CN1423522A - 从培养细胞产生克隆胚胎和成年动物的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种核转移方法,其中核DNA整个或部分被注射到去核卵母细胞中。该方法适合于不同的供体核,并优选ES细胞。

Description

从培养细胞产生克隆胚胎和成年动物的方法
发明技术领域
描述了一种从体外培养的细胞克隆胚胎和成活后代的方法。优选地，该细胞是建立的细胞系，更优选它们是胚胎干(ES)细胞。也公开了来自克隆源胚胎的细胞系。我们描述了本发明不同的方案，表明该方法不是非常依赖于核供体细胞的细胞周期或基因组含量。该方法在产生具有或不具有定向突变的克隆来源组织和生物中有潜在的用途。这种潜在性比现有技术更大，因为现有技术不能使单个细胞从已建立的细胞系执行完整胚胎发育到足月的程序。
发明背景技术
以前用去核卵母细胞融合核供体细胞已经克隆了哺乳动物(Willadsen，Nature 320，63[1986])。该方法在绵羊中初次描述(Willadsen，Nature 320，63[1986])，并且随后进一步应用于绵羊的静止体细胞(Campbell等Nature 380，64[1996]；Schnieke等Science278，2130[1997]；Wilmut等Nature 385，810[1997])，以及应用于牛(Cibelli等，Science 280，1256[1997]；Kato等，Science 282，2095[1998]；Renard等，Lancet 353，1489[1999]；Wells等，Biol.Reprod.60，996[1999])和山羊(Baguisi等，Nature Biotech.17，456[1999])的增殖体细胞。这些报道中描述的核供体细胞是从动物或从短期原代细胞培养物中新鲜分离的。据报道用这个方法从未鉴定的来自乳腺的细胞克隆了名为“多利”的绵羊。(Wilmut等，Nature 385，810[1997])。
最近，发展了一种独特的克隆方法，其中首先选择来自成年哺乳动物组织的供体细胞核，然后显微注射到去核卵母细胞中(Wakayama等，Nature 394，369[1998])。显微注射法能用于生产能被选择性遗传改造的存活胚胎、活后代和健康成年动物。这个核转移方法的应用已经使采用成年来源的丘细胞克隆雌性动物(Wakayama等，Nature 394，369[1998])和尾来源细胞克隆雄性动物(Wakayama和Yanagimachi，NatureGenet.22，127[1999])的活产后代的克隆可行。用表型和基因组分析已经严格证实了这些动物的克隆起源(Wakayama等，Nature394，369[1998])。
迄今为止，细胞融合和显微注射法都存在缺点，它们描述使用新鲜分离的细胞或来自原代的，常常不清楚的细胞培养物作为核供体。这部分是由于培养细胞的外遗传不稳定性(Dean等，Development 125，2273[1998])。任何规避了这些问题的克隆方法将允许细胞在被用作克隆方法中的核供体前，在体外被改造。这将具有重大的实用性：它将，例如，允许含有基因组定向突变克隆的产生和允许克隆祖先细胞的长期贮存。
培养的胚胎干(ES)细胞(如ES细胞系)来自胚泡的内细胞团(ICM)，并在体外显示出罕见的核型和细胞遗传学稳定性(Evans等，Nature292，154[1981]；Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国78，7634[1981]；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版[ColdSpring Harbor Laboratory Press]，173-181页[1994])。小鼠ES细胞显示发育多潜能：当被转移至小鼠胚胎时，它们能产生含有细胞类型方面明显无限制的ES细胞贡献的嵌合后代(Hogan等，Manipulating themouse embryo.第二版.[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，173-181页[1994]；Bradley等，Nature 309，255[1994])。然而，对于完全由ES细胞发育为个体，它们必须与来自发育中胚胎的异源细胞相伴(因此，该胚胎是嵌合的)。该异源细胞来自二倍体(Bradley等，Nature309，255[1984]；Hooper等，Nature 326，292[1987])或四倍体(Nagy等，Development 110，815[1990]；Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国90，8424[1993]；Zang等，Mech.Dev.62，137[1997])胚胎。除非ES细胞被发育中胚胎的异源细胞拯救，否则ES细胞不可能进行足月胚胎发育。这是使用ES细胞的一个主要缺点，因为它们不能指导能够向足月发育进展的胚胎发育；因此由它们产生的后代先前必然是嵌合的。这就使得必需漫长的育种程序以获得仅仅来自ES细胞的后代。
ES细胞可用于将定向基因组改变导入动物。ES细胞基因寻靶已经被广泛用于创造带有定向突变的多种小鼠品系(Capecchi，Science244，1288[1989])；Ramirez-Solis等，Mets.Enzymol.225，855-878[1993])。定向突变的导入利用同源重组来“剔除”或“引入(knock in)”基因组的靶片段，以用新来的基因替换它们。突变的表型效果可由选择引入基因来制定，可以完全改变表型，或细微改变。来自ES细胞的克隆动物能够结合基因寻靶和动物克隆的优点，利于基因打靶动物的生产。如果来自ES细胞的核-甚至在体外长期培养的-能用于生产有活力的、可繁殖的克隆动物的话，它们将是通过克隆改造哺乳动物基因组的最佳选择。然而，以前的一些困难已经包括开发适当的培养和选择步骤以有效允许在寻靶步骤而不是随机DNA修饰中ES细胞的选择。
现有技术尚未证明任何培养的ES细胞系，或ES细胞样细胞系或其它已建立的细胞系能指导核转移后完整发育，尽管核转移已经用于生产绵羊、牛和山羊。例如，Campbell等(Nature 380，64[1996])已经报道采用核转移，从短期培养的、胚胎源上皮细胞通过细胞融合方法克隆绵羊；然而，这些细胞表达与分化和细胞定型关联的标记，因此明显不是ES细胞。
Stice等(WO 95/17500)已经报道用同代来源的、低传代的ES细胞样细胞的膜融合核转移来生产牛胚胎。Stice等没有提供他们在从这些或任何其它ES细胞样细胞生产后代(活或仍活产)中，核转移方法成功的实施例，因为所有受孕在妊娠60天前均流产；母牛最长的妊娠是55天，平均妊娠期280天。
Tsunoda and Kato(J.Reprod.Fert.98，537[1993])报道了与来自已经传代11-20次的细胞系的ES细胞核融合(用副流感病毒和电融合)的小鼠去核卵在体外至双细胞、四细胞、桑椹胚和胚泡期的发育。然而，用所得胚胎向替代母亲转移后没有获得活胎儿。
与此显著不同，现在公开的本发明的方法允许从单个培养细胞的核产生活后代。
发明概述
这里描述的发明提供了这些缺点的解决方法。它提供了一种从单个重建的细胞克隆繁殖(例如，以完整动物的形式)分化细胞的方法。供体核典型地插入去核受体细胞如，卵母细胞或卵裂球中，并产生重建细胞。所得重建细胞的发育被启动和培养。因此，在相关的实施方案中，本发明提供了(i)从ES细胞，通过将ES细胞的核内容物插入去核卵母细胞的细胞质中，并允许重建细胞分化，而克隆地衍生胚胎，和(ii)该方法产生的培养细胞或动物。
在一个实施方案中，所得重建细胞的分化沿着一个或多个导致产生各种不同细胞类型的特定的途径进行。在另一个实施方案中，所得重建细胞发育为胚胎，该胚胎接着发育为有活力的活产后代。这里使用的术语“核”意指包含整个核或其一部分，其中核内容物至少包括能够在缺乏任何其它非线粒体基因组的细胞中指导发育的最少物质。所得组织是由提供用于注射到去核卵母细胞中的核的细胞(核供体)克隆得到的；该步骤产生后代时，该后代是来自核供体细胞的克隆。
因此，本发明提供了通过将培养的ES细胞系的细胞核插入去核卵母细胞中，由ES细胞系克隆动物的方法。核供体可来自构建成熟的细胞系，或可来自新产生的细胞系。在一些动物如哺乳动物中，大多数构建的ES细胞系会源于雄性；即，它们拥有XY核型。相反，在鸟类中，大多数构建的ES细胞系会源于雌性；即，它们拥有XX核型。来自这种XY细胞系的完整动物克隆因此反映了这个起源并且是雄性。相应地，在核供体来自源于雌性的细胞系的实施方案中，产生具有XX核型的完整动物克隆并且其是雌性，反之对于来自XY核型的ES细胞的动物亦然。
在进一步的实施方案中，本发明方法中使用的细胞来自除小鼠之外的物种，包括但不限于下组中的那些：灵长类动物、绵羊、牛、猪、熊、猫、山羊、犬、马、cetids和鼠的其它啮齿动物。在一个有利实施方案中，ES细胞样细胞来自这些物种胚泡的ICM。
在进一步的实施方案中，就在使用待提供核供体细胞的ES细胞前，构建该细胞。在一个有利实施方案中，在ES细胞用于产生克隆来源细胞，如克隆动物前，进行遗传修饰。
ES细胞核转移后重建的细胞可在体外培养后发育为胚泡，或在体内可实施这种发育，如，对于猪而言。在一个实施方案中，胚泡可转移到适当的代孕母亲中，产生来自重建细胞的克隆动物。
在另一个实施方案中，本发明方法的克隆来源的桑椹胚或胚泡可以，反过来，与来自最初用于提供核供体以产生克隆来源胚胎的培养物的ES细胞聚集(或注射该ES细胞)。这产生其细胞部分来自克隆胚胎、部分来自培养ES细胞的注射/聚集细胞的胚胎。这些聚集和注射的方法是本领域熟练技术人员中建立成熟的，并且原则上与在标准基因寻靶方法中用于产生嵌合胚胎的相同(Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，189-216页[1994]；Joyner[ed]，Gene targeting.[Oxford University Press]，107-146页[1993])。然而，现在公开的本发明的方法产生的胚胎的核基因组不是嵌合的，因为所得活后代来自遗传上等同的ES细胞。该方法的这个实施方案提高了由ES细胞生产克隆活后代的效率。
在进一步的实施方案中，用本发明方法克隆得到的桑椹胚或胚泡可用作干细胞如胚泡的内细胞团(ICM)细胞的来源。这种细胞能够按照本领域熟练技术人员已知的方法沿着指定的途径进行分化。因此，本发明的这个实施方案从任何核供体细胞的培养群产生给定类型的分化细胞。能用这个方法产生的细胞类型包括，但不限于，分布广泛的解剖学部位中存在的细胞类型，如上皮细胞、血细胞和成纤维细胞等，以及显示较多解剖学限制的细胞，如心肌细胞、造血细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、角化细胞等。
这里我们示范了由来自F1和近交鼠品系的已构建ES细胞系的ES细胞核克隆的活后代的产生。在本发明的一个实施方案中，克隆的活后代是由‘2C’ES细胞核产生的；即，它们拥有基因组DNA的二倍体含量，如在细胞周期G0或G1期的S期前细胞中所见。
本发明的另一个实施方案中，供体ES细胞核是‘2-4C’。尽管对于分裂中细胞的大多数生活史中，它包含2C DNA，表现为2n染色体，在细胞周期的S期之后的一个时期，染色体数目保持不变，但DNA含量已经由DNA合成复制循环而加倍；因此这种细胞是2n，但为4C，直到有丝分裂末期二价染色体的姐妹染色单体分离。在本发明的一个实施方案中，使用4C核生产活克隆后代。这证明(ES)细胞处于细胞周期的G0或G1期，对于为了它们的核指导任何细胞类型的发育，并不是必要的。
在一个实施方案中，已经经遗传改变使ES细胞核供体含有期望的突变。因此，用本发明的方法从遗传改变的ES细胞克隆的动物或细胞群将拥有该突变。ES细胞中的遗传改变可以是非定向突变、接触诱变剂造成突变、或由已知方法(如电穿孔、逆转录病毒感染等)将外源核酸或核酸衍生物导入到细胞中的结果。更优选，用作核供体的ES细胞已经通过基因寻靶进行遗传改变，以致一个或多个特定基因的一部分或全部以精确的和可控制的方式被修饰。
因此，本发明提供了一种在一代中从细胞系(包括但不限于ES细胞系)产生克隆的、遗传改变的活后代的方法，该细胞系在核转移前能在体外被遗传操作和表征。因此，本发明的方法提高了从相应细胞系产生基因打靶动物的速度和效率。
附图简要说明
图1是本发明克隆步骤的图示，并在正文中解释。
图2是包含其中去核卵母细胞接受E14核，但没有接受活化刺激的实验的结果的表。
图3是包含其中去核卵母细胞接受E14核，并在核转移后用锶离子活化的实验的结果的表。
图4是用来自不同大小并与不同浓度FCS一起生长的E14细胞的核重建1765个卵母细胞的实验的结果总结表。
图5是包含用来自F1杂种129/SV × 129/SV-CP的细胞系R1实施的1087个核转移实验的结果的表。
发明详述
本发明公开了通过将胚胎干(ES)细胞的核组分(包括染色体)插入去核卵母细胞中，并促使所得重建细胞发育至足月，可获得可存活的活产后代。在用于核转移前，ES细胞可培养或长期深低温保存。小鼠ES细胞的分离、培养和操作-包括通过同源重组基因寻靶-在Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版.(Cold Spring HarborLaboratory Press)，253-290页(1994)中描述。关于牛、仓鼠、人和兔的建立ES细胞或类似ES细胞的细胞(ES细胞样细胞)的方法，已分别在Cibelli等，Theriogenology 47，241[1997]；Doetschman等，Dev.Biol.127，224[1988]；Thomson等，Science 282，1145[1998]和Schoonjans等，Mol.Reprod Dev.45，439[1996]中描述。
来自根据本发明的ES细胞核的后代是基因组克隆，其中后代的每个细胞的染色体均来自起源核供体ES细胞的染色体。
优选地，ES细胞来自ES细胞系，该ES细胞系的干细胞性能已经通过在本领域普通技术人员已知的标准胚泡注射步骤(Bradley等，Nature，309，255[1984]；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版.[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，196-204页[1994])后，嵌合后代中种系贡献和传递而被证明。这个过程通常包括将ES细胞注射到受精产生的胚泡的腔中。在这个细胞背景中，ES细胞能够参与形成部分来自宿主胚泡、部分来自注射的ES细胞的嵌合动物的发育过程。ES细胞能在嵌合体中产生躯体组织并能形成所有细胞类型，包括嵌合体的种系。ES细胞形成多方面细胞类型的能力被称为“多能性”。证明ES在种系传递中的多潜能限于小鼠和牛，尽管没有已知的理由相信该现象限于这些物种。ES细胞系被认为为哺乳动物遗传学、发育生物学和医学的研究提供了一个有力的工具。
ES细胞可以来自已建立的ES细胞系。这种ES细胞系是熟知的，包括但不限于，来自F1杂种系和近交小鼠系的那些。来自F1杂种系的ES细胞系的实例包括R1(Nagy，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，90，8424[1993])(见实施例2)。来自近交系的ES细胞系的实例包括129/01a来源的雄性系E14(Hooper，M.等，Nature 326，292[1987])(可从美国典型培养物保藏中心，Bethesda，MD获得，[ATCC]号CRL-11632)、D3(ATCC号CRL-1934)和可从Lexicon Genetics购买得到的AB1和AB2.2。
除了小鼠ES细胞系，ES细胞样细胞已从牛(Cibelli等，Tlaeriogenology 47，241[1997])、仓鼠(Doetschman等，Dev.Biol.127，224[1988])、人(Thomson等，Science 282，1145[1998])和兔(Schoonjans等，Mol.Reprod.Dev.45，439[1996])获得。技术障碍妨碍将和鼠相同的严格条件应用于来自这些动物的ES细胞，即它们是广泛多潜能的并能够对大多数或全部细胞命运(包括种系)有贡献。可以预期，对于小鼠以外的物种，将会证明实验证实能达到所有ES细胞限定标准的ES细胞系。
ES细胞(或来自ICM的细胞)以外的细胞可在体外充分培养以在完整动物的克隆步骤中进行基因组操作和/或用作核供体。这种细胞类型不是物种限制的，其实例有人成纤维细胞系、猪胚胎生殖(EG)细胞(REF)，以及鼠胚胎癌性(EC)细胞(Stewart和Mintz，J Exp.Zoot.224，465[1982]；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版.[ColdSpring Harbor Laboratory Press]，p92[1994])。适于在体外长期培养和遗传操作的细胞种类可能增加；所有这些细胞是本发明方法中潜在的核供体。
确然，ES细胞系能被基因组改造。实施的方法现在已经建立成熟并且在改造ES细胞系以使它们具有给定遗传(且常常是相应的表型)性状的文献(Mombaerts等，Proc.Nad.Acad Sci.美国，88，3084[1991]；Mombaerts等，Nature 360，225[1992]；Itohara等，Cell 72，337[1993])中有许多报道。这又是通过采用如电穿孔或脂质转染法导入重组DNA实现的。突变ES细胞也可以在培养物中自发产生并可以在选择性培养基存在下富集。例如，据报道通过变异体ES细胞抵抗嘌呤类似物6-巯基鸟嘌呤，可从培养物中选择次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷的变异体ES细胞，而且这些突变ES细胞用于生产导致HPRT缺陷的雄性后代的种系嵌合体(Hooper等，Nature 326，292[1987])。
ES细胞技术的一个关键特征是它们允许在整个基因组环境中DNA序列的定向改变。这依赖于被称为同源重组的现象，其中在细胞内，DNA序列与它们的互补(匹配，或接近等同的)基因组序列对准。该互补序列被称为同源序列。然后该序列可以进行交换反应(互换)，产生有效替代染色体上存在序列的新来序列。如果新来序列与其基因组对应物接近等同，或如果它被另外无关序列点缀，则该替代使新序列定向导入。该替代利用细胞酶，据认为该酶的正常作用是在DNA修复和维持方面。由于目前未知的原因，ES细胞是这种酶的丰富来源，并且是已知易于支持同源(即定向)重组的唯一被很好表征的哺乳动物细胞。然后，基因寻靶导致产生一个或多个特定位点以精确指定方式修饰的ES细胞。基因寻靶的实例包括用作为一部分相对短(＜约25千碱基对[kbp])重组DNA片段的新来DNA序列来产生“剔除”和“引入”鼠。预期ES细胞样细胞也可以使用与基因寻靶ES细胞类似的技术进行基因打靶。
目前使用基因打靶ES细胞系来产生遗传改变鼠的方法涉及将改造的ES细胞分别与桑椹胚(大约8个细胞)或胚泡(16个细胞以上)一起聚集或注射至其中。植入后，这种胚胎可以产生嵌合亲本(F0)动物，其随后与野生型动物繁殖使来自ES细胞的基因组以可变的频率(常常等于零)进行种系传递。对已经传递了定向基因修饰的任何第一代(F1)后代进行表型(例如，它们的毛色)鉴定，且通过分析它们的基因组DNA进行鉴定(Joyner[主编]，Gene targeting.[Oxford University Press]，52-59页[1993]；Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，291-324页[1994])。
F1杂合体的繁殖常常是必要的，且在一些情况下，能产生突变纯合的第二代(F2)动物。因此，产生定向基因突变纯合的动物的当前程序至少涉及三代动物。对于小鼠，这需要大约至少六个月来建立给定的突变等位基因纯合的纯育系。然而，对于大多数哺乳动物，包括可购买到的有价值品种，具有长得多的妊娠/成熟期，产生纯育系所需的时间将远远更长。例如，对于牛，三代需要至少3×280天，或大约2.3年。
由于ES细胞系是克隆的(在细胞克隆的意义上，不是完整动物克隆)，它们在完整动物克隆中的应用允许相对较快地产生本质上无限数量的等同动物。因此，通过使用单一ES细胞群作为核供体以产生相应数量的能够发育至足月的重建细胞，来生产大量等同动物将成为可能。预期接近等同的、遗传改造的动物的增殖为人医学和兽医学及农业带来巨大的益处。例如，通过在乳汁或其它液体或组织，通常是分泌性组织，产生有价值的药物剂，遗传改变的动物(包括较大的动物)能作为活的制药“工厂”。这个生产方法有时称作“制药法(pharming)”。
大量的等同研究动物，如小鼠、豚鼠、大鼠和仓鼠的产生也是令人期望的，因为它们在药物发现和筛选中有用。接近等同的小鼠的群体的可利用性在例如发育、人类疾病的分析中，和在新药测试中非常有益；个体间固有的可变性最小，利于对比研究。
本发明描述了一种通过核转移产生分化细胞群，例如来自培养细胞如ES细胞的动物克隆的方法。在该方法中，克隆来源的细胞从接受ES细胞(如来自建立的ES细胞系)核(或其一部分，至少包括染色体)的去核卵母细胞开始发育。在本发明的一个实施方案中，在用本发明的方法将ES细胞核显微注射到去核卵母细胞后可以产生克隆小鼠。在进一步的实施方案中，ES细胞核供体可以来自ES细胞系，E14。从ES细胞克隆的后代可以在出生几天后，通过它们的毛色来识别，毛色反映了核供体细胞系所来源的小鼠品系的表型。目前可获得的许多ES细胞系来自Jackson实验室Leroy Stevens博士的129小鼠品系，129/Sv。
本发明可用于克隆能够或可能从中分离ES细胞并培养形成ES细胞系的所有动物，包括两栖动物、鱼、鸟(如家鸡、火鸡、鹅等)和哺乳动物，如灵长类、绵羊、牛、猪、熊、猫、犬、马、山羊、鼠等。
本发明方法的一个实施方案包括步骤(i)在ES细胞核插入卵母细胞后，但在发育活化之前，允许ES细胞核与去核卵母细胞的细胞质接触一段时间(如不超过大约6小时)，和(ii)活化重建细胞以启动发育。
在一个实施方案中，使用具有2C基因组含量的供体核。当核供体是2C时，为了抑制假极体(pseudo-polar body)中染色体的挤出，优选在微管和/或微丝组装抑制剂存在下进行活化。当例如使用4C供体核时，在缺乏微管/微丝抑制剂下活化之前，重建细胞可以培养不超过大约6小时；在这种情况下，假极体被挤出，以致重建细胞的倍性可恢复到2n。(形式上的2n倍体通常是指导原肠胚形成以上胚胎发育的先决条件。)
在本发明的一个优选实施方案中，用显微注射法将ES细胞核插入去核卵母细胞的细胞质中，并且，更优选用压电驱动(piezo-electrically-actuated)显微注射法。使用压电显微操作器允许用单针收获和注射来自ES细胞的核供体。而且，卵母细胞的去核和供体ES细胞核的注射可快速、高效完成，并且与以前报道的方法(如，用融合促进化学制剂、放电或融合病毒诱导供体细胞和卵母细胞的融合)相比，降低了对卵母细胞的创伤。
用显微注射法导入核物质的方法与用细胞融合导入核物质的方法在时间和拓扑上明显不同。在本发明的显微注射法中，首先供体ES细胞的质膜被穿孔，随后，去核卵母细胞的质膜被穿孔。因此，从供体细胞提取核(或其一部分，至少包括染色体)与该核送递到受体细胞在时间上是分开的。核内容物的分离和送递在时间和空间上分离不是细胞融合的特征，在细胞融合中使两个细胞并列，然后在单个步骤中发生融合。
而且，本发明方法的核取出和导入的时间空间分离允许有控制地导入除核之外的物质。可能非常期望去除外来物质(如细胞质和核质)和导入额外物质和试剂的工具。例如添加剂可能很好地影响随后的发育。这种试剂可以包含抗体、药理学上信号转导抑制剂，或其组合，其中抗体和/或抑制剂直接对抗和/或抑制在细胞分裂或胚胎发育中起负调节作用的蛋白或其它分子的作用。该试剂可以包括核酸序列，如重组质粒或转化载体构建体，它们可以在胚胎发育过程中表达以编码对发育具有潜在正作用的蛋白和/或核酸序列，可以在核与去核卵母细胞结合前、结合过程中或结合后，将试剂导入细胞。
本发明方法的一个实施方案中，通过核转移从培养ES细胞克隆产生分化细胞群的步骤和分步在图1中图解。
概括地说，从卵母细胞供体动物收获(1)卵母细胞，优选中期I阶段卵母细胞，并除去每一个卵母细胞的中期II(mII)板(plate)(含mII染色体)(2)形成去核卵母细胞(缺乏母系来源的染色体)。可以在体外用已知步骤或在体内用其他研究者已经描述的步骤使受体卵母细胞成熟。如本发明中不同实施方案提供的，从含有直径或小(典型地10μm)或大(典型地18μm)的细胞的体外培养物中选择外貌健康ES细胞(3，4)。单一核被注射到(5)去核卵母细胞的细胞质中。允许核在去核卵母细胞细胞质中停留(6)不超过6小时。在一个实施方案中，这个时期最小大约0-5分钟。在一个更优选实施方案中，这个时期是1-3小时。
然后，在微管和/或微丝组装抑制剂存在或缺乏下，活化卵母细胞(7)，抑制剂存在与否依赖于新来核的倍性或基因组当量(genomeequivalence)，其部分由供体核在转移时所处细胞周期阶段反映。有丝分裂细胞周期确保在DNA复制的一个复制循环后，活跃分裂的细胞将相等的遗传物质分给两个子细胞。DNA合成并不是贯穿整个细胞周期，而是限于细胞周期的一部分：合成期，S期。其后是间期，G2期，这期间细胞在进入有丝分裂(M期)前为分裂作进一步准备。初生子细胞从那时起递送到另一个间期，G1期。明显地，某些非分裂细胞，例如在体内终末分化细胞，在周期中的这个阶段-相当于分裂细胞G1期并在S期前的阶段-悬置。这种细胞通常称作“静止的”，从细胞周期中退出进入G0期。细胞周期的G0或G1期的细胞核是二倍体，带有相应于这种情况下2C DNA含量的2n染色体；它们具有每条形态学明显不同的常染色体(非X，非Y)的两个拷贝，和依赖于物种，或XX(雌性)或XY对。细胞周期G2期的细胞核经历了一轮DNA复制，染色体数量仍是2n，但此时含有4C DNA含量。在S期期间，每条不同的染色体的两个拷贝中每一个的DNA都被复制，但这些拷贝(单价姐妹染色单体)连接在每个染色体的着丝粒处。在非同步分裂的ES细胞培养物中，可期望，根据定义，表现出细胞周期的所有阶段。所以，ES细胞培养物中含有由一个直径范围反映的细胞混合物；这个范围可以从大约10μm到大约18μm。相对小的细胞(直径大约10μm)有可能是二倍体(2n)并有2C的基因组DNA，因为这些细胞相对较近分裂，细胞质体积后来增加相对较小。趋向最大大小的细胞(直径大约18μm)更有可能前进到S期后。
当ES细胞供体核是二倍体和2C时，在核转移后，在胞质分裂抑制剂存在下活化重建细胞(7)。这抑制假极体的形成并防止染色体遗失，以此维持重建细胞的2n二倍性。当认为核可能处于S期后(因为它存在于较大细胞中)时，在胞质分裂抑制剂缺失下，活化卵母细胞，这样假极体形成能同时使卵母细胞的二倍性减少到2n，2C。在活化期间，可观察到假前核(pseudo-pronuclei)形成。
ES核供体细胞培养基中胎牛血清(FCS)浓度可以在广泛范围内变化；认为FCS浓度对来自培养的ES细胞的核支持用本发明方法克隆的活后代发育的能力没有明显的影响。
或小或大细胞的核转移后，将形成假前核的重建卵母细胞(8)转移到新鲜培养基，胚胎培养1到大约3.5天(9)。培养后，胚胎可以转移(10)到替代母亲以允许活后代的发育和出生(11)。可供选择地，(9)产生的胚胎可用作ES细胞样细胞培养物的后续衍生中ICM细胞的来源。
因此，本发明方法的一个实施方案描述了哺乳动物的克隆，包括步骤：(a)收集细胞如ES细胞的核的全部或一部分，至少包括染色体；(b)将其插入去核卵母细胞中；(c)允许重建细胞发育为胚胎；和(d)允许胚胎发育为胎儿和随后发育为活后代，或使胚胎的细胞在体外培养。这些步骤中的每一步在下面进行详细描述，以ES细胞核供体作为范例。
可以从ES细胞收集ES细胞核(或包含染色体的核组分)，该ES细胞具有如上所述的2-4C的基因组DNA含量。优选，ES细胞核插入到去核卵母细胞的细胞质中。优选通过显微注射法进行核插入，并且更优选通过压电驱动显微注射法进行。在进一步的方案中，可以通过允许核供体细胞与受体去核卵母细胞融合的方法将核导入(Willadsen，Nature320，63[1986])。
可以在ES细胞核插入前、插入过程中或插入后，活化重建细胞。在一个实施方案中，在ES细胞核插入零小时到大约六小时后，实施活化步骤。在活化前的时间内，核与mII卵母细胞(可能被新来的成分修饰)的居住(resident)细胞质接触。活化可以通过多种方式实施，包括但不限于，电活化，或接触乙醇、精子胞质因子(sperm cytoplasmic factors)、卵母细胞受体配体肽模拟物、Ca2+释放的药理学刺激剂(如咖啡因)、Ca2+离子载体(如A2318，离子霉素)、磷蛋白信号传导(signaling)调节剂、蛋白合成抑制剂等，或它们的组合。在本发明的一个实施方案中，通过使细胞接触锶离子(Sr2+)进行活化。
优选通过接触微管和/或微丝组装的抑制剂以防止极体形成(见下)，来实施已经用含有2C DNA的核注射的重建细胞的活化。这有利于在重建细胞内保留来自供体核的所有染色体。优选在这种抑制剂缺乏时，活化已接受2-4C核的重建细胞，以允许假极体的形成，从而使基因组含量降为2C。在一个实施方案中，2C基因组含量对应于2n染色体。
允许胚胎发育的步骤可包括将胚胎转移给受体替代母亲，在那里胚胎发育为存活胎儿(即，足以正常发育至足月的成功植入的胎儿)的分步。如本领域技术人员所知，胚胎可以在体外发育的任何阶段，从两细胞到桑椹胚/胚泡，进行转移。
根据图1的步骤(1)到(10)，本发明另外实施方案的前十步产生了克隆的桑椹胚或胚泡(胚胎)。在一个实施方案中，在此之后，在克隆胚胎转移给替代受体雌性动物前，根据本领域普通技术人员所知的方法，用聚集技术或胚泡注射将至少一个，通常5-15个ES细胞导入克隆胚胎中。这些“第二”ES细胞被完整导入并可以来自与核供体来源的培养物相同的培养物，或那个培养物的继续，或不同的培养物，或混合物。第二ES细胞的一个功能是拯救或增强克隆胚胎的发育潜力，这样使其完全发育的可能性更大。所得胚胎现在含有来自克隆来源胚胎和第二导入的ES细胞的细胞混合物。接着将混合细胞胚胎转移到雌性替代受体中，在那里胚胎发育为成活胎儿。当核供体和第二ES细胞采用相同的ES细胞培养物时，所得胚胎不是遗传嵌合的。当采用不同的ES细胞培养物时，所得胚胎可以是遗传上嵌合的。
在本发明的另一个实施方案中，在核组分转移到去核卵母细胞后重建的细胞接受一个信号，从而活化胚胎在体外的发育，并如所述进行培养。然而，得到的胚胎在体外进一步培养，用于衍生细胞系。在一个优选方案中，根据本领域技术人员已知的方法，将胚胎培养到胚泡期并用于衍生胚胎干(ES)细胞系或ES细胞样系。在进一步的实施方案中，通过变化体外培养条件，诱导用这种方法来源的细胞系的细胞沿着指定的途径进行分化。本领域技术人员能够诱导ES细胞或ES样细胞分化产生各种细胞类型的群体，包括但不限于心肌细胞(Klug等，J.Clin.Invest.98，216[1996])，神经元细胞(Bain等，Dev.Biol.168，342[1995])或血细胞(Wiles和Keller，Development 111，259[1991])。这种细胞有巨大的用途，如在组织工程的新兴领域(描述在：Kaihara和Vacanti，Arch.Surg.134，1184[1999])。
显微注射法具有许多优点，涉及ES细胞送递到去核卵母细胞中和ES细胞的随后重建方面，包括下列优点。 第一，采用显微注射法实施全部或部分核送递(即部分送递到去核卵母细胞和包含核组分(包括染色体组分)的ES核的随后重建)，可应用于大量各种细胞类型，无论在体外或在体内生长，不论其大小、形态、核供体的发育阶段等。 第二，显微注射法送递核能够仔细控制在核注射时，共导入到去核卵母细胞的核供体细胞的细胞质和核质体积。当外来物质对发育潜能有不利影响时，这是特别恰当的。 第三，显微注射法送递核允许仔细控制在核注射时，另外的试剂共注射(与供体核共同注射)到卵母细胞中：这些试剂在下示例。 第四，显微注射法送递核易于允许在活化前，使供体核与去核卵母细胞的细胞质接触一段时间。这种接触可便于染色质改型(remodeling)、重编程或其它转移染色质的改变(如母系来源的转录因子的募集)，这将利于胚胎随后的发育。 第五，显微注射法送递核使随后活化方案的选择范围广(在一个实施方案中，使用Sr2+)；不同的活化方案可能对发育潜能产生不同的影响。 第六，活化可以在微丝干扰剂(在一个实施方案中，细胞松弛素B)存在下进行以防止染色体挤出，和在细胞分化调节物(在不同的实施方案中，二甲基亚砜或9-顺-视黄酸)存在下进行以促进有利的发育结果。 第七，在一个方案中，用压电驱动的显微注射法进行核送递，允许快速和有效地处理样品并因此降低对进行操作的细胞的损伤。损伤降低部分是因为供体细胞核的制备和导入去核卵母细胞的过程是用相同的注射针实施的；相比之下，使用传统显微注射针，在透明带取核和卵母细胞质膜穿刺之间至少需要更换一次针。 第八，不仅各单个步骤，而且其相互关系，是本发明方法的一个特征。现在我们更详细地提供这些单个的步骤并显示它们在本发明中彼此之间是如何安排的。
详细描述1：受体卵母细胞。卵母细胞在收获用于去核和制备用作核转移的受体前，在体内的成熟阶段对克隆方法的结果有潜在的影响。供体核可以注射到任何发育阶段的卵母细胞或它们的祖先细胞中。本发明的一个优选实施方案，将核转移到成熟的mII卵母细胞受体中；这种mII卵母细胞是被受精精子正常活化的类型。卵母细胞细胞质的化学变化贯穿成熟的过程。这可被中期促进因子(MPF)-细胞周期蛋白B2和cdc2蛋白激酶的二聚复合体例证。MPF活性高的细胞处于细胞周期的中期。例如，在小鼠中，与MPF有关的细胞质活性在那些停滞在第一次减数分裂中期(中期I，mI)的未成熟卵母细胞中最高。然后，随着第一极体(Pb1)的挤出，MFF活性下降，在第二中期，mII时再次达到高水平。在mII期，这些高水平保持不变并使卵母细胞滞留在mII期，当卵母细胞接受重新开始细胞周期(活化)的信号，如由受精精子或Sr2+传递的信号时，它快速减少。当ES细胞核注射到mII卵母细胞的细胞质时，高MPF活性破裂其核被膜，伴随染色质凝聚，导致来自ES细胞的中期染色体的形成。
可用于本发明方法的卵母细胞包括未成熟期卵母细胞(如带有完整核，即称为生发泡的那些)和成熟期卵母细胞(即，那些在mII的卵母细胞)。成熟卵母细胞可通过，如注射促性腺或其它激素(例如，连续给予马和人绒毛膜促性腺激素)来诱导动物超排卵并在排卵后不久(例如，在小鼠动情期开始后13-15小时，母牛动情期开始后72-96小时和家猫动情期开始后80-84小时)手术收获卵细胞而得到。
当可获得的卵母细胞限于未成熟卵母细胞时，可以在促进成熟培养基中培养它们，直到它们进展到mII；这是已知的体外成熟(IVM)。未成熟牛卵母细胞的IVM方法在WO 98/07841中描述，对于未成熟小鼠卵母细胞在Eppig和Telfer(Mets.Enzymol.[Academic Press]225，pp.77-84，[1993])中描述。在本发明的进一步实施方案中，未成熟卵母细胞可以不经IVM用作受体细胞，如卵母细胞在去核前可以在体外成熟。
详细描述2：卵母细胞去核。可以用本领域已知的方法实施卵母细胞的去核。优选，卵母细胞在去核前和去核过程中接触含有微管和/或微丝组装抑制剂的培养基。含肌动蛋白的微丝或含微管蛋白的微管的破坏给予了细胞膜和/或下面的皮层细胞质相对的流动性，这样能够很容易地将装在膜内的一部分卵母细胞吸出到移液管中，伴有亚细胞结构最低限度的破坏。一个微丝干扰剂的选择是细胞松弛素B(5μ/ml)。合适的微管干扰剂，如诺考达唑、6-二甲氨基嘌呤和秋水仙碱，也是本领域技术人员已知的。另外的微丝干扰剂包括但不限于，细胞松弛素D、jasplakinolide、拉春库林A(latrunculin A)等。
在本发明一个优选实施方案中，采用压电驱动微量移液管吸引实施mII卵母细胞的去核。去核显微外科术过程中，用常规固定微量移液管锚定mII卵母细胞。压电驱动去核微量移液管(内径约等于7μm)的平头尖端接触透明带。合适的压电驱动装置在Prime Tech Ltd.(Tsukuba，Ibaraki-ken，日本)以Piezo Micromanipulator/Piezo Impact DriveUnit的名称出售。该单位利用压电效果来以高度可控、快速的方式使显微注射微管尖前进一个短距离(大约0.5μm)。每一脉冲的强度和脉冲间的间隔可被控制单元改变和调节。应用压电脉冲(例如，强度＝1-5，速度＝4-16)使微量移液管前进(或钻过)通过透明带，同时保持其内小的负压。这样，微量移液管尖快速通过透明带，并前进到临近mII板的位置(它含有染色体-纺锤体复合体，在几个物种的mII卵母细胞的细胞质中可分辩为半透明区，通常位于第一极体附近)。然后轻轻地敏捷地将含有中期板的卵母细胞细胞质以最小体积吸出到显微注射移液管中，抽出注射移液管(此时含有mII染色体)。这步的作用是使部分含有mII染色体的卵母细胞细胞质被吸出。接着显微注射移液管被抽出脱离透明带，在从下一个卵母细胞手术取出染色体前，将染色体释放到周围培养基中。适当地，成批卵母细胞可筛选证实完全去核。对于颗粒状细胞质的卵母细胞(如猪、绵羊和猫卵母细胞)，用DNA特异性荧光染料(例如，Hoeschst 33342)染色并在低强度UV照明下简单检测(在一些情况下，用图像加强视频监视器增强)在确定去核效率中是有利的。
mII卵母细胞的去核可通过其它方法实施，如在美国专利4,994,384中描述的方法。例如，用与压电驱动微量移液管相对的常规微量移液管显微手术进行去核。可通过首先用玻璃针沿着10-20％的周缘和接近mII染色体的位置切开卵母细胞的透明带来实施去核。卵母细胞存在于显微镜载物台上含有细胞松弛素B的培养基悬滴中。用不锐利倾斜尖的去核移液管取出染色体。
去核后，卵母细胞等待接受ES细胞核。优选在供体核插入前大约2小时内制备去核细胞。
详细描述3：ES细胞系的制备和维持。ES细胞的分离、培养和操作在如Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版(Cold SpringHarbor Laboratory Press)(1994)中描述。在这里总结了该描述的要素。
原代小鼠ES细胞可以从发育活化(如受精)后至少大约3.5天的扩张胚泡分离。胚胎用培养基如DMEM(补充10％胎牛血清和25mM HEPES，pH7.4)从动物的子宫角冲洗出并分别放置到含有预制饲养细胞层(下面描述)和1ml ES细胞培养基的10mm孔组织培养皿中。胚胎培养的初期阶段也可以在不含饲养细胞的ES培养基小悬滴中，少量石蜡油下培养。进一步培养1-2天后，胚胎从透明带中“孵出”并粘附在组织培养皿的表面，以滋养外胚层(TE)谱系细胞迁移。胚胎粘附后不久，内细胞团(ICM)变得很容易与TE谱系(滋养层)的细胞区分并且生长快速。胚泡培养总共4-5天后，用末端密封的细巴斯德移液管移出来自ICM的(ES)细胞。
用胰蛋白酶处理细胞，将ES细胞团解聚为通常包含3或4个细胞的较小组。然后将这些转移到新的饲养细胞组织培养孔中。原代ES细胞样集落可由其形态学来辨认，如下所述。
在严格生长条件下培养ES细胞及其遗传改造的衍生物以使它们保持正常的核型；这对确保它们具有以工作频率贡献给功能性生殖细胞的潜能是必需的。已知次最优的培养条件可以产生发生核型改变、染色体重排和/或增加其生长速度和降低其在体内分化能力的其它突变的ES细胞变异体。最佳的培养条件对培养ES细胞领域技术人员是已知的，包括提供必需浓度的营养物和生长因子并避免以很高密度培养细胞。高密度培养细胞具有形成团的倾向，团表面细胞分化为多能性受限的内胚层样细胞。可以根据标准方法，每隔2-3天以1∶2到1∶6分裂培养物，用蛋白酶胰蛋白酶适度处理使3-4个细胞的小组进一步分成单个细胞，达到良好的培养密度。培养物中健康ES细胞典型地以轮廓“光滑”的紧密压缩群形式生长。集落表面“粗糙”内胚层的出现，或细胞在基层铺开，是本领域普通技术人员所知的次最优培养条件的指征。
所有培养基、添加物等是无内毒素的。最常用的培养基是Dulbecco改良Eagle’s培养基(DMEM)和4.5mg/ml葡萄糖，可选择地含有1mM的丙酮酸钠。DMEM是设计在5％CO2的空气中，大约35℃下，提供pH7.2-7.4的碳酸氢盐缓冲培养基。DMEM通常就在使用前补充：(a)2mM谷氨酰胺；0.1mM非必需氨基酸；(c)0.1mM β-巯基乙醇；(d)50μg/ml庆大霉素，或青霉素和链霉素各100U/ml，或不含抗生素；(e)15％胎牛血清(FCS；见下)；并可任选，(f)白血病抑制因子(LIF)，也称分化抑制因子(DIA)(见下)。
对于ES细胞继代培养和收获，用含胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)混合物(例如，终浓度分别为0.025％和75mM)的无Ca2+-Mg2+的磷酸缓冲盐水处理，使其从组织培养皿分离下来并彼此分开。
用胎牛血清FCS补充到用于ES细胞培养的DMEM中。典型地，FCS以15％(v/v)使用。然而，在本发明方法中，更低浓度(如1-5％)的FCS支持ES细胞的培养，该细胞的核能够指导胎儿和活后代的发育。而且，这些更低浓度的FCS支持活跃生长的培养物，意味着其中可呈现出处于细胞周期各个阶段的细胞，并且它们在本发明方法中可使用。
白血病抑制因子(LIF)是一种抑制ES细胞自发分化的分泌性细胞因子。它是已知可用于ES细胞生长的水牛-大鼠-肝(BRL)细胞条件培养基的活性成分之一。在ES细胞共培养中，饲养细胞表达活性形式LIF，尽管可用纯化LIF补充该培养基。饲养细胞调节的无细胞培养基不足以支持ES细胞培养，需要补充，例如纯化的LIF(见下)。
尽管在缺乏饲养细胞的含有LIF的培养基中培养ES细胞是可能的，但是大多数实验室依赖饲养层来提供增强ES细胞的增殖和维持未分化状态的因子。最常用的两种饲养细胞是用本领域技术人员已知的方法从12.5到14.5dpc胚胎中收获的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的原代培养物，和STO小鼠成纤维细胞系，它是SIM小鼠成纤维细胞的抗硫代鸟嘌呤和乌本苷的亚系。用丝裂霉素C处理或用γ射线辐射制备不有丝分裂的饲养细胞。
已经描述了其它物种的得到ES细胞样细胞的方法，包括牛(Cibelli等，Theriogenology 47，241[1997])、仓鼠(Doetschman等，Dev.Biol.127，224[1988])、人(Thomson等，Science 282，1145[1998])和兔(Schoonjans等，Mol.Reprod.Dev.45，439[1996])。本领域技术人员可将这些方法应用于任何适当的物种以得到ES细胞样细胞。
详细描述4：遗传修饰或基因打靶ES细胞的制备。可用本领域已知技术对ES细胞进行遗传修饰。优选用“基因寻靶”对ES细胞进行修饰。基因寻靶描述了一种将基因组突变以定向非随机方式导入的方法。这样，特定的突变可以被导入到整个基因组内。由于ES细胞可以用来产生个体，所以含有定向改变基因的ES细胞能够产生包含该定向突变的完整动物。该方法的一个重要特征-“寻靶构建体”的设计和构建-是本领域普通技术人员已知的。寻靶构建体典型地包括至少一个非宿主基因组天然的核苷酸序列。非天然序列相当于待导入的突变，侧翼有相比之下与宿主基因组中那些区域高度保守的，如果不等同的话，较大区域(典型地＞5kbp)。这意味着一旦进入细胞内，该保守/等同序列能够与靶基因组中存在的它们的互补对应物发生同源重组。
为了将突变导入给定ES细胞类型的基因组中，制备相对纯形式的寻靶构建体DNA并用下列方法，包括用野生型或重组逆转录病毒感染、脂质转染、转染等，并优选电穿孔(Hogan等，Manipulating the mouseembryo.第二版.[Cold Spring Harbor Laboratory Press]，277-278页[1994]；Joyner[ed]，Gene targeting.[Oxford University Press][1993])，使ES细胞摄取该DNA。
基因寻靶的效率依赖于可能是每个寻靶构建体序列、DNA制品或ES细胞系独特的变量的组合。然而，这些仅需要本领域技术内的常规实验。例如，效率可受等基因对非等基因DNA的使用、寻靶构建体内的互补序列的长度、寻靶DNA和内源基因之间序列连续片段的等同程度、寻靶DNA的每一侧的互补的长度等的影响。产生基因打靶ES细胞的方法是本领域技术人员熟知的。适合用于本发明的示范基因打靶ES细胞包括但不限于Mombaerts等，Proc.Nad.Acad.Sci.美国，88，3084(1991)；Mombaerts等，Nature 360，225(1992)；Itohara等，Cell 72，337(1993)；美国专利5,859,307等中描述的那些。
详细描述5：ES细胞供体核的制备。培养后，用含胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)(例如，分别以0.025％和75mM的终浓度)混合物的无Ca2+和Mg2+的磷酸缓冲盐水处理从组织培养皿中分离ES细胞未汇合培养物并使它们彼此分开。然后将细胞悬液转移至显微镜载物台上含有12％聚乙烯吡咯烷酮的CZB·H培养基悬滴中。
详细描述6：供体核插入去核卵母细胞中。可以采用显微注射技术将核(或至少包括染色体的核组分)直接注射到去核卵母细胞的细胞质中。在一个将来自ES细胞的核注射到去核卵母细胞的优选方法中，使用压电驱动微量移液管，其中可基本使用带有这里详述改进的上述装置和技术(有关卵母细胞的去核)。
例如，如前所述制备显微注射针，使其具有一个内径大约5μm的平头尖端。根据供应商的说明，该针在它的针尖附近可以含有汞并位于压电驱动装置中。显微注射移液管尖部附近存在汞小滴能增加尖部前进固有的动量，因此能以可控制方式增加尖穿透能力。含有各自选择核的显微注射移液管尖部紧密接触去核卵母细胞的透明带，应用几个压电脉冲(应用时用控制器设置尺度调节，可以是强度1-5、速度4-6)来推进微量移液管，同时可选地使其内部保持轻微负压。当移液管尖部通过透明带，所得带“核心”被逐至卵周隙，微量移液管中预选的核前进到尖部附近。然后移液管尖部置于质膜(卵膜)附近并推进(朝向卵母细胞的相反面)直到几乎位于卵母细胞皮质的对侧。此时卵母细胞质膜深深凹入包绕在注射针的尖部。应用一到两个压电脉冲(例如，强度1-2、速度1)后，卵膜快速和典型可辨的松弛指示质膜在尖部被穿刺。核被排到卵质中，带有最少量(小于等于约1pl)伴随介质。接着，小心撤回微量移液管，在卵母细胞的细胞质中留下了新导入的核。该方法轻快、典型地批处理15-20个去核卵母细胞，该卵母细胞在其它所有时间保持在培养条件下。
可以使用可供选择的变型通过常规显微注射插入供体核。这种使用常规显微注射将精子核插入仓鼠卵母细胞的一个方法的描述，在Yanagida，Biol.Reprod.44，440(1991)中描述，其中涉及这种方法的公开在此引入作为参考。
详细描述7：与核供体共插入发育调节性因子。在本发明的一个实施方案中，在供体核与去核卵母细胞结合前、结合过程中或结合后，可以导入一个或多个具有改变胚胎发育结果潜能的试剂。例如，核可以与对抗具有假定或已知影响本发明方法结果潜能的蛋白的功能调节型抗体共同注射。这种分子可以包括但不限于，参与囊泡转运的蛋白(如突触结合蛋白)，那些可以介导染色质-卵质通讯的蛋白(如DNA破坏细胞周期关卡分子如Chk1)，那些在卵母细胞信号传导中有推定作用的蛋白(如转录因子，STAT3)或修饰DNA的蛋白(如DNA甲基转移酶)。这类分子中的成员也可以是用本发明方法中显微注射法导入、并且具有与抗体类似的功能调节作用的调节性药理学试剂的(间接)靶标。抗体和药理学试剂通过与它们各自的靶分子或它们各自靶分子的配体结合来发挥作用。当该靶对发育结果具有抑制性作用时，这种结合降低靶的功能，当该靶对发育结果有正作用时，结合能促进那个功能。作为替代，在克隆方法中重要功能的调节可以直接通过注射这些因子(或具有类似活性的因子)，而不是注射与它们结合的试剂来达到。
在本发明进一步的实施方案中，可以在供体核插入前或后，通过显微注射将核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)导入卵母细胞中。例如，注射带有必需的顺式作用信号的重组DNA可使居住或共同注射的转录因子引起重组DNA上存在的序列发生转录；编码蛋白的随后表达可以对抑制胚胎发育的因子具有拮抗作用，或对正性作用的因子具有增强作用。而且，转录本可以对编码减少发育潜能的蛋白的mRNA具有反义调节活性。可供选择地，这种调节可以通过直接送递具有反义功能(如反义mRNA)的核酸(或其衍生物)来达到；这排除了在卵母细胞内转录产生反义调节分子的需要。在一个有利实施方案中，通过显微注射进行送递。最后，转录本可以对早期胚胎中基因表达的转录调节起关键的影响。这种影响也可能被显微注射能够影响翻译的另外分子种类介导。
本发明方法导入的重组DNA(或环状或线性)可以包含含有一个或多个表达的功能性基因的功能性复制子。该基因可以在一个或多个启动子的控制之下，启动子的活性可以表现狭窄、宽广或中等的发育表达范围。例如，仅在早期合子中有活性的启动子会指导其关联基因立即但短暂的表达。导入的DNA可以在胚胎发育期间丢失，或整合在一个或多个基因组座位，在所得转基因个体的整个生活史中稳定复制。在一个实施方案中，可以通过显微注射法将编码推断的“抗老化”蛋白，如端粒酶、过氧化物歧化酶或其它氧化保护蛋白的DNA构建体，导入卵母细胞。可供选择地，可以直接在那里注射蛋白，如精子因子蛋白。
详细描述8：重建细胞发育的活化。在本发明的一个实施方案中，接受了供体核的去核卵母细胞，在活化前，重回培养条件培养0-6个小时；这样，卵母细胞可以在供体核插入去核卵母细胞后不超过大约6小时的任何时间进行活化。我们这里将这个间隔称作“潜伏期”。在一个优选实施方案中，潜伏期是1-3个小时。活化可以，但不限于，以电的方式，通过注射一种或多种卵母细胞活化物质，或将卵母细胞转移至含有一种或多种卵母细胞活化物质的介质中来进行。
能够提供活化刺激(或活化刺激的组合)的试剂包括，但不限于，来自精子的胞质因子(例如负责溶解活性(soluble artivity)的蛋白，oscillogen)和某些药理学化合物(例如6-二甲氨基嘌呤[DMAP]、IP3和其它信号转导调节剂)；可以在由供体核插入的细胞重建前、与重建同时或重建后，通过显微注射将这些导入。一种或多种活化刺激可以在重建细胞转移到含有活化化合物子集一或多个成员的介质后(立即或潜伏期后)提供。这个子集包括但不限于，Ca2+释放刺激剂(如咖啡因、乙醇和Ca2+离子载体如A23187和离子霉素)、磷蛋白信号传导调节剂(如2-氨基嘌呤、星形孢菌素和鞘氨醇)、蛋白合成抑制剂(如A23187和环己酰胺(cyclohexamide))、DMAP或前述的组合(如DMAP加离子霉素)。在本发明的一个实施方案中，通过在含有10mM SrCl2提供的二价锶离子Sr2+的无Ca2+ CZB培养基中培养1-6个小时达到重建细胞的活化。
本发明的活化刺激与供体核的插入同时或在其后应用的实施方案中，重建细胞可以在进行活化刺激时或刺激后很快被转移到含有一种或多种微丝干扰剂如含5μg/ml细胞松弛素B的二甲基亚砜的培养基中；这能抑制胞质分裂并因此抑制通过假极体造成的染色体损失。在胞质分裂抑制剂存在下培养4-12小时，但更优选6个小时。这个方案优选应用于含有2C DNA的供体核。
在本发明的另一个实施方案中，去核卵母细胞可以在供体核插入前用上述活化方法活化。接触活化刺激后，如上所述在2C核注射前培养去核卵母细胞不超过大约6小时。在这个方案中，新导入的染色体快速与前核样结构联合并且不期望与胞质分裂防止剂培养抑制假极体排出。
详细描述9：发育产生有活力胎儿和后代。重建细胞被活化产生可经体外培养允许发育的前核、1-细胞胚胎。当该胚胎与胞质分裂阻断剂接触抑制假极体排出时，将胚胎转移到缺乏微丝或微管干扰剂的新鲜培养基中。继续培养到2-细胞到桑椹胚/胚泡期，在此时可将胚胎转移到假孕替代母亲的输卵管或子宫中。
可供选择地，为了通过增加由单一细胞重建来源的后代数量而增加产量，可以分裂胚胎和克隆扩增细胞。
在进一步的实施方案中，通过系列核转移用本发明方法得到的胚胎产生进一步的胚胎。为了达到这点，如上所述活化重建细胞并允许体外培养发育。在另一个实施方案中，可以在转移到合适的替代母亲后在体内培养。继续培养几天，优选3-5天后，用蛋白酶如胰蛋白酶适度处理，或用本领域技术人员所知的机械方法将所得胚胎的细胞分散开。接着，来自这些胚胎的各个细胞被用作核供体；每个细胞的核可以被移出并插入到去核卵母细胞，去核卵母细胞随后活化并允许进行发育。上面描述了供体核插入、去核、发育活化和胚胎培养的方法。
详细描述10：分化细胞群的产生。在另外的实施方案中，用本发明方法产生的克隆胚胎建立体外ES细胞样细胞培养物。这可通过本领域技术人员已知的方法达到且在Hogan等，Manipulating the mouse embryo.第二版。(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，265-272(1994)中描述。可以诱导这种培养物以指定的方式进行分化，因此产生可能无限的特定基因型的丰富细胞来源。已经描述了诱导这种分化的方法获得丰富的神经元细胞群(Bain等，Dev.Biol.168，342[1995])、心肌细胞群(Klug等，J.Clin.Invest.98，216[1996])和造血细胞群(Wiles和Keller，Development 111，259[1991])。作为例子，这允许扩增免疫相容细胞用于移植。该细胞之所以可以相容，因为它们是用本发明方法从移植受体克隆得到的。在另一个实施方案中，对扩增细胞进行遗传修饰，例如，使它们不再表达免疫监视的分子靶标，如妨碍非灵长类来源细胞成功移植到灵长类的Galαl-3Gal部分。克隆来源细胞在体外基质中的生长为克隆技术和组织工程之间提供了联系(Kaihara和Vacanti，Arch.Surg.134，1184[1999])。因此，本发明方法产生的细胞群在移植医学中有用。这里使用的定义
2C，4C：细胞的基因组含量(genomic complement)。1C代表单位基因组，因此定义为“C”。1C代表单倍体复制前细胞的基因组，其中每个座位出现一次。
2n：细胞的二倍体状态，“n”是指染色体的单倍体(单位)数量。
分化：细胞群变得逐渐特化，通常是基因表达改变的结果。
克隆动物：克隆产生的动物。其核基因组来自单一细胞的非嵌合后生动物。
克隆：核染色体从核供体细胞转移到居住染色体已被移走的受体细胞后，生产分化细胞群；该方法优选使用去核卵母细胞作为受体细胞。这可发育这样的后代，其非线粒体DNA来自单个培养细胞，核供体。
卵：卵母细胞或最近受精的雌性配子。
胚胎：卵母细胞发育活化后的任何阶段，或另一种细胞类型模拟卵母细胞活化步骤后的任何阶段。
胚胎干(ES)细胞：来自植入前胚胎(胚泡)内细胞团(ICM)的那些细胞，具有下列性质：(i)它们能经受长期实验室培养和保存，(ii)它们保持未分化状态，(iii)它们保持2n倍性，(iv)如果与胚胎的细胞混合并培养形成嵌合胚胎，它们能够重新开始它们的发育程序并分化为任何细胞类型，包括功能性生殖细胞。ES细胞展现能被操作的同源重组，如在基因寻靶中。
ES细胞样细胞：来自胚泡ICM的培养细胞，但ES细胞性质没有被完全证实。
胎儿：胎盘形成后和足月(后代出生或分娩)前的发育阶段。
活产：活后代。
微丝：细胞支架聚合肌动蛋白。
微管：包含锚定和定向染色体的微管蛋白亚单位的亚细胞细丝。
核：整个核或其一部分，其中核内容物至少包括能够在缺乏任何其它非线粒体基因组的细胞中指导发育的最少的物质。
后代：至少发育至足月的个体。
卵母细胞：已经历了减数分裂第一个中期并停滞于第二中期(中期II)的雌性配子。因此，卵母细胞没有受精但处于可以参与正常受精的发育阶段。卵母细胞可以排卵后在体内产生，或可以是允许随后在体外成熟的手术分离的未成熟前体成熟的结果。
多潜能：分化为多种细胞类型的任何一个的能力。它典型描述干细胞。
重建细胞：通过将至少包括核供体细胞中存在的指导持续发育必需的最少套染色体的另外物质插入去核卵母细胞的方法制备的细胞。在一个优选实施方案中，重建细胞是具有插入其中的ES细胞核的去核卵母细胞。
足月：完整期限。已经历了胚胎在子宫发育的全部程序，相当于妊娠期。
合子：最近受精的雌性配子，也称为1-细胞胚胎。
实施例
下列实施例举例说明了本发明的方法以及从注射了来自ES细胞系E.14，AB 2.2和R1细胞的核的卵母细胞发育的活后代。这些是最初来自F1和小鼠自交系的成熟建立的可广泛获得的细胞系。M72是携带定向突变的E.14的衍生物。下列实施例旨在用作可用于本发明方法的动物卵母细胞、ES细胞、ES细胞样细胞、培养基和应用的举例说明性实例，并不作为限制；本领域技术人员会很容易认识到本发明方案的其它实施。
试剂。除非另外说明，所有有机和无机化合物是实验室级别或更高级别的，并购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。一般地除非另外说明，卵母细胞培养在补充了5.56mM D-葡萄糖的CZB培养基中(Chatot等，1989.J.Reprod Fert.86，679-688)。CZB培养基是：81.6mM NaCl、4.8mM KCl、1.7mM CaCl2、1.2mM MgSO4、1.8mM KH2PO4、25.1mM NaHCO3、0.1mM Na2EDTA、31mM乳酸钠、0.3mM丙酮酸钠、7U/ml青霉素G、5U/ml硫酸链霉素和4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。输卵管中的排卵卵母细胞的收集和它们随后在显微镜载物台上的显微操作是在修饰的CZB(这里称为CZB·H)中进行的，它是补充20mM Hepes但降低了NaHCO3(5mM)和BSA(3mg/ml)浓度的CZB；CZB·H的pH是7.4。CZB·H中的BSA可以用0.1mg/ml聚乙烯醇(PVA；冷水溶解，平均相对分子量约等于103)替代；BSA和PvA的作用都是降低显微操作过程中注射移液管壁的粘性。PVA的润滑效果比BSA持续更长时间，这使得在单个微量移液管重复用于广泛显微操作的过程将其包括在内是理想的。适当的时候，卵母细胞或重建细胞在缺乏CaCl2(即Ca2+)，但补充了诱导卵母细胞活化的试剂，以及一些情况下，补充了抑制胞质分裂的试剂的CZB中培养。
ES细胞在用于ES细胞的Dulbecco改良Eagle氏培养基(DMEM)(Specialty Media，Lavallette，NJ)中培养，该培养基补充了0.5％-15％(v/v)热灭活胎牛血清(FCS；HyClone Laboratories，Logan，UT)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Specialty Media)、0.2mM L-谷氨酸(Specialty Media)、1％(v/v)非必需氨基酸混合物(SpecialtyMedia)、1％(v/v)2-β巯基乙醇(Specialty Media)、1％(v/v)核苷混合物(Specialty Media)和1000U/ml重组白血病抑制因子(LIF)(GIBCO，Grand Island，NY)。FCS使用前在56℃热灭活25分钟。
动物。这些实施例中使用的动物根据实验资源国家研究委员会协会实验动物的管理和使用委员会制定的联合指南(DHEW公开号[NIH]80-23，1985年修订)饲养。
实施例1：由成熟建立的ES细胞系E14制备核供体细胞
这个实施例利用成熟建立和可广泛获得的ES细胞系，E14作为用于显微注射给去核小鼠卵母细胞的核来源。E14细胞系来自小鼠胚泡129/Ola株(Hooper等，Nature 326，292[1987])。129/Ola亲本株是A(野灰色)基因纯合的，具有灰鼠毛色，这反映了其cchp/cchp基因型(灰鼠毛色是柔和的黄色)。ES细胞系E14来自这种小鼠株之一；129/Ola，来自Edinburgh，UK的Martin Hooper博士的实验室。为了通过后代毛色识别由ES细胞核克隆的后代，需要选择卵母细胞供体并饲养毛色与ES细胞来自的小鼠株不同的母本株。在一个方案中，E14细胞的核(遗传上是灰鼠)被转移到去核B6D2F1卵母细胞(遗传上是黑色)中，在转移到CD-1替代母亲(遗传上是白色)中后允许重建细胞发育。
低传代E14细胞等分试样(即传代少于11次的细胞)在1990年获得并在三个不同的实验室进一步培养，共进行了31-39次传代。这里报道的实施例中E14细胞的选择被它们在产生基因寻靶小鼠(Mombaerts等，Proc.Nad.Acad.Sci.美国，88，3084[1991]；Mombaerts等，Nature 360，225[1992]；Itohara等，Cell 72，337[1993]；Rodriguez等，Cell 87，199[1999])中的相当大有用性所支持。因此，E14细胞被证明在种系嵌合体的产生中是有效的，从这些种系嵌合体已建立了基因寻靶小鼠品系。E14培养物典型地呈现从大约10μm到大约18μm的细胞直径范围。无理论上的限制，推测小细胞(大约10μm到大约12μm)很可能在S期前并因此含有2C基因组含量(在2n染色体中)，以及较大细胞(大约16μm到大约18μm)通常在S期后，可能含有2-4C DNA(2n染色体)。
ES细胞在“用于ES细胞的DMEM”(Specialty Media，Phillipsburg，NJ)中生长，其中补充了0.5-15％(v/v)热灭活胎牛血清(FCS)(Hyclone)、1000U白血病抑制因子(LIF)/ml(Gibco)，和下列试剂(Specialty Media)：1％(v/v)青霉素-链霉素、1％(v/v)L-谷氨酰胺、1％(v/v)非必需氨基酸、1％(v/v)核苷和1％(v/v)β巯基乙醇。每隔24小时将细胞以1∶3或1∶4分裂，这反映了大约12小时的细胞周期期限，适当的时候，在用丝裂霉素C处理的来自胚胎13.5天小鼠的原代胚胎成纤维细胞的饲养层上进行培养。在这些情况下，显微操作前，ES细胞在无饲养条件下培养至少一周；到核转移的时候，培养物中检测不到饲养细胞。
在缺乏饲养细胞的条件下ES细胞在补充15％(v/v)FCS和1000U/mlLIF的培养基中培养。如期望在低[FCS]中生长，则逐步降低FCS的浓度。在5％(v/v)FCS的浓度下，与在15％(v/v)时细胞几乎同样活跃地分裂，几乎没有明显分化。然而，当FCS浓度是4％(v/v)或更低时，细胞生长明显地缓慢。当细胞在有0.75％或0.5％(v/v)FCS的培养基中培养时，发生了广泛细胞死亡，这种条件可能造成某些类型细胞“饥饿”并使它们退出了细胞周期(即进入G0期)。
为从培养物中制备单个ES细胞悬液，首先用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。随后用含胰蛋白酶(0.025％[w/v])和乙二胺四乙酸二钠(EDTA；0.75mM)在无Ca2+/Mg2+ PBS中的混合物使细胞彼此之间以及和培养容器之间分开。接着通过轻微离心(2000g，5分钟)和重悬(两次在DMEM中，一次在PBS中)洗涤细胞三次，并以大约107/ml的浓度重悬于PBS培养基中。
ES细胞核收集前不超过2天(但通常在收集前立即)，将一滴大约2μl ES细胞悬液与补充了12％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(平均相对分子量，3.6×105)的20μl CZB·H混合；这里我们称之为CZB·H-PVP。将混合物转移到显微镜载物台上进行显微操作。
卵母细胞的去核。卵母细胞去核是通过吸入到用MB-U型装置(PrimeTech Ltd.，Tsukuba，Ibaralci-ken，日本)经压电驱动(piezo-actuation)已前进通过卵母细胞透明带的微量移液管(内径6μm)中而完成的。这个装置使用压电效应来使微量移液管尖部以高速度每个脉冲前进非常短的距离(大约0.5μm)。脉冲的强度和速度由控制器来调节，对于透明带穿刺典型设置分别是2和4。
从雌性、8-12周龄的B6D2F1小鼠的输卵管收集成熟卵母细胞，其中5U妊娠母马血清促性腺激素(PMSG)和5U人绒毛膜促性腺激素(hCG)分别在卵母细胞收集前64和13-16小时，腹膜内系列给予该小鼠，使其超量排卵。卵母细胞立即置于含有0.1％(w/v)牛睾丸透明质酸酶(300U/mg，ICN Biochemicals Inc.，Costa Mesa，CA)的CZB·H中，25-30℃处理5-10分钟，使其从周围卵丘细胞中分离出来。通过使用移液管作系列转移在CZB·H(无透明质酸酶)中洗涤无卵丘细胞的卵母细胞四次。洗过的卵母细胞随后保持在一滴在水饱和的4％(在空气中v/v)CO2中37℃下平衡的CZB(10-30μl)中，置于矿物油(E.R.Squibb and Sons，Princeton，NJ)下，预备用于显微操作。
将无卵丘卵母细胞群(通常15-20个)转移到显微镜载物台上含有5μg/ml细胞松弛素B的一小滴CZB·H中。用带孔移液管抵住进行显微手术的卵母细胞，向去核移液管施加几个压电脉冲后，透明带被“去核”。mII染色体-纺锤体复合体(可辨认的半透明区)被吸出到移液管中，带有最少量的卵母细胞细胞质。相对高温(达到30℃)使mII板更容易辨认，原因是其半透明度增加。一组中所有卵母细胞去核(大约花费10分钟)后，将它们转移到无细胞松弛素B的CZB中并在那里37℃保持不超过2小时后，再返回到显微镜载物台进行进一步操作。
用显微注射法将ES细胞核转移到去核卵母细胞中。这里，将ES细胞核转移到如上所述制备的去核卵母细胞中。最好使用与卵母细胞去核时相同的微量移液管进行这种转移。
为了将供体核显微注射给去核卵母细胞，使用塑料皿(100mm×15mm；Falcon Plastics，Oxnard，CA，catalogue no.1001)的盖(深度大约5mm)制成显微注射室。一排或多排液滴，每排由两个圆形小滴以及一个延长滴组成并沿着皿中线排列。第一个小滴(大约2μl；直径2mm)，用于显微注射移液管洗涤，是CZB·H-PVP。第二个小滴(大约2μl；直径2mm)含有存在于CZB·H-PVP中的核供体细胞悬液。第三个(延长的)小滴(大约6μl；2×6mm)，用于去核的卵母细胞，是CZB·H。将整个皿，包括小滴，浸于矿物油(Squibb)中。将皿放置到装备了Hoffman对比光调节器的倒置显微镜的载物台上，准备用于显微操作。
供体细胞核显微注射给卵母细胞是通过压电驱动显微注射达到的。取出ES供体细胞的核，每个核被轻轻吸入和挤出显微注射移液管(内径大约7μm)，直到它们的核中基本上见不到细胞质的物质。这是为了使核组分不含细胞质污染物。有些情况下，需要实施少量(典型的是1次)压电脉冲(低强度设置下)打破供体细胞的质膜。当核膜破裂，非染色体的核质成分能被洗掉。
5-10分钟内将分离到移液管中的每个核显微注射到各去核卵母细胞。在微量移液管被移入含有去核卵母细胞的小滴中前，在微量移液管中收集几个细胞(典型地多达7个)的核形成一行裸核通常能加速核转移过程。
去核卵母细胞被置于显微镜载物台上一滴含有5μg/ml细胞松弛素B的CZB中。去核卵母细胞的透明带抵住带孔移液管的尖部并应用轻吸力将其固定在适当位置。然后，注射移液管的尖部向透明带前进，并使其紧密接触透明带。用几个压电脉冲(如，强度1-2，速度1-2)来推进移液管，同时保持其内部轻度负压。当移液管尖部通过透明带，注射移液管内产生的圆柱形核心带物质被挤到卵周隙中。接着，注射移液管内(典型地含有多达7个快速连续收获的核)最前的供体核被推进，直到它接近针尖。然后，移液管又被机械推进直到其尖部几乎到达卵母细胞皮层的对侧。这使去核卵母细胞质膜(卵膜)产生了一个深的凹陷。接着，应用1或2个压电脉冲(典型的强度1-2，速度1)穿刺凹陷的卵膜，ES细胞核组分被挤到卵质中，伴随的介质＜1pl。然后轻轻撤回移液管，核留在卵质内。每个去核卵母细胞注射一个核。用这个方法在10-15分钟内，典型显微注射大约15-20个去核卵母细胞。所有注射在室温进行，通常在25-30℃的范围。
卵母细胞活化。ES细胞培养物典型地含有处于不同细胞周期阶段的细胞，一些含有2n细胞典型的2C含量DNA，另一些已经经历了DNA合成(S期)的复制循环，以致它们含有这个量的两倍(4C DNA)，准备进行细胞分裂。DNA含量的差异是本发明方法预期的，因此需要在核转移后对重建细胞进行不同的处理。处于不同细胞周期阶段的细胞间的区别(如不同的DNA含量)在下面描述；这里我们将相对小直径细胞(10-12μm，称作“小”)与2C DNA以及相对大直径细胞(16-18μm，称作“大”)与4C DNA联系起来。
相当于已接受来自 小ES细胞的核的卵母细胞的重建细胞在CZB中(矿物油下，在空气中4％v/v CO2饱和湿度，37℃下平衡)，孵育1-3个小时。接着，将这些细胞移到含10mM SrCl2和5.1/ml细胞松弛素B(从二甲基亚砜[DMSO]中的100×原液加入)的无Ca2+ CZB中孵育6小时。这种处理诱导发育的活化，同时防止胞质分裂，并且因此，防止染色体以假第二极体形式损失。6小时后，细胞转移到缺乏Sr2+/细胞松弛素B的新鲜CZB培养基中，并在37℃，在空气中4％v/v CO2及饱和湿度下继续培养。因此，6小时后没有抑制S期完成后的正常减数分裂。
相当于已接受来自大ES细胞的核的卵母细胞的重建细胞在CZB中(矿物油下，在空气中4％v/v CO2及饱和湿度，37℃下平衡)，孵育多达2个小时。活化前培养将允许在刺激减数分裂和胞质分裂重新开始前，功能性地完成有利的大分子成分(如纺锤体微管)的合成。将细胞转移到含10mM SrCl2的无Ca2+ CZB中，在空气中4％v/v CO2及饱和湿度下37℃1小时，启动减数分裂的重新开始(活化)。注意这个培养基不含细胞松弛素B或任何其它阻断胞质分裂的试剂。因此，这些活化的细胞排出了假第二极体。既然ES供体细胞的转移核含有4C DNA，后来的姐妹染色单体分离和染色体丢失应当使胚胎恢复至2C的基因组DNA含量。
活化后，重建细胞接着被转移到新鲜CZB中，在空气中4％v/v CO2及饱和湿度下，37℃进行胚胎培养。这种方法产生的胚胎在活化后大约5小时，通常具有2个假前核和一个假第二极体。
基于细胞周期状态选择ES核供体细胞。我们推测小细胞处于G1期(2C DNA)，而大细胞相对于处于G2/M期的那些细胞(S期后，4C DNA)。这提供了一个快速和无损伤的细胞倍性的计量方法。通过使用经改造含有可无破坏性测定的报道基因衍生物(如突变的绿色荧光蛋白，EGRP)的ES细胞系(该报道基因衍生物处于指导细胞周期阶段诊断性转录的启动子控制之下)，能够增强这种评定。这种启动子的实例包括那些指导细胞周期蛋白D(限于细胞周期的G1期)或细胞周期蛋白B2(限于细胞周期的M期)转录的启动子。该报道蛋白含有定向破坏序列(破坏盒)如长存于细胞周期蛋白中的序列。这确保了其半衰期短暂，且它的存在反映了启动子活性(因此反映细胞周期阶段)而不是蛋白的寿命。当报道基因是EGRP时，通过用长波长的表面荧光显微镜术检查，可容易并无损伤地将处于特定细胞周期阶段的细胞从非同步培养物中鉴定出来；只有那些细胞周期阶段特异性启动子活动的细胞具有荧光，使得可立即鉴定并选择它们作为核转移的供体。
最后，我们使Rl ES细胞接触微管干扰剂诺考达唑(Sigma)3μg/ml12小时。这种方法处理的培养物与未处理的培养物相比，发生了戏剧性的改变，出现了许多圆形和漂浮的细胞。这种处理的作用是通过防止细胞完成中期，使ES细胞培养物同步。这种细胞的基因组含量是4C，因为它们已完成了S期无减数循环的复制DNA合成。
胚胎转移。在一滴CAB(10-30μl)中(矿物油下(Squibb)，在水饱和的4％(在空气中v/v)CO2中37℃下平衡)，培养3.5-4天后，检测桑椹胚/胚泡，并且适当的时候，转移到受体白化病CD1雌性小鼠的子宫角中，该小鼠在3天前与切除输精管的CD-1雄性小鼠交配；这在胚胎发育和子宫内膜的发育间建立了协调。雌性或者允许分娩并抚养它们的替代后代，或者在交配(coitum)后19.5天通过剖腹产分娩幼畜并给予幼畜合适的哺乳母亲的照顾。实施例2：用ES细胞核克隆
进行以下实验，其中用来自各种ES细胞系的细胞核显微注射去核卵母细胞，用最初来自小鼠自交和F1系的成熟建立的细胞系示例。我们描述了核供体ES细胞在各种条件下培养进行实验所产生的后代，并进一步用不同倍性的供体细胞证明了本发明的方法。
核转移到去核卵母细胞后ES细胞染色体的命运。在实验系列1(图2)中，接受E14核的去核卵母细胞没有进行活化刺激。因此这种重建卵母细胞停滞在mII。在小细胞的核显微注射后2-4小时我们作了检查，51％的重建卵母细胞具有以分散形式排列的凝聚染色体。相比之下，用来自大细胞的核注射的68％卵母细胞具有以规律阵列排列的凝聚染色体，类似在成熟中期II卵母细胞中母系来源的染色体。
在实验系列2(图3)，我们在核转移后给重建细胞作活化刺激(锶离子，Sr2+)。预期小和大细胞DNA含量的潜在差异，因此我们对每种细胞型所用的核转移方案进行了修改。用小细胞的核重建的卵母细胞在核显微注射后约4小时，从CZB培养基中移走，并置于含有Sr2+(为了活化它们)和细胞松弛素B(为了防止胞质分裂)的培养基中。我们包括了细胞松弛素B，是因为在它缺乏时，供体染色体将被半随机地挤出成为假第二极体，产生无活力的亚二倍体胚胎。我们由小细胞核产生的胚胎中，活化后约6小时检测有78％含有两个假前核(图3)，推测是由于细胞内染色体在假前核形成前常常形成2个簇。
相比之下，用大ES细胞的核重建的每个卵母细胞的活化都在细胞松弛素B缺乏下进行，因为我们推论假第二极体的胞质分裂挤出预期会在许多这种情况下使重建细胞重新建立正常的2C DNA含量。我们注意到在细胞松弛素B缺乏下活化后，68％的1-细胞胚胎含有单一假前核并释发出假第二极体(图3)。
由E14细胞克隆的小鼠的足月发育。图4总结了实验系列3得到的结果，其中用来自不同大小的E14细胞的核重建1765个卵母细胞并在不同浓度的FCS存在下生长。我们没有发现证据表明培养基中FCS的浓度对ES细胞核指导发育为桑椹胚/胚泡期的能力有显著的影响。
小细胞的核转移后，17％的活化卵母细胞产生了桑椹胚/胚泡。转移到合适的替代母亲后，62％的所得胚胎被植入，在活化后20天(dpa)产生了9个胎儿；通过剖腹切开分娩了4个活后代，5个胎儿在15-17dpa停止发育。
一个活产仔由于缺乏代孕母亲而安乐死，2个在分娩后24小时死亡。一个小鼠(称作“Hooper”)存活，是灰色毛色和粉红色眼睛的雄性。这些特性是预知的，因为E14是来自雄性129/Ola小鼠品系的XY细胞系；129/Ola小鼠具有灰色毛色和粉红色眼睛。所有发育至足月的小仔也是无着色眼睛的雄性。Hooper与CD-1雌性交配时产下三窝仔，共33只表面正常的仔。
大细胞核转移后，37％成功活化的卵母细胞在体外培养3.5天后，发育至桑椹胚/胚泡期。在被转移的胚胎中，67％植入到子宫中。在20dpa，剖腹切开将一个完全长大、表面正常仔和3个死胎儿(在15-17dpa停止发育)移出。我们从ES细胞来源克隆小鼠的胎盘和Hooper的耳活检物分离了基因组DNA，并对样本进行聚合酶链式反应(PCR)分析，寻找多态性标记和Y染色体特异性基因Zfy的存在。这些分析进一步证实了克隆仔的E14起源。
这些效率的大小意味着本发明的方法易于重复。然而，与发明的补充实施方案联合可以进一步增强该方法的效率，在补充实施方案中胚胎是由ES细胞和根据本发明方法核转移产生的来自ES细胞的胚胎细胞的混合物形成的。
从R1 ES细胞核转移后胚胎的发育。在实验系列4(图5)中，我们用来自F1杂种129/Sv×129/Sv-CP的细胞系R1实施了1087个核转移。FCS浓度对克隆结果没有明显的影响。然而，R1细胞的克隆效率明显高于E14细胞。从314个转移的桑椹胚/胚泡得到了26个活产克隆仔(8.3％)。PCR分析支持它们的克隆起源。
因为大E14细胞的核，在适当的实验条件下，能够支持转移后的所有发育，所以在第五个实验系列(系列5)中，我们用R1细胞进行了类似实验。这里，代替了简单选择大R1细胞，在核转移前，我们使培养物接触诺考达唑12小时，使培养物中细胞同步处于M期，使得它们含有4CDNA。所得后代的比例与小R1细胞相应的值没有明显的差异。出生了三个活产克隆。这进一步提示核供体倍性或细胞周期阶段都不是克隆中关键的参数。实施例3：用基因打靶ES细胞的核进行克隆
本方法的有用性通过其在从含有定向突变的ES细胞系产生后代中的用途而阐明。
基因打靶ES细胞的产生。包含定向突变的ES细胞系来自E14。该系(Zheng和Mombaerts描述；提交发表)是用M72→VRi2-IRES-tauGFP构建体电穿孔E14细胞，随后如所描述(Mombaerts等，Cell 87，675[1996])进行培养而产生的。一个携带该突变的所得细胞系，T15，在胚泡注射后产生了躯体组织和种系广泛集群的嵌合体。因此，我们估计了这个系提供本发明克隆方法中的核供体的能力。
由基因打靶E14细胞系T15克隆小鼠的发育。选择小T15细胞(估计平均直径大约12μm和2n倍性、2C)并如上所述将它们的核转移产生重建细胞。T15这样核转移后，成功重建了252个细胞并在体外培养。培养3.5天后，91个(36％)已发育至桑椹胚/胚泡期。它们转移到假孕代孕母亲使发育继续。
剖腹切开交配(coitum)后19.5天的代孕母亲，显示8个死胎(转移胚胎的9％)和一个活产克隆。这表明来自含有定向突变的细胞的核可用来通过这里描述的本发明的方法克隆产生后代。实施例4：ES细胞样细胞的获得
胚胎可以通过体外受精或自然交配和收获而产生。植入前胚胎在体外至胚泡期的发育是在Gardner等，Fertil.Steril.69，84(1998)描述的G1.2或G2.2培养基中进行。用兔抗BeWo细胞的抗血清免疫外科分离所选胚泡的ICM的细胞，如前所述(Thomson等，Proc.Nad.Acad.Sci.美国92，7844[1995]；Solter和Knowles，Proc.Nad.Acad Sci.美国72，5099[1995])。细胞各自铺到含有预先形成的辐射小鼠胚胎成纤维细胞层和1ml培养基的10mm孔组织培养皿中。培养基由80％Dulbecco改良Eagle’s培养基(无丙酮酸盐，高葡糖配方；Gibco-BRL)，补充20％FCS(Hyclone)、1mM谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)和1％非必需氨基酸贮液(GIBCO-BRL)组成。
进一步培养9-15天后，通过接触含有1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的无Ca2+和Mg2+的磷酸缓冲盐水，或接触分散酶，或用巴斯德移液管机械分散，把来自内细胞团的生长晕分成含有3或4个细胞的小团。该较小的团转移到新鲜饲养细胞组织培养孔中。进一步生长后，选择形态均匀未分化的独立集落并重新铺板如前所述。
据其形态学可鉴定的原代ES细胞样集落，通过接触IV型胶原酶(1mg/ml；GIBCO-BRL)或用巴斯德移液管选择单个集落后进行传代和扩增。
已知次最优培养条件可产生经历核型改变、染色体重排和/或增加其生长速率并减少其在体内分化能力的其它突变的ES细胞变异体。传代2-7次时对每个ES细胞样系进行核型分析，丢弃核型异常的那些系。
最佳培养条件是本领域技术人员已知的。所有培养基、补充物、塑料器具等应该不含内毒素。已经描述了牛(Cibelli等，Theriogenology47，241[1997])、仓鼠(Doetschman等，Dev.Biol.127，224[1988])、人(Thomson等，Science 282，1145[1998])和兔(Schoonjans et al.，Mol.Reprod.Dev.45，439[1996])的ES细胞样培养物的衍生。
这里引用的所有专利和参考文献通过参考文献的方式引入。我们进一步通过参考文献的方式特别引入了Wakayama等，ProceedingNational Academy of Sciences，美国，96(26)：14984-14989(1999年12月21日)的全部。

Claims (72)

1.克隆胚胎的方法，包括步骤：
(a)收集培养细胞的核；
(b)将(a)的核或其包括染色体的至少一部分显微注射到去核卵母细胞中，重建细胞；和
(c)允许重建细胞进行胚胎发育。
2.权利要求1的方法，其中显微注射是压电驱动的显微注射。
3.权利要求1的方法，其中允许胚胎发育为活后代。
4.权利要求3的方法，其中允许所得胚胎发育为活后代的步骤进一步包括将该胚胎转移给雌性替代受体的分步。
5.权利要求1的方法，其中培养细胞是胚胎干(ES)细胞。
6.权利要求5的方法，其中ES细胞来自ES细胞系。
7.权利要求6的方法，其中ES细胞系来自F1小鼠系。
8.权利要求7的方法，其中ES细胞系是R1。
9.权利要求6的方法，其中ES细胞系来自近交小鼠系。
10.权利要求9的方法，其中ES细胞系是E14。
11.权利要求1的方法，其中培养细胞是ES细胞样细胞。
12.权利要求9的方法，其中ES细胞样细胞来自选自灵长类动物、绵羊、牛、猪、熊、猫、山羊、犬、马、cetids、啮齿类动物、鸟类、两栖动物、爬行动物和鱼类的动物。
13.权利要求1的方法，其中培养细胞是胚胎生殖(EG)细胞。
14.权利要求12的方法，其中EG细胞来自选自灵长类动物、绵羊、牛、猪、熊、猫、山羊、犬、马、cetids和啮齿类动物如鼠的哺乳动物。
15.权利要求15的方法，其中哺乳动物是猪。
16.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的细胞核具有2n染色体。
17.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的细胞核含有2-4C基因组DNA。
18.权利要求1的方法，其中步骤(a)中的细胞被遗传改变。
19.权利要求18的方法，其中遗传改变是通过基因寻靶进行的。
20.权利要求16的方法，其中细胞核来自ES细胞。
21.权利要求17的方法，其中细胞核来自ES细胞。
22.权利要求18的方法，其中遗传改变的细胞是ES细胞。
23.权利要求22的方法，其中遗传改变是通过基因寻靶进行的。
24.权利要求1的方法，其中步骤(b)中的去核卵母细胞停滞在第二次减数分裂的中期。
25.权利要求1的方法，进一步包括在细胞核或其一部分插入前、或插入过程中、或插入后活化卵母细胞的步骤。
26.权利要求25的方法，其中活化步骤发生在插入步骤后大约0-6小时。
27.权利要求25的方法，其中活化步骤发生在细胞核或其一部分插入后大约1-3小时。
28.权利要求25的方法，其中活化步骤包括电活化或接触化学活化剂。
29.权利要求28的方法，其中化学活化剂选自：乙醇、精子胞质因子、卵母细胞受体配体肽模拟物、Ca2+释放药理学刺激剂、Ca2+离子载体、锶离子、磷蛋白信号传导调节剂、蛋白合成抑制剂或它们的组合。
30.权利要求28的方法，其中化学活化剂选自咖啡因、Ca2+离子载体A23187、乙醇、2-氨基嘌呤、星形孢菌素、鞘氨醇、环己酰胺、离子霉素、6-二甲氨基嘌呤、精子携带的可溶性卵母细胞活化因子-I(SOAF-Is)或它们的组合。
31.权利要求28的方法，其中活化剂包含Sr2+。
32.权利要求1的方法，进一步包括在插入步骤(b)前或后一段时间间隔中，干扰卵母细胞中微管和/或微丝组装的步骤。
33.权利要求32的方法，其中时间间隔是大约0-6小时。
34.权利要求32的方法，其中微管组装被诺考达唑或二甲氨基嘌呤抑制。
35.权利要求32的方法，其中微丝组装被细胞松弛素B、细胞松弛素D、jasplakinolide、拉春库林A或它们的组合干扰。
36.权利要求1的方法，其中步骤(b)进一步包括将除了细胞核部分以外的试剂插入到所述卵母细胞的细胞质中。
37.权利要求34的方法，其中试剂选自外源蛋白、外源蛋白的衍生物、抗体、药理学试剂和它们的组合。
38.权利要求37的方法，其中试剂是外源核酸或核酸衍生物。
39.克隆得到分化细胞的方法，包括步骤：
(a)收集ES细胞的核；
(b)将包括染色体的ES细胞核的至少一部分显微注射到去核卵母细胞中，形成重建细胞；
(c)活化前，培养重建细胞0-6小时；
(d)活化重建细胞的发育；和
(e)允许重建细胞发育。
40.权利要求39的方法，其中步骤(a)的核是2C。
41.权利要求39的方法，其中步骤(a)的核是2-4C。
42.权利要求39的方法，其中进一步允许步骤(e)的重建细胞发育为胚胎。
43.权利要求39的方法，其中活化步骤(d)包括接触化学活化剂。
44.权利要求43的方法，其中活化剂包括Sr2+。
45.权利要求43的方法，其中接触进行不超过大约6小时的一段时间。
46.权利要求39的方法，其中活化步骤(d)在微管和/或微丝组装抑制剂存在下进行。
47.权利要求45的方法，其中微管和/或微丝组装抑制剂包含细胞松弛素B。
48.克隆得到分化细胞的方法，包括步骤：
(a)收集细胞的核；
(b)将包括染色体的(a)的细胞核的至少一部分显微注射到去核卵母细胞中，形成重建细胞；
(c)允许重建细胞发育为桑椹胚/胚泡；
(d)收集ES细胞；
(e)将(d)的ES细胞导入(c)的桑椹胚/胚泡中；
(f)允许(e)的重建胚胎发育。
49.权利要求48的方法，其中进一步允许步骤(f)的重建细胞发育为成活胚胎。
50.权利要求48的方法，其中步骤(a)的细胞是ES细胞。
51.权利要求50的方法，其中ES细胞是在体外培养的。
52.权利要求48的方法，其中步骤(a)的细胞是与步骤(d)的ES细胞来自相同培养物的ES细胞。
53.权利要求1的方法产生的分化细胞。
54.权利要求1的方法产生的动物，其核染色体来自培养细胞的核。
55.权利要求54的方法产生的动物，其中培养细胞是ES细胞。
56.权利要求54的动物，其中ES细胞包含重组DNA且所得动物包含该重组DNA。
57.权利要求54的动物，其中重组DNA是基因组整合的。
58.权利要求57的动物，其中重组DNA通过基因寻靶导入。
59.权利要求57的动物，其中动物选自哺乳动物、两栖动物、鱼类和鸟类。
60.权利要求57的动物，其中动物是哺乳动物。
61.权利要求60的动物，其中哺乳动物选自灵长类动物、绵羊、牛、猪、熊、猫、山羊、犬、马、cetids和鼠。
62.权利要求61的动物，其中哺乳动物是小鼠。
63.权利要求61的动物，其中哺乳动物是猪。
64.权利要求61的动物，其中哺乳动物是母牛。
65.调节胚胎学发育的方法，包括步骤：
(a)将ES细胞的核与去核卵母细胞组合形成重建细胞；
(b)在组合步骤之前、或过程中、或之后，将试剂插入到卵母细胞的细胞质中；和
(c)允许试剂处理的重建细胞发育。
66.权利要求65的方法，其中进一步允许步骤(c)的重建细胞发育为成活胚胎。
67.权利要求65的方法，其中步骤(b)的试剂选自：外源蛋白、外源蛋白的衍生物、抗体、药理学试剂、和外源核酸、外源核酸的衍生物，或它们的组合。
68.权利要求65的方法，其中ES细胞含有正常DNA量的两倍。
69.权利要求68的方法，其中显微注射是压电驱动的显微注射。
70.权利要求1的方法，其中将所得胚胎解离，并允许其细胞分化成一个或多个细胞系。
71.权利要求1的方法，其中细胞系是心肌细胞、神经元细胞或造血细胞。
72.权利要求70的方法产生的细胞。
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