローン化
されている（Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ３２０，６３［１９８６］）
。この方法は最初にヒツジについて記載され（Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ，Ｎａｔｕｒ
ｅ３２０，６３［１９８６］）ついでヒツジ静止状態体細胞（Ｃａｍｐｂｅｌ
ｌ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３８０，６４［１９９６］；Ｓｃｈｎｉｅｋ
ｅｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７８，２１３０［１９９７］；Ｗｉｌｍ
ｕｔ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３８５，８１０［１９９７］）、及びウシ
増殖体細胞（Ｃｉｂｅｌｌｉ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０，１２５
６［１９９７］；Ｋａｔｏ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２，２０９５
［１９９８］；Ｒｅｎａｒｄ，ｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３５３，１４８９
［１９９９］；Ｗｅｌｌｓ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６０，９
９６［１９９９］）及びヤギ（Ｂａｇｕｉｓｉ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，４５６［１９９９］）にさらに応用された。これらの報
告に記載されている核ドナー細胞は動物からか、あるいは短期間初代細胞培養か
ら新たに単離されている。「ドーリー」と名付けられたヒツジは由来不明の哺乳
動物細胞からこの方法を使用してクローン化された（Ｗｉｌｍｕｔ，ｅｔａｌ
．，Ｎａｔｕｒｅ３８５，８１０［１９９７］）。

【０００３】最近クローニングの別の方法が発展し、その方法では成体哺乳動物の組織から
得たドナー細胞の核を選別し、それを脱核卵母細胞にマイクロインジェクション
する（Ｗａｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３９４，３６９［１９
９８］）。マイクロインジェクション法は、任意に遺伝子操作した生育できる胚
、生存仔及び健康成獣を作製するのに使用し得る。この核移植法の応用により、
雌にクローン化するために成体由来小丘細胞を（Ｗａｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ
．，Ｎａｔｕｒｅ３９４，３６９［１９９８］）及び雄をクローン化するため
に尾由来細胞を（Ｗａｋａｙａｍａ＆Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ．２２，１２７［１９９９］）使用して生産仔のクローニングが可能
になった。これらの動物のクローン起源について表現型及びゲノム分析による評
価が充分に行なわれた（Ｗａｋａｙａｍａ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３９
４，３６９［１９９８］）。

【０００４】細胞融合法及びマイクロインジェクション法のいずれも、核ドナーとして新た
に分離した細胞あるいは初代、しばしば誤った定義の細胞培養の細胞を使用する
と記載しているような欠点の影響を被っている。これは部分的には培養細胞にお
ける個体新生上の不安定性に基づいている（Ｄｅａｎ，ｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ１２５，２２７３［１９９８］）。このような問題を回避した
クローニング方法であれば、クローニング操作に核ドナーとして使用する前にイ
ンビトロで細胞を操作することが出来るであろう。これは非常に大きな有用性で
ある：例えば、目的とするゲノム上の突然変異を含むクローンを発生させたり、
クローン先駆細胞を長期保存したりすることが出来るであろう。

【０００５】培養胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、ＥＳ細胞系）は胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣ
Ｍ）から由来し、インビトロにおいて異常な核型及び細胞遺伝学的安定性を示す
（Ｅｖａｎｓ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２９２，１５４［１９８１］；Ｍ
ａｒｔｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７８，７６３４［１９８１］；Ｈｏｇａｎ，ｅｔａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔ
ｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ．２^nd ｅｄ．［ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］，ｐｐ１７３−
１８１［１９９４］）。マウスＥＳ細胞は発生多能性を示す：マウス胚に移植さ
れると、明らかに細胞型に限定されないＥＳ細胞の寄与が認められるキメラ仔を
発生する（Ｈｏｇａｎ，ｅｔａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｍ
ｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ．２^nd ｅｄ．［ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］，ｐｐ１７３−１８１［１９９４］
；Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０９，２５５［１９９４］
）。しかし、ＥＳ細胞が個体の発生に充分に寄与するためには、発生胚とは異な
る系の細胞を伴う必要がある（したがって、胚はキメラである）。異系細胞は二
倍体胚（Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３０９，２５５［１９
８４］；Ｈｏｏｐｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２６，２９２［１９８
７］）または四倍体胚（Ｎａｇｙ，ｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１
１０，８１５［１９９０］；Ｎａｇｙ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，８４２４［１９９３］；Ｚａｎｇ，ｅｔａｌ
．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．６２，１３７［１９９７］）から由来する。発生胚の異
系細胞によって守られないと、ＥＳ細胞に完全な胚発生を完成させることは不可
能である。この完全発育が出来る胚発生を指令出来ないのがＥＳ細胞を使用する
ことの大きな障害である；したがってそれから仔を発生させるには予めキメラに
する必要がある。このことがもっぱらＥＳ細胞から子孫を得るために長い育種操
作を必要としている。

【０００６】ＥＳ細胞は標的ゲノムの改変を動物に導入するために使用することができる。
ＥＳ細胞における遺伝子ターゲティングは目的突然変異を有する多種のマウスを
作製するために広く使用されてきた（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
４，１２８８［１９８９］；Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓ，ｅｔａｌ．，Ｍｅ
ｔｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５，８５５−８７８［１９９３］）。目的突然変異
の導入は相同的組換えに利用され、ゲノムの標的部分を導入遺伝子で置換して「
ノックアウト」あるいは「ノックイン」する。変異の表現型上の効果は導入する
遺伝子の選択により調節することができ、この遺伝子は表現型を完全に変えるこ
ともあり潜在的なこともある。ＥＳ細胞からのクローニング動物は、遺伝子ター
ゲティング動物の生産を増強するために必要な遺伝子ターゲティングと動物のク
ローニングの利点を併せ持っている。もし、ＥＳ細胞系の核−インビトロで長期
に培養されたものであっても−が生存し、生殖能力のあるクローン動物を生産す
るのに使用できるならば、クローニングを介して哺乳動物ゲノムを操作するため
の第一選択となるであろう。しかし、適切な培養方法及びランダムでなく標的を
絞ったＤＮＡ変換によりＥＳ細胞を選別する効率的選択方法にこれまで困難があ
った。

【０００７】核移植がヒツジ、ウシ及びヤギの生産に使用されたとは言え、培養ＥＳ細胞系
あるいはＥＳ細胞様細胞系またはその他の樹立細胞系から核移植により直接に完
全発育できるということは、未だ先行技術では示されていない。例えば、Ｃａｍ
ｐｂｅｌｌ，ｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ３８０，６４［１９９６］）は、短
時間培養、胚由来上皮細胞から細胞融合法を用いた核移植によりヒツジのクロー
ニングをしたと報告した；しかし、この細胞は分化及び細胞特性に関連したマー
カーを示し、明らかにＥＳ細胞ではなかった。

【０００８】Ｓｔｉｃｅ，ｅｔａｌ．（ＷＯ９５／１７５００）は、同時発生、低継代
ＥＳ様細胞との膜融合核移植によりウシ胚を生産したことを報告した。Ｓｔｉｃ
ｅ，ｅｔａｌ．は、これらのあるいはその他のＥＳ様細胞から核移植法により
仔（生産あるいは死産）を得ることに成功した例を提供していない、その理由は
妊娠６０日以前に全ての妊娠が流産してしまったからである；最も長い妊娠期間
は、ウシの平均妊娠期間２８０日に対して、５５日であった。

【０００９】ＴｓｕｎｏｄａａｎｄＫａｔｏ（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．９８，５
３７［１９９３］）は、１１−２０代を経た系のＥＳ細胞核と（センダイウイル
ス及び電気融合により）融合させた脱核マウス卵をインビトロで２細胞、４細胞
、桑実胚及び胚盤胞段階に分化させたと報告した。しかし、得られた胚を代理母
に移植したが生存胎児を得ていない。

【００１０】これと著しく異なって、ここに開示する本発明の方法は一個の培養細胞の核か
ら生存仔を発生させることが出来ることである。

【００１１】（発明の要約）ここに記述した本発明は近い将来これらの問題解決をもたらす。一個の再構成
細胞から分化細胞のクローン増殖（例えば、完全動物の形に）をする方法を提供
する。ドナー核は典型的な方法で脱核宿主細胞、例えば卵母細胞あるいは卵割球
、に挿入されて、再構成細胞を生じる。生成した再構成細胞の発生を開始し、培
養する。したがって、関連する態様において、本発明は、（ｉ）ＥＳ細胞の核含
有物を脱核卵母細胞の細胞質に挿入しそして再構成細胞を分化させることによる
ＥＳ細胞からの胚のクローン誘導、及び（ｉｉ）この方法により生産される培養
細胞あるいは動物を、提供する。

【００１２】一態様において、得られた再構成細胞の分化は１以上の特定された経路に沿っ
て進み、種々の異なる細胞型を生成する。もう一つの態様において、得られた再
構成細胞の分化は、育成しうる生産仔に分化する胚へと進む。ここに使用されて
いるように、用語「核」は核全体またはその一部を含むことを意図しており、そ
の核含有物は少なくとも非ミトコンドリアゲノムを欠いている細胞に発生を指令
することが出来る最低限の物質を含んでいる。得られた組織は、脱核卵母細胞に
注入するための核を提供した細胞（核ドナー）に由来するクローンである；子孫
を得る方法の場合には、仔は核ドナー細胞由来のクローンである。

【００１３】したがって、本発明は、培養ＥＳ細胞系から得た細胞の核を脱核卵母細胞に挿
入することによりＥＳ細胞系に由来する動物のクローニング法を提供する。核ド
ナーは樹立細胞系由来であるか、新規に誘導した細胞系である。ある動物種、例
えば哺乳動物、では樹立ＥＳ細胞系の大部分は雄由来であろう；つまり、ＸＹ核
型を有している。これに対して、鳥類では、樹立ＥＳ細胞系の大部分は雌由来で
あろう；つまり、ＸＸ核型を有している。そのようなＸＹ細胞系由来の動物クロ
ーンはその起源を反映して雄である。したがって、雌由来細胞系からの核ドナー
を使用した態様においては、ＸＸ核型の動物クローンが作製され、雌となり、ま
たＸＹ核型のＥＳ細胞から誘導された動物は逆になる。

【００１４】他の態様においては、本発明の方法に使用される細胞の由来はマウス以外に下
記群に含まれる動物種、これに限定するものではないが、霊長類、ヒツジ、ウシ
、ブタ、クマ、ネコ、ヤギ、イヌ、ウマ、クジラ及びネズミ及びその他のげっ歯
類を含む。望ましい態様においては、ＥＳ細胞はこれら動物種の胚盤胞のＩＣＭ
から由来する。

【００１５】他の態様において、核ドナー細胞の起源となるＥＳ細胞は使用直前に樹立され
る。望ましい態様においては、ＥＳ細胞はクローン化細胞、例えばクローン動物
を作製するのに使用する直前に遺伝的な修飾を受ける。

【００１６】ＥＳ細胞核移植により再構成された細胞はインビトロで培養されて胚盤胞に発
育するか、発育がインビボ、例えばブタ、で行われる。ある態様において胚盤胞
を適当な代理母に移植して再構成細胞から由来するクローン動物を生産する。

【００１７】他の態様においては、本発明の方法により誘導したクローン化桑実胚あるいは
胚盤胞に、逆にクローン化胚を発生させるための核ドナーを供給するのに最初使
用した培養から由来するＥＳ細胞を集合した（注入した）。その結果、部分的に
クローン化胚由来細胞及び部分的に培養ＥＳ細胞の注入／集合した細胞に由来す
る胚を生じた。この集合及び注入法は当業者の間では確立されており、標準的な
遺伝子ターゲティングプロトコールにおいてキメラ胚を作製するのに使用される
ものと原理は同一である（Ｈｏｇａｎ，ｅｔａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎ
ｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ，２^nd ｅｄ．［ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］，ｐｐ．１８９−２１
６［１９９４］；Ｊｏｙｎｅｒ［ｅｄ］，Ｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ．［
ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ］，ｐｐ．１０７−１４６［
１９９３］）。しかし、今公開する本発明の方法により発生する胚は核ゲノムに
関してはキメラではない、なぜなら得られた生産仔は遺伝的に同一のＥＳ細胞か
ら由来しているからである。方法のこの態様は、ＥＳ細胞からクローン化生産仔
を作製する効率を改善する。

【００１８】他の態様において、本発明の方法によりクローン化した桑実胚または胚盤胞は
胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）のような幹細胞の原料として利用することが出来
る。このような細胞は当業者に知られている方法にしたがって規定された経路に
沿った分化を生じさせることが出来る。したがって、本発明のこの態様によりい
ずれの核ドナー細胞の培養集団からも所定の型の分化細胞が作製される。この方
法により発生することが出来る細胞型は、制限なく、広い解剖学的部位に存在す
る細胞型、例えば上皮細胞、血液細胞及び繊維芽細胞など、及び著しく解剖学的
制限を示す細胞、例えば心筋細胞、造血細胞、神経細胞、グリア細胞、角化細胞
などを含んでいる。

【００１９】Ｆ１及び近交系マウス系統から由来する樹立ＥＳ細胞系のＥＳ細胞核からクロ
ーン化した生産仔を作製する方法をここに示す。本発明の一態様では、クローン
化生産仔は「２Ｃ」であるＥＳ細胞核から作製される；すなわち、細胞周期のＧ
０−またはＧ１−期にあるプレＳ期細胞に見られるゲノムＤＮＡの２倍の相補体
を有している。

【００２０】本発明の他の態様では、ドナーＥＳ細胞核は‘２−４Ｃ’である。分割しつつあ
る細胞寿命のほとんどの間は２ｎ染色体で示される２ＣＤＮＡを含んでいるが
、細胞周期のＳ−期に続く期では染色体数は変わらないがＤＮＡ含量は１回のＤ
ＮＡ合成の複製により倍になる；したがって、その細胞は２ｎであるが、終期に
おいて２価染色体の姉妹染色分体が分離するまでは４ｎではない。本発明の一態
様において４Ｃ核を使用することにより生存、クローン化仔を作製した。このこ
とは、いずれの細胞型にも発育を指令する核にとってＥＳ細胞が都合よく細胞周
期のＧ０−あるいはＧ１−期にある必要はないことを示している。

【００２１】一態様において、ＥＳ細胞核ドナーは目的とする変異を宿すために遺伝的に変
換が行なわれた。したがって、遺伝的に変換されたＥＳ細胞から本発明の方法に
よりクローン化された動物または細胞種は変異を有しているであろう。ＥＳ細胞
の遺伝的変換は非指向性突然変異、変異誘発剤への曝露による変異誘発、または
外来性核酸あるいは核酸誘導体を既知の方法（電気穿孔、レトロウイルス感染な
ど）により細胞に導入することなどにより生じさせることができる。より望まし
くは、核ドナーとして使用されるＥＳ細胞は、１以上の特定遺伝子の部分あるい
は全部が正確に調節し得る方法で修飾されている、遺伝子ターゲティングにより
遺伝的変換が行なわれている。

【００２２】このようにして、本発明はクローン化し、遺伝的に変換した生産仔を、核移植
に先立ってインビトロで遺伝的に操作し特性付けすることが出来る細胞系（ＥＳ
細胞系を含むが、それに限定しない）から一世代で作製する方法を提供する。本
発明の方法はこのように対応する細胞系から遺伝子ターゲティング動物を作製す
ることによりスピード及び効率を改善する。

【００２３】（発明の詳細な説明）本発明は、胚性幹（ＥＳ）細胞の核成分（染色体を含む）を脱核卵母細胞に挿
入し、生成した再構成細胞の出産までの発育を促進することにより生育し得る生
産仔が得られることを開示する。ＥＳ細胞は核移植に使用するまで長期間培養あ
るいは凍結保存することが出来る。マウスＥＳ細胞の単離、培養及び操作−相同
的組換えによる遺伝子ターゲティングを含む−は既に記述されている：Ｈｏｇａ
ｎ，ｅｔａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒ
ｙｏ．２^nd ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ），ｐｐ．２５３−２９０（１９９４）。樹立ＥＳ細胞ある
いはＥＳ細胞に似た細胞（ＥＳ細胞様細胞）に対する方法は、ウシ（Ｃｉｂｅｌ
ｌｉ，ｅｔａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ４７，２４１［１９９７
］）、ハムスター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．
１２７，２２４［１９８８］）、ヒト（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２８２，１１４５［１９９８］）及びウサギ（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ
，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＲｅｐｒｏｄＤｅｖ．４５，４３９［１９９６］）
について記述されている。

【００２４】本発明によるＥＳ細胞核から由来した子孫は、そのいずれの細胞の染色体も起源
の核ドナーＥＳ細胞から由来しているゲノムクローンである。

【００２５】望ましくは、ＥＳ細胞は、その幹細胞の性質が当業者に知られている標準的胚
盤胞注射法によりキメラ子孫における生殖系列寄与及び伝達を介して明らかにさ
れているＥＳ細胞に由来している（Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３０９，２５５［１９８４］；Ｈｏｇａｎ，ｅｔａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌ
ａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ．２^nd ｅｄ．［ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］，ｐｐ．１９
６−２０４［１９９４］）。この操作は一般的に受精から生じた胚盤胞の腔にＥ
Ｓ細胞を注射することを含んでいる。この細胞の状況において、ＥＳ細胞は発育
に関与し、一部は宿主胚盤胞から由来しそして一部は注射されたＥＳ細胞から由
来するキメラ動物を形成する。ＥＳ細胞は体組織を生じることが出来るし、また
キメラの生殖系を含めた全ての細胞型になることが出来る。広範囲の細胞型にな
ることが出来るＥＳ細胞の能力を「多能性」と称している。生殖系伝達における
ＥＳ多能性の発現は、これらの動物種に限定されていると信じる理由は判ってい
ないけれども、マウスとウシに限られている。ＥＳ細胞系は哺乳動物の遺伝学、
分化発生生物学及び医学の強力な研究手段を提供すると考えられている。

【００２６】ＥＳ細胞は樹立ＥＳ細胞系由来でよい。そのようなＥＳ細胞系はよく知られて
おり、それに限るものではないが、Ｆ１交雑系及び近交系マウス由来のものを含
んでいる。Ｆ１交雑系由来のＥＳ細胞系の例は、Ｒ１（Ｎａｇｙ，ａｌｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８４２４［１
９９３］）（例２参照）がある。近交系由来ＥＳ細胞の例は、１２９／０１ａ−
由来雄系Ｅ１４（Ｈｏｏｐｅｒ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２６，２
９２［１９８７］）（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手可能、［ＡＴＣＣ］ｎｕｍｂｅ
ｒＣＲＬ−１１６３２）、Ｄ３（ＡＴＣＣｎｕｍｂｅｒＣＲＬ−１９３４
）及びＡＢ１及びＡＢ２．２、ＬｅｘｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓから購入可能
、がある。

【００２７】マウスＥＳ細胞系に加えて、ＥＳ様細胞としては、ウシ（Ｃｉｂｅｌｌｉ，ｅｔ
ａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ４７，２４１［１９９７］）、ハム
スター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２７，２
２４［１９８８］）、ヒト（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２８２，１１４５［１９９８］）及びウサギ（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓｅｔａ
ｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４５，４３９［１９９６］）がある。技
術的障壁が、まったく多能性であり生殖系を含めたほとんどのあるいは全ての細
胞になり得るこれらの動物から得たＥＳ細胞に、マウスと同じ基準を適用するこ
とを阻んでいる。ＥＳ細胞としての全ての規定条件を充たす実験的に実証された
ＥＳ細胞系がマウス以外の動物種で示されることが期待されている。

【００２８】ＥＳ細胞（あるいはＩＣＭ由来細胞）以外の細胞を、ゲノム操作及び／または
動物クローニング操作における核ドナーとして使用するために、インビトロで培
養することはできる。この細胞型は動物種に限定されることなく、ヒト繊維芽細
胞、ブタ胚性生殖（ＥＧ）細胞（ＲＥＦ）、及びマウス胚性腫瘍（ＥＣ）細胞な
どで例示される（Ｓｔｅｗａｒｔ，＆Ｍｉｎｔｚ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２２
４，４６５［１９８２］；Ｈｏｇａｎ，ｅｔａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎ
ｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ．２^nd ｅｄ．［ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］，ｐ９２［１９９４］
）。長期間培養及びインビトロ遺伝子操作をしやすい細胞の種類は増加している
ようである；全てこれらの細胞は本発明の方法における潜在的核ドナーである。

【００２９】ＥＳ細胞系は明らかにゲノムに関して操作することができる。これを達成する
方法は今では充分に確立しておりまた遺伝的（及びしばしば対応する表現型）特
性を持つ操作ＥＳ細胞系に関する文献に多くの報告がある（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ
，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ，８８，３０８
４［１９９１］；Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６０，
２２５［１９９２］；Ｉｔｏｈａｒａ，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ７２，３３７
［１９９３］）。これは、例えば電気穿孔あるいはリポフェクションにより組換
えＤＮＡを導入することによっても行なえる。変異ＥＳ細胞は培養中に自然に生
じることもあり、選択培養液中で濃縮することが出来る。例えば、ヒポキサンチ
ングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＰＲＴ）を欠失した変異ＥＳ細胞は、プ
リン同族体６−チオグアニンに対する耐性を利用した培養により選別されること
、及びこの変異ＥＳ細胞はＨＰＲＴ欠失雄仔になる生殖系キメラを作製するのに
使用されることが報告されている（Ｈｏｏｐｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３２６，２９２［１９８７］）。

【００３０】ＥＳ細胞技術の重要な特徴はゲノム全体中の標的ＤＮＡを変換できることであ
る。これは、ＤＮＡ配列が細胞内で相補的（マッチングあるいはほぼ同じ）ゲノ
ム配列と並列する、相同的組換えと呼ばれる現象に基づいている。この相補的配
列は相同的配列と呼ばれる。この配列は交換反応（交差）を生じることができ、
その結果として染色体上に存在する配列が侵入したＤＮＡの配列に効率よく置き
換わる。もし、侵入配列が相手ゲノムとほぼ同じであるか、さらに他の無関係な
配列で変化を受けていると、この置換は新しい配列の所定位置導入となる。この
置換は、正常な役割がＤＮＡ修復及び維持にあると考えられている細胞酵素を利
用する。現在のところ理由はよく分からないが、ＥＳ細胞はその酵素に富んでお
り、またよく解析されている哺乳動物細胞のみが相同的（つまり位置指定）組換
えを行ないやすいことが知られている。遺伝子ターゲティングにより、１以上の
特定位置に正確な指示に従った修飾が行なわれたＥＳ細胞が作製される。遺伝子
ターゲティングの例としては、比較的短い（＜〜２５キロ塩基対［ｋｂｐ］）組
換えＤＮＡセグメントの部分である侵入ＤＮＡ配列を使用して「ノックアウト」
及び「ノックイン」マウスを作製したものがある。ＥＳ細胞様細胞についても、
ＥＳ細胞遺伝子ターゲティングに使用したのと同じ技術を使用して遺伝子ターゲ
ティングを行なえることが期待される。

【００３１】遺伝的に変換したマウスを作製するために遺伝子ターゲティングＥＳ細胞系を
使用する現在の方法は、操作ＥＳ細胞を桑実胚（約８細胞）あるいは胚盤胞（１
６細胞以上）と共に、または、の中に注入あるいは集合することを含んでいる。
移植によりその胚はキメラ親（Ｆ０）動物を生じる、この動物と野生型との間に
生れた動物はＥＳ細胞由来ゲノムを生存率（しばしば０）で生殖系に伝達する。
遺伝子ターゲティング修飾が伝達された第一世代（Ｆ１）の仔は表現型（例えば
、被毛の色）及びゲノムＤＮＡの分析によって同定される（Ｊｏｙｎｅｒ［ｅｄ
］，Ｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ．［ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ］，ｐｐ５２−５９［１９９３］；Ｈｏｇａｎ，ｅｔａｌ．，Ｍａ
ｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ．２^nd ｅｄ．［Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ］，
ｐｐ２９１−３２４［１９９４］）。

【００３２】Ｆ１ヘテロ接合体の繁殖は通常必要であり、ある場合には変異によりホモ接合
体の第二世代（Ｆ２）動物を発生する。したがって、遺伝子ターゲティング変異
によるホモ接合体動物を作製するには、現行方法では少なくとも３世代の動物が
含まれることになる。マウスでは、所与の変異対立遺伝子がホモ接合である純粋
な繁殖系を確立するには少なくとも６ヶ月が必要である。しかし、より長い妊娠
／成長期間を有する、商業的に価値のある種を含めて、多くの哺乳動物にとって
は、純粋な繁殖系を創り出すのに必要な時間は長すぎるであろう。例えば、ウシ
では、３世代は少なくとも３×２８０日、すなわち約２．３年を要するであろう
。

【００３３】ＥＳ細胞系はクローン（動物クローニングではなく、細胞クローニングの意味
で）であるので、それを動物クローニングに使用することにより本質的に限りな
い数の同じ動物を比較的早く作製できる。したがって、一種類のＥＳ細胞を核ド
ナーとして使用することにより対応する数の、出産まで発育させることが出来る
再構成細胞を発生させて、多数の同じ動物を作製することが出来るであろう。ほ
ぼ同じで、遺伝的に操作された動物は、ヒト及び動物の薬及び育種に対して大き
な利益をもたらすと期待される。例えば、遺伝的に変換された動物（大動物を含
め）は、高価な医薬品をその乳の中にあるいはその他の体液または組織、通常分
泌組織の中に造ることにより、生きた医薬品「工場」として働くことが出来る。
この製造方法はしばしば「ｐｈａｒｍｉｎｇ」と呼ばれる。

【００３４】マウス、モルモット、ラット及びハムスターのような研究動物を多数同一に生
産することは、医薬品を発見したりスクリーニングするのに使用できるので望ま
しいことである。ほとんど同一のマウスの集団が使用できることは、例えば、発
生分化及びヒトの病気の解析、及び新薬の試験に極めて有益である；個体間の先
天的変動を少なくするので比較試験が行ないやすい。

【００３５】本発明は、核移植によりＥＳ細胞のような培養細胞から動物のクローンのよう
な分化細胞集団を発生させる方法を記述している。この方法では、例えば樹立Ｅ
Ｓ細胞系から得たＥＳ細胞の核（あるいはその部分、少なくとも染色体を含む）
を受け入れた脱核卵母細胞からクローン化細胞が発育する。本発明の一態様にお
いて、本発明の方法により脱核卵母細胞のなかにＥＳ細胞の核を注入することに
よりクローン化マウスを作製することが出来る。他の態様では、ＥＳ細胞核ドナ
ーはＥＳ細胞系、Ｅ１４、に由来する。ＥＳ細胞からクローン化された仔動物は
出産数日後に、核ドナーが由来したマウス系統の表現型を反映するその被毛の色
で確認することが出来る。現在使用し得る多くのＥＳ細胞系は１２９マウス系統
、１２９／Ｓｖ、から由来するものであり、これはＪａｃｋｓｏｎ研究室におい
てＤｒ．ＬｅｒｏｙＳｔｅｖｅｎｓによって誘導された。

【００３６】本発明は、そのＥＳ細胞を単離し、培養によりＥＳ細胞系を形成することが可
能あるいはできそうな全ての動物、両生類、魚類、鳥類（例えば、ニワトリ、シ
チメンチョウ、アヒルなど）及び霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、クマ、ネコ、イ
ヌ、ウマ、ヤギ、ネコなどのような哺乳動物、のクローニングに適用することが
出来る。

【００３７】本発明の方法のある態様は、下記の段階を含んでいる、（ｉ）ＥＳ細胞核を卵
母細胞中に挿入した後、発生の活性化をする前に、脱核卵母細胞の細胞質と一定
時間（例えば、約６時間まで）接触させる、そして（ｉｉ）発生分化を開始する
ように再構成細胞を活性化する。

【００３８】一態様においては、２Ｃゲノム相補体を有するドナー核が使用される。核ドナ
ーが２Ｃである場合には、偽極体に染色体が追い出されるのを抑制するために微
小管及び／またはミクロフィラメント集合の阻害剤の存在下に活性化を行なうこ
とが望ましい。例えば４Ｃドナー核が使用された場合には、再構成細胞は約６時
間までの間培養した後、微小管／ミクロフィラメント集合の阻害剤を存在させず
に活性化を行なう；その場合には、偽極体が押し出されて再構成細胞の倍数性は
２ｎに回復する（形式的２ｎ倍数性は原腸形成を超える胚発生分化を指令するに
は欠くことが出来ない）。

【００３９】本発明の望ましい態様では、ＥＳ細胞核は脱核卵母細胞の細胞質内にマイクロ
インジェクションにより注入される、そしてより望ましくはピエゾ電気駆動マイ
クロインジェクションによる。ピエゾ電気微細操作装置の使用によりＥＳ細胞の
ドナー核の取出し及び注入を一本の針で行なうことができるようになった。さら
に、卵母細胞の脱核及びＥＳ細胞核の注入がすばやく、効率よくそして既報の方
法（例えば、融合促進化合物、放電あるいは融合誘発ウイルスなどによるドナー
細胞と卵母細胞の融合）に比較して卵母細胞の外傷を少なくすることが出来る。

【００４０】マイクロインジェクションによる核物質の導入法は細胞融合による核物質の導
入とは、時間的にも、局所解剖学的にも区別される。本発明のマイクロインジェ
クション法では、最初にドナーＥＳ細胞の原形質膜に針が刺され、次いで脱核卵
母細胞に針が刺される。したがって、ドナー細胞の核（あるいは少なくとも染色
体を含むその部分）の取出しと、レシピエント細胞への核の供給とは時間的に分
離されている。核成分の単離と供給が空間的にも時間的にも分離されていること
は、両細胞を並置して一段階で融合させる細胞融合にはない特徴がある。

【００４１】さらに、本発明方法における核の取出しと導入の空間的時間的分離は、核に加
えて物質を調節して導入することを可能にする。（細胞質及び核質のような）無
関係の物質を除くことが出来ること、及び追加的物質あるいは試薬を導入できる
ことは、非常に望ましいことであろう。例えば添加物は続く発生分化に好ましい
影響を与えることであろう。そのような試薬としては、抗体、薬理的信号伝達阻
害剤、またはそれらの組み合わせがあり、抗体及び／または阻害剤は細胞分裂や
胚の発生分化に対して陰性調節作用を有するタンパク質あるいはその他の分子の
作用を抑制したり阻害したりする。試薬には、胚の発育の間に発現され発生分化
に潜在的な陽性作用を有するタンパク質をコードする組換えプラスミドあるいは
トランスフォーミングベクター構築のような核酸配列及び／または細胞への試薬
の導入が脱核卵母細胞と核の結合、に先立って、その間にまたはその後に行われ
る核酸配列がある。

【００４２】ＥＳ培養細胞から核移植によりクローン化分化細胞集団を得るための本発明方
法の一態様における段階及び中間段階を図１に示す。

【００４３】要約すると、卵母細胞ドナー動物から卵母細胞が取出し（１）、望ましくは中
期Ｉ期の卵母細胞、そしてそれぞれの中期ＩＩ（ｍＩＩ）板（ｍＩＩ染色体を含
む）を取り去り（２）脱核卵母細胞を形成する（母体由来染色体を除去）。レシ
ピエント卵母細胞は既知方法によりインビトロであるいは他の研究者により記述
されているようにインビボで成熟させることができる。本発明の異なる態様に順
応している、小径（典型的には１０μｍ）あるいは大径（典型的には１８μｍ）
の細胞を含むインビトロ培養から健康に見えるＥＳ細胞を選択する（３，４）。
１個の核を脱核卵母細胞の細胞質の中に注入する（５）。核は脱核卵母細胞の細
胞質の中に６時間まで留置する（６）。一態様においては、この期間は最低約０
−５分である。望ましい態様において、この期間は１−３時間である。

【００４４】次いで卵母細胞は、部分的に移植時のドナー核の細胞周期段階によって反映さ
れる倍数性または侵入核のゲノム同等性に応じて、微小管及び／またはミクロフ
ィラメント集合の阻害剤の存在下にあるいは非存在下に活性化を行なう（７）。
分裂細胞周期は、ＤＮＡ複製の複写過程に続いて活発に分裂する細胞は二個の娘
細胞に同等の遺伝物質を分譲する。ＤＮＡ合成は細胞周期を通して行なわれるの
ではなく、その一部に限られている；合成期、Ｓ−期。これに続いてギャップ期
、Ｇ２−期、があり、この期間に細胞は中期（Ｍ−期）に入る前にさらに分裂の
準備を行なう。したがって、生れたばかりの娘細胞はもう一つのギャップ期、Ｇ
１−期、に入れられる。ある分裂しない細胞、例えばインビボで分化し終わった
細胞、は周期のこの段階に止まっている−この期は分裂しつつある細胞のＧ１−
期に相当し、この期はＳ−期に進む。この細胞は、しばしば「静止」と称され、
細胞周期から外れてＧ０−期に入る。細胞周期のＧ０−あるいはＧ１−期にある
細胞の核は二倍体であり、２ＣＤＮＡ含有に相当する２ｎ染色体を持っている
；それぞれ形態的に異なる常染色体（非Ｘ、非Ｙ）の２コピー、及び動物種によ
って、ＸＸ（雌）かあるいはＸＹ対のいずれかを有している。ＤＮＡ複製を終了
した細胞周期のＧ２−期にある細胞核はまだ染色体数に関しては２ｎであるが、
４ＣＤＮＡ含有となっている。Ｓ−期の間に、異なる染色体のそれぞれの２コ
ピーの各々にあるＤＮＡは複製されるが、そのコピー（一価姉妹クロマチド）は
各染色体のセントロメアに繋ぎ止められている。同期しない分裂をするＥＳ細胞
培養の中では、定義により、細胞周期の全ての段階が現れていることが期待され
る。その結果、ＥＳ細胞培養は直径の範囲に現れる細胞の混合を含んでいる；そ
の範囲は約１０μｍから約１８μｍである。比較的小さな細胞（約１０μｍ径）
は二倍体（２ｎ）でゲノムＤＮＡに関して２Ｃであるらしい、なぜならこれらの
細胞は比較的最近分裂し、比較的少ししか細胞質容量が増加していない。最大（
約１８μｍ径）に近い細胞はＳ−期を超えて進んでいるようである。

【００４５】ＥＳ細胞ドナー核が二倍体で２Ｃである場合には、核移植に続いて細胞質分裂
の阻害剤の存在下に再構成細胞を活性化する。偽極体の形成の抑制及び染色体の
排出防止により、再構成細胞の２ｎ倍体を保持する。核がＳ−期後にあると考え
られる（大きな細胞の範囲にあるので）場合には、偽極体の形成に伴って卵母細
胞の倍数が２ｎ，２Ｃに減少するように、細胞質分裂阻害剤を存在させずに卵母
細胞を活性化する。活性化期間中に、偽極体の形成を観察することが出来る。

【００４６】ＥＳ核ドナー細胞の培養液中のウシ胎児血清（ＦＣＳ）濃度は広い範囲で変化
させることができる；ＦＣＳ濃度は、本発明の方法によりクローン化生存仔の発
育を維持する培養ＥＳ細胞核の能力に著しい影響を及ぼすとは思われていない。

【００４７】小さいか大きいかいずれかの細胞の核を移植した後、偽前核を形成した卵母細
胞（８）は、１から約３．５日の胚培養を行なうために新鮮な培養液に移す（９
）。培養に続いて、胚を代理母に移植し（１０）、発育させ生存仔を出産させる
（１１）。そうでなければ、発生した胚は（９）ＥＳ細胞様細胞誘導培養におけ
るＩＣＭ細胞源として使用することができる。

【００４８】このように、本発明方法の一態様には下記段階からなる哺乳動物のクローニン
グが記載されている：（ａ）少なくとも染色体を含む、ＥＳ細胞のような細胞核
の全部または部分を採取する；（ｂ）それを脱核卵母細胞に挿入する；（ｃ）再
構成細胞を胚に発生分化させる；そして（ｄ）胚を胎児及び生存仔に発育させる
、あるいはインビトロで培養する胚の細胞にする。これらの段階のそれぞれにつ
いて、代表例としてＥＳ細胞核ドナーを用いて、以下に詳細に記述する。

【００４９】ＥＳ細胞核（または染色体を含む核構成成分）を、既述のように２−４Ｃのゲ
ノムＤＮＡ相補体を有するＥＳ細胞から採取することが出来る。望ましくは、Ｅ
Ｓ細胞核を脱核卵母細胞の細胞質中に挿入する。望ましくは核の挿入はマイクロ
インジェクションによって、またより望ましくはピエゾ電気駆動マイクロインジ
ェクションによって行なう。他の態様においては、核ドナー細胞とレシピエント
、脱核卵母細胞とを融合させることにより核を導入することができる（Ｗｉｌｌ
ａｄｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ３２０，６３［１９８６］）。

【００５０】再構成細胞の活性化はＥＳ細胞核の挿入の前に、その間に、またはその後に行
なうことができる。一態様においては、活性化段階はＥＳ細胞核の挿入の０から
約６時間後に行なう。活性化されるまでの時間の間に核はｍＩＩ卵母細胞の細胞
質と接触する（侵入成分により潜在的に修飾される）。活性化は次のような種々
の方法で行われるが、これに限定されない；電気活性化、あるいはエタノール、
精子細胞質因子、卵母細胞受容体リガンドペプチド類似体、Ｃａ²⁺放出刺激薬（
例えばカフェイン）、Ｃａ²⁺イオノフォア（例えばＡ２３１８、イオノマイシン
）、リン酸タンパク質シグナリング調節剤、タンパク合成阻害剤など、あるいは
それらの組合せへの曝露。本発明の一態様においては、この活性化はストロンチ
ウムイオン（Ｓｒ²⁺）に細胞を曝露することにより行なう。

【００５１】２ＣＤＮＡを含む核を注入された再構成細胞の活性化は、微小管及び／また
はミクロフィラメント集合の阻害剤に曝露することにより極体の形成を防止して
行なうことが望ましい（下記参照）。これはドナー核からの染色体をすべて再構
成細胞中にとどめるのに有利に作用する。２−４Ｃ核を持つ再構成細胞は偽極体
を形成させるために阻害剤を存在させずに活性化を行なうことが望ましい、これ
によりゲノム相補体は２Ｃに減少する。一態様においては、２Ｃゲノム相補体は
２ｎ染色体に対応している。

【００５２】胚を発育させる段階は、胚を生存胎児（つまり、着床に成功した胚が出産まで
成長することが出来る）に発育させるレシピエント代理母に胚を移植する中間段
階を含んでいる。胚は、当業者に知られているように、インビトロ発育のどの段
階、２細胞から桑実胚／胚盤胞、においても移植することができる。

【００５３】本発明の追加的態様の初めから１０段階までで、図１の段階（１）から（１０
）にしたがって、クローン化桑実胚または胚盤胞が作製される。一態様において
は、これに続いて、クローン化胚を代理レシピエント母に移植する前に、少なく
とも１個、通常は５−１５個のＥＳ細胞をクローン化胚の中に、当業者には知ら
れている方法にしたがって集合技術あるいは胚盤胞注入により、導入する。この
「二次」ＥＳ細胞は元のままであり、また核ドナーが由来した細胞と同一の培養
から由来してもよく、あるいはその培養の継続から、または別の培養、あるいは
混合から由来してもよい。二次ＥＳ細胞の機能の一つはクローン化胚の発生分化
の潜在能力を助けあるいは増強して、完全に発育する確率を大きくすることであ
る。生じた胚はクローン由来胚細胞及び二次的に導入したＥＳ細胞の混合したも
のを含んでいる。次いでこの混合細胞胚は雌代理レシピエントに移植され、胚は
生存胎児に発育する。同じＥＳ細胞培養が核ドナー及び二次ＥＳ細胞の両者に使
用された場合には、生じた胚は遺伝的にキメラではない。異なるＥＳ細胞培養が
使用された場合には、生じた胚は遺伝的にキメラであることもあり得る。

【００５４】本発明の別の態様において、脱核卵母細胞に核成分を移植することにより再構
成した細胞にインビトロで胚発生活性化の信号を与え、既述したように培養する
。しかし、生じた胚はインビトロで更に培養して細胞系を得るのに使用する。望
ましい態様では、胚を胚盤胞段階まで培養し、当業者に知られている方法にした
がって、胚性幹（ＥＳ）細胞系あるいはＥＳ細胞様細胞系を得るために使用する
。さらに別の態様では、このようにして得た系の細胞を、インビトロ培養条件を
変えることにより、指定の経路に沿って分化するように誘導する。ＥＳ細胞ある
いはＥＳ細胞様細胞は、心筋細胞（Ｋｌｕｇ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．９８，２１６［１９９６］）、神経細胞（Ｂａｉｎ，ｅｔａｌ．
，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６８，３４２［１９９５］）あるいは血液細胞（Ｗｉｌ
ｅｓ，＆Ｋｅｌｌｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１１，２５９［１９９１］
）を含む、これに限定されない、種々の細胞種の集団を作製するために分化すべ
く、当業者により、誘導することができる。このような細胞は、例えば組織工学
のような新興分野において、大きな有用性を有している（Ｋａｉｈａｒａ＆Ｖａ
ｃｎｔｉ，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１３４，１１８４［１９９９］に記述されてい
る）。

【００５５】マイクロインジェクションは、ＥＳ細胞核の脱核卵母細胞への供給及びその結
果としてのＥＳ細胞核の再構成に関連して、下記のような多くの利点を有してい
る。第一、マイクロインジェクションによる核の全部あるいは一部の供給（つま
り、脱核卵母細胞へ一部を供給し、染色体成分を含む核成分を含有するＥＳ核の
結果としての再構成）は、−インビトロで育成したのかインビボで育成したのか
−サイズ、形態、核ドナーの発生段階などに関係なく、幅広い種々の細胞型に適
用しうる。第二、マイクロインジェクションによる核供給は、核注入の際に脱核
卵母細胞の中に一緒に導入される核ドナー細胞の細胞質及び核質の容量を注意深
く調節することができる。無関係な物質が発生分化の潜在能力に悪影響を与える
場合には、特に適切である。第三、マイクロインジェクションによる核供給は、
核注入時に卵母細胞に追加の試薬を（ドナー核と）一緒に注入するのを注意深く
調節することができる：このような試薬は下記に例示する。第四、マイクロイン
ジェクションによる核供給は、活性化に先立ってドナー核を脱核卵母細胞の細胞
質に曝露する期間を置くことを容易にする。この曝露は、続く胚の成長に都合の
よいクロマチンリモデリング、リプログラミング及び移植クロマチンにおけるそ
の他の変化（例えば、母体由来転写因子の動員）を促進する。第五、マイクロイ
ンジェクションによる核供給は続く活性化プロトコールの広範囲の選択を可能に
する（一態様においては、Ｓｒ²⁺の使用）；異なる活性化プロトコールは発生分
化能力に対して異なる効果を及ぼし得る。第六、活性化はミクロフィラメント分
離剤（一態様においては、サイトカラシンＢ）の存在下に行われ、染色体の押し
出しを防ぐ、また細胞分化の調節剤（異なる態様において、ジメチルスルフォキ
シド、または９−ｃｉｓ−レチノイン酸）の存在により望ましい発生分化結果を
生じる。第七、一態様において、ピエゾ電気駆動マイクロインジェクションによ
り行なった核供給は、サンプルの処理をすばやく効率的に行なうことができ、そ
の結果操作した細胞の外傷を少なくすることができた。この外傷減少は、部分的
にはドナー細胞核の調製及び卵母細胞への導入を同じ注射針で行なうことによる
ものある；対照的に、従来のマイクロインジェクションの使用では、透明帯の切
り離しと卵母細胞形質膜の穿刺の間に少なくとも１回は針の交換を必要とする。
第八、個々の段階のみならず、それらの相互関係が、本発明方法の特徴である。
ここにこれらの個別の段階を詳細に示すと共にそれらが本発明において相互にど
のように配置されているか示す。

【００５６】詳細な説明１：レシピエント卵母細胞。脱核のために採取し、核移植のレシピ
エントとして調製するのに先立つインビボにおける卵母細胞の成熟段階は、クロ
ーニング方法の成果に大きく影響する。ドナー核の注入は発生のどの段階にあっ
ても卵母細胞あるいはその前駆体に行なうことができる。本発明の望ましい態様
では、核をレシピエントである成熟、ｍＩＩ卵母細胞に移植している；そのｍＩ
Ｉ卵母細胞は通常受精精子により活性化されるタイプである。卵母細胞細胞質の
化学は成熟過程を通して変化する。これはＭ期促進因子（ＭＰＦ）に代表される
、サイクリンＢ２及びｃｄｃ２プロテインキナーゼの２量体複合体である。ＭＰ
Ｆ活性が高い細胞は細胞周期のＭ期にある。例えば、マウスにおいて、ＭＰＦと
関係する細胞質活性は、第一減数分裂のＭ期（Ｍ期Ｉ、ｍＩ）に止まっている未
成熟卵母細胞において最大である。ＭＰＦ活性は、次いで一次極体（Ｐｂ１）の
押し出しと共に低下し、再び第二Ｍ期、ｍＩＩ、で高レベルに達する。この高レ
ベルは維持され、ｍＩＩに卵母細胞をとどめるのに役立ち、受精精子あるいはＳ
ｒ²⁺により提供されるような細胞周期を再開する（活性化）シグナルを卵母細胞
が受けると急速に減少する。ＥＳ細胞核がｍＩＩ卵母細胞の細胞質に注入される
と、高いＭＰＦ活性は核膜を分解し、付随するクロマチンの濃縮、ＥＳ細胞由来
Ｍ期染色体を形成する。

【００５７】本発明方法に使用することができる卵母細胞には、未成熟段階卵母細胞（卵胞
として知られる完全な核を持っているもの）及び成熟段階（つまり、ｍＩＩにあ
るもの）のいずれも含まれる。成熟卵母細胞は次のようにして得ることができる
、例えば性腺刺激あるいは他のホルモン（例えば、ウマ及びヒト絨毛性性腺刺激
ホルモン連続投与）の注射により動物に過排卵をおこさせ、そして、排卵の短時
間後に外科的に卵を採取する（例えば、マウスでは発情開始から１３−１５時間
後、ウシでは発情開始から７２−９６時間後、そしてネコでは発情開始から８０
−８４時間後）。

【００５８】卵母細胞の入手が未成熟卵母細胞に限られている場合には、成熟促進培養液中
でｍＩＩに進むまで培養することができる；これはインビトロ成熟（ＩＶＭ）と
して知られている。未成熟ウシ卵母細胞のＩＶＭ方法はＷＯ９８／０７８４１
に記載されており、未成熟マウス卵母細胞についてはＥｐｐｉｇ＆Ｔｅｌｆｅｒ
（Ｍｅｔｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．［ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ］２２５，ｐｐ
７７−８４，［１９９３］）に記載されている。本発明のその他の態様では、
未成熟卵母細胞はＩＶＭ無しにレシピエント細胞として使用することができる、
例えば、卵母細胞は脱核の前にインビトロで成熟させることができる。

【００５９】詳細な説明２：卵母細胞脱核。卵母細胞脱核は既知方法により行なうことがで
きる。望ましくは、卵母細胞は脱核の前及びその間に、微小管及び／またはミク
ロフィラメント集合の阻害剤を含有する液に曝露する。アクチン含有ミクロフィ
ラメントあるいはチュブリン含有微小管の分解は、細胞膜及び／またはその下に
ある表層細胞質に流動性を与える、細胞内構造に対する傷害を最少にして、その
ため膜に囲まれた卵母細胞の部分は容易にピペットの中に吸い取ることができる
。選択されるミクロフィラメント分解剤はサイトカラシンＢ（５μ／ｍｌ）であ
る。ノコダゾール、６−ジメチルアミノプリン及びコルヒチンのような、適切な
微小管分解剤は、当業者に知られている。その他のミクロフィラメント分解剤と
しては、これに限るものではないが、サイトカラシンＤ、ジャスプラキノリド、
ラトランクリンＡなどがある。

【００６０】本発明の望ましい態様においては、ｍＩＩ卵母細胞の脱核はピエゾ電気駆動マ
イクロピペットを使用して吸引することにより行われる。脱核微小手術を通して
、ｍＩＩ卵母細胞は通常の固定マイクロピペットで固定される。ピエゾ電気駆動
脱核マイクロピペットの平らなチップ（内径〜７μｍ）を透明帯に接触させる。
適当なピエゾ電気駆動ユニットはＰｉｅｚｏＭｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏ
ｒ／ＰｉｅｚｏＩｍｐａｃｔＤｒｉｖｅＵｎｉｔの名称でＰｒｉｍｅＴ
ｅｃｈＬｔｄ．（筑波、茨城県、日本）から発売されている。このユニットは
、高度に調節され、すばやく、マイクロインジェクションピペットチップを短距
離（約０．５μｍ）進めるピエゾ電気効果を利用している。強さとパルス間隔は
調節装置により変化させたり調節することができる。ピエゾパルス（例えば、強
さ＝１−５、速度＝４−１６）を適用して、その中を少し引圧に保って、マイク
ロピペットを透明帯を通して進める（孔を開ける）。この様にして、マイクロピ
ペットチップは速やかに透明帯を通過し、ｍＩＩ板（染色体−紡錘体複合体を含
みそしていくつかの動物種のｍＩＩ卵母細胞の細胞質中に半透明領域として確認
することができ、しばしば一次極体の近くにある）に隣接した位置に進められる
。Ｍ期板を含む卵母細胞細胞質は穏やかにそして手際よくマイクロインジェクシ
ョンピペットの中に最少容量で吸引し、インジェクションピペット（今はｍＩＩ
染色体が入いっている）を引き抜く。この操作の効果は、ｍＩＩ染色体を含む卵
母細胞細胞質の部分を摘み出すことである。次いでマイクロインジェクションピ
ペットを引いて透明帯を取り除き、そして次の卵母細胞から染色体を微小手術除
去をする前に染色体を周囲の液中に放出する。適当であるなら、卵母細胞の群に
ついて、完全に脱核されていることを確認するスクリーニングをすることができ
る。顆粒性細胞質を持つ卵母細胞（例えば、ブタ、ヒツジ及びネコ卵母細胞）に
ついては、ＤＮＡ特異的蛍光色素（例えば、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ３３３４２）で
染色し、そして低強度ＵＶ照射の下で簡単な検査（ある場合には、画像強調ビデ
オモニターにより増強される）をすることが脱核の効率を確かめるのに有利であ
る。

【００６１】ｍＩＩ卵母細胞の脱核は、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．４，９９４，３８４
に記載されているような、他の方法によって行なうことができる。例えば、脱核
はピエゾ電気駆動に対するものとして、従来のマイクロピペットを使用して微小
手術的に行なうことができる。最初に卵母細胞のｍＩＩ染色体の位置に回近い透
明帯の外周に沿って１０−２０％にガラス針でスリットをいれることにより脱核
を行なうことができる。卵母細胞は顕微鏡ステージ上のサイトカラシンＢを含む
液滴の中に置かれる。染色体は、鈍化させた、斜めに切ったチップを持つ脱核ピ
ペットで除去される。

【００６２】脱核の後には、卵母細胞はＥＳ細胞核を受け入れる準備が出来ている。脱核卵
母細胞は、ドナー核挿入の約２時間前以内に調製されることが望ましい。

【００６３】詳細な説明３：ＥＳ細胞系の調製及び維持。ＥＳ細胞の単離、培養及び操作は
、例えば、下記に記載されている：Ｈｏｇａｎ，ｅｔａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌ
ａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ．２^nd ｅｄ．（ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓ）（１９９４）．記載の要点をここに要約した。

【００６４】初代マウスＥＳ細胞は、（受精のような）発生分化の活性化後少なくとも約３
．５日に膨張した胚盤胞から単離することができる。胚はＤＭＥＭ（１０％ウシ
胎児血清及び２５ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４を添加）のような液で動物の子
宮角から流し出し、そして、予め作製した下記の支持細胞層及びＥＳ細胞培養液
１ｍｌを入れた１０ｍｍウエル培養皿に個別に入れた。胚培養のこの最初の段階
は、支持細胞なしで軽パラフィン油下のＥＳ培養液の小滴中でインキュベートし
ても行なうことができる。１−２日間さらに培養した後、胚は透明帯から「孵化
」して、栄養外胚葉（ＴＥ）系統の細胞の遊走により組織培養皿の表面に接着す
る。胚の接着の直後に内部細胞塊（ＩＣＭ）はＴＥ系統の細胞とは容易に区別で
きるようになり、そして急速に成長する。合計４−５日の胚盤胞培養の後、ＩＣ
Ｍから由来した（ＥＳ）細胞は下層の細胞から精巧に引いたパスツールピペット
のシール端を使用して取出す。

【００６５】細胞はトリプシンで処理し、ＥＳ細胞塊を通常３または４個の細胞を含む小さ
な群に分解する。これを次いで新鮮な支持細胞組織培養ウエルに移す。初代ＥＳ
細胞様コロニーは以下に記述するようにその形態により確認し得る。

【００６６】ＥＳ細胞及び遺伝的に操作した細胞は、正常な核型を維持するために、厳密な
生育条件の下に培養される；これにより使用するたびに生殖細胞として機能する
潜在的能力を有することを保証する。最適でない培養条件ではＥＳ細胞の変異体
を生じ、これは核型の変化、染色体の再編成及び／またはその他の変異を起こし
、増殖速度を増し、インビボにおける発生分化能力を減ずることが、知られてい
る。最適培養条件はＥＳ細胞を培養している業者には知られており、必要濃度の
栄養素及び成長因子の供給及び非常に高密度での培養の回避を含んでいる。高密
度での細胞培養は、その表面の細胞が限定された多能性を持つ内胚葉様細胞に分
化した塊を形成する望ましくない傾向がある。望ましい培養密度は、２−３日毎
に培養を１：２から１：６に分割し、標準的方法にしたがって、タンパク分解酵
素、トリプシン、で緩和に処理して３−４細胞の塊を１細胞に分離することによ
り得られる。培養中の健康なＥＳ細胞は、典型的に「滑らかな」外観を持つ密集
した群に増殖する。「粗い」内胚葉のコロニー表面の存在あるいは培養基盤上に
広がった細胞は、なかんずく当業者に知られている最適でない条件の現われであ
る。

【００６７】全ての培養液、添加物などはエンドトキシンを除去してある。最もよく使用さ
れる培溶液はダルベッコー修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び４．５ｍｇ／ｍｌ
グルコースであり、任意に１ｍＭピルビン酸ナトリウムを加える。ＤＭＥＭは約
３５℃の５％ＣＯ₂を含む空気中でｐＨ７．２−７．４になるようにした重炭酸
バッファー培養液である。ＤＭＥＭは通常使用直前に次のようなものが添加され
る：（ａ）２ｍＭグルタミン；（ｂ）０．１ｍＭ非必須アミノ酸；（ｃ）０．１
ｍＭ β−メルカプトエタノール；（ｄ）５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、また
は各１００Ｕ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン、あるいは抗生剤なし；
（ｅ）１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；下記参照）；及び任意に、（ｆ）分化抑制
因子（ＤＩＡ）としても知られている白血病阻害因子（ＬＩＦ）（下記参照）。

【００６８】ＥＳ細胞の植え継ぎ及び採取には、それを組織培養皿からはがして、Ｃａ²⁺−
Ｍｇ²⁺を含まないリン酸バッファー食塩液中でトリプシン及びエチレンジアミン
テトラ酢酸ジナトリム（ＥＤＴＡ）（例えば、それぞれ０．０２５％及び７５ｍ
Ｍの最終濃度）の混合物で処理してお互いを切り離す。

【００６９】ウシ胎児血清としても知られるＦＣＳは、ＤＭＥＭに添加されてＥＳ細胞培養
に使用される。典型的には、ＦＣＳは１５％（ｖ／ｖ）で使用される。しかし、
低濃度（例えば、１−５％）のＦＣＳはＥＳ細胞の培養を維持し、その核を本発
明方法における胎児及び生存仔への発生分化を進行させることを可能にする。さ
らに、この低濃度のＦＣＳは活発な増殖培養を維持し、細胞周期の全ての段階に
ある細胞を示し得ることを暗示しており、本発明の方法に使用し得る。

【００７０】白血病阻害因子（ＬＩＦ）は分泌型サイトカインであり、ＥＳ細胞の自発的分
化を抑制する。それはバッファローラット肝（ＢＲＬ）細胞順化培地の活性成分
の一つであり、ＥＳ細胞を増殖するために使用されることが知られている。ＥＳ
細胞共存培養では、培地に精製ＬＩＦを添加してもよいが、支持細胞がＬＩＦを
活性型で発現する。支持細胞で順化した細胞除去培地はＥＳ細胞培養を維持する
には充分でなく、例えば、精製ＬＩＦの添加を必要とする（下記参照）。

【００７１】ＥＳ細胞培養を支持細胞なしでＬＩＦを添加した培地中で行なうことは可能で
あるが、ほとんどの研究室はＥＳ細胞の増殖を促進し、そして分化段階を維持す
るための因子を供給するために支持細胞層に頼っている。最も一般的に使用され
ている二種の支持細胞は、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）の初代培養であり、当
業者に既知の方法で１２．５から１４．５ｄｐｃ胚から採取したものであり、ま
たＳＩＭマウス繊維芽細胞細胞のチオグアニン及びウワバイン抵抗性亜系である
ＳＴＯマウス繊維芽細胞細胞系である。分裂に不活性の支持細胞はマイトマイシ
ンＣあるいはγ線照射の処理により調製される。

【００７２】ＥＳ細胞様細胞を誘導する方法は他の動物種について既に記載されている、そ
れらはウシ（Ｃｉｂｅｌｌｉ，ｅｔａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ
４７，２４１［１９９７］）、ハムスター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，ｅｔａｌ
．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，１２７，２４４［１９８８］）、ヒト（Ｔｈｏｍｓｏｎ
，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２，１１４５［１９９８］）及びウサギ
（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４５
，４３９［１９９６］）。これらの方法は、当業者がＥＳ細胞様細胞を誘導する
のに適した動物種に適用することができる。

【００７３】詳細な説明４：遺伝的修飾あるいは遺伝子ターゲティングＥＳ細胞。ＥＳ細胞
に既知の方法で遺伝的に修飾することができる。「遺伝子ターゲティング」によ
りＥＳ細胞に修飾を施すことが望ましい。遺伝子ターゲティングとは、指向性が
あり無秩序でない方法でゲノム変異を導入する方法である。この方法により、特
異的変異を全ゲノム配列の中に導入することができる。ＥＳ細胞は個体を発生さ
せるのに使用することができるので、遺伝子ターゲティング変換をしたＥＳ細胞
は目的突然変異を含む動物を生産することができる。方法−「ターゲティング構
築」の設計及び構築−の重要な特徴は当業者には既知である。ターゲティング構
築は典型的には少なくとも一つの宿主ゲノムには本来ないヌクレオチド配列を含
んでいる。本来ない配列は導入する変異に対応しており、宿主ゲノムの配列と同
一でないとしても、高度に保存された広範囲な領域（典型的には＞５ｋｂｐ）で
並列する。これはひとたび細胞内に入ると保存／同等配列は、標的ゲノム上の相
補的対応配列と相同組換えを行なえることを意味する。

【００７４】所与のＥＳ細胞型のゲノムに変異を導入するために、ターゲティング構築ＤＮＡ
を比較的純粋な形態で調製し、ＥＳ細胞にこのＤＮＡを下記から選んだ方法によ
り取り込ませる、野生型または組換えレトロウイルスの感染、リポフェクション
、トランスフェクション、など及び望ましくは電気穿孔（Ｈｏｇａｎ，ｅｔａ
ｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ．２^nd
ｅｄ．［ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ］，ｐｐ．２７７−２７８［１９９４］；Ｊｏｙｎｅｒ［ｅｄ］，Ｇｅｎ
ｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ．［ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ
］［１９９３］）。

【００７５】遺伝子ターゲティングの効率は、それぞれのターゲティング構築配列、ＤＮＡ
調製あるいはＥＳ細胞系に固有の変動の組み合わせに依存している；しかしこれ
らは当業者内の日常の実験に必要であるに過ぎない。例えば、効率は、同質遺伝
子的に対する非同質遺伝子的ＤＮＡの使用、ターゲティング構築内の相補的配列
の長さ、ターゲティングＤＮＡ及び内在遺伝子に存在する同じ配列の連続長の程
度、ターゲティングＤＮＡに並列する相補性の長さなどの影響を受ける。遺伝子
ターゲティングＥＳ細胞を作成する方法は当業者には既知である。本発明に使用
するのに適した代表的遺伝子ターゲティングＥＳ細胞は、これに限るものではな
いが、下記に記載されている：Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，３０８４（１９９１）；Ｍｏｍｂａ
ｅｒｔｓ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６０，２２５（１９９２）；Ｉｔｏ
ｈａｒａ，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ７２，３３７（１９９３）；Ｕ．Ｓ．Ｐａ
ｔｅｎｔ５，８５９，３０７など）。

【００７６】詳細な説明５：ＥＳ細胞ドナー核の調製。培養の後、コンフルエントに至らな
い培養のＥＳ細胞を組織培養皿からはがし、Ｃａ²⁺−Ｍｇ²⁺を含まないリン酸バ
ッファー食塩液中でトリプシン及びエチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリム（Ｅ
ＤＴＡ）（例えば、それぞれ０．０２５％及び７５ｍＭの最終濃度）の混合物で
処理してお互いを切り離す。細胞懸濁は次いで顕微鏡ステージ上の１２％ポリビ
ニルピロリドンを含むＣＺＢ・Ｈ培地の滴に移す。

【００７７】詳細な説明６：ドナー核の脱核卵母細胞への挿入。核（あるいは少なくとも染
色体を含む核成分）をマイクロインジェクション技術により脱核卵母細胞の細胞
質中に直接注入することができる。脱核卵母細胞へのＥＳ細胞核の望ましい注入
法では、ピエゾ電気駆動マイクロピペットを使用し、その場合に本質的には（卵
母細胞の脱核に関して）既述した装置と技術を使用することができ、ここにその
応用を詳述した。

【００７８】例えば、マイクロインジェクション針は、既述のとおり内径約５μｍの平らなチ
ップを持つように作製する。針はそのチップの近くに水銀を含んでおり、供給業
者の説明書によるとピエゾ電気駆動ユニットの中に入れてある。マイクロインジ
ェクションピペットのチップの近くにある水銀滴の存在はチップの前進に必要な
勢いを増強し、したがって調節された方法でチップの貫通能力を強める。個々に
選択された核を含むマイクロインジェクションピペットのチップを脱核卵母細胞
の透明帯と密に接触するようにし、そして数回のピエゾパルス（強度１−５、速
度４−６の設定範囲の調節器を使用して調節）を施して、任意にない圧をわずか
に低圧に保った、マイクロピペットを前進させる。ピペットチップが透明帯を通
過したら、できた帯の「コア」を卵周囲スペースに排出し、そしてマイクロピペ
ットの中にある予め選択した核をチップの近くまで進める。次いでピペットチッ
プを形質膜（透明帯）に隣接させ、そして卵母細胞のほとんど反対側の面に至る
まで（卵母細胞の反対面の方向に）進める。卵母細胞形質膜はインジェクション
針の周りに深く窪む。１から２のピエゾパルス（例えば、強度１−２、速度１）
の適用により、速やか−そして典型的に認識できる−透明帯の弛緩に示されるよ
うに、チップの位置で形質膜に孔があく。次いで核を卵母細胞質の中に最少量（＜〜１ｐｌ）の付随培地で排出する。マイクロピペットを次いで注意深く引きぬ
き、卵母細胞の細胞質の中に新たに導入した核を残す。典型的には、それまで培
養条件に維持されている脱核卵母細胞の１５−２０個の群についてこの方法をき
びきびと、実施する。

【００７９】この他の変法として従来のマイクロインジェクションによるドナー核の挿入も
使用することができる。ハムスター卵母細胞への精子核を挿入するために従来の
マイクロインジェクションを使用した一方法が記載されている：Ｙａｎａｇｉｄ
ａ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４４，４４０（１９９１）、この方法に関係する
この報告を参照文献に採用した。

【００８０】詳細な説明７：ドナー核と発育調節因子の同時注入。本発明の一態様において
、胚の発育結果を変動させる能力を持つ試薬の一つ以上をドナー核と脱核卵母細
胞を結合する以前に、その間に、あるいはその後に、導入することができる。例
えば、核と一緒に本発明方法の成績に影響する理論的あるいは既知の効力を有す
るタンパク質に作用することを目的とした機能調節抗体を注入することができる
。このような分子としては、これに限定するものではないが、小胞輸送に含まれ
るタンパク質（例えば、シナプトタグミン）、クロマチン−卵母細胞質連絡を仲
介するタンパク質（例えば、Ｃｈｋ１のようなＤＮＡ損傷細胞周期チェックポイ
ント分子）、卵母細胞シグナル伝達に推定上の機能を有するタンパク質（例えば
、転写因子、ＳＴＡＴ３）またはＤＮＡを修飾するタンパク質（例えば、ＤＮＡ
メチル転移酵素）がある。この類の分子は、本発明方法においてマイクロインジ
ェクションにより導入される薬理的調節剤の（間接的）標的であり、それは抗体
に類似した機能調節作用を有している。抗体及び薬理的試薬のいずれもそれぞれ
の標的分子あるいはそれぞれの標的分子のリガンドに結合することにより効果を
発現する。標的が発育結果に抑制作用を有する場合には、この結合は標的機能を
低下させ、標的が発生分化結果に陽性効果を有する場合には、この結合はその機
能を亢進する。あるいは、クローニング過程に重要な機能の調節は、それに結合
する試薬よりはその因子（あるいは類似活性を持つ因子）を注入することにより
直接行なうことができる。

【００８１】本発明の他の態様においては、リボ核酸（ＲＮＡ）あるいはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）をドナー核の挿入の前に、またはそれに続いてマイクロインジェクシ
ョンにより卵母細胞に導入すことができる。例えば、必要なｃｉｓ活性信号を含
む組換えＤＮＡの注入により、元からあった転写因子によるかあるいは同時に注
入した転写因子によって組換えＤＮＡ上に存在する配列の転写を生じることがで
きる；その結果発現するコードされたタンパク質は、胚の発育に対して抑制的な
因子に拮抗作用を有するか、あるいは陽性因子に増強作用を有するかのいずれか
であろう。さらに、転写は、発育能力を減ずるｍＲＮＡコードタンパク質に対し
てアンチセンス調節活性を有する。あるいは、そのような調節は直接アンチセン
ス機能を有する核酸（またはその誘導体）（例えば、アンチセンスｍＲＮＡ）を
直接供給することにより行なうことができる；これにより卵母細胞内におけるア
ンチセンス調節分子を生産するための転写は不必要になる。好ましい態様におい
て、この供給はマイクロインジェクションによる。最後に、転写は初期胚におい
ては遺伝子発現の転写調節に重大な影響を及ぼす。そのような影響はやはり、翻
訳に影響する追加的分子種のマイクロインジェクションにより仲介することがで
きるであろう。

【００８２】本発明方法により導入された組換えＤＮＡ（環状か線状）は、１以上の発現さ
れる機能遺伝子を含む機能的複製子を含むことができる。この遺伝子は、狭い、
広いあるいは中間の発生分化の発現プロフィールを示し得る活性を持つ１以上の
プロモーターの支配下にある。例えば、初期接合体においてのみ活性なプロモー
ターは、その関係遺伝子の即時、しかし短時間の発現を指示する。導入されたＤ
ＮＡは多分胚の発生分化の間に失われるか、あるいは１以上のゲノム位置に取り
込まれ生じた形質転換個体の生涯を通して安定して複製される。一態様において
、テロメラーゼ、スーパーオキシドヂスムターゼあるいはその他の酸化防止タン
パク質のような、うわさの「抗老化」タンパク質をコードしたＤＮＡ構築をマイ
クロインジェクションにより卵母細胞に導入することができる。あるいは、精子
因子タンパク質のようなタンパク質を直接注入することもできる。

【００８３】詳細な説明８：再構成細胞の発生分化の活性化。本発明の一態様において、ド
ナー核を受け入れた脱核卵母細胞は、活性化の前に０−６時間の間培養条件に戻
される；こうして、脱核卵母細胞にドナー核を挿入してから約６時間後までには
いつでも卵母細胞を活性化することができる。われわれはこの間を「潜伏期間」
と呼んでいる。望ましい態様において潜伏期間は１−３時間である。活性化は、
限定されることなく、電気的に、１以上の卵母細胞活性化物質の注入により、あ
るいは卵母細胞を１以上の卵母細胞活性化物質を含む培地に移すことにより行な
うことができる。

【００８４】活性化刺激（または活性化刺激の組合せ）をもたらすことができる試薬として
は、これに限るものではないが、精子の細胞質因子（可溶性活性に対応するタン
パク質、オシローゲン、に例示される）及びある種の薬理的化合物（６−ジメチ
ルアミノプリン［ＤＭＡＰ］、ＩＰ₃及びその他の信号伝達調節剤により例示さ
れる）；これらはドナー核の挿入により細胞が再構成される前に、同時に、ある
いはそれに続いて、マイクロインジェクションにより導入することができる。再
構成細胞（直ちにあるいは潜伏期の後）を１あるいは複数の活性化化合物を含む
培地に移して１以上の活性化刺激を与えることができる。このような化合物群と
しては、限定するものではないが、Ｃａ²⁺放出促進剤（例えば、カフェイン、エ
タノール、及びＡ２３１８７及びイオノマイシンのようなＣａ²⁺イオノフォアー
）、リン酸化タンパク質シグナル伝達調節剤（例えば、２−アミノプリン、スタ
ウロスポリン及びスフィンゴシン）、タンパク質合成抑制剤（例えば、Ａ２３１
８７及びシクロヘキサミド）、ＤＭＡＰあるいは上記の組合せ（例えばＤＭＡＰ
とイオノマイシン）がある。本発明の一態様においては、再構成細胞の活性化は
、１０ｍＭＳｒＣｌ₂で供給する２価ストロンチウムイオン、Ｓｒ²⁺、を含む
Ｃａ²⁺除去ＣＺＢ培地中で１−６時間培養することにより行なうことができる。

【００８５】ドナー核の挿入と同時に、あるいはその後に、活性化刺激を適用するような本
発明の態様においては、再構成細胞は活性化刺激の適用時に、あるいはその直後
に、サイトカラシンＢ５μｇ／ｍｌジメチルスルホキシドのようなミクロフィラ
メント分解剤を１以上含む培地に移すことができる；これは細胞質分裂を抑制し
、したがって偽極体を介する染色体の消失を抑制する。細胞質分裂抑制剤の存在
下における培養は４−１２時間の間であるが、６時間がより望ましい。この態様
は、ドナー核が２ＣＤＮＡを含有している場合に適用することが望ましい。

【００８６】その他の態様においては、卵母細胞をドナー核の挿入に先立って上記活性化法
により活性化することができる。活性化刺激に曝露した後、卵母細胞を上記のよ
うに２Ｃ核を注入する前に約６時間まで培養する。この態様では、新規に導入し
た染色体は急速に前核様構造と結びつきそして細胞質分裂抑制剤との培養により
偽極体排出を抑制するには好ましくない。

【００８７】詳細な説明９：生存胎児及び生産仔をつくるための発育。再構成された細胞を
前核、インビトロ培養により発育できる１細胞胚、をつくるために活性化する。
胚を細胞質分裂阻害剤により偽極体排出を抑制した場合には、胚をミクロフィラ
メントあるいは微小管分解剤を含まない新鮮な培地に移す。培養を２細胞から桑
実胚／胚盤胞段階にまで継続することができ、この時点で胚を偽妊娠代理母の卵
管あるいは子宮に移すことができる。

【００８８】あるいは、単細胞再構成から由来する仔の数を増大することにより収量を改善
する目的で、胚を分割し、細胞クローンを拡大する。

【００８９】別の態様では、本発明方法により誘導した胚を、連続核移植によりさらに胚を
発生させるために使用する。これを達成するために、再構成細胞を活性化し、上
記のようにインビトロ培養により発育させる。他の態様においては、培養は適当
な代理母に移植した後インビボで行われる。数日、望ましくは３−５日、の継続
した培養の後に、生じた胚の細胞を、トリプシンのようなタンパク質分解酵素の
緩和な処理あるいは当業者には既知の機械的方法により切り離す。この胚から得
た個別の細胞を次いで核ドナーとして使用する；それぞれの核を取出しそして脱
核卵母細胞に挿入する、そしてこれは次いで活性化され、発生分化させられる。
ドナー核挿入、脱核、発生分化の活性化及び胚培養の方法は上に記述した。

【００９０】詳細な説明１０：分化細胞集団の作製。追加的態様において、本発明の方法に
より発生したクローン化胚は、ＥＳ細胞様細胞インビトロ培養を樹立するために
使用する。これは当業者に既知の方法により行われ、下記に記載されている：Ｈ
ｏｇａｎ，ｅｔａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｍｏｕｓｅｅ
ｍｂｒｙｏ．２^nd ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ），２６５−２７２（１９９４）。この培養は記述の
ように発生分化を誘導することができ、それにより特別な遺伝子型の細胞の潜在
的に無限な源を発生する。この分化を誘導する方法は神経細胞（Ｂａｉｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６８，３４２［１９９５］）、心筋細胞（Ｋｌ
ｕｇ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８，２１６［１９９６］
）及び造血細胞（Ｗｉｌｅｓ＆Ｋｅｌｌｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１１
，２５９［１９９１］）の豊富な集団を得るために記載されている。一例として
、これは移植に使用するための免疫学的に適合した細胞の増殖を可能にする。移
植レシピエントから本発明方法により誘導されたクローンであるので、細胞は適
合することができる。その他の態様では、増殖した細胞の遺伝子的を修飾して、
例えば、非霊長類細胞を霊長類に移植することを阻んでいるＧａ１α１−３Ｇａ
１分子のような免疫調査の標的分子をもはや発現しないようにする。インビトロ
マトリックス上のクローン化細胞の増殖は、クローニング技術と組織工学を結合
させるものである（Ｋａｉｈａｒａ＆Ｖａｃａｎｔｉ，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１
３４，１１８４［１９９９］）。したがって、本発明方法により作製される細胞
集団は移植医療に有用性を有している。

【００９１】このなかで使用した定義２Ｃ，４Ｃ：細胞のゲノム相補体。１Ｃは単位ゲノムを表し、したがって「Ｃ
」とする。１Ｃは、各位置が一度表されている半数体、複製前の細胞のゲノムを
示す。

【００９２】２ｎ：二倍体状態の細胞、「ｎ」は染色体の半数体（単位）数を示す。

【００９３】分化：通常は遺伝子発現における変化の結果として、細胞群が増殖しつつ特異
化する過程。

【００９４】クローン化動物：クローニングにより作製された動物。核ゲノムが一細胞から
由来し、キメラでない多細胞動物。

【００９５】クローニング：核ドナー細胞の核染色体を、染色体を取り去ったレシピエント
細胞に移植して分化した細胞集団を作製すること；この方法では、レシピエント
細胞として脱核卵母細胞を使用することが望ましい。これにより、非ミトコンド
リアＤＮＡが一培養細胞、核ドナー、から由来した仔を発生させることができる
。

【００９６】卵：卵母細胞または受精したばかりの雌配偶子。

【００９７】胚：卵母細胞の発生分化を活性化した後の時期、または他の細胞型において卵
母細胞の活性化に類似した段階に続く時期。

【００９８】胚性幹（ＥＳ）細胞：着床前胚（胚盤胞）の内部細胞塊（ＩＣＭ）から由来し
た下記のような性質を有する細胞：（ｉ）長期間の実験室培養及び保存に馴染み
やすい、（ｉｉ）未分化状態を維持する、（ｉｉｉ）２ｎ倍数性を維持する、（
ｉｖ）胚の細胞と混合し、キメラ胚を作製するために培養すると、発生分化プロ
グラムを再開することができ、機能的生殖細胞を含めて、いずれの細胞型にも分
化することかできる。ＥＳ細胞は、遺伝子ターゲティングにおけると同様に、操
作し得る相同組換えを示す。

【００９９】ＥＳ細胞様細胞：胚盤胞のＩＣＭから誘導される培養細胞であるが、ＥＳ細胞
の特徴を完全には示さない。

【０１００】胎児：胎盤形成から出産（誕生あるいは仔の出産）までの発育段階。

【０１０１】生産仔：生きている仔。

【０１０２】ミクロフィラメント：細胞骨格重合アクチン。

【０１０３】微小管：染色体を固定し定位させるチュブリンサブユニットからなる細胞内繊
維。

【０１０４】核：その成分に、他の非ミトコンドリアゲノムを欠失した細胞に発生分化の指
令をすることができる最少の物質を含む、核全体あるいはその一部。

【０１０５】仔：少なくとも出産まで成長した個体。

【０１０６】卵母細胞：分裂の第一Ｍ期を過ぎて第二Ｍ期（Ｍ期ＩＩ）に止まっている雌配
偶子。したがって、卵母細胞は受精していないが、正常な受精を行ない得る発生
段階にある。卵母細胞は、インビボでは排卵により発生し得るし、インビトロで
成熟させることができる未成熟前駆体を外科的に取出し、成熟させることにより
得ることができる。

【０１０７】多能性：複数の細胞型のいずれにも分化することができる能力。典型的に、幹
細胞に使う。

【０１０８】再構成細胞：核ドナー細胞に存在する染色体中の、継続する発生分化を指令す
るのに必要な最少成分を少なくとも含んでいる物質を、脱核細胞に挿入する操作
により作られる細胞。望ましい態様においては、再構成細胞はＥＳ細胞の核を挿
入した脱核卵母細胞である。

【０１０９】出産予定日：完全妊娠期間。子宮中で胚発生分化のプログラムを完全に行なっ
た状態、妊娠期間に相当。

【０１１０】接合子：受精したばかりの雌配偶子、１細胞胚としても知られている。

【０１１１】例以下の例により本発明方法及びＥＳ細胞系Ｅ．１４，ＡＢ２．２及びＲ１の細
胞核を注入した卵母細胞から生存仔への発育を説明する。これらの系はＦ１及び
近交系マウスから誘導された、樹立され、広く使用されている細胞系である。Ｍ
７２は目的突然変異を持つＥ．１４の誘導系である。下記例は、動物卵母細胞、
ＥＳ細胞、ＥＳ細胞様細胞、培地及び本発明の操作に使用される応用の説明の助
けとなることを意図したものであり、限定されることを意図していない；さらに
、本発明の態様の例は当業者には容易に理解されるであろう。

【０１１２】試薬。全ての有機及び無機化合物は実験室規格またはそれ以上の規格であり、
特記しない限りＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）から購入した。一般的にそして特記しない限り、卵母細胞培養は５．５６ｍ
ＭＤ−グルコースを添加したＣＺＢ培地（Ｃｈａｔｏｔ，ｅｔａｌ．，１９
８９．Ｊ．ＲｅｐｒｏｄＦｅｒｔ．８６，６７９−６８８）中で行なった。Ｃ
ＺＢ培地は：８１．６ｍＭＮａＣｌ，４．８ｍＭＫＣｌ，１．７ｍ
ＭＣａＣｌ₂，１．２ｍＭＭｇＳＯ₄，１．８ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄，２５．
１ｍＭＮａＨＣＯ₃，０．１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ，３１ｍＭ乳酸ナトリウム，
０．３ｍＭピルビン酸ナトリウム，７Ｕ／ｍｌペニシリンＧ，５Ｕ／ｍｌ硫酸ス
トレプトマイシン，及び４ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。輸卵管中
の排卵卵母細胞の採取及び続く顕微鏡ステージ上の微細操作は、２０ｍＭＨｅ
ｐｅｓを添加し、ＮａＨＣＯ₃（５ｍＭ）及びＢＳＡ（３ｍｇ／ｍｌ）の濃度を
減らした、修正ＣＺＢ（ここでＣＺＢ・Ｈと名付ける）中で行なった；ＣＺＢ・
Ｈは７．４のｐＨを有する。ＣＺＢ・Ｈ中のＢＳＡは０．１ｍｇ／ｍｌポリビニ
ルアルコール（ＰＶＡ；冷水可溶、平均相対分子量〜１０³）で置換することが
できる；ＢＳＡ及びＰＶＡの機能は微細操作中の注入ピペット壁の粘着性を減少
させることである。ＰＶＡの潤滑効果はＢＳＡよりも長く続くので、多くの微細
操作を一つのマイクロピペットを使用して反復する間それが含まれていることが
望ましい。適切であれば、卵母細胞または再構成細胞は、ＣａＣｌ₂（つまりＣ
ａ²⁺）を含まず、卵母細胞活性化を誘導する薬剤及び、場合によっては、細胞質
分離を抑制する薬剤を添加したＣＺＢ中で培養する。

【０１１３】ＥＳ細胞はＥＳ細胞用ダルベッコー修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｐｅｃ
ｉａｌｔｙＭｅｄｉａ，Ｌａｖａｌｌｅｔｔｅ，ＮＪ），以下を添加、０．５
％−１５％（ｖ／ｖ）加熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＨｙＣｌｏｎｅＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン‐１０
０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ）、０．２
ｍＭＬ−グルタミン酸（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ）、１％（ｖ／ｖ）
非必須アミノ酸カクテル（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ）、１％（ｖ／ｖ）
２−β−メルカプトエタノール（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ）、１％（ｖ
／ｖ）ヌクレオシドカクテル（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ）、及び１００
０Ｕ／ｍｌ組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ）（ＧＩＢＣＯ，ＧｒａｎｄＩｓｌ
ａｎｄ，ＮＹ）。ＦＣＳは使用前に５６℃２５分間加熱不活化した。

【０１１４】動物。この実験に使用した動物は、研究資源国家研究協議機構の実験動物の飼
育と使用に関する委員会によって作成された連邦ガイドラインにしたがって維持
した（ＤＨＥＷ出版ｎｏ．［ＮＩＨ］８０−２３、１９８５年改訂）。

【０１１５】例１：樹立ＥＳ細胞系、Ｅ１４、から核ドナー細胞の調製この例では脱核卵母細胞へマイクロインジェクションする核の供給源として樹
立し広く使用されているＥＳ細胞系、Ｅ１４を使用した。Ｅ１４細胞系は系統１
２９／Ｏｌａマウス胚盤胞から誘導した（Ｈｏｏｐｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ３２６，２９２［１９８７］）。１２９／Ｏｌａ母系はＡ（ａｇｏｕｔ
ｉ）遺伝子について同型接合であり、そのｃ^chｐ／ｃ^chｐ遺伝子型（チンチラ被
毛色はぼやけた黄色）を反映するチンチラ被毛色を持っている。ＥＳ細胞系、Ｅ
１４、は一つのマウス系統；１２９／Ｏｌａ，からＥｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ
のＤｒ．ＭａｒｔｉｎＨｏｏｐｅｒ研究室において誘導された。上記仔の被毛
色によってＥＳ細胞核からクローン化した仔を確認するために、ＥＳ細胞が由来
したマウス系統の被毛色と異なる被毛色を持つ卵母細胞ドナー及び育成母の系統
を選ぶ必要がある。一態様において、Ｅ１４細胞の核（遺伝的にチンチラ）を脱
核Ｂ６Ｄ２Ｆ１卵母細胞（遺伝的に黒）に移植し、そして再構成細胞をＣＤ−１
代理母（遺伝的に白）に移植して発生分化させた。

【０１１６】Ｅ１４細胞の低い継代（すなわち、１１回より少ない継代）の一部を１９９０
年に得た、そして３個所の異なる研究室でさらに培養を続け、合計３１−３９代
となった。ここに報告されている例においてＥ１４細胞を選択したことは、それ
が遺伝子ターゲティングマウスにかなり使用されていることにより支持されてい
る（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，８８，３０８４［１９９１］；Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，ｅｔａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ３６０，２２５［１９９２］；Ｉｔｏｈａｒａ，ｅｔａｌ．，
Ｃｅｌｌ７２，３３７［１９９３］；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，ｅｔａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ８７，１９９［１９９９］）。この様に、Ｅ１４細胞は、遺伝子ターゲ
ティングマウスの系統を樹立する生殖系キメラを発生するのに有効であることが
証明されている。Ｅ１４の培養は、約１０μｍから約１８μｍ径の範囲の細胞を
提示する。理論に捕らわれることなく、小細胞（約１０μｍから１２μｍ）は前
Ｓ期にあるようでありしたがって２Ｃゲノム相補体（２ｎ染色体において）を含
み、そして大細胞（約１６μｍから１８μｍ）は概して後Ｓ期であり、２−４Ｃ
ＤＮＡ（２ｎ染色体）を含んでいるようである。

【０１１７】ＥＳ細胞は、０．５−１５％（ｖ／ｖ）加熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈ
ｙｃｌｏｎｅ）、１０００Ｕ白血病阻害因子（ＬＩＦ）／ｍｌ（Ｇｉｂｃｏ）、
及び下記試薬（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ）：１％（ｖ／ｖ）ペニシリン
−ストレプトマイシン、１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン、１％（ｖ／ｖ）非必須
アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）ヌクレオシド、及び１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエ
タノールを添加した「ＥＳ細胞用ＤＭＥＭ」中で増殖した。細胞は約１２時間の
細胞周期を反映して、２４時間毎に１：３あるいは１：４に分割する。適切であ
れば、培養は１３．５日のマウス胚から誘導したマイトマイシンＣ処理初代胚性
繊維芽細胞の支持層上で行なった。微細操作の前少なくとも１週間は支持細胞の
ない条件でＥＳ細胞を培養した；核移植の時点では培養中に支持細胞は認められ
なかった。

【０１１８】支持細胞が存在しないＥＳ細胞培養は、１５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ及び１０００
Ｕ／ｍｌＬＩＦを添加した培地中で行なった。低［ＦＣＳ］での増殖が望まし
い場合には、ＦＣＳ濃度を段階的に減少させた。５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳの濃度に
おいて、細胞は明らかな分化を伴わずに、１５％（ｖ／ｖ）におけるとほとんど
同様に活発に分裂した。しかし、ＦＣＳ濃度が４％（ｖ／ｖ）かそれ以下の場合
には、細胞の増殖は明らかに遅くなった。０．７５％または０．５％（ｖ／ｖ）
ＦＣＳの培地、ある細胞型を「餓死」させまた細胞周期から追い出す（つまり、
Ｇ０に入る）条件、で細胞を培養した場合には、著しい細胞死を生じた。

【０１１９】培養から個別のＥＳ細胞の懸濁を作成するために、まず細胞をリン酸バッファ
ー食塩液（ＰＢＳ）で洗浄した。次いでトリプシン（０．０２５％［ｗ／ｖ］）
及びエチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム塩（ＥＤＴＡ；０．７５ｍＭ）
混合物のＣａ²⁺／Ｍｇ²⁺を含まないＰＢＳ液で処理することにより細胞相互及び
容器からの分離を行なった。細胞を３回緩和な遠心分離（２０００ｇ５分間）
及び再懸濁（２回ＤＭＥＭで、１回はＰＢＳで）して洗浄し、ＰＢＳ培地に約１
０⁷／ｍｌの濃度になるように再懸濁した。

【０１２０】ＥＳ細胞を採取するのに先立って２日間まで（しかし通常は採取の直前）、Ｅ
Ｓ細胞懸濁の約２μｌの滴を１２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
（平均分子量、３．６×１０⁵）を添加したＣＺＢ・Ｈ２０μｌと混合した；
ここでこれをＣＺＢ・Ｈ−ＰＶＰと呼ぶ。この混合物を微細操作のために顕微鏡
のステージに移した。

【０１２１】卵母細胞の脱核。卵母細胞の脱核は、ＭｏｄｅｌＭＢ−Ｕユニット（Ｐｒｉ
ｍｅＴｅｃｈＬｔｄ．，筑波、茨城県、日本）を使用したピエゾ動力により
卵母細胞透明帯を貫通したマイクロピペット（内径６μｍ）のなかへ吸引するこ
とにより行なった。ピエゾ電気を使用したこのユニットは、マイクロピペットチ
ップを高速でパルス毎に非常に短距離（約０．５μｍ）前進させる。パルスの強
度と速度は調節器により調節した、典型的な透明帯貫通のセッティングはそれぞ
れ２及び４である。

【０１２２】成熟卵母細胞は、卵母細胞採取のそれぞれ６４及び１３−１６時間前に５Ｕ妊
娠雌ウマ血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）及び５Ｕヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈ
ＣＧ）の連続腹腔内投与により過排卵させられた８−１２週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１マ
ウス雌の輸卵管から採取した。卵母細胞は、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ精巣ヒアル
ロニダーゼ（３００Ｕ／ｍｇ，ＩＣＮＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｃ．，
ＣｏｓｔａＭｅｓａ，ＣＡ）を含有するＣＺＢ・Ｈ中で２５−３０℃におい
て５−１０分間処理して取り巻く小丘細胞から切り離した。小丘細胞を取り除い
た卵母細胞は、ピペットを使用して連続的に移すことにより、４回ＣＺＢ・Ｈ（
ヒアルロニダーゼを含まない）で洗浄した。次いで、洗浄した卵母細胞は、微細
操作のために調製した、水を飽和した、３７oＣで４％（ｖ／ｖ空気中）ＣＯ₂で
平衡させた鉱油（Ｅ．Ｒ．ＳｑｕｉｂｂａｎｄＳｏｎｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏ
ｎ，ＮＪ）下のＣＺＢ（１０−３０μｌ）のなかに入れた。

【０１２３】小丘を含まない卵母細胞の群（通常１５−２０）を顕微鏡ステージ上の５μｇ
／ｍｌサイトカラシンＢを含むＣＺＢ・Ｈの滴の中に移した。微細手術を受ける
卵母細胞は穴あけピペット及び脱核ピペットにピエゾパルスを数回適用して「コ
アになった」透明帯によって保持される。ｍＩＩ染色体−紡錘体複合体（透明領
域として認めることができる）は卵母細胞細胞質の最少容量でピペット中へ吸引
した。比較的高温度（３０℃近く）ではその透過性が増すためｍＩＩ板は見分け
易くなる。一群の全卵母細胞の脱核（約１０分間を要す）の後に、サイトカラシ
ンＢを含まないＣＺＢ中に移し、再び操作を行なうために顕微鏡ステージに戻す
前に２時間までの間３７℃に維持した。

【０１２４】マイクロインジェクションによるＥＳ細胞核の脱核卵母細胞への移植。ここで
、ＥＳ細胞核は上記のように調製された脱核卵母細胞の中に移植される。この移
植は、卵母細胞の脱核に使用したのと同じマイクロピペットで行なうことが好ま
しい。

【０１２５】脱核卵母細胞中にドナー核をマイクロインジェクションするために、プラステ
ィック皿（１００ｍｍ×１５ｍｍ；ＦａｌｃｏｎＰｌａｓｔｉｃｓ，Ｏｘｎａ
ｒｄ，ＣＡ，カタログ番号１００１）のカバー（厚さ約５ｍｍ）を利用してマイ
クロインジェクションチャンバーを作製した。２つの丸い小滴及び１つの長い滴
を有する列を一つかそれ以上皿の中心線に沿って配置した。最初の滴（約２μｌ
；２ｍｍ径）、マイクロインジェクションピペットの洗浄用、はＣＺＢ・Ｈ−Ｐ
ＶＰである。二番目の滴（約２μｌ；２ｍｍ径）はＣＺＢ・Ｈ−ＰＶＰ中にドナ
ー核細胞の懸濁を含んでいる。三番目の（長い）滴（約６μｌ；２×６ｍｍ）、
脱核卵母細胞用、はＣＺＢ・Ｈである。滴を含めて皿全体を鉱物油（Ｓｑｕｉｂ
ｂ）の中に沈めた。微細操作に備えて、Ｈｏｆｆｍａｎコントラスト変換光学系
を装着した倒立顕微鏡のステージの上に皿を置いた。

【０１２６】ドナー細胞核の卵母細胞へのマイクロインジェクションはピエゾ電気作動マイ
クロインジェクションにより行なった。核をＥＳドナー細胞から取出し、核から
細胞質性物質が大部分見えなくなるまでマイクロピペット（内径約７μｍ）に吸
引及び排出を行なった。これは核成分に細胞質が混入するのを防ぐのに役立つ。
ある場合には、ピエゾパルス（低強度セッティング）の少数回（典型的には１回
）の適用によりドナー細胞の形質膜を破ることが必要であった。核膜の破裂が生
じた場合は、非染色体核質成分を洗い流すことができた。

【０１２７】個々の核は、別々の脱核卵母細胞に、ピペットに抽出してから５−１０分以内
にマイクロインジェクションした。核移植の操作は、通常脱核卵母細胞を含む滴
のなかにマイクロピペットを移動させる前に数個（典型的には７個まで）の細胞
の核を取出しマイクロピペットの中に裸の核の列を作ることにより加速すること
ができた。

【０１２８】脱核卵母細胞を顕微鏡ステージ上の５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含むＣＺ
Ｂ培地の滴のなかに入れた。脱核卵母細胞の透明帯を固定ピペットのチップに接
着させ、緩和に吸引することにより場所に固定した。注入ピペットのチップを真
っ直ぐに進め、透明帯にぴったりと接着させた。数回のピエゾパルス（例えば、
強度１−２、速度１−２）を適用し、その中の弱い引圧を保って、ピペットを進
めた。ピペットのチップが透明帯を貫通したとき、ピペットの中に生じた帯物質
の柱状のコアを卵周囲空間に排出した。注入ピペット内（典型的には迅速に続け
て採取した７核までを含む）の最も前にあるドナー核を、針チップの近くまで進
めた。今度は、ピペットを、そのチップが卵母細胞の反対側の膜にほとんど近づ
くまで、機械的に進めた。これにより脱核卵母細胞の形質膜（透明帯）に深い窪
みをつくった。窪んだ透明帯は１または２ピエゾパルス（典型的には、強度１−
２、速度１）の適用により穿孔し、ＥＳ細胞核成分を＜１ｐｌの随伴培地と共に
卵質中に排出した。ピペットを静かに引き抜き、卵細胞質中に核を残した。各脱
核卵細胞に１個の核を注入した。この方法より約１５−２０個の脱核卵母細胞に
対して典型的には１０−１５分でマイクロインジェクションを行なった。インジ
ェクションはすべて通常２５−３０℃の範囲の室温で行なった。

【０１２９】卵母細胞活性化。ＥＳ細胞培養は、典型的に細胞周期の異なる段階にある細胞
を含んでいる、ある細胞は２ｎ細胞に代表的な２Ｃ相補体ＤＮＡを含み、他の細
胞はＤＮＡ合成の複製過程（Ｓ期）を終えて細胞分裂に備えて二倍量（４ＣＤ
ＮＡ）を含んでいる。このＤＮＡ含量の相違は本発明方法では予期されており、
したがって核移植後の再構成細胞の処理を変える必要がある。細胞周期の異なる
段階にある細胞（例えば、異なるＤＮＡ含量をもつ）の区別は次のようなことで
ある；ここでは２ＣＤＮＡを有する比較的小さい径（１０−１２μｍ、「小」
と呼ぶ）の細胞と４ＣＤＮＡを有する比較的大きな径（１６−１８μｍ、「大
」と呼ぶ）の細胞の関係を述べる。

【０１３０】小ＥＳ細胞の核を受け入れた卵母細胞に対応する再構成細胞を４％（ｖ／ｖ）
ＣＯ₂を含む空気中飽和湿度３７℃で平衡した鉱物油下のＣＺＢ中で１−３時間
培養した。次いでこの細胞を、１０ｍＭＳｒＣｌ₂及び５μｌ／ｍｌサイトカラ
シンＢ（ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］１００倍溶液から加えた）を含むＣ
ａ²⁺除去ＣＺＢに６時間移した。この処理により発生分化活性化を誘導し、他方
では原形質分離、したがって偽極体の形成による染色体損失を阻止した。６時間
後、細胞をＳｒ²⁺／サイトカラシンＢを含まない新鮮ＣＺＢに移し、４％（ｖ／
ｖ）ＣＯ₂を含む空気中飽和湿度３７℃で培養を続けた。このようにして、Ｓ−
期完了後の正常減数分裂は６時間後に妨げられることはなかった。

【０１３１】大ＥＳ細胞の核を受け入れた卵母細胞に対応する再構成細胞は、４％（ｖ／ｖ
）ＣＯ₂を含む空気中飽和湿度３７℃で平衡した鉱物油下のＣＺＢ中で２時間ま
での間培養した。活性化前培養により、分裂及び原形質分離を再開する刺激に先
立って機能的に完成すべき高分子成分（例えば、紡錘微小管）の合成を行なわせ
る。分裂の再開（活性化）は、４％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂を含む空気中飽和湿度３７
℃で１０ｍＭＳｒＣｌ₂を含むＣａ²⁺除去ＣＺＢに１時間細胞を移すことにより
開始した。この培地はサイトカラシンＢあるいはその他の原形質分離阻害剤を含
んでいないことに注意する。したがって、この活性化により細胞は偽２次極体の
排出を行なう。移植したＥＳドナー細胞核は４ＣＤＮＡを含んでいたので、そ
の結果得られた姉妹クロマチドの分離及び染色体損失により、胚は２ＣゲノムＤ
ＮＡを回復した。

【０１３２】活性化に続いて、胚培養のために再構成細胞を４％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂を含む空
気中飽和湿度３７℃で新鮮ＣＺＢに移した。このようにして発生した胚は活性化
後約５時間には通常２偽前核及び１個の偽２次極体を持っている。

【０１３３】細胞周期段階に基づくＥＳ核ドナー細胞の選択。われわれは、小細胞はＧ１期
（２ＣＤＮＡ）にあり、他方大細胞はＧ２／Ｍ期（後Ｓ期、４ＣＤＮＡ）に
対応すると推測した。これは迅速なそして非侵襲的な細胞倍数性の物差しを提供
する。細胞周期段階の診断に応じて転写指示するプロモーターの管理の下に、破
壊せずに測定し得るレポーター遺伝子（例えば、変異緑色蛍光タンパク質、ＥＧ
ＦＰ）の誘導体を操作導入したＥＳ細胞系を使用することにより確認される。そ
のような例としては、サイクリンＤ（細胞周期のＧ１期に限定される）あるいは
サイクリンＢ２（細胞周期のＭ期に限定される）を指示するものがある。このレ
ポータータンパク質はサイクリンタンパク質に存在するような標的破壊配列（破
壊ボックス）を含んでいる。このことは、半減期が短く、そしてその存在がタン
パク質の寿命よりもプロモーター活性（したがって細胞周期段階）を反映するこ
とを確実にしている。レポーターがＥＧＦＰである場合には、ある所与の細胞周
期段階にある細胞は、長波長蛍光顕微鏡を使用して検査することにより、非同期
培養の中から容易に非侵襲的に同定することができる；細胞周期段階特異的プロ
モーターが活性な細胞のみが蛍光を発するので、直ちに核移植のドナーとして同
定及び選択することができる。

【０１３４】最後に、Ｒ１ＥＳ細胞を、３μｇ／ｍｌの微小管分解剤ノコダゾール（Ｓｉ
ｇｍａ）に１２時間曝露した。このように処理した培養は、処理をしていない培
養に比較すると、劇的に変化し、多数の丸い、浮かぶ細胞が現れた。この処理は
、細胞にＭ期の完了をさせないのでＥＳ細胞培養を同期させるのに役立つた。Ｓ
期における複製ＤＮＡ合成の非減数過程を完了しているので、この細胞のゲノム
含有量は４Ｃである。

【０１３５】胚移植。水飽和、４％（空気中ｖ／ｖ）ＣＯ₂３７℃で平衡した鉱物油（Ｓｑ
ｕｉｂｂ）の下のＣＺＢ（１０−３０μｌ）滴中で３．５−４日の培養の後、桑
実胚／胚盤胞を検査し、適しているならば、精管切除ＣＤ−１雄と３日前に交配
したレシピエント白色ＣＤ−１雌マウスの子宮角に移植した；これにより、胚発
生分化と子宮内膜との適切な協調が保たれる。雌には出産させ、代理仔を養育さ
せるか、あるいは交配から１９．５日後に帝王切開により仔を取出し、適当な哺
乳里親に養育させた。

【０１３６】例２：ＥＳ細胞核を用いたクローニング。実験は、脱核卵母細胞に種々のＥＳ細胞系、マウスの近交系及びＦ１系統から
元来誘導した代表的な、樹立細胞系、の細胞核をマイクロインジェクションして
行なった。核ドナーＥＳ細胞を種々の条件で培養した実験における仔の発生を記
述し、さらにことなる倍数体のドナー細胞を用いた本発明方法を示す。

【０１３７】脱核卵母細胞へ核移植した後のＥＳ細胞染色体の発育。実験系１（図２）にお
いて、Ｅ１４核を受け入れた脱核卵母細胞は活性化刺激を受けていない。したが
って、その再構成卵母細胞はｍＩＩに止まっていた。小細胞の核をマイクロイン
ジェクションした２−４時間後に調べたところ、５１％の再構成卵母細胞は散在
する状態の凝縮染色体を有していた。これに対して、大細胞の核を注入された卵
母細胞の６８％は、成熟Ｍ期ＩＩ卵母細胞における母体由来染色体の配置に似た
正規配置に並んだ凝縮染色体を有していた。

【０１３８】実験系２（図３）において、核移植の後活性化刺激（ストロンチウムイオン、
Ｓｒ²⁺）した再構成細胞を使用した。小及び大の細胞ではＤＮＡ含量に潜在的な
違いがあることを予想して、各細胞型に対する核移植プロトコールを適用した。
小細胞の核で再構成した卵母細胞は核のマイクロインジェクションの〜４時間後
にＣＺＢ培地から取出し、Ｓｒ²⁺（活性化するため）及びサイトカラシンＢ（原
形質分離を阻害するため）を含む培地に移した。それが存在しないと、ドナー染
色体は偽２次極体へほとんど無秩序に排出され、生存不可能な低倍数胚を発生し
てしまうので、サイトカラシンＢを加えた。活性化から〜６時間後に調べた小細
胞核から発生させた胚の７８％は２個の偽前核を含んでいた（図３）、多分細胞
内の染色体は前核を形成する前に通常２個の塊を形成するからであろう。

【０１３９】これに対して、大ＥＳ細胞の核で再構成した卵母細胞の活性化は、サイトカラ
シンＢを存在させずに行なった、というのは原形質分離と偽２次極体の排出によ
り多くの場合に再構成細胞中に正常２ＣＤＮＡを確立すると期待したからであ
る。サイトカラシンＢが存在しない活性化の後、１細胞胚の６８％は１個の偽前
核を有しておりそして偽２次極体を排出した（図３）。

【０１４０】Ｅ１４細胞からクローン化したマウスの妊娠期間発育。図４には、１７６５個
の卵母細胞を異なるサイズのまたことなる濃度のＦＣＳの存在下においたＥ１４
細胞の核を使用して再構成した、実験系３から得られた結果を要約した。桑実胚
／胚盤胞段階に発生分化することを指令するＥＳ細胞核の能力に対して、培養液
中のＦＣＳ濃度が著しい影響を与える証拠は見当たらなかった。

【０１４１】小細胞の核を移植した後、活性化卵母細胞の１７％が桑実胚／胚盤胞を作った
。適当な代理母に移植した後、生じた胚の６２％が着床し、活性化後２０日（ｄ
ｐａ）で９胎児を生じた；４匹の生存仔が帝王切開により得られ、そして５胎児
は１５−１７ｄｐａで発育を停止した。

【０１４２】生産仔の１匹は里親がいなかったので安楽死させた、そして２匹は出生後２４
時間以内に死亡した。１匹のマウス（「Ｈｏｏｐｅｒ」と呼ばれた）は生存し、
チンチラ被毛色及びピンク眼を持つ雄である。このような特徴は、Ｅ１４が１２
９／Ｏｌａマウス系統の雄から由来したＸＹ細胞系であることから、予測されて
いた；１２９／Ｏｌａマウスはチンチラ被毛色及びピンク眼を持っている。出産
まで成長した仔はすべて色素のない眼を持った雄であった。Ｈｏｏｐｅｒは、Ｃ
Ｄ−１雌と交配して、３腹に合計３３匹の外見的に正常な仔をつくった。

【０１４３】大細胞の核の移植後、活性化に成功した卵母細胞の３７％はインビトロ培養の
３．５日後に桑実胚／胚盤胞の段階まで発育した。移植した胚の６７％は子宮に
着床した。１匹の充分に成長し、外見的に異常のない仔及び３匹の死亡胎児（１
５−１７ｄｐａに発育を停止）は帝王切開により２０ｄｐａに取出した。ＥＳ細
胞由来クローン化マウスの胎盤及びＨｏｏｐｅｒの耳バイオプシーからゲノムＤ
ＮＡを単離し、サンプルをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけ多形マーカー
及びＹ染色体特異的遺伝子、Ｚｆｙ、の存在を分析した。この分析によりさらに
クローン仔のＥ１４起源を確認した。

【０１４４】この効率の程度は、本発明方法が容易に再現できることを意味する。しかし、
方法の効率は、胚が本発明方法にしたがう核移植により発生したＥＳ細胞及びＥ
Ｓ細胞由来胚性細胞の混合から作られる、本発明の追加的な態様の組み合わせに
おいて増加することができる。

【０１４５】Ｒ１ＥＳ細胞から核移植後の胚の発育。実験系４（図５）において、１２９
／Ｓｖ×１２９／Ｓｖ−ＣｐのＦ１雑種から誘導した細胞系Ｒ１を用いた１０８
７核移植を行なった。クローニング成績にＦＣＳ濃度の顕著な影響はなかった。
しかし、クローニングの効率はＥ１４細胞よりＲ１細胞のほうが著しく高かった
。３１４個の移植桑実胚／胚盤胞から、２６生産クローン仔（８．３％）を得た
。そのクローン起源はＰＣＲ分析により確認された。

【０１４６】Ｅ１４大細胞の核は適切な実験条件の下で移植後の完全発育を支持することが
できたので、５番目の実験系（系５）ではＲ１細胞を使用して類似の実験を行な
った。単純にＲ１大細胞を選び出したが、核移植の１２時間前に培養をノコダゾ
ールに曝露し、４ＣＤＮＡを含むように培養中の細胞をＭ期に同期させた。得
られた生存仔の率はＲ１小細胞から得られた対応する値から著しく異なるもので
はなかった。このことは、核ドナーの倍数性も、細胞周期段階もクローニングに
対して重要なパラメーターではないことを示唆している。

【０１４７】例３：遺伝子ターゲティングＥＳ細胞の核を使用したクローニングこの方法の有用性は目的突然変異を持つＥＳ細胞系から仔を発生させることに
使用することによって説明される。

【０１４８】遺伝子ターゲティングＥＳ細胞の生成。目的突然変異を含むＥＳ細胞系はＥ１
４から誘導した。この系統（Ｚｈｅｎｇ＆Ｍｏｍｂａｅｒｔｓにより記載；出版
準備中）はＭ７２→ＶＲ_i２−ＩＲＥＳ−ｔａｕＧＦＰ構築を電気穿孔でＥ１４
細胞に導入して発生させ、続いて記載のように培養した（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，
ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ８７，６７５［１９９６］）。突然変異を持っている
一細胞系、Ｔ１５、は体組織及び胚盤胞注入による生殖系の大規模なコロニー形
成をもったキメラを生じた。本発明のクローニング方法における核ドナーを供給
するためにこの系の能力を評価した。

【０１４９】遺伝子ターゲティングＥ１４細胞系、Ｔ１５、からクローン化したマウスの発
育。小Ｔ１５細胞（推定平均径約１２μｍ及び２ｎ，２Ｃの倍数を持つ）を選び
、その核を上記のように再構成細胞をつくるために核移植した。２５２細胞をこ
の方法のＴ１５核移植により再構成し、そしてインビトロで培養した。３．５日
の培養後、９１個（３６％）は桑実胚／胚盤胞段階に発育した。これを発育を継
続することができる偽妊娠代理母に移植した。

【０１５０】交尾後１９．５日の代理母の帝王切開により、８死亡胎児（移植胚の９％）及
び１生産クローンを認めた。このことは、目的突然変異を含む細胞の核はここに
記載した本発明の方法によりクローン仔を発生するために使用することができる
ことを示している。

【０１５１】例４：ＥＳ細胞様細胞の誘導。胚は、インビトロ受精によるか、あるいは自然交配及び採取により作製する。
インビトロにおける胚盤胞までの着床前胚の発育は、Ｇａｒｄｎｅｒ，ｅｔａ
ｌ．，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９，８４（１９９８）により記載されて
いるようにＧ１．２またはＧ２．２培地中で行なう。選んだ胚盤胞のＩＣＭの細
胞を既述（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ９２，７８４４［１９９５］；Ｓｏｌｔｅｒ，＆Ｋｎｏｗｌｅｓ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ７２，５０９９［１９９５］）
のようにＢｅＷｏ細胞に対するウサギ抗血清を使用して免疫外科的に単離した。
照射マウス胚性繊維芽細胞の予め作製した層及び１ｍｌの培養液を入れた１０ｍ
ｍウエル組織培養皿に細胞を個別に入れた。培養液は、２０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅ），１ｍＭグルタミン、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍ
ａ）及び１％非必須アミノ酸ストック（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を添加した８０％
ダルベッコ修正イーグル培地（ピルビン酸塩除去、高グルコース処方、；Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ）からなる。

【０１５２】９−１５日さらに培養した後、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ
）を含みＣａ²⁺及びＭｇ²⁺を含まないリン酸バッファー食塩液に曝露するか、ジ
スパーゼに曝露するか、あるいはパスツールピペットで機械的に分散することに
より、内部細胞塊から由来した生成物を典型的には３か４細胞を含む塊に分離す
る。この小塊を新鮮な支持細胞の入った組織培養ウエルに移す。更に生育した後
、一様で、分化していない形態を持った個々のコロニーを選び、再度上記のよう
に分離した。

【０１５３】形態により識別できる初代ＥＳ細胞様コロニーを継代し、タイプＩＶコラゲナ
ーゼ（１ｍｇ／ｍｌ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に曝露するか、あるいはパスツー
ルピペットで個別のコロニーを選択して、拡大した。

【０１５４】最適でない培養条件では、その増殖速度を増加してインビボにおける発育を減
少させる核型変化、染色体再編成及び／またはその他の変異を行なったＥＳ細胞
変種を生じることが知られている。各ＥＳ細胞様細胞系は２−７代で核型が確認
され、異常な核型は廃棄した。

【０１５５】最適培養条件は当業者には知られている。全ての培養液、添加物、プラスチッ
ク製品などは、エンドトキシンを含んでいてはならない。ＥＳ細胞様細胞培養は
ウシ（Ｃｉｂｅｌｌｉ，ｅｔａｌ．，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ４７，
２４１［１９９７］）、ハムスター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｄ
ｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２７，２２４［１９８８］）、ヒト（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２，１１４５［１９９８］）、及びウサギ（Ｓ
ｃｈｏｏｎｊａｎｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４５，４
３９［１９９６］）について記述されている。

【０１５６】ここに引用した全ての特許及び参照文献は参照として取り入れた。さらに、Ｗａ
ｋａｙａｍａｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇＮａｔｉｏｎａｌＡｃ
ａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６（２６）：１４９８
４−１４９８９（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２１，１９９９）をそっくりそのまま参照
に特別に取り入れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のクローニング手順を図式的に示したものであり、本文中で説
明する。

【図２】図２は、脱核卵母細胞にＥ１４核を挿入したが活性化刺激を行なわない実験の
結果を示した表である。

【図３】図３は、脱核卵母細胞にＥ１４核を挿入し、核移植後にストロンチウムイオン
で活性化した実験の結果を示した表である。

【図４】図４は、１７６５個の卵母細胞を異なる大きさのＥ１４細胞の核を使用して再
構成し、異なる濃度のＦＣＳで増殖させた実験結果を要約した表である。

【図５】図５は、１２９／ＳＶ×１２９／ＳＶ−ＣＰのＦ１雑種から由来した細胞系Ｒ
１で１０８７核移植を行なった実験結果を示した表である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ペリー、アンソニー、シー．エフ．アメリカ合衆国、マサチューセッツ、ボストン、ウォーレンアベニュー 29 (72)発明者モムバーツ、ピーターアメリカ合衆国、ニューヨーク、ニューヨーク、イー．シックスティサード 504、ナンバー 25 アール (72)発明者ワカヤマテルヒコアメリカ合衆国、マサチューセッツ、ウスター、メインストリート 600、ナンバー1203 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 AA20 BA80 CA20 DA02 GA12 GA18 GA25 GA27 HA20 4B065 AA90X AA90Y AA91X AA91Y AB01 AB10 AC20 BA04 BA16 BA24 BA30 BB01 BD50 CA43 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）培養細胞の核を採取する；（ｂ）細胞を再構成するために（ａ）の核または少なくとも染色体を含むその部
分を脱核卵母細胞にマイクロインジェクションする；及び（ｃ）再構成した細胞を胚として発育させる、段階からなる胚をクローニングする方法。
【請求項２】マイクロインジェクションがピエゾ電気作動マイクロインジ
ェクションである請求項１に記載の方法。
【請求項３】胚を生存可能な仔に発育させる請求項１に記載の方法。
【請求項４】胚を生存可能な仔に発育させる段階がさらに胚を雌代理レシ
ピエントに移植する中間段階を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】培養細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞である請求項１に記載の方法
。
【請求項６】ＥＳ細胞がＥＳ細胞系由来である請求項５に記載の方法。
【請求項７】ＥＳ細胞系がＦ１マウス系統由来である請求項６に記載の方
法。
【請求項８】ＥＳ細胞系がＲ１である請求項７に記載の方法。
【請求項９】ＥＳ細胞系がマウス近交系由来である請求項６に記載の方法
。
【請求項１０】ＥＳ細胞系がＥ１４である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】培養細胞がＥＳ細胞様細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】ＥＳ細胞様細胞が、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、クマ、
ネコ、ヤギ、イヌ、ウマ、クジラ、げっ歯類、鳥類、両生類、爬虫類及び魚類を
含む群から選択された動物から由来した請求項９に記載の方法。
【請求項１３】培養細胞が胚性生殖（ＥＧ）細胞である請求項１に記載の
方法。
【請求項１４】ＥＧ細胞が、霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、クマ、ネコ、
ヤギ、イヌ、ウマ、クジラ及びネズミのようなげっ歯類を含む群から選択された
哺乳動物から由来した請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】哺乳動物がブタである請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】段階（ａ）の細胞核が２ｎ染色体を有する請求項１に記載
の方法。
【請求項１７】段階（ａ）の細胞核が２−４ＣゲノムＤＮＡを含有する請
求項１に記載の方法。
【請求項１８】段階（ａ）の細胞が遺伝的に変換されている請求項１に記
載の方法。
【請求項１９】遺伝的変換が遺伝子ターゲティングによって行なわれてい
る請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】細胞核がＥＳ細胞由来である請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】細胞核がＥＳ細胞由来である請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】遺伝的に変換されている細胞がＥＳ細胞である請求項１８
に記載の方法。
【請求項２３】遺伝的変換が遺伝子ターゲティングによって行なわれてい
る請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】段階（ｂ）の脱核卵母細胞が第二減数分裂の中期で停止し
ている請求項１に記載の方法。
【請求項２５】細胞核またはその部分を挿入する前に、またはその間に、
あるいはその後に卵母細胞の活性化をする段階をさらに含む請求項１に記載の方
法。
【請求項２６】挿入段階の後約０−６時間に活性化段階を行なう請求項２
５に記載の方法。
【請求項２７】細胞核またはその部分を挿入後約１−３時間に活性化段階
を行なう請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】活性化段階が電気活性化あるいは化学的活性化剤への曝露
からなる請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】化学的活性化剤が、エチルアルコール、精子細胞質因子、
卵母細胞受容体リガンドペプチド類似体、薬理的Ｃａ²⁺遊離促進剤、Ｃａ²⁺イオ
ノフォア、ストロンチウムイオン、リン酸タンパク質シグナル伝達調節剤、タン
パク質合成阻害剤、またはそれらの組合せからなる群から選択されている請求項
２８に記載の方法。
【請求項３０】化学的活性化剤がカフェイン、Ｃａ²⁺イオノフォアＡ２３１
８７、エタノール、２−アミノプリン、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｕ
ｒｉｎｅ）、スフィンゴシン、シクロヘキサミド、イオノマイシン、６−ジメチ
ルアミノプリン、可溶性受精卵母細胞活性化因子Ｉ（ＳＯＡＦ−Ｉ_S）あるいは
それらの組合せからなる群から選択されている請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】活性化剤がＳｒ²⁺を含んでいる請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】挿入段階（ｂ）の前あるいはその後の時間間隔中に卵母細
胞の微小管及び／またはミクロフィラメント集合を破壊する段階をさらに含む請
求項１に記載の方法。
【請求項３３】時間間隔が約０−６時間である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】微小管集合がノコダゾールまたはジメチルアミノプリンに
よって阻害される請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】ミクロフィラメント集合がサイトカラシンＢ，サイトカラ
シンＤ、ジャスプラキノリド、ラクトランクリンＡ，またはその組み合わせによ
り破壊される請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】段階（ｂ）が卵母細胞の細胞質の中に細胞核の部分に加え
て試薬を挿入することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３７】試薬が外来性タンパク質、外来性タンパク質の誘導体、抗
体、薬理的作用物質及びその組み合わせからなる群から選択されている請求項３
４に記載の方法。
【請求項３８】試薬が外来性核酸または核酸誘導体である請求項３７に記
載の方法。
【請求項３９】（ａ）ＥＳ細胞の核を採取する；（ｂ）再構成細胞を形成するために脱核卵母細胞に染色体を含むＥＳ細胞核の部
分をマイクロインジェクションする；（ｃ）活性化の前に０−６時間再構成細胞をインキュベートする；（ｄ）再構成細胞の発育を活性化する；及び（ｅ）再構成細胞を発育させる、段階からなる分化細胞をクローン化する方法。
【請求項４０】段階（ａ）の核が２Ｃである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】段階（ａ）の核が２−４Ｃである請求項３９に記載の方法
。
【請求項４２】段階（ｅ）の再構成細胞をさらに胚に発育させる請求項３
９に記載の方法。
【請求項４３】活性化段階（ｄ）が化学的活性化剤に曝露することを含む
請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】活性化剤がＳｒ²⁺を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】曝露が約６時間以内の時間である請求項４３に記載の方法
。
【請求項４６】活性化段階（ｄ）に微小管及び／またはミクロフィラメン
ト集合の阻害剤が存在する請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】微小管及び／またはミクロフィラメント集合の阻害剤がサ
イトカラシンＢを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】（ａ）細胞の核を採取する；（ｂ）再構成細胞を形成するために脱核卵母細胞に少なくとも染色体を含む（ａ
）の細胞核の部分をマイクロインジェクションする；（ｃ）再構成細胞を桑実胚／胚盤胞に発育させる；（ｄ）ＥＳ細胞を採取する；（ｅ）（ｄ）のＥＳ細胞を（ｃ）の桑実胚／胚盤胞の中に導入する；（ｆ）（ｅ）の再構成胚を発育させる、段階からなる分化細胞をクローン化する方法。
【請求項４９】段階（ｆ）の再構成細胞をさらに生存可能な胚に発育させ
る請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】段階（ａ）の細胞がＥＳ細胞である請求項４８に記載の方
法。
【請求項５１】ＥＳ細胞がインビトロで培養された請求項５０に記載の方
法。
【請求項５２】段階（ａ）の細胞が段階（ｄ）のＥＳ細胞と同じ培養から
由来するＥＳ細胞である請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】請求項１に記載の方法により作製された分化細胞。
【請求項５４】その核染色体が培養細胞の核から由来する請求項１の方法
により作製された動物。
【請求項５５】培養細胞がＥＳ細胞であった請求項５４に記載の方法によ
り作製された動物。
【請求項５６】ＥＳ細胞が組換えＤＮＡを含みそして生じた動物が組換え
ＤＮＡを含む請求項５４に記載の動物。
【請求項５７】組換えＤＮＡがゲノムに取り込まれている請求項５４に記
載の動物。
【請求項５８】組換えＤＮＡが遺伝子ターゲティングにより導入されてい
る請求項５７に記載の動物。
【請求項５９】動物が哺乳類、両生類、魚類及び鳥類から選択されている
請求項５７に記載の動物。
【請求項６０】動物が哺乳動物である請求項５７に記載の動物。
【請求項６１】哺乳動物が霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタ、クマ、ネコ、ヤ
ギ、イヌ、ウマ、クジラ及びネズミからなる群から選択されている請求項６０に
記載の動物。
【請求項６２】哺乳動物がマウスである請求項６１に記載の動物。
【請求項６３】哺乳動物がブタである請求項６１に記載の動物。
【請求項６４】哺乳動物が雌ウシである請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】（ａ）再構成細胞を形成するためにＥＳ細胞の核と脱核卵
母細胞を結合する；（ｂ）結合段階の前に、その間に、またはその後に、卵母細胞の細胞質の中に試
薬を挿入する；そして（ｃ）試薬処理再構成細胞を発育させる、段階を含む胚発育を調節する方法。
【請求項６６】段階（ｃ）の再構成細胞をさらに生存可能な胚に発育させ
る請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】段階（ｂ）の試薬が外来性タンパク質、外来性タンパク質
の誘導体、抗体、薬理的作用物質、及び外来性核酸、外来性核酸の誘導体あるい
はその組み合わせからなる群から選択されている請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】ＥＳ細胞がＤＮＡの正常量の２倍含有している請求項６５
に記載の方法。
【請求項６９】マイクロインジェクションがピエゾ電気作動マイクロイン
ジェクションである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】生じた胚を分解してその細胞を１以上の細胞系に分化させ
る請求項１に記載の方法。
【請求項７１】細胞系が心筋細胞、神経細胞あるいは造血細胞である請求
項１に記載の方法。
【請求項７２】請求項７０に記載の方法により作製された細胞。