CN102933074A - 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 - Google Patents
由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102933074A CN102933074A CN2011800287171A CN201180028717A CN102933074A CN 102933074 A CN102933074 A CN 102933074A CN 2011800287171 A CN2011800287171 A CN 2011800287171A CN 201180028717 A CN201180028717 A CN 201180028717A CN 102933074 A CN102933074 A CN 102933074A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- female
- approximately
- cell
- basal medium
- mouse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 105
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 99
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 84
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 60
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 54
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 42
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 39
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 39
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 39
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 31
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 28
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 15
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims description 13
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 13
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 10
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 8
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 5
- -1 alkali metal halogen Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 101100204227 Homo sapiens STEAP2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 165
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 13
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 10
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 10
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 8
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 244000144987 brood Species 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 5
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 5
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 5
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 5
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 5
- 101000628535 Homo sapiens Metalloreductase STEAP2 Proteins 0.000 description 4
- 102100026711 Metalloreductase STEAP2 Human genes 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 3
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008771 sex reversal Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 3
- BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyisobutyric acid Chemical compound CC(C)(O)C(O)=O BWLBGMIXKSTLSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 2
- 241000699718 Akodon Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699709 Microtus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000009400 out breeding Methods 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical group 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283730 Bos primigenius Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101150112093 FGF9 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003957 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000367 Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 1
- 206010062904 Hormone-refractory prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241001327887 Lemmus Species 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001232540 Myopus Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 1
- 241000288716 Talpa Species 0.000 description 1
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M benzylpenicillin sodium Chemical compound [Na+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 FCPVYOBCFFNJFS-LQDWTQKMSA-M 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001135 feminizing effect Effects 0.000 description 1
- 108010035554 ferric citrate iron reductase Proteins 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0091—Oxidoreductases (1.) oxidizing metal ions (1.16)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
- C12N2517/02—Cells from transgenic animals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
- C12N2517/10—Conditioning of cells for in vitro fecondation or nuclear transfer
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明描述了用于由XY供体细胞和合适的宿主胚胎制备表型雌性的能育动物的方法和组合物。提供了用于将XY供体细胞维持在培养中的培养基和方法，在引入宿主胚胎内和在合适的宿主中孕育后，所述XY供体细胞将导致能育的XY雌性动物。描述了用于由供体XY细胞和宿主胚胎在F0代中制备能育的雌性动物的方法和组合物，以及用于由杂合的F0能育雄性和杂合的F0能育雌性同胞制备F1后代的方法，所述F1后代对于修饰是纯合的。
Description
发明领域
本发明涉及衍生自XY胚胎干（“ES”）细胞且具有XY核型的能育的雌性动物的制造。在特定实施方案中，描述了关于由XY供体鼠ES细胞制备能育的XY雌性小鼠的方法和组合物。还描述了用于支持表型雌性形成的体外受精方法。
发明背景
几乎所有通常采用的用于制备遗传修饰小鼠的ES细胞系都是基因型雄性（XY）ES细胞系。因此，在F0代中，所有XY动物都是雄性。大多数遗传修饰通过靶向XY ES细胞执行，以产生两种现有等位基因之一的修饰，即供体小鼠ES细胞对于遗传修饰是杂合的。然而，通常希望获得对于遗传修饰是纯合的小鼠。因为基本上没有完全ES细胞衍生的雌性小鼠在包含该修饰的F0代中出生，所以F0雄性一般与雌性（例如匹配的近亲繁殖的雌性）交配，以生成其中至少一个雌性（F1雌性）对于遗传修饰可能是杂合的一窝动物。随后使杂合F1雌性与F1杂合雄性互交，以获得纯合后代。此类交配需求代表昂贵和费时的步骤。希望在F0代中生成交配对，或至少生成大部分或完全衍生自供体（XY雄性）ES细胞的F0雌性。
本领域存在关于由供体雄性（XY）ES细胞和宿主胚胎在F0代中制备能育的雌性动物的方法和组合物的需要。
发明概述
在一个方面，提供了用于由XY供体细胞制备能育的雌性非人动物的方法，其包括：（a）将非人XY供体细胞引入非人宿主胚胎内，以形成嵌合胚；和（b）使该嵌合胚孕育，以形成非人雌性动物，其中所述非人雌性动物是XY并且在达到性成熟后是能育的。
在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
在一个实施方案中，非人XY雌性动物在F0代中形成。在一个实施方案中，在F0代中的非人雌性XY动物是小鼠且具有100%衍生自供体细胞的毛色。在一个实施方案中，在F0代中形成的非人雌性XY动物至少90%、92%、94%、96%、98%或99.8%衍生自XY供体细胞。在一个实施方案中，在F0代中的非人雌性XY动物约100%衍生自供体细胞。在一个实施方案中，宿主胚胎胎细胞对F0代中非人雌性XY动物的贡献通过定量测定法进行测定，所述定量测定法能够检测2,000中的1个细胞（0.05%），并且没有雌性XY动物的组织对于宿主胚胎细胞贡献是阳性的。
在一个实施方案中，供体细胞包含遗传修饰。在一个实施方案中，遗传修饰包含内源核酸序列整体或部分的缺失；一个或多个核酸的取代；内源核酸序列例如基因整体或部分由异源核酸序列的替换；敲除；和/或敲入。
在一个实施方案中，该方法进一步包括使对于遗传修饰杂合的F0代XY雄性与对于遗传修饰杂合的F0代XY雌性（例如同胞）交配，并且由所述交配获得对于遗传修饰纯合的F1代动物。
在一个实施方案中，在引入宿主胚胎内之前，将XY供体细胞维持在包含基础培养基和补充物的培养基中，其中所述基础培养基显示选自下述的特征：（a）约250-310mOsm/kg的摩尔渗透压浓度；（b）约11-13mS/cm的导电性；（c）浓度约60-105mM的碱金属和卤素的盐；（d）约20-30mM的碳酸盐浓度；（e）至多约85-130mM的碱金属卤盐和碳酸盐总浓度；和（f）其组合。
在一个实施方案中，补充物包含用于维持在培养中的ES细胞的组分。在一个实施方案中，补充物包含胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、抗生素、丙酮酸盐、非必需氨基酸、2-巯基乙醇和LIF中的一种或多种。
在一个实施方案中，基础培养基是低盐DMEM。在特定实施方案中，低盐DMEM具有85-130mM的NaCl浓度。在一个实施方案中，基础培养基是低摩尔渗透压浓度DMEM。在特定实施方案中，低摩尔渗透压浓度DMEM具有250-310mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在一个实施方案中，基础培养基是低导电性DMEM。在特定实施方案中，低导电性DMEM具有11-13mS/cm的导电性。
在一个实施方案中，在引入宿主胚胎内之前，将供体细胞在所述基础培养基加上补充物中维持约1、2、3、4、5、6天，1周，8、9、110、11或12天，2周、3周或4周或更久。在特定实施方案中，在引入宿主胚胎内之前，将供体细胞维持在所述基础培养基加上补充物中至少一周。在特定实施方案中，在引入宿主胚胎内之前，将供体细胞维持在所述基础培养基加上补充物中2-4周。
在一个实施方案中，宿主胚胎是2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、16-细胞期、32-细胞期或64-细胞期胚胎。在另一个实施方案中，宿主胚胎是囊胚。在一个实施方案中，胚胎在选自桑椹胚前期、桑椹胚期、非致密的桑椹胚期和致密的桑椹胚期的阶段中。在一个实施方案中，胚胎期选自泰勒期（Theiler Stage）1（TS1）、TS2、TS3、TS4、TS5和TS6，参考Theiler（1989）“The House Mouse：Atlas of MouseDevelopment,”Springer-Verlag，New York中所述的泰勒期。在特定实施方案中，泰勒期选自TS1、TS2、TS3和TS4。在一个实施方案中，胚胎包含透明带，并且供体细胞是通过透明带中的孔引入胚胎内的ES细胞。
在一个实施方案中，胚胎包含囊胚前胚胎。在一个实施方案中，胚胎是桑椹胚期胚胎。在特定实施方案中，桑椹胚期胚胎是聚集的。在一个实施方案中，胚胎是少带（zona-less）胚胎。
在一个实施方案中，XY供体细胞选自ES细胞、诱导的多能干（iPS）细胞、多能细胞和全能细胞。在特定实施方案中，XY供体细胞是小鼠ES细胞并且宿主胚胎是小鼠胚胎。
在一个实施方案中，XY供体细胞是来自近交小鼠品系的ES细胞。在一个实施方案中，XY供体细胞是来自杂交或远交小鼠品系的ES细胞。
在一个实施方案中，宿主胚胎是小鼠宿主胚胎。在一个实施方案中，小鼠宿主胚胎来自近交品系，在另一个实施方案中，来自杂交或远交品系。在一个实施方案中，供体细胞是小鼠供体细胞。在一个实施方案中，宿主胚胎和供体细胞都是小鼠，并且各自独立地选自其为129品系、C57BL/6品系、129和C57BL/6的杂种、BALB/c品系或Swiss Webster品系的小鼠。在特定实施方案中，小鼠是50% 129和50% C57BL/6。在一个实施方案中，小鼠是选自其为129P1、129P2、129P3、129X1、129S1（例如129S1/SV、129S1/SvIm）、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6（129/SvEvTac）、129S7、129S8、129T1、129T2（参见例如，Festing等人（1999）Revised nomenclature for strain129 mice、Mammalian Genome 10:836）品系的129品系。在一个实施方案中，小鼠是C57BL品系，在特定实施方案中，选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、C57BL/Ola。在特定实施方案中，小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的杂种。在另一个特定实施方案中，小鼠是前述129品系的杂种或前述BL/6品系的杂种。在特定实施方案中，杂种的129品系是129S6（129/SvEvTac）品系。
在一个实施方案中，XY雌性小鼠在其寿命期间产生1、2、3、4、5、6、7、8或9窝的活小鼠。在一个实施方案中，XY雌性小鼠产生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10只幼崽/窝。在一个实施方案中，XY雌性小鼠产生约4-6只幼崽/窝。在一个实施方案中，XY雌性小鼠产生2-6窝，其中每窝具有至少2、3、4、5或6只幼崽。在一个实施方案中，约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的幼崽是XY雌性幼崽。在特定实施方案中，约15%-25%是XY雌性幼崽。
在一个方面，提供了用于制备对于遗传修饰是纯合的小鼠的方法，采用对于遗传修饰是杂合的XY ES细胞。在一个实施方案中，该方法包括遗传修饰XY供体ES细胞，以形成杂合XY供体ES细胞，将杂合XY供体ES细胞维持在低盐和/或低摩尔渗透压浓度或低导电性培养基中，将杂合XY供体ES细胞引入桑椹胚前宿主胚胎内，使宿主胚胎孕育，在孕育后获得能育的F0代雌性XY小鼠，其包含杂合修饰且至少部分衍生自供体ES细胞，并且在孕育后获得能育的F0代雄性XY小鼠，其包含杂合修饰且至少部分衍生自供体ES细胞，并且使F0雄性和F0雌性交配，以获得包含纯合修饰的F1后代。
在一个实施方案中，F0代雌性XY小鼠和/或F0代雄性XY小鼠至少20%或更多衍生自供体ES细胞。在一个实施方案中，F0雌性XY小鼠至少30%、40%、50%、60%、70%或80%衍生自供体ES细胞。
在一个实施方案中，F0代雌性XY小鼠和/或雄性XY小鼠至少90%衍生自供体ES细胞。在一个实施方案中，F0雌性XY小鼠至少92%、94%、96%、98%、99%或99.8%衍生自供体ES细胞。在一个实施方案中，F0代雌性XY小鼠和/或F0代雄性XY小鼠具有100%衍生自供体ES细胞的毛色。
在一个实施方案中，F0代小鼠包含XY卵母细胞。
在一个实施方案中，F1代后代小鼠包含完全衍生自供体ES细胞的基因组。
在一个实施方案中，F0代雄性和F0代雌性小鼠产生完全ES细胞衍生小鼠的杂交频率是100%。
在一个方面，提供了用于生成小鼠幼崽窝的方法，其包括将根据本发明制备的XY供体ES细胞引入宿主小鼠胚内，使胚胎在合适的小鼠中孕育，并且获得包含至少一只XY雌性小鼠幼崽的一窝小鼠幼崽，所述XY雌性小鼠幼崽在达到性成熟后是能育的XY雌性小鼠。
在一个实施方案中，出生的在达到性成熟后是能育的XY雌性小鼠幼崽百分比是约10%、15%、20%、25%、30%、35%.、40%、45%或50%。在特定实施方案中，该百分比是约15-25%。
在一个方面，提供了用于将XY ES细胞维持在培养中的方法，其中在将XY ES细胞引入宿主胚胎内之后且在合适的雌性小鼠中孕育之后，在促进或支持雌性XY小鼠发育的条件下维持所述XY ES细胞。该方法包括将雄性ES细胞维持在包含基础培养基和补充物的合适培养基中，其中所述基础培养基显示约240-320mOsm/kg的摩尔渗透压浓度、约10-14mS/cm的导电性、约50-105mM的碱金属卤盐浓度、10-40mM的碳酸盐浓度、和/或约80-140mM的合并的碱金属盐和碳酸盐浓度。在一个实施方案中，在引入宿主胚胎内之前，将XY ES细胞维持在所述培养基（具有用于维持ES细胞的补充物）中1、2、3、4、5或6天，或1周，8、9、110、11或12天，2周、3周或4周的时期。在特定实施方案中，在引入宿主胚胎内之前，将ES细胞维持在所述培养基（具有用于维持ES细胞的补充物的低盐基础培养基）中约2-4周。
在一个实施方案中，基础培养基显示至多约320、310、300、290、280、270、260、250或240mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在一个实施方案中，基础培养基显示至多约240-320、250-310或260-300mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在特定实施方案中，基础培养基显示约270mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。
在一个实施方案中，基础培养基显示至多约10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5或14.0mS/cm的导电性。在一个实施方案中，基础培养基显示至多约10-14mS/cm或11-13mS/cm的导电性。在特定实施方案中，基础培养基显示约12-13mS/cm的导电性。
在特定实施方案中，基础培养基显示约12-13mS/cm的导电性和约260-300mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在进一步的特定实施方案中，基础培养基包含浓度约90mM NaCl的氯化钠。在进一步的特定实施方案中，氯化钠的浓度是约70-95mM。在进一步的特定实施方案中，基础培养基包含浓度小于约35mM的碳酸氢钠。在进一步的特定实施方案中，碳酸氢钠的浓度是约20-30mM。
在一个实施方案中，基础培养基显示至多约100mM的碱金属和卤素的盐浓度。在一个实施方案中，碱金属和卤素的盐是NaCl。在一个实施方案中，碱金属和卤素的盐的浓度不高于90、80、70、60或50mM。在一个实施方案中，在基础培养基中的碱金属和卤素的盐浓度是约60-105、70-95或80-90mM。在特定实施方案中，该浓度是约85mM。
在一个实施方案中，基础培养基显示碳酸盐浓度。在一个实施方案中，碳酸盐是钠盐。在一个实施方案中，钠盐是碳酸氢钠。在一个实施方案中，在基础培养基中的碳酸盐浓度不高于40、35、30、25或20mM。在一个实施方案中，在基础培养基中的碳酸盐浓度是约10-40，在另一个实施方案中，是约20-30mM。在特定实施方案中，该浓度是约25或26mM。
在一个实施方案中，在基础培养基中碱金属和卤素的盐以及碳酸盐的浓度总和是至多140、130、120、110、100、90或80mM。在一个实施方案中，在基础培养基中碱金属和卤素的盐以及碳酸盐的浓度总和是约80-140、85-130、90-120、95-120或100-120mM。在特定实施方案中，在基础培养基中碱金属和卤素的盐以及碳酸盐的浓度总和是约115mM。
在一个实施方案中，碱金属和卤素的盐以及碳酸盐的摩尔比高于2.5。在一个实施方案中，该比是约2.6-4.0、2.8-3.8、3-3.6或3.2-3.4。在一个实施方案中，该比是3.3-3.5。在特定实施方案中，该比是3.4。
在一个实施方案中，基础培养基显示约250-310mOsm/kg的摩尔渗透压浓度，和约60-105mM的碱金属和卤素的盐浓度。在进一步的实施方案中，基础培养基具有约20-30mM的碳酸盐浓度。在进一步的实施方案中，碱金属和卤素的盐以及碳酸盐的浓度总和是约80-140mM。在进一步的实施方案中，基础培养基的导电性是约12-13mS/cm。
在一个方面，提供了在如本文描述的条件下用于维持培养中的供体XY ES细胞的方法，其中在将供体XY ES细胞引入宿主胚胎内以形成嵌合胚，和嵌合胚在合适动物中孕育之后，嵌合胚发育成其为至少90%XY且在达到性成熟后是能育的雌性的小鼠幼崽。
在一个实施方案中，小鼠幼崽是至少92%、94%、96%、98%或99.8%XY。
在一个方面，提供了用于制备能育的XY雌性动物的方法，其包括在将供体细胞引入宿主胚胎内之前，将XY供体细胞维持在包含低盐基础培养基的培养基中，将供体细胞引入宿主胚胎内，使宿主胚胎在合适动物中孕育至足月，和在孕育后由其获得XY雌性动物，其中在达到性成熟后该XY雌性动物是能育的。
在一个实施方案中，XY供体细胞是小鼠ES细胞，并且宿主胚胎是来自XX雌性小鼠的胚胎。
在一个实施方案中，供体细胞在其中维持的培养物包含如本文描述的基础培养基，和适合于维持培养中的小鼠ES细胞的一种或多种补充物。在特定实施方案中，适合于维持培养中的小鼠ES细胞的一种或多种补充物是FBS（90mL FBS/0.5L基础培养基）、谷氨酰胺（2.4mmol/0.5L基础培养基）、丙酮酸钠（0.6mmol/0.5L基础培养基）、非必需氨基酸（<0.1mmol/0.5L基础培养基）、2-巯基乙醇、LIF和一种或多种抗生素。
在一个实施方案中，在将供体细胞引入宿主胚胎内之前，将供体细胞维持在具有低盐基础培养基的培养基中至少1、2、3、4、5或6天，或1周，8、9、110、11或12天，2周、3周或4周。在特定实施方案中，在将供体细胞引入宿主胚胎内之前，将供体细胞维持在具有低盐基础培养基的培养基中至少2-4周。
在一个实施方案中，在将供体细胞引入宿主胚胎内之前，将供体细胞维持（例如冷冻）在包含低盐基础培养基的培养基中，并且将供体细胞解冻且维持在包含低盐基础培养基的培养基中至少1、2、3或4或更多天。在特定实施方案中，在引入宿主胚胎内之前，将供体细胞在包含低盐基础培养基的培养基中传代至少一次，将细胞在包含低盐基础培养基的培养基中冷冻，并且将细胞在包含低盐基础培养基的培养基中解冻且生长1、2、3、4、5或6天或更久，或1周，8、9、110、11或12天，2周、3周或4周或更久。
在一个实施方案中，在引入宿主胚胎内之前，将供体细胞维持一、二、三或四天的时期。在一个实施方案中，将供体细胞维持在包含所述基础培养基的培养基中3天的时期。
在一个方面，提供了用于在相同F0代中制备各自完全衍生自供体ES细胞的能育的小鼠交配对的方法，其包括：将供体雄性小鼠XYES细胞维持在如本文描述的包含基础培养基和补充物的培养物中，其中所述ES细胞维持在基础培养基和补充物中至少一天的时期；将ES细胞引入宿主胚胎（例如来自XX小鼠）内以形成嵌合胚；使嵌合胚在合适小鼠中孕育至足月；且由合适小鼠获得一窝小鼠幼崽，其包含完全衍生自供体ES细胞的F0代能育的雄性XY小鼠，且包含完全衍生自供体ES细胞的F0代能育的雌性XY小鼠。
在一个实施方案中，供体ES细胞包含遗传修饰。在一个实施方案中，供体ES细胞包含其为杂合的遗传修饰。在一个实施方案中，供体ES细胞包含杂合的遗传修饰，F0代能育的雄性小鼠和F0代能育的雌性XY小鼠各自对于遗传修饰是杂合的，并且F0代能育的雄性和F0代能育的雌性彼此交配，且产生对于遗传修饰纯合的F1代小鼠的后代。
在一个实施方案中，将ES细胞维持两天、三天或四天或更久的时期。
在一个方面，提供了用于在F0代中制备能育的雌性XY小鼠的方法，其包括步骤（a）在包含基础培养基和适合于维持培养中的小鼠ES细胞的补充物的培养基中维持供体XY小鼠ES细胞，（b）将供体XY小鼠ES细胞引入宿主胚胎内，（c）孕育宿主胚胎，和（d）获得XY雌性小鼠后代，其中在达到性成熟后XY雌性小鼠是能育的。根据这个方面的基础培养基显示选自下述的一种或多种特征：（1）200mOsm/kg至小于329mOsm/kg的摩尔渗透压浓度，（2）约11-13mS/cm的导电性，（3）浓度约50-110mM的碱金属和卤素的盐，（4）约17-30mM的碳酸盐浓度，和（5）约85-130mM的碱金属卤盐和碳酸盐总浓度。
在一个实施方案中，供体XY小鼠ES细胞包含遗传修饰。在一些实施方案中，遗传修饰包含内源核酸序列、一个或多个核酸的取代、内源核酸序列由异源核酸序列的替换、敲除和敲入中的一种或多种。在一个特定实施方案中，遗传修饰是STEAP2基因的敲除。
在一个实施方案中，基础培养基尤其含有（显示）50±5mM NaCl和26±5mM碳酸盐，具有218±22mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在特定实施方案中，基础培养基显示约3mg/mL NaCl和2.2mg/mL碳酸氢钠，具有约218mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。
在另一个实施方案中，基础培养基显示87±5mM NaCl和18±5mM，具有261±26mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在特定实施方案中，基础培养基显示约5.1mg/mL NaCl和1.5mg/mL碳酸氢钠，具有约261mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。
在另一个实施方案中，基础培养基显示110±5mM NaCl和18±5mM碳酸氢钠，具有294±29mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在特定实施方案中，基础培养基显示约6.4mg/mL NaCl和1.5mg/mL碳酸氢钠，具有约294mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。
在另一个实施方案中，基础培养基显示87±5mM NaCl和26±5mM碳酸氢钠，具有约270±27mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在特定实施方案中，基础培养基显示约5.1mg/mL NaCl和2.2mg/mL碳酸氢钠，具有约270mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。
在另一个实施方案中，基础培养基显示87±5mM NaCl、26±5mM碳酸氢钠和86±5mM葡萄糖，具有322±32mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在特定实施方案中，基础培养基显示约5.1mg/mL NaCl、约2.2mg/mL碳酸氢钠和约15.5mg/mL葡萄糖，具有约322mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。
在一个方面，提供了用于在F1代中产生对于遗传修饰纯合的转基因小鼠的方法，其包括步骤（a）使根据前述方法产生的F0 XY能育的雌性小鼠与同期组群F0 XY雄性小鼠杂交，和（b）获得对于遗传修饰是杂合的F1后代小鼠。根据这个方面，F0 XY能育的雌性小鼠和F0 XY雄性小鼠各自对于遗传修饰是杂合的。在一些实施方案中，遗传修饰包含内源核酸序列、一个或多个核酸的取代、内源核酸序列由异源核酸序列的替换、敲除和敲入中的一种或多种。
在一个特定实施方案中，F0 XY能育的雌性小鼠根据前述方法制备，其中基础培养基显示50±5mM NaCl和26±5mM碳酸盐，具有218±22mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在特定实施方案中，基础培养基显示约3mg/mL NaCl和2.2mg/mL碳酸氢钠，具有约218mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。
在一个方面，提供了根据前述方法产生的对于遗传修饰纯合的转基因小鼠。
在一个方面，提供了根据前述方法中的任何产生的能育的雌性XY小鼠。在一个实施方案中，将由其衍生XY雌性小鼠的ES细胞维持在基础培养基中，所述基础培养基显示50±5mM NaCl和26±5mM碳酸钠，具有218±22mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。在特定实施方案中，基础培养基显示约3mg/mL NaCl和2.2mg/mL碳酸钠，具有约218mOsm/kg的摩尔渗透压浓度。
除非明确说明，或由上下文显而易见的，本文描述的任何方面或实施方案可以彼此组合。
附图简述
图1显示使用由不同XY ES细胞克隆制备的F0代雌性XY小鼠的交配结果。
图2显示由ES细胞生成XY雌性小鼠，所述ES细胞与低盐DMEM、DMEM或补充有FS的低盐DMEM（Wnt-3a-条件培养基，即通过由Wnt-3a表达构建体转染的小鼠L细胞条件化的培养基）、NaCl和NaHCO3一起温育。
发明详述
本公开内容中引用的所有出版物在此引入作为参考。
短语“基础培养基”包括本领域已知的基础培养基（例如DMEM），其适合于用于（伴随加入的补充物）生长或维持培养中的ES细胞。适合于制备能育的XY雌性的基础培养基（即，“低盐DMEM”）不同于一般用于将ES细胞维持在培养中的基础培养基。为了一般而言讨论基础培养基的目的，不适合于制备能育的XY雌性的基础培养基在这个部分和下表中（例如一般的DMEM培养基）描述为“DMEM”。为了讨论适合于制备能育的XY雌性的基础培养基的目的，使用短语“低盐DMEM”。在一般用于维持培养中的ES细胞的基础培养基（例如DMEM）和适合于制备能育的XY雌性的基础培养基（例如“低盐DMEM”）之间的差异在本文中连接。短语“低盐DMEM”为了方便使用；用于制备能育的XY雌性的合适DMEM显示不限于“低盐”的特征，还包括本文描述的那些。例如，通过改变如对于本文提供的氯化钠和/或碳酸氢钠浓度，如与表1中所示的DMEM相比较的，其还导致不同的摩尔渗透压浓度和不同的导电性，表1中所示的DMEM可以制备为适合于制备能育的XY雌性的。基础培养基的例子是以多种形式的达尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）（例如InvitrogenDMEM，目录号11971-025）（表1）。合适的低盐DMEM可作为KO-DMEMTM（Invitrogen目录号10829-018）商购获得。当用于维持培养中的细胞用于用作供体细胞时，基础培养基一般补充有本领域已知的许多补充物。此类补充物在本公开内容中指示为“补充物”或“+补充物”。
术语“补充物”或短语“+补充物”包括加入基础培养基用于生长或维持培养中的供体细胞的元素，例如用于维持培养中的供体细胞的多能性或全能性。例如，适合于生长或维持培养中的非人ES细胞的培养基补充物包括胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素和链霉素（例如青霉素-链霉素（penstrep））、丙酮酸盐（例如丙酮酸钠）、非必需氨基酸（例如MEM NEAA）、2-巯基乙醇和LIF。
在用于维持培养中的非人供体细胞的培养基的多个实施方案中，向约500mL基础培养基中加入下述补充物：约90mL FBS（例如Hylcone FBS目录号SH30070.03）、约2.4毫摩尔谷氨酰胺（例如约12mL 200mM谷氨酰胺溶液，例如Invitrogen目录号25030-081）、青霉素:链霉素（例如60,000单位的青霉素G钠和60mg硫酸链霉素，具有约51mg NaCl；例如约6mL Invitrogen青霉素-链霉素，目录号15140-122）、约0.6毫摩尔丙酮酸钠（例如6mL 100mM丙酮酸钠，Invitrogen目录号11360-070）、约0.06毫摩尔非必需氨基酸（例如约6mL MEM NEAA，例如来自Invitrogen目录号11140-050的MEMNEAA）、约1.2mL 2-巯基乙醇、和约1.2微克LIF（例如约120微升106单位/mL LIF制剂；例如约120微升Millipore ESGROTM-LIF，目录号ESG1107）。当组成用于维持XY ES细胞的基础培养基用于制备能育的XY雌性时，一般地采用以约相同量的相同补充物，但基础培养基的组成将不同（于DMEM，例如上表中所述的培养基），并且差异对应于本文教导的差异。
在一些实施方案中，补充物包括Wnt条件化培养基，例如Wnt-3a条件化培养基。
提及供体细胞和/或宿主胚胎的术语“动物”包括哺乳动物、鱼和鸟。哺乳动物包括例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物（例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠）、家畜（例如牛物种，例如母牛、阉牛等；羊物种例如绵羊、山羊等；和猪物种，例如猪和公猪）。鸟包括例如鸡、火鸡、鸵鸟、鹅、鸭等。提及供体细胞和/或宿主胚胎的短语“非人哺乳动物”排除人。
在多个实施方案中，供体细胞和/或宿主胚胎不来自下述中的一种或多种：原鼠属物种（Akodon spp.）、林旅鼠属物种（Myopus spp.）、田鼠属物种（Microtus spp.）、鼹属物种（Talpa spp）。在多个实施方案中，供体细胞和/或宿主胚胎不来自其中正常野生型特征是XY雌性生育力的任何物种。在多个实施方案中，当遗传修饰存在于供体细胞或宿主胚胎中时，遗传修饰不是XYY或XXY、Tdy-阴性性逆转、Tdy-阳性性逆转、X0修饰、非整倍性、SRY易位或修饰、fgf9-/-基因型、或SOX9修饰。
概述
用于由供体ES细胞和宿主胚胎制备非人动物例如小鼠的方法是本领域已知的。供体ES细胞就特定特征加以选择，所述特定特征增强细胞繁殖宿主胚胎的能力，且从而部分或大部分促成由供体ES细胞和宿主胚胎形成的动物。形成的动物可以是雄性或雌性，大部分基于ES细胞的基因型（例如XY或XX）。
用于制备小鼠的大多数ES细胞系具有雄性XY基因型。因为Y染色体在哺乳动物性别决定中的优势，所以当引入宿主胚胎内且孕育时，XY ES细胞几乎总是导致在表型雄性动物中的第一代（F0），其为嵌合体，即含有衍生自雄性供体ES细胞（XY）的细胞和衍生自宿主胚胎的细胞，其可以是雄性（XY）或雌性的（XX）。就在F0代中观察到表型雌性而言，这些一般起于XY ES细胞引入雌性XX胚胎内，这导致其ES细胞贡献不足以雄性化胚胎生殖脊的嵌合体。在大多数情况下，此类雌性嵌合体不产生衍生自XY ES细胞的卵母细胞，且因此不能将ES细胞基因组传递给下一代。在罕见情况下，雌性嵌合体不产生衍生自XY ES细胞的卵母细胞；这些雌性可以将ES细胞基因组传递给下一代（参见例如，Bronson等人（1995）High incidence ofXXY and XYY males among the offspring of female chimeras fromembryonic stem cells，Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:3120-3123）。
具有XY基因型的表型雌性小鼠可以由于特定突变而出现。参见例如，Lovell-Badge等人（1990）XY female mice resulting from aheritable mutation in the primary testis determining gene，Tdy，Development 109:635-646；还参见Colvin等人（2001）Male-to-FemaleSex Reversal in Mice Lacking Fibroblast Growth Factor 9，Cell 104（6）:875-889（在出生时死于肺发育不全的Fgf-/-XY雌性）。啮齿类动物的南美原鼠属物种包含XY雌性（参见例如，Hoekstra等人（2000）Multiple origins of XY female mice（genus Akodon）：phylogenetic and chromosomal evidence，Proc.R.Soc.Lond.B267:1825-1831），但来自此类小鼠的ES细胞系一般是不可用的且并未广泛使用，如果发生的话。
在一些情况下，例如使用
方法（参见例如，美国专利号7,659,442、7,576,259、7,294,754和Poueymirou等人（2007）F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stemcells allowing immediate phenotypic analyses，Nat.Biotech.25（1）:91-99；各自在此引入作为参考），可以获得完全衍生自供体ES细胞的F0代小鼠。在正常情况和标准实验条件下，XY供体ES细胞仅产生表型雄性的完全ES细胞衍生的小鼠，而其为XX或X）（已丧失Y染色体的XY ES细胞）的ES细胞仅产生表型雌性的完全ES细胞衍生的小鼠。为了由雄性和雌性的完全ES细胞衍生的小鼠产生具有纯合靶向突变的小鼠，需要后续两代的交配，以首先产生F1代杂合的雄性和雌性，当互交时，其具有在F2代中产生纯合后代的潜力。
本发明人已设想用于由XY供体细胞（例如衍生自表型雄性小鼠的XY供体细胞）和合适的宿主胚胎制备表型雌性的能育XY小鼠的方法。该方法包括在F0代中制备此类小鼠，这允许在F0代中形成交配对（雄性F0和雌性F0）。当供体细胞包含杂合的遗传修饰，并且需要纯合小鼠时，这是特别有用的。尽管本公开内容在由供体小鼠XYES细胞制备表型雌性的能育XY小鼠的背景中举例说明本发明，但本文描述的方法和组合物可以应用于由任何合适的非人细胞（例如iPS细胞、ES细胞或多能细胞）和任何合适的非人胚胎制备表型雌性的XY能育的非人动物。
描述了包括用于维持供体细胞的条件的方法和组合物，从而使得当通过将供体细胞引入宿主胚胎内，供体细胞用于生成动物时，如此生成的动物包括表型雌性的能育XY动物。表型雌性的能育XY动物包括显示足够的表型雌性特征的动物，以排卵且在通过动物中的排卵产生的卵子受精后孕育胚胎，包括将胚胎孕育至足月，且生育活产动物。
本发明人已设想在多个实施方案中至少约10%、15%、20%或25%或更多倍导致由XY小鼠ES细胞出生能育的雌性XY小鼠的方法。
畜牧业
在一个方面，提供了用于由精细胞和卵细胞生成雌性动物的方法，其包括在受精前将精细胞和/或卵细胞维持在包含低盐基础培养基的培养基中一、二、三或四天或更多天，使精细胞和卵细胞在允许受精的条件下接触以形成受精卵，将受精卵植入合适的宿主中用于孕育，在宿主中孕育，且获得包含雌性动物的一窝动物。
在一个实施方案中，在植入合适的宿主中之前，受精卵进一步在包含低盐基础培养基的培养基中维持一、二、三或四天或更多天。
在一个方面，提供了用于支持由受精卵或胚胎生成雌性动物的方法，其包括在植入合适的宿主中之前，将受精卵或胚胎在包含低盐基础培养基的培养基中维持一、二、三或四天或更多天，将受精卵或胚胎植入合适的宿主中用于孕育，在宿主中孕育受精卵或胚胎，且获得包含雌性动物的一窝动物。
在一个方面，本发明的方法或组合物用于制备雌性宠物、雌性驯养农场动物、作为科学研究受试者的雌性动物、或濒临灭绝的物种的动物。在一个实施方案中，动物是小鼠、大鼠、仓鼠、猴、猿、猫、犬、母牛、马、公牛、绵羊、山羊、猪、鹿和野牛。
实施例
实施例1：供体XY ES细胞和宿主胚胎
供体细胞和宿主胚胎。供体ES细胞是129S6C57Bl6/F1杂种ES细胞。供体ES细胞在含有10%DMSO的冷冻培养基中冷冻直至使用时。解冻后，将供体ES细胞维持在如下所述的基础培养基和补充物中。宿主胚胎来自Swiss Webster（SW）小鼠，且维持在KSOM培养基（Millipore）中直至使用时。如先前所述获得八-细胞胚（Poueymirou等人（2007）Nature Biotech.25（1）:91-99；美国专利号7,659,442、7.576,259和7,294,754）。
DMEM ES细胞：在DMEM制备且冷冻的ES细胞在DMEM中解冻，生长三天，且显微注射到在DMEM中的宿主胚胎内。
低盐DMEM ES细胞：在低盐DMEM制备且冷冻的ES细胞在低盐DMEM（KO-DMEM）中解冻，生长三天，且显微注射到在DMEM中的宿主胚胎内。
FS低盐DMEM：在低盐DMEM制备且冷冻的ES细胞在低盐DMEM（440mL）+10%Wnt-3a条件化培养基（FS）（60mL）中解冻且维持，且显微注射到在DMEM中的宿主胚胎内。
低盐DMEM+NaCl+NaHCO3：ES细胞在具有NaCl（1,300mg/L）和NaHCO3（1,500mg/L）添加的低盐DMEM中制备且冷冻，且显微注射到在DMEM中的宿主胚胎内。
10%Wnt-3a条件化培养基（FS）：由用Wnt-3a表达载体（ATCCCRL-2647）转化的小鼠L细胞的培养物制备Wnt-3a条件化培养基。L细胞根据ATCC说明（除了使用KO-DMEMTM代替DMEM外）在FibraStageTM（New Brunswick）系统中生长。
实施例2：制备衍生自供体ES细胞的F0代小鼠
生成F0代小鼠。如先前所述（Poueymirou等人（2007）NatureBiotech.25（1）:91-99；美国专利号7,659,442、7.576,259和7,294,754），使用
方法将供体ES细胞引入8-细胞期桑椹胚前宿主胚胎内，除了将小鼠ES细胞维持在如本文描述的基础培养基加上补充物中。对于显微注射，使ES细胞生长且显微注射到胚胎内，并且在植入代孕母亲内之前，将胚胎在KSOM或DMEM培养基中培养过夜。
实施例3：来自XY ES细胞的F0代能育的雌性小鼠
在一般方案中，在KO-DMEMTM的存在下将ES细胞解冻且生长用于一次传代（约5五天）。随后将传代细胞与基因靶向载体一起电穿孔，且随后在包含KO-DMEMTM（Invitrogen目录号10829-018）的培养基中置于选择下10天。收获药物抗性细胞且在包含KO-DMEMTM的培养基中扩增，随后冷冻。对于显微注射，将细胞在KO-DMEMTM中解冻且在KO-DMEMTM中生长3天，随后显微注射到在DMEM中的胚胎内。随后将胚胎引入代孕母亲内用于孕育。
小鼠幼崽最初基于外生殖器的外观表征为雄性或雌性，以便选择交配对。
图1显示F0 XY雌性显示高比率的生育力。33个F0 XY雌性中的二十一个产生一窝动物。
实施例4：比较DMEM与低盐DMEM
摩尔渗透压浓度在
型号3250 Single-Sample渗压计上进行测量。导电性在Mettler Toledo GmbH SevenMultiTM ECN #15055电导计上进行测量。
研究低盐DMEM和DMEM（各自具有补充物）对由XY ES细胞形成F0代XY雌性的作用。表2显示含和不含另外的盐和/或补充物的基础培养基的摩尔渗透压浓度和导电性值。指示物“+补充物”=下述的添加（向0.5L基础培养基中）：90mL Hyclone FBS（目录号SH30070.03）、12mL Invitrogen谷氨酰胺溶液（目录号25030-081）、6mL Invitrogen Pen Strep（目录号15140-122）、6mL Invitrogen丙酮酸钠（目录号11360-070）、6mL MEM NEAA（Invitrogen目录号11140-050）、1.2mL 2-巯基乙醇和120微升MilliporeESGROTM-LIF（目录号ESG1107）。
图2显示在显微注射到宿主胚胎内之前，在不同培养基中生长的XY ES细胞的比较。XY ES细胞在低盐DMEM中生长且维持且随后注射到胚胎内，产生XY雌性。XY ES细胞在补充有NaCl和NaHCO3的低盐DMEM中生长且维持且随后注射到胚胎内，不产生XY雌性。这证实当XY ES细胞在低盐DMEM中维持时，促进XY雌性产生，并且通过改变基础培养基的盐浓度可以控制XY ES细胞的性别比。将Wnt-3a条件化培养基（10%FS）加入低盐DMEM中增加F0 XY雌性产生的频率。
此外，当ES细胞维持在低盐DMEM中时，在F0中生成ES细胞衍生的小鼠的效率增加。ES细胞衍生的幼崽与在F0代中生成的总幼崽的比从在DMEM中维持的ES细胞的约23%增加到在低盐DMEM中维持的ES细胞的61%，到在补充有10%Wnt-3a条件化培养基的低盐DMEM中维持的ES细胞的72%。参见图2。
实施例5：F0代小鼠的分析
毛色。就来自供体XY ES细胞（刺豚鼠皮毛上的深浅环纹（agouti））和宿主胚胎（白色）的毛色贡献分析小鼠。F0代小鼠无一显示来自宿主胚胎的任何毛色贡献。
性别。F0代幼崽通过外生殖器的目视检查鉴定为雌性或雄性。F0幼崽基于目视检查指定性别且配对用于交配。
基因分型。使用对于X染色体上的序列特异性的TAQMANTMQPCR测定法检测X染色体的存在。使用对于Y染色体上的序列特异性的TAQMANTM QPCR测定法检测Y染色体的存在。表型雌性F0代小鼠的基因分型指出在测试的那些表型雌性小鼠中X染色体的单个拷贝和Y染色体的单个拷贝。
核型分型。将六个F0代XY雌性进行核型分型。核型分型结果指出所有6个都具有正常X和正常Y染色体。
XY雌性生殖解剖学。就内部生殖器官检查几个F0代XY雌性。检查的所有F0 XY雌性看起来都具有正常雌性内部生殖器官。来自每个生殖器官（卵巢、输卵管、子宫）的组织样品进行基因分型，并且结果指出组织具有一致的XY基因型。
实施例6：摩尔渗透压浓度对生成ES细胞衍生的幼崽和XY雌性的效率的作用分析
为了测定摩尔渗透压浓度对由维持在低盐、低碳酸盐DMEM中的XY ES细胞生成XY雌性的作用，将葡萄糖加入低盐、低碳酸盐DMEM中，以使摩尔渗透压浓度达到在DMEM内的那种。摩尔渗透压浓度在型号3250 Single-Sample渗压计上进行测量。
将供体XY ES细胞维持在尤其含有5.1mg/ml NaCl、2.2mg/mlNaHCO3和15.5mg/ml葡萄糖，具有322mOsm/kg的摩尔渗透压浓度的低盐、低碳酸盐、高葡萄糖DMEM（“DMEM-LS/LC/HG”）中。在根据
方法（同上）将所述ES细胞转移到胚胎内之后，所有所得到的ES细胞衍生的F0后代的15%是表型雌性的XY小鼠。作为阴性对照，在F0代中，无表型雌性的XY小鼠衍生自维持在DMEM（“DMEM”：6.4mg/ml NaCl、3.7mg/ml NaHCO3和4.5mg/ml葡萄糖；329mOsm/kg）中的ES细胞。这个15%F0 XY雌性结果在来自DMEM衍生的ES细胞（329mOsm/L）的0%F0 XY雌性和衍生自维持在低盐、低碳酸盐DMEM（“DMEM-LS/LC”：5.1mg/ml NaCl、2.2mg/ml NaHCO3和4.5mg/ml葡萄糖；270mOsm/kg）中的ES细胞的27.8%F0 XY雌性小鼠之间。因此，一个解释是摩尔渗透压浓度提供一些但并非全部雌性化效应。备选解释是低盐和/或低碳酸盐提供雌性化效应，并且高葡萄糖在一定程度上阻碍XY ES细胞的雌性化。参见表3。
此外，当ES细胞维持在DMEM-LS/LC/HG中时，在F0中生成ES细胞衍生的小鼠的效率（表3）（即，约40%）大于维持在DMEM中的ES细胞的那种（即，约22%），但不如维持在DMEM-LS/LC中的ES细胞的那种（即，约51%）那么高。参见表3。
实施例7：盐浓度对生成ES细胞衍生的幼崽和XY雌性的效率的作用分析
为了测定盐浓度或离子强度对由XY ES细胞生成XY雌性的作用，将ES细胞维持在极低盐（DMEM-VLS/LC：3.0mg/mL NaCl、2.2mg/mL NaHCO3、4.5mg/mL葡萄糖，以218mOsm/kg）中。在根据
方法（同上）将所述ES细胞转移到胚胎内之后，所有所得到的ES细胞衍生的F0后代的34%是表型雌性的XY小鼠；略微增加超过27.8%的DMEM-LS/LC对照水平。有趣的是，起因于维持在DMEM-VLS/LC培养基中的ES细胞转移的91.4%F0幼崽是ES细胞衍生的；而仅50.7%和22.4%是分别在DMEM-LS/LC和DMEM对照中衍生的ES细胞。
在另一个实验中，将ES细胞维持在高盐和低碳酸盐培养基（DMEM-HS/VLC：6.4mg/mL NaCl、1.5mg/mL NaHCO3、4.5mg/mL葡萄糖，以294mOsm/kg）中。在根据方法（同上）将所述ES细胞转移到胚胎内之后，所有所得到的ES细胞衍生的F0后代的28.6%是表型雌性的XY小鼠；略微增加超过27.8%的DMEM-LS/LC对照水平。有趣的是，起因于维持在DMEM-HS/VLC培养基中的ES细胞转移的72.1%F0幼崽是ES细胞衍生的；而仅50.7%和22.4%是分别在DMEM-LS/LC和DMEM对照中衍生的ES细胞。
这些结果证实低盐和/或低碳酸盐都促成ES细胞衍生的F0后代比例以及F0 XY雌性中的增加。（参见表3。）
实施例8：碳酸盐浓度对生成ES细胞衍生的幼崽和XY雌性的效率的作用分析
为了测定碳酸盐浓度对由XY ES细胞生成XY雌性的作用，将ES细胞维持在低盐和极低碳酸盐培养基（DMEM-LS/VLC：5.1mg/mL NaCl、1.5mg/mL NaHCO3、4.5mg/mL葡萄糖，以261mOsm/kg）中。在根据方法（同上）将所述ES细胞转移到胚胎内之后，所有所得到的ES细胞衍生的F0后代的34%是表型雌性的XY小鼠；略微增加超过27.8%的DMEM-LS/LC对照水平。有趣的是，起因于维持在DMEM-LS/VLC培养基中的ES细胞转移的87.7%F0幼崽是ES细胞衍生的；而仅50.7%和22.4%是分别在DMEM-LS/LC和DMEM对照中衍生的ES细胞。
这些结果证实低碳酸盐促成ES细胞衍生的F0后代比例以及F0XY雌性中的增加。（参见表3。）
实施例9：F0 XY雌性小鼠的表型
与相同品系的F1 XX表型雌性小鼠相比较，F0 XY表型雌性小鼠显示相对正常的表型属性。然而，XY雌性小鼠的确显示对于每个物理参数更大范围的值。成年XY雌性的体重范围为约15克到约30克，具有约21.5克的平均值。成年XX雌性的体重范围为约16克到约17克，具有约16.8克的平均值。
测定在肛门和生殖器之间的距离比且计算为体质量的比（肛门与生殖器的距离（cm）/体质量（g））。关于F0 XY雌性的比范围为约0.11cm/g到约0.24cm/g，具有约0.16cm/g的平均值。关于F1 XX雌性的比范围为约0.17cm/g到约0.19cm/g，具有约0.18cm/g的平均值。
在关于XY雌性小鼠和XX雌性小鼠的多个器官（例如肝、肾、心与肺、和脾）的相对质量之间不存在显著差异。相对质量表示为器官质量（mg）/体质量（g）。F0 XO雌性的肝的相对质量范围为约35mg/g到约50mg/g，具有约42mg/g的平均值。F1 XX雌性的肝的相对质量范围为约37.5mg/g到约46.9mg/g，具有约42.5mg/g的平均值。F0 XO雌性的肾的相对质量范围为约11.5mg/g到约15mg/g，具有约13.4mg/g的平均值。F1 XX雌性的肾的相对质量范围为约12.6mg/g到约13.8mg/g，具有约13.7mg/g的平均值。F0 XO雌性的心与肺的相对合并质量范围为约14.3mg/g到约18.9mg/g，具有约16.1mg/g的平均值。F1 XX雌性的心与肺的相对合并质量范围为约14.7mg/g到约16.1mg/g，具有约15.9mg/g的平均值。F0 XO雌性的脾的相对质量范围为约2.7mg/g到约6.6mg/g，具有约3.3mg/g的平均值。F1 XX雌性的脾的相对质量范围为约2.7mg/g到约4.0mg/g，具有约3.8mg/g的平均值。
与同基因的F1 XX雌性相比较，F0 XY雌性小鼠显示具有相对正常的电解质、酶、葡萄糖、蛋白质、脂质和其他标记的血清水平。然而，XY雌性小鼠的确显示对于每种测量的血清参数更大范围的值。成年XY雌性的血清钠水平范围为约150mEq/L到约159mEq/L；并且关于XX雌性的水平范围为约148mEq/L到约155mEq/L。
成年XY雌性的血清钾水平范围为约0.7mEq/L到约7mEq/L；并且关于XX雌性的水平为约0.7mEq/L。
成年XY雌性的血清氯化物水平范围为约111mEq/L到约121mEq/L；并且关于XX雌性的水平范围为约113mEq/L到约120mEq/L。
成年XY雌性的血清钙水平范围为约7mEq/L到约9mEq/L；并且关于XX雌性的水平为约7mEq/L。
成年XY雌性的血清碱性磷酸酶水平范围为约124U/L到约285U/L；并且关于XX雌性的水平范围为约191U/L到约236U/L。
成年XY雌性的血清丙氨酸氨基转移酶水平范围为约21U/L到约285U/L；并且关于XX雌性的水平范围为约13U/L到约34U/L。
成年XY雌性的血清天冬氨酸氨基转移酶水平范围为约42U/L到约190U/L；并且关于XX雌性的水平范围为约42U/L到约269U/L。
成年XY雌性的血清脂肪酶水平范围为约16U/L到约49U/L；并且关于XX雌性的水平范围为约21U/L到约26U/L。
成年XY雌性的血清葡萄糖水平范围为约227mg/dL到约319mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约255mg/dL到约270mg/dL。
成年XY雌性的总血清蛋白质水平范围为约4.6mg/dL到约5.2mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约4.6mg/dL到约4.8mg/dL。
成年XY雌性的血清白蛋白水平范围为约3mg/dL到约3.5mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约3.1mg/dL到约3.2mg/dL。
成年XY雌性的血清胆固醇（总）水平范围为约58mg/dL到约108mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约61mg/dL到约85mg/dL。
成年XY雌性的血清甘油三酯水平范围为约42mg/dL到约89mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约39mg/dL到约48mg/dL。
成年XY雌性的血清HDL水平范围为约29mg/dL到约57mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约23mg/dL到约42mg/dL。
成年XY雌性的血清LDL水平范围为约3.7mg/dL到约11mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约3.7mg/dL到约13mg/dL。
成年XY雌性的血尿素氮（BUN）水平范围为约12mg/dL到约27mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约18mg/dL到约21mg/dL。
成年XY雌性的血清镁水平范围为约1.6mg/dL到约3.2mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约2.1mg/dL。
成年XY雌性的血清无机磷酸盐水平范围为约5.1mg/dL到约10mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约7.2mg/dL到约8.4mg/dL。
成年XY雌性的血清尿酸水平范围为约0.9mg/dL到约3.5mg/dL；并且关于XX雌性的水平范围为约0.7mg/dL到约2.2mg/dL。
实施例10：在F1代中纯合的遗传修饰的小鼠的产生
为了测定是否可以制备对于遗传修饰纯合的F1小鼠，使含有STEAP2基因的至少一个敲除的等位基因的F0 XY雌性小鼠与含有相同STEAP2基因敲除的XY雄性同期组群配对。（STEAP2（六次跨膜的前列腺上皮抗原2）基因编码具有铁还原酶和铜还原酶活性的假定的6膜金属还原酶，并且已显示在体外刺激铁和铜的细胞摄取。作为细胞表面抗原，STEAP2是前列腺癌中的潜在诊断或治疗靶。STEAP2在未处理的原发性和激素难治性前列腺癌中都显著高于良性前列腺增生中，暗示它可能涉及前列腺癌的发展。STEAP2 KO小鼠仍未得到报道。参见Ohgami等人，BLOOD，第108卷（4）:1388-1394，2006.）结果在表4中描述。
Claims (20)
1.一种用于在F0代中制备能育的雌性XY小鼠的方法，其包括：
（a）在包含下述的培养基中维持供体XY小鼠ES细胞
（i）基础培养基，和
（ii）适合于维持培养中的小鼠ES细胞的补充物，
其中所述基础培养基显示出选自下述的特征：200mOsm/kg-小于329mOsm/kg的摩尔渗透压浓度、约11-13mS/cm的导电性、浓度约50-110mM的碱金属和卤素的盐、约17-30mM的碳酸盐浓度、约85-130mM的碱金属卤盐和碳酸盐总浓度、和其中任何两种或多种的组合；
（b）将所述供体XY小鼠ES细胞引入宿主胚胎内；
（c）孕育所述宿主胚胎；和
（d）获得XY雌性小鼠后代，其中在达到性成熟后，所述XY雌性小鼠是能育的。
2.权利要求1的方法，其中所述供体XY小鼠ES细胞包含遗传修饰。
3.权利要求2的方法，其中所述遗传修饰包含内源核酸序列、一个或多个核酸的取代、内源核酸序列由异源核酸序列的替换、敲除和敲入中的一种或多种。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述遗传修饰是STEAP2基因的敲除。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述基础培养基显示50±5mM NaCl、26±5mM碳酸盐和218±22mOsm/kg。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述基础培养基显示约3mg/mL NaCl、2.2mg/mL碳酸氢钠和218mOsm/kg。
7.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述基础培养基显示87±5mM NaCl、18±5mM碳酸盐和261±26mOsm/kg。
8.权利要求1-4和7中任一项的方法，其中所述基础培养基显示约5.1mg/mL NaCl、1.5mg/mL碳酸氢钠和261mOsm/kg。
9.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述基础培养基显示110±5mM NaCl、18±5mM碳酸盐和294±29mOsm/kg。
10.权利要求1-4和9中任一项的方法，其中所述基础培养基显示约6.4mg/mL NaCl、1.5mg/mL碳酸氢钠和294mOsm/kg。
11.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述基础培养基显示87±5mM NaCl、26±5mM碳酸盐和270±27mOsm/kg。
12.权利要求1-4和11中任一项的方法，其中所述基础培养基显示约5.1mg/mL NaCl、2.2mg/mL碳酸氢钠和270mOsm/kg。
13.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述基础培养基显示87±5mM NaCl、26±5mM碳酸盐、86±5mM葡萄糖和322±32mOsm/kg。
14.权利要求1-4和13中任一项的方法，其中所述基础培养基显示约5.1mg/mL NaCl、2.2mg/mL碳酸氢钠、15.5mg/mL葡萄糖和322mOsm/kg。
15.一种在F1代中产生对于遗传修饰纯合的转基因小鼠的方法，其包括使权利要求1-14中任一项的F0 XY能育的雌性小鼠与同期组群F0 XY雄性小鼠杂交，其中所述F0 XY能育的雌性小鼠和F0 XY雄性小鼠各自对于所述遗传修饰是杂合的，且获得对于所述遗传修饰是杂合的F1后代小鼠。
16.权利要求15的方法，其中所述遗传修饰包含内源核酸序列、一个或多个核酸的取代、内源核酸序列由异源核酸序列的替换、敲除和敲入中的一种或多种。
17.权利要求16的方法，其中所述F0 XY能育的雌性小鼠根据权利要求6制备。
18.一种对于遗传修饰纯合的转基因小鼠，其根据权利要求15-17中任一项产生。
19.一种能育的雌性XY小鼠，其根据权利要求1-14中任一项产生。
20.权利要求19的能育的雌性XY小鼠，其中所述基础培养基显示50±5mM NaCl、26±5mM碳酸盐和218±22mOsm/kg。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510101534.8A CN104711218B (zh) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35389610P | 2010-06-11 | 2010-06-11 | |
| US61/353,896 | 2010-06-11 | ||
| PCT/US2011/039997 WO2011156723A1 (en) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | Production of fertile xy female animals from xy es cells |
| US13/157,728 | 2011-06-10 | ||
| US13/157,728 US9149026B2 (en) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | Production of fertile XY animals from XY ES cells |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510101534.8A Division CN104711218B (zh) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102933074A true CN102933074A (zh) | 2013-02-13 |
| CN102933074B CN102933074B (zh) | 2015-04-08 |
Family
ID=45097380
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510101534.8A Active CN104711218B (zh) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 |
| CN201180028717.1A Active CN102933074B (zh) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510101534.8A Active CN104711218B (zh) | 2010-06-11 | 2011-06-10 | 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US9149026B2 (zh) |
| EP (1) | EP2579711B1 (zh) |
| JP (3) | JP2013528062A (zh) |
| CN (2) | CN104711218B (zh) |
| AU (1) | AU2011265306C1 (zh) |
| CA (1) | CA2800534C (zh) |
| CY (1) | CY1121955T1 (zh) |
| DK (1) | DK2579711T3 (zh) |
| ES (1) | ES2727738T3 (zh) |
| HK (1) | HK1211621A1 (zh) |
| MY (2) | MY172702A (zh) |
| PL (1) | PL2579711T3 (zh) |
| PT (1) | PT2579711T (zh) |
| SG (1) | SG185703A1 (zh) |
| WO (1) | WO2011156723A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107002042A (zh) * | 2014-10-15 | 2017-08-01 | 瑞泽恩制药公司 | 用于产生或维持多能细胞的方法和组合物 |
| CN107002093A (zh) * | 2014-06-26 | 2017-08-01 | 瑞泽恩制药公司 | 用于靶向遗传修饰的方法和组合物，以及这些组合物的使用方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104711218B (zh) | 2010-06-11 | 2018-09-25 | 瑞泽恩制药公司 | 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 |
| ES2683071T3 (es) | 2012-04-25 | 2018-09-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Direccionamiento mediado por nucleasas con grandes vectores de direccionamiento |
| RS62263B1 (sr) | 2013-04-16 | 2021-09-30 | Regeneron Pharma | Ciljana modifikacija genoma pacova |
| RU2725520C2 (ru) | 2013-12-11 | 2020-07-02 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Способы и композиции для направленной модификации генома |
| EP3708671A1 (en) | 2014-06-06 | 2020-09-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for modifying a targeted locus |
| SI3221457T1 (sl) | 2014-11-21 | 2019-08-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Postopki in sestavki za ciljno genetsko modifikacijo z uporabo vodilnih RNK v parih |
| WO2016100819A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting |
| CA2998642C (en) * | 2015-09-17 | 2023-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Selection of pluripotent cells for production of fertile xy female mice |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1217746A (zh) * | 1996-04-29 | 1999-05-26 | 勒芬研究与发展公司 | 多能性兔胚胎干(es)细胞系及其在嵌合兔的产生中的应用 |
| CN1423522A (zh) * | 1999-12-20 | 2003-06-11 | 安东尼·C·F·佩里 | 从培养细胞产生克隆胚胎和成年动物的方法 |
| EP1516924A1 (en) * | 2003-09-17 | 2005-03-23 | Fundacion IVI para el Estudio de la reproduccion Humana (FIVIER) | Generation of human embryonic stem cells from triploid zygotes |
| CN1649489A (zh) * | 2002-02-27 | 2005-08-03 | 长尾恭光 | 一种制备种系嵌合动物的方法 |
| CN101506354A (zh) * | 2006-08-09 | 2009-08-12 | 维涡里斯公司 | 用胚胎干细胞制备转基因禽类的方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| GB0031744D0 (en) | 2000-12-28 | 2001-02-07 | Pig Improvement Co Uk Ltd | Methods |
| JP2004248505A (ja) * | 2001-09-21 | 2004-09-09 | Norio Nakatsuji | 移植抗原の一部または全てを欠除したｅｓ細胞由来の未分化な体細胞融合細胞およびその製造 |
| AU2003210405A1 (en) * | 2002-03-05 | 2003-09-16 | Artemis Pharmaceuticals Gmbh | Inbred embryonic stem-cell derived mice |
| WO2005090557A1 (ja) | 2004-03-23 | 2005-09-29 | Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. | 多能性幹細胞の増殖方法 |
| ES2463476T3 (es) | 2004-10-19 | 2014-05-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética |
| JP4595896B2 (ja) | 2006-07-14 | 2010-12-08 | パナソニック電工株式会社 | 静電霧化装置 |
| GB0623635D0 (en) * | 2006-11-27 | 2007-01-03 | Stem Cell Sciences Uk Ltd | Pluripotent cell growth media |
| US10913929B2 (en) | 2009-10-13 | 2021-02-09 | Stemcell Technologies Inc. | Method of differentiating stem cells |
| CN104711218B (zh) | 2010-06-11 | 2018-09-25 | 瑞泽恩制药公司 | 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| US9902971B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-02-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for producing a mouse XY embryonic (ES) cell line capable of producing a fertile XY female mouse in an F0 generation |
| ES2741387T3 (es) | 2014-10-15 | 2020-02-10 | Regeneron Pharma | Métodos y composiciones para generar o mantener células pluripotentes |
-
2011
- 2011-06-10 CN CN201510101534.8A patent/CN104711218B/zh active Active
- 2011-06-10 PL PL11729215T patent/PL2579711T3/pl unknown
- 2011-06-10 JP JP2013514391A patent/JP2013528062A/ja not_active Withdrawn
- 2011-06-10 CA CA2800534A patent/CA2800534C/en active Active
- 2011-06-10 SG SG2012085916A patent/SG185703A1/en unknown
- 2011-06-10 EP EP11729215.1A patent/EP2579711B1/en active Active
- 2011-06-10 AU AU2011265306A patent/AU2011265306C1/en active Active
- 2011-06-10 MY MYPI2012005043A patent/MY172702A/en unknown
- 2011-06-10 ES ES11729215T patent/ES2727738T3/es active Active
- 2011-06-10 PT PT11729215T patent/PT2579711T/pt unknown
- 2011-06-10 WO PCT/US2011/039997 patent/WO2011156723A1/en active Application Filing
- 2011-06-10 DK DK11729215.1T patent/DK2579711T3/da active
- 2011-06-10 MY MYPI2018702421A patent/MY191870A/en unknown
- 2011-06-10 CN CN201180028717.1A patent/CN102933074B/zh active Active
- 2011-06-10 US US13/157,728 patent/US9149026B2/en active Active
-
2014
- 2014-11-11 US US14/538,209 patent/US9398762B2/en active Active
-
2015
- 2015-12-17 HK HK15112450.1A patent/HK1211621A1/zh unknown
-
2016
- 2016-06-22 US US15/189,767 patent/US9655351B2/en active Active
- 2016-07-29 JP JP2016149597A patent/JP6310968B2/ja active Active
- 2016-07-29 JP JP2016149598A patent/JP6310969B2/ja active Active
-
2017
- 2017-04-12 US US15/486,210 patent/US9885058B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-21 CY CY20191100649T patent/CY1121955T1/el unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1217746A (zh) * | 1996-04-29 | 1999-05-26 | 勒芬研究与发展公司 | 多能性兔胚胎干(es)细胞系及其在嵌合兔的产生中的应用 |
| CN1423522A (zh) * | 1999-12-20 | 2003-06-11 | 安东尼·C·F·佩里 | 从培养细胞产生克隆胚胎和成年动物的方法 |
| CN1649489A (zh) * | 2002-02-27 | 2005-08-03 | 长尾恭光 | 一种制备种系嵌合动物的方法 |
| EP1516924A1 (en) * | 2003-09-17 | 2005-03-23 | Fundacion IVI para el Estudio de la reproduccion Humana (FIVIER) | Generation of human embryonic stem cells from triploid zygotes |
| CN101506354A (zh) * | 2006-08-09 | 2009-08-12 | 维涡里斯公司 | 用胚胎干细胞制备转基因禽类的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JINSONG LI,ETC.: "Non-equivalence of cloned and clonal mice.", 《CURRENT BIOLOGY》 * |
| ROBIN LOVELL-BADGE AND ELIZABETH ROBERTSON: "XY female mice resulting from a heritable mutation in the primary testis-determining gene,Tdy.", 《DEVELOPMENT》 * |
| 宋震涛等: "从早期胚胎多能干细胞生成的嵌合鼠", 《遗传学报》 * |
| 童英等: "具高效种系嵌合能力的C57BL/6J小鼠ES细胞系的建立", 《遗传学报》 * |
| 陈伟胜等: "小鼠ES细胞种系嵌合体的获得", 《遗传学报》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107002093A (zh) * | 2014-06-26 | 2017-08-01 | 瑞泽恩制药公司 | 用于靶向遗传修饰的方法和组合物，以及这些组合物的使用方法 |
| CN113322277A (zh) * | 2014-06-26 | 2021-08-31 | 瑞泽恩制药公司 | 用于靶向遗传修饰的方法和组合物，以及这些组合物的使用方法 |
| CN107002042A (zh) * | 2014-10-15 | 2017-08-01 | 瑞泽恩制药公司 | 用于产生或维持多能细胞的方法和组合物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104711218A (zh) | 2015-06-17 |
| DK2579711T3 (da) | 2019-06-17 |
| WO2011156723A1 (en) | 2011-12-15 |
| EP2579711B1 (en) | 2019-04-17 |
| MY172702A (en) | 2019-12-10 |
| US9885058B2 (en) | 2018-02-06 |
| US20110307968A1 (en) | 2011-12-15 |
| PT2579711T (pt) | 2019-06-11 |
| US20160295841A1 (en) | 2016-10-13 |
| SG185703A1 (en) | 2013-01-30 |
| AU2011265306A1 (en) | 2012-12-20 |
| CA2800534A1 (en) | 2011-12-15 |
| JP6310969B2 (ja) | 2018-04-11 |
| CN104711218B (zh) | 2018-09-25 |
| CN102933074B (zh) | 2015-04-08 |
| US9655351B2 (en) | 2017-05-23 |
| ES2727738T3 (es) | 2019-10-18 |
| US20150067901A1 (en) | 2015-03-05 |
| JP2013528062A (ja) | 2013-07-08 |
| MY191870A (en) | 2022-07-18 |
| JP2016185168A (ja) | 2016-10-27 |
| JP6310968B2 (ja) | 2018-04-11 |
| US20170218399A1 (en) | 2017-08-03 |
| US9149026B2 (en) | 2015-10-06 |
| EP2579711A1 (en) | 2013-04-17 |
| PL2579711T3 (pl) | 2019-09-30 |
| HK1211621A1 (zh) | 2016-05-27 |
| US9398762B2 (en) | 2016-07-26 |
| AU2011265306B2 (en) | 2014-08-07 |
| JP2016185167A (ja) | 2016-10-27 |
| CA2800534C (en) | 2019-01-22 |
| AU2011265306C1 (en) | 2015-01-22 |
| CY1121955T1 (el) | 2020-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102933074B (zh) | 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 | |
| US12041918B2 (en) | Production of fertile XY female animals by silencing of genes on the Y chromosome | |
| US20180103619A1 (en) | Disease model pig exhibiting stable phenotype, and production method thereof | |
| AU2013204021B2 (en) | Production of fertile xy female animals from xy es cells | |
| Kuno et al. | Generation of fertile and fecund F0 XY female mice from XY ES cells | |
| NZ740899B2 (en) | Selection of pluripotent cells for production of fertile xy female mice |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |