CN107002042A - 用于产生或维持多能细胞的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于在培养物中产生或维持人iPS细胞的方法和组合物。方法包括使用低渗透压培养基来制备人iPS细胞,或使用低渗透压培养基来维持人iPS细胞。还包括用于对在低渗透压培养基中培养的人iPS细胞进行靶向遗传修饰的方法。组合物包括使用本文定义的低渗透压培养基培养和维持的人iPS细胞。
Description
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背景技术
人诱导的多能干细胞(iPS)细胞可表现出原始态( state)或始发态(Primedstate)的多能性(Nichols and Smith,Cell Stem Cell(2009)Vol.4(6),pp.487-492(Nichols和Smith,《细胞·干细胞》,2009年,第4卷第6期,第487-492页))。始发态人iPS细胞表达与植入后的外胚层细胞相似的特征,并且参与谱系特化和分化。相比之下,原始态人iPS细胞表达与植入前胚胎的内细胞团的胚胎干(ES)细胞相似的特征。在一些方面,原始态iPS细胞比始发态细胞更具多能性,因为它们不参与谱系特化。可以使用各种培养条件来将人iPS维持在原始态或始发态。
发明内容
提供了用于制备人诱导多能干细胞(hiPSC)的方法。此类方法包括在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中体外培养被转化以表达多能性状态的非多能细胞群体,其中所述低渗透压培养基包含:(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和(c)MEK抑制剂;其中该培养基的渗透压为约175mOsm/kg至约280mOsm/kg。此类方法还包括在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中体外培养被转化以表达多能性状态的非多能细胞群体,其中所述低渗透压培养基包含:(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和(c)MEK抑制剂;其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
还提供了一种用于在体外培养物中维持hiPSC群体的方法,所述方法包括:在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养hiPSC群体,其中低渗透压培养基包含:(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和(c)MEK抑制剂;其中该培养基的渗透压为约175mOsm/kg至约280mOsm/kg。此类方法还可包括在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养hiPSC群体,其中低渗透压培养基包含:(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和(c)MEK抑制剂;其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
在一些方法中,hiPSC包含原始态或原始样态的hiPSC。在一些方法中,hiPSC包括类原始态的hiPSC。
在一些方法中,所述方法富集了原始态或原始样态hiPSC的群体。在一些方法中,所述方法富集了类原始态hiPSC的群体。
在一些方法中,转化细胞表达包括Oct4、Sox2、Klf4、Myc或它们的任何组合的重编程基因。在一些方法中,转化细胞包括始发态的hiPSC。
在一些方法中,基础培养基的渗透压为约200mOsm/kg。在一些方法中,基础培养基包含约3mg/ml的NaCl、约2.2mg/ml的碳酸氢钠,并且渗透压为约200mOsm/kg。
在一些方法中,基础培养基包含约4.5mg/mL的葡萄糖。
在一些方法中,低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。在一些方法中,低渗透压培养基的渗透压为约233mOsm/kg。
在一些方法中,补充剂包含:(a)F-12培养基;(b)N2补充剂;(c)NEUROBASAL培养基;(d)B-27补充剂;(e)L-谷氨酰胺;(f)2-巯基乙醇;或者(g)(a)至(f)的任何组合。
在一些方法中,LIF多肽是人LIF(hLIF)多肽。在一些方法中,GSK3抑制剂包括CHIR99021。在一些方法中,MEK抑制剂包括PD0325901。在一些方法中,低渗透压培养基包含基本上由GSK3抑制剂和MEK抑制剂组成的抑制剂。
在一些方法中,低渗透压培养基包含约24.75%(v/v)的基础培养基、约24.75%(v/v)的F-12培养基、约0.5%(v/v)的N2补充剂、约49%(v/v)的NEUROBASAL培养基、约1%(v/v)的B-27补充剂、约2mM的L-谷氨酰胺、约0.1mM的2-巯基乙醇、约100单位/mL的hLIF、约3μM的CHIR99021,以及约0.5μM的PD0325901。
在一些方法中,低渗透压培养基不包含以下中的一者或多者:bFGF补充剂、TGF-β1补充剂、JNK抑制剂、p38抑制剂、ROCK抑制剂和PKC抑制剂。在一些方法中,低渗透压培养基不包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
在一些方法中,hiPSC或转化细胞是在MATRIGELTM、新生儿人包皮成纤维细胞(NuFF)饲养细胞或GELTREXTM上培养的。
在一些方法中,hiPSC表达一种或多种多能性标记物。在一些方法中,该一种或多种多能性标记物包括NANOG、碱性磷酸酶或它们的组合。在一些方法中,hiPSC具有正常核型。
在一些方法中,hiPSC表现出致密圆顶形集落特征的形态。
在一些方法中,可以将hiPSC酶促解离成单细胞悬浮液并传代培养。在一些方法中,使用胰蛋白酶来进行酶促解离。在一些方法中,可以在没有Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的情况下进行酶促解离。在一些方法中,传代培养的hiPSC继续表达一种或多种多能性标记物。在一些方法中,传代培养的hiPSC维持原始态或原始样态,并且表现出致密圆顶形集落特征的形态。在一些方法中,传代培养的hiPSC维持正常核型。
在一些方法中,hiPSC可以分化成内胚层、外胚层或中胚层中任一者的细胞。
在一些方法中,hiPSC具有在约16小时与约24小时之间的倍增时间。
在一些方法中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,然后在低渗透压培养基中培养,其中高渗透压培养基包含bFGF。任选地,高渗透压培养基的渗透压为至少约290mOsm/kg。
在一些方法中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,直至它们表现出原始态或原始样态的特征。在一些方法中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养约2个月的时段。在一些方法中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,直至它们表现出三维细胞团块特征的形态。
还提供了通过上述方法中的任一种制备的hiPSC。
还提供了用于修饰hiPSC中的靶基因组基因座的方法,所述方法包括:(a)向hiPSC中引入包含插入核酸的靶向载体,所述插入核酸侧接有对应于靶基因组基因座处的5'和3'靶位点的5'和3'同源臂;以及(b)鉴定在其基因组中包含整合在靶基因组基因座处的插入核酸的经遗传修饰的hiPSC;其中hiPSC是在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养的,其中所述低渗透压培养基包含:(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和(c)MEK抑制剂;其中该培养基的渗透压为约175mOsm/kg至约280mOsm/kg。此类方法还可以包括:(a)向hiPSC中引入包含插入核酸的靶向载体,所述插入核酸侧接有对应于靶基因组基因座处的5'和3'靶位点的5'和3'同源臂;以及(b)鉴定在其基因组中包含整合在靶基因组基因座处的插入核酸的经遗传修饰的hiPSC;其中hiPSC是在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养的,其中所述低渗透压培养基包含:(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和(c)MEK抑制剂;其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。在一些方法中,靶向载体是大靶向载体(LTVEC),其中所述5'和3'同源臂的总和为至少10kb。在一些方法中,引入步骤(a)还包括:引入促进hiPSC中靶向载体和靶基因组基因座之间的同源重组的核酸酶试剂。在一些方法中,所述靶向遗传修饰包括:(a)内源性人核酸序列的缺失;(b)外源核酸序列的插入;或者(c)用外源核酸序列置换内源性人核酸序列。在一些方法中,外源核酸序列包括以下的一种或多种:(a)与内源性人核酸序列同源或直系同源的核酸序列;(b)嵌合核酸序列;(c)侧接有位点特异性重组酶靶序列的条件等位基因;和(d)与hiPSC中有活性的启动子有效连接的报告基因。
此类用于修饰hiPSC中的靶基因组基因座的方法还可包括:(a)向hiPSC中引入一种或多种可在靶基因组基因座的识别位点处诱导一个或多个切口或双链断裂的核酸酶试剂;以及(b)鉴定在其基因组中包含靶基因组基因座处的修饰的至少一个细胞;其中hiPSC是在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养的,其中所述低渗透压培养基包含:(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;以及(iii)MEK抑制剂;其中所述培养基的渗透压为约175mOsm/kg至约280mOsm/kg。此类方法还可以包括:(a)向hiPSC中引入一种或多种可在靶基因组基因座的识别位点处诱导一个或多个切口或双链断裂的核酸酶试剂;以及(b)鉴定在其基因组中包含靶基因组基因座处的修饰的至少一个细胞;其中hiPSC是在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养的,其中所述低渗透压培养基包含:(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;以及(iii)MEK抑制剂;其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
在用于修饰hiPSC中的靶基因组基因座的任何此类方法中,可以在步骤(a)之前将hiPSC酶促解离成单细胞悬浮液并传代培养。任选地,使用胰蛋白酶来进行酶促解离。任选地,在没有ROCK抑制剂的情况下进行酶促解离。在一些方法中,传代培养的hiPSC继续表达一种或多种多能性标记物。在一些方法中,传代培养的hiPSC维持原始态或原始样态,并且表现出致密圆顶形集落特征的形态。在一些方法中,传代培养的hiPSC维持正常核型。
在一些方法中,核酸酶试剂包括锌指核酸酶(ZFN)。在一些方法中,核酸酶试剂包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。在一些方法中,核酸酶试剂包括规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白,和包含识别基因组靶序列的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的向导RNA(gRNA)。任选地,Cas蛋白为Cas9。
在一些方法中,所述靶向遗传修饰是双等位基因修饰。
在一些方法中,hiPSC包括原始态或原始样态的hiPSC。在一些方法中,hiPSC包括类原始态的hiPSC。在一些方法中,hiPSC表达一种或多种多能性标记物。任选地,多能性标记物包括NANOG、碱性磷酸酶或它们的组合。在一些方法中,hiPSC表现出致密圆顶形集落特征的形态。在一些方法中,hiPSC可以分化成内胚层、外胚层或中胚层中任一者的细胞。在一些方法中,hiPSC具有在约16小时与约24小时之间的倍增时间。在一些方法中,hiPSC具有正常核型。
在一些方法中,hiPSC衍生自被转化以表达多能性状态的非多能细胞。任选地,转化细胞表达包括Oct4、Sox2、Klf4、Myc或它们的任何组合的重编程基因。任选地,转化细胞包括始发态的hiPSC。在一些方法中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,然后在低渗透压培养基中培养,其中高渗透压培养基包含bFGF。任选地,高渗透压培养基的渗透压为至少290mOsm/kg。在一些方法中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,直至它们表现出原始态或原始样态的特征。在一些方法中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养约2个月的时段。在一些方法中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,直至它们表现出三维细胞团块特征的形态。
在一些方法中,基础培养基的渗透压为约200mOsm/kg。在一些方法中,基础培养基包含约3mg/ml的NaCl、约2.2mg/ml的碳酸氢钠,并且渗透压为约200mOsm/kg。
在一些方法中,基础培养基包含约4.5mg/mL的葡萄糖。
在一些方法中,低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。在一些方法中,低渗透压培养基的渗透压为约233mOsm/kg。
在一些方法中,补充剂包含:(i)F-12培养基;(ii)N2补充剂;(iii)NEUROBASAL培养基;(iv)B-27补充剂;(v)L-谷氨酰胺;(vi)2-巯基乙醇;或者(vii)(i)至(vi)的任何组合。在一些方法中,LIF多肽是人LIF(hLIF)多肽。在一些方法中,GSK3抑制剂包括CHIR99021。在一些方法中,MEK抑制剂包括PD0325901。
在一些方法中,低渗透压培养基包含基本上由糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂和MEK抑制剂组成的抑制剂。
在一些方法中,低渗透压培养基包含约24.75%(v/v)的基础培养基、约24.75%(v/v)的F-12培养基、约0.5%(v/v)的N2补充剂、约49%(v/v)的NEUROBASAL培养基、约1%(v/v)的B-27补充剂、约2mM的L-谷氨酰胺、约0.1mM的2-巯基乙醇、约100单位/mL的hLIF、约3μM的CHIR99021,以及约0.5μM的PD0325901。
在一些方法中,低渗透压培养基不包含以下中的一者或多者:bFGF补充剂、TGF-β1补充剂、JNK抑制剂、p38抑制剂、ROCK抑制剂和PKC抑制剂。在一些方法中,低渗透压培养基不包含bFGF补充剂。
在一些方法中,hiPSC是在MATRIGEL、NuFF饲养细胞或GELTREX上培养的。
还提供了通过上述方法中的任一种制备的经修饰的hiPSC。
还提供了包含以下物质的体外培养物:(a)hiPSC群体;和(b)包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基,其中所述低渗透压培养基包含:(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;以及(iii)MEK抑制剂;其中所述培养基的渗透压为约175mOsm/kg至约280mOsm/kg。此类体外培养物还可包含(a)hiPSC群体;和(b)包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基,其中所述低渗透压培养基包含:(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;以及(iii)MEK抑制剂;其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
还提供了在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中制备或维持的hiPSC群体,其中所述低渗透压培养基包含:(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和(c)MEK抑制剂;其中该培养基的渗透压为约175mOsm/kg至约280mOsm/kg。此类hiPSC群体还可以在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中制备或维持,其中所述低渗透压培养基包含:(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和(c)MEK抑制剂;其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
在一些群体或体外培养物中,hiPSC包括原始态或原始样态的hiPSC。在一些群体或体外培养物中,hiPSC包括类原始态的hiPSC。
在一些群体或体外培养物中,hiPSC衍生自被转化以表达多能性状态的非多能细胞。在一些群体或体外培养物中,转化细胞表达包括Oct4、Sox2、Klf4、Myc或它们的任何组合的重编程基因。在一些群体或体外培养物中,转化细胞包括始发态的hiPSC。
在一些群体或体外培养物中,基础培养基的渗透压为约200mOsm/kg。在一些群体或体外培养物中,所述基础培养基包含约3mg/ml的NaCl、约2.2mg/ml的碳酸氢钠,并且渗透压为约200mOsm/kg。
在一些群体或体外培养物中,所述基础培养基包含约4.5mg/mL的葡萄糖。
在一些群体或体外培养物中,所述包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。在一些群体或体外培养物中,所述低渗透压培养基的渗透压为约233mOsm/kg。
在一些群体或体外培养物中,补充剂包括:(a)F-12培养基;(b)N2补充剂;(c)NEUROBASAL培养基;(d)B-27补充剂;(e)L-谷氨酰胺;(f)2-巯基乙醇;或者(g)(a)至(f)的任何组合。
在一些群体或体外培养物中,LIF多肽是人LIF(hLIF)多肽。在一些群体或体外培养物中,GSK3抑制剂包括CHIR99021。在一些群体或体外培养物中,MEK抑制剂包括PD0325901。在一些群体或体外培养物中,低渗透压培养基包含基本上由GSK3抑制剂和MEK抑制剂组成的抑制剂。
在一些群体或体外培养物中,低渗透压培养基包含约24.75%(v/v)的基础培养基、约24.75%(v/v)的F-12培养基、约0.5%(v/v)的N2补充剂、约49%(v/v)的NEUROBASAL培养基、约1%(v/v)的B-27补充剂、约2mM的L-谷氨酰胺、约0.1mM的2-巯基乙醇、约100单位/mL的hLIF、约3μM的CHIR99021,以及约0.5μM的PD0325901。
在一些群体或体外培养物中,低渗透压培养基不包含以下中的一者或多者:bFGF补充剂、TGF-β1补充剂、JNK抑制剂、p38抑制剂、ROCK抑制剂和PKC抑制剂。在一些群体或体外培养物中,低渗透压培养基不包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
在一些群体或体外培养物中,hiPSC或转化细胞是在MATRIGELTM、新生儿人包皮成纤维细胞(NuFF)饲养细胞或GELTREXTM上培养的。
在一些群体或体外培养物中,hiPSC表达一种或多种多能性标记物。在一些群体或体外培养物中,该一种或多种多能性标记物包括NANOG、碱性磷酸酶或它们的组合。在一些群体或体外培养物中,hiPSC具有正常核型。
在一些群体或体外培养物中,hiPSC表现出致密圆顶形集落特征的形态。
在一些群体或体外培养物中,可以将hiPSC酶促解离成单细胞悬浮液并传代培养。在一些群体或体外培养物中,使用胰蛋白酶来进行酶促解离。在一些群体或体外培养物中,可以在没有Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的情况下进行酶促解离。在一些群体或体外培养物中,传代培养的hiPSC继续表达所述一种或多种多能性标记物。在一些群体或体外培养物中,传代培养的hiPSC维持原始态或原始样态,并且表现出致密圆顶形集落特征的形态。在一些群体或体外培养物中,传代培养的hiPSC维持正常核型。
在一些群体或体外培养物中,hiPSC可以分化成内胚层、外胚层或中胚层中任一者的细胞。
在一些群体或体外培养物中,hiPSC具有在约16小时与约24小时之间的倍增时间。
在一些群体或体外培养物中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,然后在低渗透压培养基中培养,其中高渗透压培养基包含bFGF。任选地,高渗透压培养基的渗透压为至少约290mOsm/kg。
在一些群体或体外培养物中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,直至它们表现出原始态或原始样态的特征。在一些群体或体外培养物中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养约2个月的时段。在一些群体或体外培养物中,转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,直至它们表现出三维细胞团块特征的形态。
附图说明
图1示出了在人iPS细胞中使用LTVEC和向导RNA,用包含小鼠Adam6a和小鼠Adam6b基因座的核酸置换人ADAM6基因座的一部分的示意图。向导RNA的靶位点由箭头指示。
图2A示出了在2i培养基中培养8天的人iPS细胞表现出的形态。
图2B示出了在2i培养基中培养12天的人iPS细胞表现出的形态。
图3A至图3D示出了在mTeSRTM-hLIF培养基或低渗透压VG2i培养基中培养6天的人iPS细胞的形态。图3A和图3B示出了在mTeSRTM-hLIF培养基(图3A)或VG2i培养基(图3B)中培养6天的人iPS细胞的形态。图3C和图3D示出了在mTeSRTM-hLIF培养基(图3C)或VG2i培养基(图3D)中的新生儿人包皮成纤维细胞(NuFF)饲养细胞上培养6天的人iPS细胞的形态。
图4A示出了在VG2i培养基中培养、已经进行了碱性磷酸酶染色的重编程人iPS细胞。图4B和图4C示出了在VG2i培养基中培养、已经针对NANOG的表达进行了免疫染色的重编程人iPS细胞。
图5A至图5C示出了在VG2i培养基中培养的重编程人iPS细胞的酶促解离和传代培养。图5A示出了在没有ROCK抑制剂的情况下使用胰蛋白酶进行酶促解离之前在VG2i培养基中培养的重编程人iPS细胞。图5B示出了在传代培养之后在VG2i培养基中培养1天的人iPS细胞。图5C示出了在传代培养之后在VG2i培养基中培养4天的人iPS细胞。
图6A和图6B示出了在用胰蛋白酶进行酶促解离以产生单细胞悬浮液之后,来自第10代的两个不同人iPS细胞克隆株的细胞的核型。
序列简述
SEQ ID NO:1列出了由ADAM6gRNA组成的核酸序列。
SEQ ID NO:2列出了CRISPR/Cas复合物的靶序列的核酸序列。
定义
在本文中可互换使用的术语“蛋白”、“多肽”和“肽”包括任何长度的氨基酸聚合形式,包括编码氨基酸和非编码氨基酸以及以化学方式或生化方式修饰或衍生的氨基酸。这些术语还包括经过修饰的聚合物,诸如具有经过修饰的肽骨架的多肽。
在本文中可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”包括任何长度的核苷酸聚合形式,包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或它们的类似物或修饰形式。这些术语包括单链、双链和多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体、以及包含嘌呤碱基、嘧啶碱基、或其他天然的、化学修饰的、生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
“密码子优化”一般包括通过以下方式修饰核酸序列以增强在特定宿主细胞中的表达的过程:将天然序列的至少一个密码子替换为在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子,同时保持天然氨基酸序列。例如,可以修饰编码Cas蛋白的核酸,以置换在人细胞中具有较高使用频率的密码子。密码子使用表是现成的,例如在“密码子使用数据库(Codon Usage Database)”处提供。这些表格可按多种方式进行改编。参见Nakamura etal.(2000)Nucleic Acids Research 28:292(Nakamura等人,2000年,《核酸研究》,第28卷,第292页)。为实现在特定宿主中的表达而对特定序列进行密码子优化的计算机算法也是现成的(参见例如Gene Forge)。
“有效连接”或“有效连接的”包括两个或更多个组分(例如,启动子和另一个序列元件)的并置,使得这两个组分正常发挥功能并使这些组分中的至少一者有可能介导被施加在其他组分中的至少一者上的功能。例如,如果启动子响应于一个或多个转录调控因子的存在或不存在而对编码序列的转录水平进行控制,则启动子可以是有效连接至编码序列。
核酸的“互补性”意指核酸的一条链中的核苷酸序列因其核碱基基团的取向而与相对核酸链上的另一个序列形成氢键。DNA中的互补碱基通常是A与T及C与G。在RNA中,它们通常是C与G及U与A。互补性可以是完全的或实质的/充分的。两个核酸之间的完全互补性意指这两个核酸可以形成双链体,其中双链体中的每个碱基按照沃森-克里克配对原则与互补碱基结合。“实质”或“充分”互补意指一条链中的序列不与相对链中的序列彻底和/或完全互补,但在一组杂交条件(例如,盐浓度和温度)中这两条链上的碱基之间发生充分键合而形成稳定的杂交复合物。可通过以下方式预测此类条件:使用序列和标准数学计算来预测杂交链的Tm,或使用常规方法凭经验确定Tm。Tm包括在两条核酸链之间形成的一群杂交复合物发生50%变性时的温度。在低于Tm的温度下,有利于杂交复合物的形成,而在高于Tm的温度下,有利于杂交复合物中的两条链的解链或分离。可在1M NaCl水溶液中对具有已知G+C含量的核酸估计Tm,例如使用Tm=81.5+0.41(%G+C),而其他已知的Tm计算法考虑了核酸结构特征。
“杂交条件”包括累积环境,其中一条核酸链通过互补链相互作用和氢键方式键合于第二核酸链,从而产生杂交复合物。此类条件包括含核酸的水溶液或有机溶液的化学组分及其浓度(例如,盐、螯合剂、甲酰胺)以及该混合物的温度。其他因素(例如,温育时间的长度或反应室尺寸)可对环境有影响。参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2.sup.nd ed.,pp.1.90-1.91,9.47-9.51,1 1.47-11.57(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)(Sambrook等人,《分子克隆实验指南》,第2版,第1.90-1.91、9.47-9.51、1 1.47-11.57节,冷泉港实验室出版社,美国纽约州冷泉港,1989年)。
杂交要求两个核酸包含互补序列,但允许碱基之间出现错配。适于两个核酸之间的杂交的条件取决于核酸的长度和互补程度,这些变量是本领域众所周知的。两个核苷酸序列之间的互补程度越大,具有这些序列的核酸的杂交体的解链温度(Tm)值就越大。对于具有短序列段互补性(例如,在35个或更少、30个或更少、25个或更少、22个或更少、20个或更少、或18个或更少核苷酸内的互补性)的核酸之间的杂交,错配的位置变得重要(参见Sambrook等人,出处同上,11.7-11.8)。通常,可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。可杂交核酸的示例性最小长度包括至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约22个核苷酸、至少约25个核苷酸以及至少约30个核苷酸。此外,可视需要根据诸如互补区域的长度和互补程度等因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
多核苷酸的序列不必与其靶核酸的序列100%互补,也能实现特异性杂交。此外,多核苷酸可在一个或多个区段内杂交,使得间插或相邻区段不参与杂交事件(例如,环结构或发夹结构)。多核苷酸(例如,gRNA)可与其靶向的靶核酸序列内的靶区域具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列互补性。例如,其中20个核苷酸中有18个与靶区域互补并因此特异性杂交的gRNA将具有90%互补性。在该示例中,剩余的非互补核苷酸可以成簇或散布在互补核苷酸内并且无需彼此邻接或与互补核苷酸邻接。
通常可使用以下程序来确定核酸内的核酸序列的特定序列段之间的互补性百分比:使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschulet al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410(Altschul等人,1990年,《分子生物学杂志》,第215卷,第403-410页);Zhang and Madden(1997)Genome Res.7:649-656(Zhang和Madden,1997年,《基因组研究》,第7卷,第649-656页))或使用Gap程序(威斯康星序列分析软件包,适用于Unix的版本8,遗传学计算机组,美国威斯康星州麦迪逊的大学研究园(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)),这些程序使用默认设置,这使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489(《应用数学进展》,1981年,第2卷,第482-489页))。
在两个多核苷酸或多肽序列的语境中,“序列同一性”或“同一性”是指在指定比较窗内对齐以实现最大对应性时这两个序列中相同的残基。当使用序列同一性百分比指涉蛋白质时,应认识到,不相同的残基位置通常差别在于保守氨基酸置换,其中氨基酸残基被置换为具有类似化学特性(例如,电荷或疏水性)的其他氨基酸残基且因此不改变分子的功能特性。当序列差别在于保守置换时,可上调序列同一性百分比以校正置换的保守性质。差别在于此类保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调节的方式是本领域技术人员众所周知的。通常,这涉及将保守置换作为部分错配而非完全错配来评分,从而增加序列同一性百分比。因此,例如,若一个相同氨基酸被给定1的分数且一个非保守置换被给定0的分数,则一个保守置换被给定0至1之间的分数。保守置换的分数例如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城的Intelligenetics公司(Intelligenetics,MountainView,California))中所执行的那样来计算。
“序列同一性百分比”包括通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列而确定的值,其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比较,多核苷酸序列在比较窗中的部分可包含添加或缺失(即,空位),以便保证这两个序列的最佳比对。该百分比通过以下方式计算:确定其中相同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置的数目以产生匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以在比较窗口中的位置总数,并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
除非另作说明,否则序列同一性/相似性值包括使用GAP版本10采用以下参数获得的值:核苷酸序列的同一性%和相似性%使用空位权重(GAP Weight)50和长度权重3及nwsgapdna.cmp评分矩阵;氨基酸序列的同一性%或相似性%使用空位权重8和长度权重2及BLOSUM62评分矩阵;或其任何等同程序。“等同程序”包括任何序列比较程序,其为所考虑的任何两个序列产生这样的比对,当与由GAP版本10产生的对应比对相比较时,该比对具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比。
“包含”或“包括”一个或多个所述及的要素的组合物或方法可包括未具体述及的其他要素。例如,“包含”或“包括”某种蛋白质的组合物可包含单独的该蛋白质或与其他成分组合的该蛋白质。
值的范围的指定包括该范围内的或限定该范围的所有整数,以及由该范围内的整数所限定的所有子范围。
术语“约”表示指定的值可以变化一定百分比。在一些示例中,所述百分比可以是指定值的1%、2%、3%、4%、8%或10%。
除非上下文另外明确指出,否则单数形式的量词“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如,术语“细胞”或“至少一种细胞”可包括多种细胞,包括它们的混合物。
具体实施方式
A用于制备和维持人诱导多能干细胞的低渗透压培养基
提供了用于本发明的方法和组合物的细胞培养基。在一个实施例中,该培养基适用于制备人iPS细胞群体。在另一个实施例中,该培养基适用于在培养物中维持人iPS细胞。在一些实施例中,人iPS细胞是原始态或原始样态的。
本文提供的培养基至少包含基础培养基、补充剂、白血病抑制因子(LIF)多肽、糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂,以及有丝分裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂。“基础培养基”包括例如本领域已知的基础培养基(例如,达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium,DMEM)),其(与添加的补充剂一起)适用于在培养物中生长或维持多能细胞(例如,iPS细胞)。当用于在培养物中维持细胞时,基础培养基通常补充有本领域已知的多种补充剂。
本发明的培养基是低渗透压培养基。在一个示例中,渗透压在约175至280mOsm/kg之间。在其他示例中,该培养基的渗透压为约180至270mOsm/kg,约200至250mOsm/kg,约220至240mOsm/kg,或约225至235mOsm/kg。在一个具体实施例中,该培养基的渗透压为约233mOsm/kg。
提供用于本发明的基础培养基是向其添加补充剂的低渗透压基础培养基。本发明的基础培养基不同于通常用于在培养物中维持人iPS细胞的基础培养基,其包括各种形式的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)(例如,Invitrogen DMEM,产品目录号1 1971-025),以及可商购为KO-DMEMTM的低盐DMEM(Invitrogen产品目录号10829-018)。
本文提供的基础培养基是低渗透压培养基,但表现出不限于低渗透压的特征。例如,通过改变如本文提供的氯化钠和/或碳酸氢钠浓度可以使表1所示的DMEM配方变得适用于本发明的目的,此改变将导致与表1所示的标准DMEM基础培养基或低盐DMEM基础培养基(KO-DMEM)相比不同的渗透压。
表1DMEM基础培养基配方
本发明的基础培养基可以包含卤化碱金属盐,诸如氯化钠(NaCl)。该基础培养基中NaCl的示例性浓度包括50±5mM或约3mg/mL。在该基础培养基或包含该基础培养基和补充剂的培养基中的卤化碱金属盐的浓度可以是例如不超过约100mM、90mM、80mM、70mM、60mM或50mM。例如,该基础培养基或包含该基础培养基和补充剂的培养基可以包含约50至110mM、60至105mM、70至95mM、80至90mM、90mM或85mM的卤化碱金属盐浓度。或者,卤化碱金属盐的浓度可以是例如50±5mM、87±5mM、110±5mM、约3mg/mL、约5.1mg/mL或约6.4mg/mL。
在另一个实施例中,基础培养基呈现出某一碳酸盐浓度。该碳酸盐可以是钠盐。在此类示例中,钠盐可以是碳酸氢钠。在一个具体实施例中,碳酸氢钠以约26±5mM或约2.2mg/mL的浓度存在于基础培养基中。在基础培养基中或包含该基础培养基和补充剂的培养基中的碳酸盐的浓度可以是例如不超过45mM、40mM、35mM、30mM、25mM或20mM。例如,基础培养基或包含该基础培养基和补充剂的培养基可以包含在基础培养基中约10至40mM、18至44mM、17至30mM、18至26mM、13至25mM、20至30mM、25至26mM、18mM或26mM的碳酸盐浓度。或者,碳酸盐的浓度可以是例如18±5mM、26±5mM、约1.5mg/mL或约2.2mg/mL。
基础培养基或包含该基础培养基和补充剂的培养基中的卤化碱金属盐与碳酸盐的总浓度可以是例如不超过140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM或者80mM。例如,基础培养基或包含该基础培养基和补充剂的培养基可以包含约80至140mM、85至130mM、90至120mM、95至120mM、100至120mM,或115mM的卤化碱金属盐与碳酸盐的总浓度。
基础培养基或包含该基础培养基和补充剂的培养基中的卤化碱金属盐与碳酸盐的摩尔比可以例如高于2.5。例如,基础培养基或包含基础培养基和补充剂的培养基可以包含约2.6至4.0、2.8至3.8、3.0至3.6、3.2至3.4、3.3至3.5,或3.4的卤化碱金属盐与碳酸盐的摩尔比。
在另一个实施例中,基础培养基是低渗透压基础培养基。基础培养基的渗透压可以在约175至280mOsm/kg、约180至250mOsm/kg、约190至225mOsm/kg或约195至205mOsm/kg的范围内。基础培养基的示例性渗透压可以是200mOsm/kg、214mOsm/kg、216mOsm/kg或218mOsm/kg。在一个具体实施例中,基础培养基的渗透压是200mOsm/kg。当细胞在不同浓度的CO2中培养时,可以测定渗透压。在一些示例中,细胞在3%CO2或5%CO2下培养。基础培养基或包含该基础培养基和补充剂的培养基的渗透压可以是例如不大于约330mOsm/kg、320mOsm/kg、310mOsm/kg、300mOsm/kg、290mOsm/kg、280mOsm/kg、275mOsm/kg、270mOsm/kg、260mOsm/kg、250mOsm/kg、240mOsm/kg、230mOsm/kg、220mOsm/kg、210mOsm/kg或200mOsm/kg。例如,基础培养基或包含该基础培养基和补充剂的培养基的渗透压可以是约200至329mOsm/kg、218至322mOsm/kg、240至320mOsm/kg、250至310mOsm/kg、275至295mOsm/kg,或260至300mOsm/kg。例如,基础培养基或包含该基础培养基和补充剂的培养基的渗透压可以是约270mOsm/kg、约261mOsm/kg或者约218mOsm/kg。另选地,渗透压可以是218±22mOsm/kg、261±26mOsm/kg、294±29mOsm/kg或者322±32mOsm/kg。
基础培养基的渗透压可以是例如约130至270mOsm/kg、140至260mOsm/kg、150至250mOsm/kg、160至240mOsm/kg、170至230mOsm/kg、180至220mOsm/kg、190至210mOsm/kg、195至205mOsm/kg或者200mOsm/kg。另选地,基础培养基的渗透压可以是例如约200±70mOsm/kg、200±60mOsm/kg、200±50mOsm/kg、200±40mOsm/kg、200±35mOsm/kg、200±30mOsm/kg、200±25mOsm/kg、200±20mOsm/kg、200±15mOsm/kg、200±10mOsm/kg、200±5mOsm/kg或者200mOsm/kg。另选地,基础培养基的渗透压可以是例如约130至140mOsm/kg、约140至150mOsm/kg、约150至160mOsm/kg、约160至170mOsm/kg、约170至180mOsm/kg、约180至190mOsm/kg、约190至200mOsm/kg、约200至210mOsm/kg、约210至220mOsm/kg、约220至230mOsm/kg、约230至240mOsm/kg、约240至250mOsm/kg、约250至260mOsm/kg、约260至270mOsm/kg、约270至280mOsm/kg、约280至290mOsm/kg、约290至300mOsm/kg、约300至310mOsm/kg、约310至320mOsm/kg,或者约320至330mOsm/kg。另选地,基础培养基的渗透压可以例如小于约330mOsm/kg、320mOsm/kg、310mOsm/kg、300mOsm/kg、290mOsm/kg、280mOsm/kg、270mOsm/kg、260mOsm/kg、250mOsm/kg、240mOsm/kg、230mOsm/kg、220mOsm/kg、210mOsm/kg、200mOsm/kg、190mOsm/kg、180mOsm/kg、170mOsm/kg、160mOsm/kg、150mOsm/kg、140mOsm/kg或者130mOsm/kg。
包含该基础培养基和补充剂的培养基的渗透压可以是例如约205至260mOsm/kg、215至250mOsm/kg、225至240mOsm/kg、230至235mOsm/kg,或者233mOsm/kg。另选地,包含该基础培养基和补充剂的培养基的渗透压可以是例如约233±27mOsm/kg、233±25mOsm/kg、233±20mOsm/kg、233±15mOsm/kg、233±10mOsm/kg、233±5mOsm/kg,或者233mOsm/kg。另选地,包含该基础培养基和补充剂的培养基的渗透压可以是例如约200至205mOsm/kg、205至210mOsm/kg、210至215mOsm/kg、215至220mOsm/kg、220至225mOsm/kg、225至230mOsm/kg、230至235mOsm/kg、235至240mOsm/kg、240至245mOsm/kg、245至250mOsm/kg、250至255mOsm/kg,或者255至260mOsm/kg。另选地,包含该基础培养基和补充剂的培养基的渗透压可以是例如小于260mOsm/kg、255mOsm/kg、250mOsm/kg、245mOsm/kg、240mOsm/kg、235mOsm/kg、230mOsm/kg、225mOsm/kg、220mOsm/kg、215mOsm/kg、210mOsm/kg、205mOsm/kg,或者200mOsm/kg。
在一些低渗透压培养基中,基础培养基包含约87±5mM的NaCl和约26±5mM的碳酸盐。例如,基础培养基可以包含约5.1mg/mL的NaCl、约2.2mg/mL的碳酸氢钠,并且其渗透压为约275mOsm/kg。
在一些低渗透压培养基中,基础培养基包含约50±5mM的NaCl和约26±5mM的碳酸盐。例如,基础培养基可以包含约3.0mg/mL的NaCl、约2.2mg/mL的碳酸氢钠,并且其渗透压为约200mOsm/kg。在一个优选的实施例中,基础培养基包含浓度为3.0mg/mL的NaCl、浓度为约2.2mg/mL的碳酸氢钠,并且其渗透压为200mOsm/kg。
低渗透压培养基的其他示例描述于WO 2011/156723、US 2011/0307968和US2015/0067901中,所述专利中的每一个全文以引用方式并入本文。
与本发明的基础培养基一起配制的补充剂适用于制备、维持或富集本文所公开的人iPS细胞群体。这种补充剂在本公开中被表示为“补充剂”或“+补充剂”。术语“补充剂”或短语“+补充剂”包括添加到表1所述的基础培养基的组分中的一种或多种另外的元素。例如,补充剂可以包括但不限于培养基(Gibco)、补充剂(Gibco;100倍溶液)、培养基(Gibco)、补充剂(Gibco;50倍溶液)、L-谷氨酰胺、葡萄糖、2-巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)多肽、糖原合酶激酶3抑制剂、MEK抑制剂,或它们的任何组合。补充剂还可以包括例如胎牛血清(FBS)、抗生素、青霉素和链霉素(即penstrep)、丙酮酸盐(例如丙酮酸钠),以及非必需氨基酸(例如MEM NEAA)。
在一个具体实施例中,LIF多肽是人LIF(hLIF)多肽。在一些示例中,hLIF多肽以约1至1000单位/mL、约20至800单位/mL、约50至500单位/mL、约75至250单位/mL或约100单位/mL的浓度使用。
所述培养基可以包含抑制剂,所述抑制剂例如基本上由GSK3抑制剂和MEK抑制剂组成。例如,所述培养基可以包含由GSK3抑制剂和MEK抑制剂组成的抑制剂。
在另一个具体实施例中,GSK3抑制剂包括CHIR99021。在一些示例中,CHIR99021是以约0.1至10μM、约1至5μM、约2至4μM,或者约3μM的浓度使用的。
在另一个具体实施例中,MEK抑制剂包括PD0325901。在一些示例中,PD0325901是以约0.1至5μM、约0.2至1μM、约0.3至0.7μM,或者约0.5μM的浓度使用的。
示例性的培养基包含约24.75%(v/v)的本文所述低渗透压基础培养基、约24.75%(v/v)的F-12培养基、约0.5%(v/v)的N2补充剂、约49%(v/v)的NEUROBASAL培养基、约1%(v/v)的B-27补充剂、约2mM的L-谷氨酰胺、约0.1mM的2-巯基乙醇、约100单位/mL的hLIF、约3μM的CHIR99021,以及约0.5μM的PD0325901。
在另一个具体实施例中,培养基可以包含或可以不包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,也称为FGF2或FGF-β)。优选地,本发明的培养基不包含bFGF。
所述培养基可以包含或可以不包含以下项中的一者或多者:转化生长因子β1(TGF-β1)补充剂、bFGF补充剂、c-Jun N端激酶(JNK)抑制剂(例如,SP600125)、p38有丝分裂原活化蛋白激酶(p38)抑制剂(例如,SB203580)、rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂(例如,Y-27632),以及蛋白激酶C(PKC)抑制剂(例如,Go6983)。所述培养基可以包含或可以不包含毛喉素。例如,一些培养基不包含以下项中的一者或多者:TGF-β1补充剂、bFGF补充剂、JNK抑制剂(例如,SP600125)、p38抑制剂(例如,SB203580)、ROCK抑制剂(例如,Y-27632),以及PKC抑制剂(例如,Go6983)。一些培养基不包含以下项中的一者或多者:p38抑制剂和JNK抑制剂。一些培养基不包含bFGF补充剂或TGF-β1补充剂。一些培养基不包含TGF-β1补充剂。一些培养基不包含以下项中的任一者:TGF-β1补充剂、bFGF补充剂、JNK抑制剂(例如,SP600125)、p38抑制剂(例如,SB203580)、ROCK抑制剂(例如,Y-27632),以及PKC抑制剂(例如,Go6983)。一些培养基不包含毛喉素。
B人诱导多能干细胞
本文提供了用于制备人iPS细胞群体的方法和组合物。本文还提供了用于在培养物中维持人iPS细胞的方法和组合物。还提供了在培养物中产生或维持的人iPS细胞。
术语“多能细胞”或“多能干细胞”包括有能力发育成不止一种分化细胞类型的未分化细胞。此类多能细胞可以是例如哺乳动物胚胎干细胞(ES细胞)或哺乳动物诱导的多能干细胞(iPS细胞)。多能细胞的示例包括人iPS细胞。
术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”是指胚胎来源的全能或多能干细胞,其衍生自囊胚内细胞团,可以在合适的条件下在体外培养物中维持。ES细胞能够分化成三个脊椎动物胚层(例如内胚层、外胚层或中胚层)中的任一层的细胞。ES细胞的特征还在于它们在合适的体外培养条件下无限繁殖的能力。参见例如,Thomson等人(Science(1998)Vol.282(5391),pp.1145-1147(《科学》,1998年,第282卷第5391期,第1145-1147页))。
术语“诱导多能干细胞”或“iPS细胞”包括可以从经分化的成体细胞直接衍生的多能干细胞。可以通过将特定组的重编程因子引入非多能细胞来产生人iPS细胞,所述重编程因子可以包括例如Oct3/4、Sox家族转录因子(例如Sox1、Sox2、Sox3、Sox15)、Myc家族转录因子(例如,c-Myc、l-Myc、n-Myc)、Krüppel样家族(KLF)转录因子(例如KLF1、KLF2、KLF4、KLF5)和/或相关转录因子(诸如NANOG、LIN28和/或Glis1)。也可以例如通过使用miRNA、模拟转录因子的作用的小分子或谱系特异性分子来产生人iPS细胞。人iPS细胞的特征在于它们能够分化成三个脊椎动物胚层(例如内胚层、外胚层或中胚层)的任何细胞。人iPS细胞的特征还在于它们在合适的体外培养条件下无限繁殖的能力。参见例如,Takahashi和Yamanaka(Cell(2006)Vol.126(4),pp.663-676(《细胞》,2006年,第126卷第4期,第663-676页))。
术语“原始态”和“始发态(primed)”辨识人iPS细胞的不同多能性状态。术语“原始样态”辨识表达表现出原始态多能细胞的一种或多种特征的多能性状态的细胞。原始样态的人iPS细胞还可以被称为“类原始态”的人iPS细胞。术语“原始样态”和“类原始态”用法等同。在一些实施例中,原始样态的人iPS细胞表现出原始态人iPS细胞的一种或多种形态特征,诸如致密圆顶形集落特征的形态。在一些实施例中,原始样态人iPS细胞表达本文所述的一种或多种多能性标记物。在一些实施例中,原始态或原始样态的人iPS细胞是原始态人iPS细胞。在其他实施例中,原始态或原始样态的人iPS细胞是原始样态的人iPS细胞。
原始态和始发态的iPS细胞的特征在本领域中有所描述。参见例如,Nichols和Smith(Cell Stem Cell(2009)Vol.4(6),pp.487-492(《细胞·干细胞》,2009年,第4卷第6期,第487-492页))。原始态人iPS细胞表现出与植入前胚胎的内细胞团的ES细胞相似的多能性状态。此类原始态细胞未经始发用于谱系特化和定型。女性原始态iPS细胞的特征在于两条活性X染色体。在培养物中,原始态人iPS细胞的自我更新依赖于白血病抑制因子(LIF)和其他抑制剂。所培养的原始态人iPS细胞表现出圆顶形集落特征的克隆形态,并且没有顶面-底侧极性。所培养的原始态细胞还可以表现出如本文别处所述的一种或多种多能性标记物。在合适的条件下,培养物中的原始态人iPS细胞的倍增时间可以在16与24小时之间。
始发态的人iPS细胞表达与移植后外胚层细胞类似的多能性状态。此类细胞经始发用于谱系特化和定型。始发态的女性iPS细胞的特征在于一条有活性的X染色体和一条无活性的X染色体。在培养物中,始发态的人iPS细胞的自我更新依赖于成纤维细胞生长因子(FGF)和激活素。所培养的始发态人iPS细胞表现出上皮单层特征的克隆形态,并且表现出顶面-底侧极性。在合适的条件下,培养物中的始发态人iPS细胞的倍增时间可以为24小时或更长。
在一个实施例中,人iPS细胞可以衍生自被转化以表达多能性状态的非多能细胞。此类转化细胞包括例如已被转化以表达诱导多能性的重编程基因的细胞。多能性状态可以包括例如本文所述的一种或多种多能性标记物的表达。可以通过本领域中已知的任何手段将此类细胞(诸如人包皮成纤维细胞)转化以表达重编程基因或任何其他所关注的基因。参见例如,Takahashi和Yamanaka(Cell(2006)Vol.126(4),pp.663-676(《细胞》,2006年,第126卷第4期,第663-676页))。例如,可以使用一种或多种质粒、慢病毒载体或逆转录病毒载体将它们引入细胞中。在一些情况下,载体整合到基因组中,并且可以在重编程完成后被移除。在具体实施例中,用包括Oct4、Sox2、Klf4、Myc或它们的任何组合的重编程基因来转化非多能细胞。在一些示例中,转化细胞包括始发态的人iPS细胞。
在一些实施例中,在本文所述的低渗透压培养基中培养的人iPS细胞表达原始态的一种或多种表型、基因表达谱或特征性标记物。在一个示例中,人iPS细胞表达其表达指示原始态的一种或多种多能性标记物。此类多能性标记物可以包括碱性磷酸酶、NANOG、5T4、ABCG2、激活素RIB/ALK-4、激活素RIIB、E-钙粘素、Cbx2、CD9、CD30/TNFRSF8、CD117/c-试剂盒、CDX2、CHD1、Cripto、DNMT3B、DPPA2、DPPA4、DPPA5/ESG1、EpCAM/TROP1、ERRβ/NR3B2、ESGP、F-box蛋白15/FBXO15、FGF-4、FGF-5、FoxD3、GBX2、GCNF/NR6A1、GDF-3、Gi24/VISTA/B7-H5、整合素α6/CD49f、整合素α6β1、整合素α6β4、整合素β1/CD29、KLF4、KLF5、L1TD1、Lefty、Lefty-1、Lefty-A、LIN-28A、LIN-28B、LIN-41、cMaf、cMyc、Oct-3/4、Oct-4A、足萼糖蛋白、Rex-1/ZFP42、Smad2、Smad2/3、SOX2、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、STAT3、Stella/Dppa3、SUZ12、TBX2、TBX3、TBX5、TERT、TEX19、TEX19.1、THAP11、TRA-1-60(R)、TROP-2、UTF1和/或ZIC3。在一个具体示例中,所表达的多能性标记物是碱性磷酸酶、NANOG,或两者。
在另一个实施例中,在本文所述的低渗透压培养基中培养的人iPS细胞表现出表征原始态的形态特征。示例性形态的特征在于细胞在培养中具有致密圆顶形集落。
在本文所述的低渗透压培养基中培养的人iPS细胞可以具有正常核型。正常核型包括其中正常表征物种的所有染色体存在并且没有显著改变的核型,或者没有使用染色体条带分析可检测出的可见数量或结构上染色体异常的细胞状态。在本文所述的低渗透压培养基中培养的人iPS细胞可以例如在本文所述的低渗透压培养基中约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100代后具有正常的核型。
在另一个实施例中,在本文所述的低渗透压培养基中培养的人iPS细胞可以机械或酶促解离成单细胞悬浮液,经传代和/或继代培养。在本文所述的低渗透压培养基中培养的此类人iPS细胞可以具有正常核型,并且可以在机械或酶促解离成单细胞悬浮液,经传代和/或继代培养后保持正常核型。例如,在本文所述的低渗透压培养基中培养的此类人iPS细胞可以具有正常核型,并且可以在机械或酶解离解成单细胞悬浮液,使用本文其他地方所描述的方法在靶基因组基因座处修饰,以及继代培养后保持正常核型。在一个示例中,可以使用胰蛋白酶进行酶促解离。
当在本发明的低渗透压培养基中培养时,由于增强地解离成单细胞悬浮液,人iPS细胞可提供更大的转化效率。对于通常用于在培养中维持人iPS细胞的其他类型的培养基(例如,mTeSRTM培养基或2i培养基),人iPS细胞的解离必须机械地或者使用相较于胰蛋白酶不那么苛刻的酶如胶原酶来进行。通常不建议将人iPS细胞作为单个细胞传代,因为已经证明这种做法对细胞群体施加了不希望的选择性压力,这可导致例如培养中的遗传畸变。人iPS细胞在细胞脱离和解离时易于凋亡,并且在完全解离后通常经历大量细胞死亡。参见Watanabe et al.(2007)Nature 25(6):681-686(Watanabe等人,2007年,《自然》,第25卷第6期,第681-686页,该文献出于所有目的全文以引用方式并入本文。因此,人iPS细胞的解离通常用最小化传代时的集落分解并且不产生单细胞悬浮液的试剂或方法进行。因此,细胞不会有效或完全解离。然而,完全解离对于诸如基因转移或产生靶向基因修饰之后的克隆分离的程序可能是重要的,特别是当试图分离相对罕见的克隆,诸如经历同源重组以产生期望的靶向修饰的那些克隆时。相比之下,利用本发明的低渗透压培养基,可以使用胰蛋白酶来解离细胞,并且增强的解离导致转化效率提高。例如,这种解离可以产生单细胞悬浮液,所述单细胞悬浮液当例如通过电穿孔或使用本文其他地方描述的进行靶向基因修饰的方法进行靶向时,导致更高的靶向效率。此外,与通常用于在培养中维持人iPS细胞的其它类型的培养基(例如,mTeSRTM培养基或2i培养基)不同,用本发明的低渗透压培养基(优选为不包含bFGF的低渗透压培养基)培养的人iPS细胞的酶促解离可以在不存在这种细胞传代通常所必需的一种或多种抑制剂的情况下进行。可以省略的示例性抑制剂是Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂。当使人iPS细胞传代以抑制促凋亡途径的活化时,ROCK抑制剂通常是必需的。具体地,当接种人iPS细胞的单细胞悬浮液时,通常建议添加ROCK抑制剂,因为据报道其增加细胞存活率。参见Watanabe et al.(2007)Nature 25(6):681-686(Watanabe等人,2007年,《自然》,第25卷第6期,第681-686页)。然而,当使用本文公开的低渗透压培养基时,即使当作为单细胞悬浮液传代时,也不需要这种ROCK抑制剂。当使用本文所公开的低渗透压培养基时,这种单细胞悬浮液可以在胰蛋白酶消化和再次接种后保持多能性和正常核型。
在另一个实施例中,在本文所述的低渗透压培养基中培养的继代培养人iPS细胞可以在酶解离和继代培养后保持原始态或原始样态。在本文所述的低渗透压培养基中培养的继代培养人iPS细胞即使当作为单细胞悬浮液传代和/或当使用在本文其他地方所述的方法在靶基因组基因座处修饰时,也可以在酶促解离和继代培养后保持原始态或原始样态。在一些示例中,继代培养的人iPS细胞可以继续表现出致密圆顶形集落特征的形态。继代培养的人iPS细胞还可以继续表达如本文所述的一种或多种多能性标记物。
C用于制备和保持人诱导多能干细胞群体的方法
提供了用于在体外培养中制备人iPS细胞的方法和组合物。还提供了用于在体外培养中保持人iPS细胞的方法和组合物。
术语“制备”包括在合适的条件下培养被转化以表达一种或多种如本文所述的重编程因子的非多能细胞,以诱导细胞表型、基因表达或两者的变化,使得细胞表现出原始态或原始样态,即表达原始态人iPS细胞的一种或多种特征。可以响应于特定的培养条件,例如在本文所述的低渗透压培养基中的培养,而表达原始态或原始样态。在一些示例中,表达原始态或原始样态的细胞的比例为培养物中细胞的至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%,以及直至100%。
在一个实施例中,该方法富集了原始态或原始样态的人iPS细胞群体的体外培养物。在此类实施例中,原始态或原始样态的人iPS细胞可以在培养中优先通过未表达原始态或原始样态的细胞增殖。在另一个实施例中,可以从培养物中选择原始态或原始样态的人iPS细胞,所述原始态或原始样态的人iPS细胞被酶促解离并经继代培养以产生经富集的原始态或原始样态的人iPS细胞群体。
在一个实施例中,被转化以表达多能性状态的非多能细胞在本文提供的适合于诱导原始态或原始样态的表达的培养基中体外培养至少1、2、5、7、10、14、21或28天,或足以在培养中诱导原始态或原始样态表达的任何时间段。可以将转化细胞在本发明的培养基中培养至少1、2、3或4周。有时将转化细胞培养1至4周。原始态或原始样态的表达可以通过观察形态特征或多能性标记物的表达,原始态或原始样态的特征来确定,所述形态特征或多能性标记物的表达、原始态或原始样态的特征在本文其他地方描述。
在一个实施例中,被转化以表达多能性状态的非多能细胞在本发明的低渗透压培养基中培养,直到它们表现出原始态或原始样态的特征。然后可以将细胞在本发明的培养基中培养以保持原始态或原始样态。在另一个实施例中,被转化以表达多能性状态的非多能细胞首先在高渗透压培养基中培养,然后在本发明的低渗透压培养基中培养。此类高渗透压培养基表现出比目前的低渗透压培养基更高的渗透压,并且可以包含bFGF。高渗透压培养基的渗透压可以是例如约300至380、310至370、320至360、330至350,或340mOsm/kg。另选地,高渗透压培养基的渗透压可以是例如340±70、340±60、340±50、340±40、340±30、340±20,或340±10mOsm/kg。例如,高渗透压培养基的渗透压可以是约270-280、280-290、290-300、300-310、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、360-370、370-380、380-390、390-400,或400-410mOsm/kg。另选地,高渗透压培养基的渗透压可以是至少约270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400,或410mOsm/kg。一些高渗透压培养基包含牛血清白蛋白、bFGF、转化生长因子β(TGFβ)、氯化锂、哌可酸和γ-氨基丁酸(GABA)中的一种或多种。高渗透压培养基的示例包括mTeSRTM培养基(Stemcell技术公司)。
在一些实施例中,被转化以表达多能性状态的非多能细胞可以首先在包含bFGF的高渗透压培养基中培养,直至它们开始表达原始态或原始样态的状态的特征,此时将细胞在本发明的低渗透压培养基中培养。在一个示例中,可以将细胞在包含bFGF的高渗透压培养基中培养至少1、2、5、10、30、60或90天的时段,1、2、4、8或12周的时段,或在1天至3个月之间的时段。在包含bFGF的高渗透压培养基中培养的示例性时间段为2个月。
在其他实施例中,被转化以表达多能性状态的非多能细胞可以首先在包含bFGF的高渗透压培养基中培养,直至它们开始表现出三维细胞团块特征的形态,此时将细胞在本发明的低渗透压培养基中培养。在此类实施例中,可以选择出表现为三维团块的细胞,解离(例如,用胰蛋白酶),并转移到本文所述的低渗透压培养基中的新培养物中。
术语“保持”包括保存本文所述的人iPS细胞的特征或表型中的至少一种或多种。这些特征可以包括保持多能性、细胞形态、基因表达谱,和/或原始态细胞的其他功能性特征。术语“保持”还可涵盖细胞的增殖,和/或所培养的原始态细胞的数目增加。所述术语包括防止细胞转化为始发态或非多能状态的培养条件。该术语还包括允许细胞保持多能性和/或原始态,同时细胞可以或可以不继续分裂和数目增加的培养条件。
在一个实施例中,将人iPS细胞在本文所提供的适合于使此类细胞保持于原始态或原始样态的培养基中体外培养。在一个具体示例中,人iPS细胞可以在合适的培养基中培养1、2、5、7、10、14、21或28天的时段,或约2周、约3周、约4周或更长的时段,只要使所培养的细胞维持在原始态或原始样态。可以将细胞培养至少1、2、3或4周。有时将细胞培养1至4周。可以将人iPS细胞保持达例如足以使培养中的细胞增殖、对所述细胞进行基因修饰和/或将所述细胞继代培养的任何时间段。
在另一个实施例中,可以将被转化以表达多能性状态的人iPS细胞或非多能细胞在适于体外培养的底物或饲养细胞层上培养。在一个具体示例中,将细胞在MATRIGELTM(BD生物科学(BD Biosciences))上培养。在另一个示例中,将细胞在新生儿人包皮成纤维细胞(NuFF)饲养细胞上培养。在另一个示例中,将细胞在GELTREXTM(美国生命技术公司(LifeTechnologies))上培养。在另一个示例中,将细胞在玻连蛋白(例如,VITRONECTIN XFTM(干细胞技术有限公司(STEMCELL Technologies)))上培养。
在另一个实施例中,与始发态的人iPS细胞或被转化以表达多能性状态的非多能细胞相比,在本发明的低渗透压培养基中培养的人iPS细胞的倍增时间减少。在一个具体示例中,本发明的人iPS细胞的倍增时间在约16至24小时之间。
D基因修饰和用于进行靶向基因修饰的方法
在一些实施例中,用于制备和保持人iPS细胞的方法包括将基因修饰导入人iPS细胞中。同样,本发明提供包含基因修饰的人iPS细胞。
在具体实施例中,基因修饰包括对一个或多个内源性核酸的修饰、对一个或多个内源性核酸的取代、用异源核酸替代内源性核酸、敲除或敲入。在具体示例中,通过将大靶向载体(LTVEC)导入人iPS细胞或被转化以表达多能性状态的非多能细胞中来导入基因修饰。在此类示例中,LTVEC可以包含待插入细胞基因组的DNA。
可以使用用于在人iPS细胞中进行靶向基因修饰的各种方法。例如,可以使用用于进行靶向基因修饰以改变人iPS细胞中的蛋白质水平和/或活性的各种方法。例如,在一种情况中,靶向基因修饰采用将通过同源重组(HR)事件产生靶向基因修饰的体系。同源介导修复(HDR)或HR包括可能需要核苷酸序列同源性,使用“供体”分子作为模板来修复“靶”分子(即,经历了双链断裂的分子),并导致将遗传信息从供体转移到靶的核酸修复形式。不希望受任何特定理论的束缚,此类转移可能涉及对在断裂的靶和供体之间形成的异源双链DNA进行错配校正,和/或其中供体用于重新合成将变成靶的一部分的基因信息的合成依赖性链退火,和/或相关过程。在一些情况下,供体多核苷酸,供体多核苷酸的一部分,供体多核苷酸的拷贝,或供体多核苷酸拷贝的一部分整合到靶DNA中。在其他情况下,可以使用在靶向基因组位置产生单链或双链断裂的核酸酶试剂来修饰细胞。然后通过非同源末端连接途径(NHEJ)修复单链或双链断裂。NHEJ包括通过在不需要同源模板的情况下将断裂端彼此直接连接来修复核酸中的双链断裂。通过NHEJ连接不连续序列通常可导致双链断裂位点附近的缺失、插入或易位。此类体系可用于例如产生靶向功能丧失的基因修饰。用于产生此类靶向基因修饰的非限制性方法在本文其他地方详细论述,包括例如使用靶向质粒或大靶向载体。还可参见Wang et al.(2013)Cell 153:910-918(Wang等人,2013年,《细胞》,第153卷,第910-918页),Mandalos et al.(2012)PLOS ONE 7:e45768:1-9(Mandalos等人,2012年,《公共科学图书馆π综合》,第7卷第e45768期,第1-9页),以及Wang et al.(2013)NatBiotechnol.31:530-532(Wang等人,2013年,《自然·生物技术》,第31卷,第530-532页),这些文献中的每一篇以引用方式并入本文。
应当认识到,在具体实施例中,对所关注的任何多核苷酸的靶向基因修饰可以当多能细胞(即人iPS细胞)被保持在本文所述的培养基中时发生。另选地,对任何所关注的多核苷酸的靶向基因修饰可以在多能细胞(即人iPS细胞)被保持在不同的培养基中并且随后转移到本文所公开的低渗透压培养基中时发生。
一般来讲,如果蛋白质的蛋白水平和/或活性水平在统计学上高于或低于尚未经用于改变蛋白质的表达和/或活性的基因修饰或诱变的适当对照细胞中的蛋白水平,则该蛋白质的水平和/或活性变化。在具体实施例中,相对于尚未经用以使其具有改变的蛋白水平和/或活性的修饰的对照细胞,该蛋白质的浓度和/或活性被改变了至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
“受试细胞”是其中已经实现了基因改变,诸如本文所公开的基因修饰的细胞,或是为如此改变的细胞的后代并且包含所述改变的细胞。“对照”或“对照细胞”提供了用于测量受试细胞的表型变化的参考点。在一个实施例中,对照细胞与具有降低的蛋白活性的细胞尽可能接近地匹配,区别为对照细胞缺乏导致活性改变的基因修饰或突变(例如,相应细胞可以源自相同的细胞系)。在其他情况下,对照细胞可以包括例如:(a)野生型细胞,即与用于导致受试细胞中基因改变的起始物质具有相同基因型的细胞;(b)与起始物质具有相同基因型但已用无效构建体(null construct)(即用对所关注性状没有已知作用的构建体,诸如包含标记基因的构建体)进行基因修饰的细胞;(c)作为受试细胞的非基因修饰后代的细胞(即,对照细胞和受试细胞源于相同的细胞系);(d)在遗传上与受试细胞相同但未暴露于诱导所关注基因表达的条件或刺激下的细胞;或者(e)在其中基因修饰不会导致所关注多核苷酸的表达改变的条件下的受试细胞本身。
可以直接(例如通过测定细胞或生物体中的多肽水平)或间接(例如通过测量该多肽的活性)来测量该多肽的表达水平。
在其他情况下,使用包括但不限于Southern印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析的方法来选择具有靶向基因修饰的细胞。然后将此类细胞用于本文所述的各种方法和组合物中。
靶向基因修饰可以包括对所关注的多核苷酸的靶向改变。此类靶向修饰包括但不限于一个或多个核苷酸的添加,一个或多个核苷酸的缺失,一个或多个核苷酸的取代,所关注多核苷酸或其部分的敲除,所关注多核苷酸或其部分的敲入,用异源核酸序列替代内源性核酸序列,或它们的组合。在具体实施例中,改变至少1个、2个、3个、4个、5个、7个、8个、9个、10个、100个、500个或更多个核苷酸,或者至少10kb至500kb或更多,以形成靶向基因组修饰。
在其他实施例中,通过将改变多肽的水平或活性的多核苷酸导入细胞中来改变该多肽的活性和/或水平。所述多核苷酸可以通过改变信使RNA的翻译直接改变多肽的表达,或通过编码改变编码蛋白的基因的转录或翻译的多肽间接改变多肽的表达。在其他实施例中,通过将编码改变靶多肽活性的多肽的序列导入细胞中来改变该多肽的活性。
在一个实施例中,人iPS细胞可以包含改变蛋白质的活性和/或水平的条件型等位基因。“条件型等位基因”包括设计成在期望的发育时间和/或期望的所关注组织内具有改变的蛋白质水平和/或活性的经修饰基因。可以将改变的水平和/或活性与缺乏产生条件型等位基因的修饰的对照细胞进行比较,或者是将期望发育时间处改变的活性与先前和/或随后时间处改变的活性进行比较的情况,或者是将所需组织与所有组织的平均活性进行比较的情况。在一个实施例中,条件型等位基因包含基因中可以在期望的发育时间点和/或特定组织中关掉或开启的条件型无效等位基因。
在一个非限制性实施例中,条件型等位基因为如US 2011/0104799中所述的多功能等位基因,该专利全文以引用的方式并入本文。在具体实施例中,条件等位基因包含:(a)相对于靶基因的转录呈有义取向的致动序列,以及呈有义或反义取向的药物选择盒(DSC);(b)呈反义取向的所关注核苷酸序列(NSI)和倒转条件模块(conditional by inversionmodule)(COIN,其利用外显子断裂内含子和可倒转的基因诱捕样模块;参见例如US 2011/0104799,该专利全文以引用的方式并入本文);以及(c)在暴露于第一重组酶后重组以形成条件型等位基因的可重组单元,所述条件型等位基因(i)缺乏致动序列和DSC,并且(ii)含有呈有义取向的NSI和呈反义取向的COIN。
本发明允许修饰细胞中染色体上的靶基因组基因座。在具体实施例中,本文提供的方法允许通过在不存在核酸酶试剂或与核酸酶试剂组合的情况下采用靶向载体来靶向染色体上的基因组基因座。
用于进行靶向基因修饰的方法可以包括例如单独或与如本文其他地方所述的一种或多种核酸酶组合地使用靶向载体(例如,LTVEC)。参见例如US 2015/0159175、US 2015/0159174、US 2014/0310828、US 2014/0309487,以及US 2013/0309670,这些专利中的每一个出于所有目的全文以引用方式并入本文。类似地,用于进行靶向基因修饰的方法可以包括单独或与靶向载体组合地使用一种或多种核酸酶。
例如,提供了用于修饰人iPS细胞中的靶基因组基因座的方法,该方法包括:(a)向细胞中导入可在靶基因组基因座处或附近的识别位点处诱导一个或多个切口或双链断裂的一种或多种核酸酶试剂;和(b)鉴定在其基因组中包含在靶基因组座处的修饰的至少一个细胞。此类方法可导致对靶基因组基因座的破坏。内源性核酸序列的破坏可以例如当用非同源末端连接(NHEJ)介导的DNA修复来修复由核酸酶产生的双链断裂时导致,该修复产生包含核酸序列的插入或缺失的突变等位基因,从而导致对该基因组基因座的破坏。破坏的示例包括改变调控元件(例如启动子或增强子)、错义突变、无义突变、移码突变、截短突变、无效突变,或少量核苷酸的插入或缺失(例如,引起移码突变)。破坏可导致失活(即,功能丧失)或等位基因的丧失。
用于修饰人iPSC细胞中的靶基因组基因座的其他方法包括:(a)向细胞中导入包含插入核酸的靶向载体,该插入核酸侧接有对应于5'和3'靶位点的5'和3'同源臂;以及(b)鉴定在其基因组中包含整合在靶基因组基因座处的插入核酸的至少一个细胞。
用于修饰人iPSC细胞中的靶基因组基因座的其他方法包括:(a)向所述细胞中导入:(i)核酸酶试剂,其中所述核酸酶试剂诱导靶基因组基因座内的识别位点处的切口或双链断裂;和(ii)包含插入核酸的靶向载体,所述插入核酸侧接有对应于位于足够接近所述识别位点的5'和3'靶位点的5'和3'同源臂;以及(c)鉴定包含在靶基因组基因座处的修饰(例如插入核酸的整合)的至少一个细胞。此类方法可以导致各种类型的靶向基因修饰。此类靶向修饰可以包括例如一个或多个核苷酸的添加,一个或多个核苷酸的缺失,一个或多个核苷酸的取代,点突变,所关注多核苷酸或其部分的敲除,所关注多核苷酸或其部分的敲入,用异源、外源或直系同源的核酸序列核酸序列替代内源性核酸序列,结构域交换,外显子交换,内含子交换,调控序列交换,基因交换,或它们的组合。例如,可以改变至少1个、2个、3个、4个、5个、7个、8个、9个、10个或更多个核苷酸以形成靶向基因组修饰。所述缺失、插入或替代可以是任何大小的,如本文其他地方所论述的。
a核酸酶试剂和核酸酶试剂的识别位点
术语“核酸酶试剂的识别位点”包括核酸酶试剂在其处诱导切口或双链断裂的DNA序列。核酸酶试剂的识别位点对于细胞可为内源的(或天然的),或识别位点对于细胞可为外源的。在具体实施例中,识别位点对于细胞为外源的,从而在细胞基因组中不是天然存在的。在另一个实施例中,识别位点对于细胞为外源的,并且对于希望被定位在靶基因座处的所关注多核苷酸为外源的。在进一步的实施例中,外源或内源识别位点在宿主细胞的基因组中仅出现一次。在具体实施例中,鉴定了在基因组内仅出现一次的内源或天然位点。然后可使用这种位点来设计将在内源识别位点处产生切口或双链断裂的核酸酶试剂。
识别位点的长度可变,并且包括例如对于锌指核酸酶(ZFN)对为约30-36bp(即,对于每个ZFN为约15-18bp)、对于转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)为约36bp、或对于CRISPR/Cas9向导RNA为约20bp的识别位点。
在一个实施例中,核酸酶试剂的每个单体识别至少9个核苷酸的识别位点。在其他实施例中,识别位点为约9至约12个核苷酸长,约12至约15个核苷酸长,约15至约18个核苷酸长,或约18至约21个核苷酸长,以及此类子范围的任何组合(例如,9至18个核苷酸)。已经认识到,给定的核酸酶试剂可以结合识别位点并切割该结合位点,或者替代地核酸酶试剂可以结合不同于识别位点的序列。此外,术语识别位点包括核酸酶试剂结合位点和切口/切割位点,无论切口/切割位点是在核酸酶结合位点之内还是之外。在另一种变型中,使用核酸酶试剂的切割可以发生在彼此直接相对的核苷酸位置处以产生钝端切割,或者在其他情况下,切口可以交错以产生单链悬垂,也称为“粘性末端”,其可以是5'悬垂或3'悬垂。
可在本文所公开的方法和组合物中使用任何会在所需识别位点中诱导切口或双链断裂的核酸酶试剂。可采用天然存在的或天然的核酸酶试剂,只要该核酸酶试剂在所需识别位点中诱导切口或双链断裂即可。作为另一种选择,可采用经修饰或经改造的核酸酶试剂。“经改造的核酸酶试剂”包括由其天然形式改造(修饰或衍生)成在所需识别位点中特异性识别并诱导切口或双链断裂的核酸酶。因此,经改造的核酸酶试剂可衍生自天然的或天然存在的核酸酶试剂,或其可人工生成或合成。核酸酶试剂的修饰在蛋白切割剂中可少至一个氨基酸,或在核酸切割剂中可少至一个核苷酸。在一些实施例中,经改造的核酸酶在识别位点中诱导切口或双链断裂,其中所述识别位点不是会被天然(未经改造的或未经修饰的)核酸酶试剂识别的序列。在识别位点或其他DNA中产生切口或双链断裂在本文中可称为“切开”或“切割”识别位点或其他DNA。
本文还提供了示例性识别位点的活性变体和片段。此类活性变体可与给定识别位点具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性,其中所述活性变体保留生物活性,从而能够被核酸酶试剂以序列特异性方式识别并切割。测量核酸酶试剂对识别位点造成的双链断裂的测定法是本领域已知的(例如, qPCR测定法,Frendewey D.et al.,Methods inEnzymology,2010,476:295-307(Frendewey D.等人,《酶学方法》,2010年,第476卷,第295-307页),该文献全文以引用的方式并入本文)。
核酸酶试剂的识别位点可以位于靶基因座中或附近的任何位置。识别位点可以位于基因的编码区内,或位于影响基因表达的调控区内。核酸酶试剂的识别位点可以位于内含子、外显子、启动子、增强子、调控区,或任何非蛋白质编码区中。在具体实施例中,识别位点被定位在编码选择标记的多核苷酸内。这种位置可位于选择标记的编码区内或者位于影响选择标记的表达的调控区内。因此,核酸酶试剂的识别位点可位于选择标记的内含子、编码选择标记的多核苷酸的启动子、增强子、调控区或任何非蛋白编码区中。在具体实施例中,识别位点处的切口或双链断裂会破坏选择标记的活性。测定功能选择标记存在与否的方法是已知的。
在一个实施例中,核酸酶试剂为转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。TAL效应物核酸酶是一类序列特异性核酸酶,其可用于在原核或真核生物基因组中的特定靶序列处产生双链断裂。可通过将天然的或经改造的转录激活因子样(TAL)效应物或其功能部分融合到内切核酸酶如FokI的催化结构域,来生成TAL效应物核酸酶。独特的模块化TAL效应物DNA结合结构域使得可以设计潜在地具有任何给定DNA识别特异性的蛋白质。因此,TAL效应物核酸酶的DNA结合结构域可被改造成识别特定DNA靶位点,故可用于在所需靶序列处产生双链断裂。参见WO 2010/079430;Morbitzer et al.(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107(Morbitzer等人,2010年,《美国国家科学院院刊》,10.1073/pnas.1013133107);Scholze&Boch(2010)Virulence 1:428-432(Scholze和Boch,2010年,《毒力》,第1卷,第428-432页);Christian et al.Genetics(2010)186:757-761(Christian等人,《遗传学》,2010年,第186卷,第757-761页);Li et al.(2010)Nuc.Acids Res.(2010)doi:10.1093/nar/gkq704(Li等人,2010年,《核酸研究》,2010年,doi:10.1093/nar/gkq704);以及Miller et al.(2011)Nature Biotechnology29:143–148(Miller等人,2011年,《自然生物技术》,第29卷,第143-148页);所有这些文献均以引用的方式并入本文。
合适TAL核酸酶的实例以及用于制备合适TAL核酸酶的方法公开于例如美国专利申请No.2011/0239315A1、No.2011/0269234A1、No.2011/0145940A1、No.2003/0232410A1、No.2005/0208489A1、No.2005/0026157A1、No.2005/0064474A1、No.2006/0188987A1和No.2006/0063231A1中(每一份专利申请均据此以引用的方式并入本文)。在各种实施例中,TAL效应物核酸酶被改造成在例如所关注的基因座或所关注的基因组基因座中的靶核酸序列中或附近进行切割,其中所述靶核酸序列位于靶向载体将要修饰的序列处或附近。适合与本文所提供的各种方法和组合物一起使用的TAL核酸酶,包括被专门设计成在本文所述的靶向载体将要修饰的靶核酸序列之处或附近进行结合的那些TAL核酸酶。
在一个实施例中,TALEN的每个单体包含12-25个TAL重复序列,其中每个TAL重复序列结合1bp的亚位点。在一些TALEN中,TALEN的每个单体包含经由两个高变残基识别单碱基对的33-35个TAL重复序列。在一个实施例中,核酸酶试剂为嵌合蛋白,其包含有效连接至独立核酸酶的基于TAL重复序列的DNA结合结构域。在一个实施例中,独立核酸酶为FokI内切核酸酶。在一个实施例中,核酸酶试剂包含第一基于TAL重复序列的DNA结合结构域和第二基于TAL重复序列的DNA结合结构域,其中所述第一基于TAL重复序列的DNA结合结构域和第二基于TAL重复序列的DNA结合结构域中的每一者均有效连接至FokI核酸酶,其中所述第一基于TAL重复序列的DNA结合结构域和第二基于TAL重复序列的DNA结合结构域识别每条DNA靶序列中被约6bp至约40bp切割位点隔开的两条邻接DNA靶序列,并且其中所述FokI核酸酶发生二聚化,从而在靶序列处产生双链断裂。例如,核酸酶试剂可以包含第一基于TAL重复序列的DNA结合结构域和第二基于TAL重复序列的DNA结合结构域,其中所述第一基于TAL重复序列的DNA结合结构域和第二基于TAL重复序列的DNA结合结构域中的每一者均有效连接至FokI核酸酶,其中所述第一和第二基于TAL重复序列的DNA结合结构域识别每条DNA靶序列中被可变长度(12-20bp)的间隔序列隔开的两条邻接DNA靶序列,并且其中所述FokI核酸酶亚基发生二聚化,从而生成能在靶序列处产生双链断裂的活性核酸酶。
在本文所公开的各种方法和组合物中采用的核酸酶试剂还可包括锌指核酸酶(ZFN)。在一个实施例中,ZFN的每个单体包含3个或更多个基于锌指的DNA结合结构域,其中每个基于锌指的DNA结合结构域结合于3bp亚位点。在其他实施例中,ZFN为包含有效连接至独立核酸酶的、基于锌指的DNA结合结构域的嵌合蛋白。在一个实施例中,独立内切核酸酶为FokI内切核酸酶。在一个实施例中,核酸酶试剂包含第一ZFN和第二ZFN,其中所述第一ZFN和第二ZFN中的每一者均有效连接至FokI核酸酶,其中所述第一ZFN和第二ZFN识别DNA靶序列每条链中被约6bp至约40bp的切割位点隔开的两条邻接DNA靶序列,并且其中所述FokI核酸酶二聚化以产生双链断裂。例如,所述核酸酶试剂可以包含第一ZFN和第二ZFN,其中所述第一ZFN和第二ZFN中的每一者均有效连接至FokI核酸酶亚基,其中所述第一ZFN和第二ZFN识别DNA靶序列每条链中被约5-7bp间隔序列隔开的两条邻接DNA靶序列,并且其中所述FokI核酸酶亚基二聚化以生成能产生双链断裂的活性核酸酶。参见例如US20060246567;US20080182332;US20020081614;US20030021776;WO/2002/057308A2;US20130123484;US20100291048;以及WO/2011/017293A2,这些专利中的每一者以引用方式并入本文。
在又一个实施例中,核酸酶试剂为大范围核酸酶。已基于保守序列基序将大范围核酸酶分类为四个家族,这些家族为LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His-Cys框家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。大范围核酸酶以其长识别位点以及耐受其DNA底物中的一些序列多态性而著称。大范围核酸酶结构域、结构和功能是已知的,参见例如,Guhan and Muniyappa(2003)Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248(Guhan和Muniyappa,2003年,《生物化学与分子生物学评论》,第38卷,第199-248页);Lucas et al.,(2001)Nucleic Acids Res 29:960-9(Lucas等人,2001年,《核酸研究》,第29卷,第960-969页);Jurica and Stoddard,(1999)Cell Mol Life Sci 55:1304-26(Jurica和Stoddard,1999年,《细胞和分子生命科学》,第55卷,第1304-1326页);Stoddard,(2006)Q RevBiophys 38:49-95(Stoddard,2006年,《生物物理学季评》,第38卷,第49-95页);以及Moureet al.,(2002)Nat Struct Biol 9:764(Moure等人,2002年,《自然结构生物学》,第9卷,第764页)。在一些示例中,使用天然存在的变体和/或经改造的衍生大范围核酸酶。用于调整动力学、辅因子相互作用、表达、最适条件和/或识别位点特异性及活性筛选的方法是已知的,参见例如,Epinat et al.,(2003)Nucleic Acids Res 31:2952-62(Epinat等人,2003年,《核酸研究》,第31卷,第2952-2962页);Chevalier et al.,(2002)Mol Cell 10:895-905(Chevalier等人,2002年,《分子细胞》,第10卷,第895-905页);Gimble et al.,(2003)Mol Biol334:993-1008(Gimble等人,2003年,《分子生物学》,第334卷,第993-1008页);Seligman et al.,(2002)Nucleic Acids Res 30:3870-9(Seligman等人,2002年,《核酸研究》,第30卷,第3870-3879页);Sussman et al.,(2004)J Mol Biol 342:31-41(Sussman等人,2004年,《分子生物学杂志》,第342卷,第31-41页);Rosen et al.,(2006)NucleicAcids Res 34:4791-800(Rosen等人,2006年,《核酸研究》,第34卷,第4791-4800页);Chames et al.,(2005)Nucleic Acids Res 33:e178(Chames等人,2005年,《核酸研究》,第33卷,第e178页);Smith et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34:e149(Smith等人,2006年,《核酸研究》,第34卷,第e149页);Gruen et al.,(2002)Nucleic Acids Res 30:e29(Gruen等人,2002年,《核酸研究》,第30卷,第e29页);Chen and Zhao,(2005)Nucleic Acids Res33:e154(Chen和Zhao,2005年,《核酸研究》,第33卷,第e154页);WO2005105989;WO2003078619;WO2006097854;WO2006097853;WO2006097784;以及WO2004031346。
可在本发明中使用任何大范围核酸酶,包括但不限于I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、PI-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NcIIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII、或其任何活性变体或片段。
在一个实施例中,所述大范围核酸酶识别12至40个碱基对的双链DNA序列。在一个实施例中,所述大范围核酸酶识别基因组中的一个完全匹配的靶序列。在一个实施例中,所述大范围核酸酶为归巢核酸酶。在一个实施例中,所述归巢核酸酶为归巢核酸酶的LAGLIDADG家族。在一个实施例中,归巢核酸酶的LAGLIDADG家族选自I-SceI、I-CreI和I-Dmol。
核酸酶试剂还可包括限制性核酸内切酶,它们包括I型、II型、III型和IV型核酸内切酶。I型和III型限制性内切核酸酶识别特定识别位点,但通常在离核酸酶结合位点的可变位置处切割,该核酸酶结合位点离切割位点(识别位点)可达数百个碱基对。在II型系统中,酶切活性独立于任何甲基化酶活性,并且通常在结合位点之内或附近的特定位点处发生切割。大多数II型酶切开回文序列,但是IIa型酶识别非回文识别位点并在识别位点之外切割,IIb型酶在识别位点之外的两个位点处切开序列两次,并且IIs型酶识别非对称识别位点并在一侧且离识别位点约1-20个核苷酸的限定距离处切割。IV型限制性内切酶靶向甲基化DNA。限制性内切酶进一步在例如REBASE数据库中进行说明和分类(网址为rebase.neb.com的网页;Roberts et al.,(2003)Nucleic Acids Res 31:418-20(Roberts等人,2003年,《核酸研究》,第31卷,第418-420页),Roberts et al.,(2003)Nucleic AcidsRes 31:1805-12(Roberts等人,2003年,《核酸研究》,第31卷,第1805-1812页),以及Belfort et al.,(2002)in Mobile DNA II,pp.761-783,Eds.Craigie et al.,(ASMPress,Washington,DC)(Belfort等人,2002年,载于《可移动的DNA II》,第761-783页,Craigie等人编辑,美国华盛顿特区ASM出版社))。
在各种方法和组合物中采用的核酸酶试剂还可以包含成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)体系或此类体系的组分。CRISPR/Cas系统包括参与Cas基因的表达或指导Cas基因的活性的转录物和其他元件。CRISPR/Cas系统可为I型、II型或III型系统。本文所公开的方法和组合物通过利用CRISPR复合物(包含与Cas蛋白复合的向导RNA(gRNA))来采用CRISPR/Cas系统对核酸进行定点切割。
用于本文所公开的方法中的一些CRISPR/Cas系统为非天然存在的。“非天然存在的”系统包括任何表明受到人工干预的系统,诸如该系统的一个或多个组分从其天然存在的状态改变或突变,至少基本上不含其在自然界中与其天然关联的至少一个其他组分,或和不与其天然关联的至少一个其他组分相关联。例如,一些CRISPR/Cas系统采用非天然存在的CRISPR复合物,这些复合物包含在天然情况下不会同时存在的gRNA和Cas蛋白。
Cas蛋白一般包含至少一个RNA识别或结合结构域。此类结构域可与向导RNA(gRNA,下文更详细地说明)相互作用。Cas蛋白还可包含核酸酶结构域(例如,DNA酶或RNA酶结构域)、DNA结合结构域、解旋酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域、二聚化结构域以及其他结构域。核酸酶结构域具有用于核酸切割的催化活性。切割包括核酸分子共价键的断裂。切割可产生平头末端或交错末端,并且其可为单链或双链的。
Cas蛋白的示例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1或Csx12)、Cas10、Casl0d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966,以及它们的同源物或修饰形式。
在一些情况下,Cas蛋白来源于II型CRISPR/Cas体系。例如,Cas蛋白可为Cas9蛋白或衍生自Cas9蛋白。这些Cas9蛋白通常共用具有保守架构的四个关键基序。基序1、2和4为RuvC样基序,并且基序3为HNH基序。Cas9蛋白可来自例如化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属物种(Streptococcussp.)、达氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、酸热脂环酸芽孢杆菌(AlicyclobacHlusacidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克氏菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆藻属物种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、聚球藻属物种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobiumarabaticum)、制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptorbecscii)、Candidatus Desulforudis、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、丙酸互营细菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、紫色硫细菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属物种(Marinobactersp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcuswatsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属物种(Nostocsp.)、极大节螺藻(Arthrospira maxima)、钝顶节螺藻(Arthrospira platensis)、节螺藻属物种(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属物种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)、颤藻属物种(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、或深海单细胞蓝细菌(Acaryochloris marina)。Cas9蛋白可以来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。Cas9家族成员的附加示例包括在WO 2014/131833中描述的那些,该专利全文以引用的方式并入本文。在一个具体示例中,Cas9蛋白是来自化脓性链球菌(S.pyogenes)或从其衍生的Cas9蛋白。来自化脓性链球菌的Cas9蛋白的氨基酸序列可以在例如SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到。
Cas蛋白可为野生型蛋白(即,自然界存在的蛋白)、经修饰的Cas蛋白(即,Cas蛋白变体)、或者野生型或经修饰的Cas蛋白的片段。Cas蛋白也可以是野生型或经修饰的Cas蛋白的活性变体或片段。活性变体或片段可与野生型或经修饰的Cas蛋白或者其一部分具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性,其中所述活性变体保留了在所需切割位点处切开的能力,从而保留了切口诱导活性或双链断裂诱导活性。针对切口诱导活性或双链断裂诱导活性的测定法是已知的,并且一般测量Cas蛋白对包含切割位点的DNA底物的总体活性和特异性。
可修饰Cas蛋白以提高或降低核酸结合亲和力、核酸结合特异性和/或酶活性。还可修饰Cas蛋白以改变蛋白的任何其他活性或特性,诸如稳定性。例如,Cas蛋白的一个或多个核酸酶结构域可以被修饰、缺失或失活,或者Cas蛋白可以被截短以去除对于蛋白质的功能并非必要的结构域,或优化(例如,增强或降低)Cas蛋白的活性。
一些Cas蛋白包含至少两个核酸酶结构域,诸如DNA酶结构域。例如,Cas9蛋白可包含RuvC样核酸酶结构域和HNH样核酸酶结构域。RuvC结构域和HNH结构域各自可切开双链DNA的不同链,从而在DNA中产生双链断裂。参见例如Jinek et al.(2012)Science 337:816-821(Jinek等人,2012年,《科学》,第337卷,第816-821页),该文献全文据此以引用的方式并入。
这些核酸酶结构域中的一者或两者可以被缺失或突变,使得它们不再有功能或具有降低的核酸酶活性。如果核酸酶结构域之一被缺失或突变,则所得的Cas蛋白(例如,Cas9)可称为切口酶,并且可在双链DNA内的靶序列处生成单链断裂,但不会生成双链断裂(即,其可切割互补链或非互补链,但无法同时切割两者)。如果这两个核酸酶结构域都被缺失或突变,则所得的Cas蛋白(例如,Cas9)将具有降低的切割双链DNA两条链的能力。将Cas9转变为切口酶的突变的示例是来自化脓性链球菌的Cas9的RuvC结构域中的D10A(Cas9的第10位处天冬氨酸至丙氨酸)突变。同样,来自化脓性链球菌的Cas9的HNH结构域中的H939A(氨基酸位置839处组氨酸至丙氨酸)或H840A(氨基酸位置840处组氨酸至丙氨酸)可将Cas9转变为切口酶。将Cas9转变为切口酶的突变的其他示例包括来自嗜热链球菌(S.thermophilus)的Cas9的对应突变。参见例如Sapranauskas et al.(2011)NucleicAcids Research 39:9275-9282(Sapranauskas等人,2011年,《核酸研究》,第39卷,第9275-9282页)和WO 2013/141680,这些文献中的每一篇全文均以引用的方式并入本文。此类突变可使用诸如定点诱变、PCR介导的诱变或全基因合成的熟知方法来生成。其他形成切口酶的突变的示例可见于例如WO/2013/176772A1和WO/2013/142578A1中,这些专利中的每一篇均以引用的方式并入本文。
Cas蛋白也可为融合蛋白。例如,Cas蛋白可融合到切割结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录阻遏物结构域。参见WO2014/089290,该专利全文以引用的方式并入本文。Cas蛋白也可融合到异源多肽,从而提供增强或减弱的稳定性。融合的结构域或异源多肽可位于N端、C端或Cas蛋白的内部。
Cas融合蛋白的一个示例是与提供亚细胞定位的异源多肽融合的Cas蛋白。此类序列可以包括例如用于靶向细胞核的核定位信号(NLS)如SV40NLS、用于靶向线粒体的线粒体定位信号、ER滞留信号等。参见例如Lange et al.(2007)J.Biol.Chem.282:5101-5105(Lange等人,2007年,《生物化学杂志》,第282卷,第5101-5105页)。此类亚细胞定位信号可位于N端、C端或Cas蛋白内的任何位置处。NLS可包含一段碱性氨基酸,并且可为单分型(monopartite)序列或双分型(bipartite)序列。
Cas蛋白也可包含细胞穿透结构域。例如,细胞穿透结构域可衍生自HIV-1TAT蛋白、来自人乙肝病毒的TLM细胞穿透基序、MPG、Pep-1、VP22、来自单纯性疱疹病毒的细胞穿透肽、或多聚精氨酸肽序列。参见例如WO 2014/089290,该专利全文以引用的方式并入本文。细胞穿透结构域可位于N端、C端或Cas蛋白内的任何位置处。
Cas蛋白还可包含便于示踪或纯化的异源多肽,诸如荧光蛋白、纯化标签或表位标签。荧光蛋白的示例包括绿色荧光蛋白(例如,GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreenl)、黄色荧光蛋白(例如,YFP、eYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellowl)、蓝色荧光蛋白(例如,eBFP、eBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如,eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(mKate、mKate2、mPlum、DsRedmonomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry、Jred)、橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)以及任何其他合适的荧光蛋白。标签的示例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白(TRX)、多聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、血凝素(HA)、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、组氨酸(His)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)以及钙调蛋白。
Cas蛋白可以任何形式提供。例如,Cas蛋白可以蛋白的形式提供,诸如与gRNA复合的Cas蛋白。作为另一种选择,Cas蛋白可以编码Cas蛋白的核酸的形式提供,诸如RNA(例如,信使RNA(mRNA))或DNA。任选地,编码Cas蛋白的核酸可进行密码子优化,以在特定细胞或生物体(即,人细胞)中有效翻译成蛋白。当将编码Cas蛋白的核酸导入细胞中时,Cas蛋白可在细胞中瞬时地、条件性地或组成型地表达。
编码Cas蛋白的核酸可稳定整合在细胞的基因组中,并有效连接至细胞中有活性的启动子。作为另一种选择,编码Cas蛋白的核酸可有效连接至表达构建体中的启动子。表达构建体包括任何能够指导目标基因或其他核酸序列(例如,Cas基因)的表达并可将这种目标核酸序列转移到靶细胞中的核酸构建体。例如,编码Cas蛋白的核酸可以在包含核酸插入物的靶向载体和/或包含编码gRNA的DNA的载体中。另选地,其可以在与包含核酸插入物的靶向载体分离的载体或质粒中,和/或与包含编码gRNA的DNA的载体分离的载体或质粒中。可用于表达构建体中的启动子包括例如在人iPS细胞中有活性的启动子或被转化以表达原始态的非多能细胞。此类启动子可为例如条件启动子、诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。
“向导RNA”或“gRNA”包括结合到Cas蛋白并使Cas蛋白靶向靶DNA内特定位置的RNA分子。向导RNA可包含两个区段:“DNA靶向区段”和“蛋白结合区段”。“区段”包括分子的区段、部分或区域,诸如RNA中的一个邻接核苷酸段。一些gRNA包含两个单独的RNA分子:“激活因子-RNA”和“靶向因子-RNA”。其他gRNA为单个RNA分子(单条RNA多核苷酸),其也可称为“单分子gRNA”、“单向导RNA”或“sgRNA”。参见例如WO/2013/176772A1、WO/2014/065596A1、WO/2014/089290A1、WO/2014/093622A2、WO/2014/099750A2、WO/2013142578A1以及WO2014/131833A1,这些专利中的每一篇均以引用的方式并入本文。术语“向导RNA”和“gRNA”是包含性的,包括双分子gRNA和单分子gRNA。
示例性双分子gRNA包含crRNA样(“CRISPR RNA”或“靶向因子-RNA”或“crRNA”或“crRNA重复序列”)分子以及对应的tracrRNA样(“反式作用CRISPR RNA”或“激活因子-RNA”或“tracrRNA”或“支架”)分子。crRNA包含gRNA的DNA靶向区段(单链)和一段核苷酸,该段核苷酸形成gRNA的蛋白结合区段的dsRNA双链体的一半。
对应的tracrRNA(激活因子-RNA)包含一段核苷酸,该段核苷酸形成gRNA的蛋白结合区段的dsRNA双链体的另一半。crRNA的一段核苷酸与tracrRNA的一段核苷酸互补并杂交,从而形成gRNA的蛋白结合结构域的dsRNA双链体。因此,每个crRNA可以说成具有对应的tracrRNA。
crRNA和对应的tracrRNA杂交以形成gRNA。crRNA另外提供了与靶序列杂交的单链DNA靶向区段。如果用于细胞内的修饰,则给定crRNA或tracrRNA分子的确切序列可被设计成对于将在其中使用这些RNA分子的物种具有特异性。参见例如Mali et al.(2013)Science 339:823-826(Mali等人,2013年,《科学》,第339卷,第823-826页);Jinek et al.(2012)Science 337:816-821(Jinek等人,2012年,《科学》,第337卷,第816-821页);Hwanget al.(2013)Nat.Biotechnol.31:227-229(Hwang等人,2013年,《自然-生物技术》,第31卷,第227-229页);Jiang et al.(2013)Nat.Biotechnol.31:233-239(Jiang等人,2013年,《自然-生物技术》,第31卷,第233-239页);以及Cong et al.(2013)Science 339:819-823(Cong等人,2013年,《科学》,第339卷,第819-823页),这些文献中的每一篇以引用方式并入本文。
给定gRNA的DNA靶向区段(crRNA)包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列。gRNA的DNA靶向区段通过杂交(即,碱基配对)以序列特异性方式与靶DNA相互作用。因此,DNA靶向区段的核苷酸序列可变化,并且决定将与gRNA和靶DNA相互作用的靶DNA内的位置。可修饰个体gRNA的DNA靶向区段,以与靶DNA内的任何所需序列杂交。天然存在的crRNA随Cas9系统和生物体不同而不同,但通常包含21至72个核苷酸长的靶向区段,该靶向区段被21至46个核苷酸长的两个正向重复序列(DR)侧接(参见例如WO2014/131833)。就化脓性链球菌而言,DR为36个核苷酸长,并且靶向区段为30个核苷酸长。位于3’的DR与对应的tracrRNA互补并杂交,继而结合于Cas9蛋白。
DNA靶向区段的长度可为约12个核苷酸至约100个核苷酸。例如,DNA靶向区段的长度可为约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约40nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、或约12nt至约19nt。作为另一种选择,DNA靶向区段的长度可为约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约19nt至约70nt、约19nt至约80nt、约19nt至约90nt、约19nt至约100nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt、约20nt至约60nt、约20nt至约70nt、约20nt至约80nt、约20nt至约90nt、或约20nt至约100nt。
与靶DNA的核苷酸序列(靶序列)互补的DNA靶向区段的核苷酸序列的长度可为至少约12nt。例如,DNA靶向序列(即,与靶DNA内的靶序列互补的DNA靶向区段内的序列)可具有至少约12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt的长度。另选地,DNA靶向序列的长度可为约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt,或约20nt至约60nt。在一些情况下,DNA靶向序列可具有至少约20nt的长度。
TracrRNA可为任何形式(例如,全长tracrRNA或有活性的部分tracrRNA)并具有不同长度。它们可包括初级转录物或加工形式。例如,tracrRNA(作为单向导RNA的一部分或作为属于双分子gRNA的一部分的单独分子)可包含以下部分或由以下部分组成:野生型tracrRNA序列的全部或一部分(例如,野生型tracrRNA序列的约或大于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多个核苷酸)。来自化脓性链球菌的野生型tracrRNA序列的示例包括171个核苷酸、89个核苷酸、75个核苷酸以及65个核苷酸的形式。参见例如Deltcheva etal.(2011)Nature 471:602-607(Deltcheva等人,2011年,《自然》,第471卷,第602-607页);WO2014/093661,这些文献中的每一篇全文均以引用的方式并入本文。单向导RNA(sgRNA)内的tracrRNA的示例包括存在于+48、+54、+67和+85形式的sgRNA内的tracrRNA区段,其中“+n”表示野生型tracrRNA的至多+n核苷酸包含在sgRNA中。参见US 8,697,359,该专利全文以引用的方式并入本文。
DNA靶向序列与靶DNA内的靶序列之间的互补性百分比可为至少60%(例如,至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)。在一些情况下,DNA靶向序列与靶DNA内的靶序列之间的互补性百分比在约20个邻接核苷酸内为至少60%。在一个示例中,在靶DNA的互补链内的靶序列的5’端的14个邻接核苷酸内,DNA靶向序列与靶DNA内的靶序列之间的互补性百分比为100%,并且在其余邻接核苷酸内低至0%。在这种情况下,DNA靶向序列可被视为14个核苷酸长。在另一个示例中,在靶DNA的互补链内的靶序列的5’端的七个邻接核苷酸内,DNA靶向序列与靶DNA内的靶序列之间的互补性百分比为100%,并且在其余邻接核苷酸内低至0%。在这种情况下,DNA靶向序列可被视为7个核苷酸长。
gRNA的蛋白结合区段可包含彼此互补的两段核苷酸。蛋白结合区段的互补核苷酸杂交而形成双链RNA双链体(dsRNA)。对象gRNA的蛋白结合区段与Cas蛋白相互作用,并且gRNA经由DNA靶向区段指导结合的Cas蛋白到达靶DNA内的特异性核苷酸序列。
向导RNA可包括提供额外所需特征(例如,经修饰或调控的稳定性;亚细胞靶向;用荧光标记物示踪;蛋白或蛋白复合物的结合位点;等等)的修饰或序列。此类修饰的示例包括例如5'帽(例如,7-甲基鸟苷酸帽(m7G));3'多聚腺苷酸化尾(即,3'多聚(A)尾);核糖开关序列(例如,以实现经调控的稳定性和/或经调控的蛋白和/或蛋白复合物可及性);稳定性控制序列;形成dsRNA双链体(即,发夹)的序列;使RNA靶向亚细胞位置(例如,细胞核、线粒体、叶绿体等)的修饰或序列;提供示踪的修饰或序列(例如,与荧光分子的直接缀合、与有利于荧光检测的部分的缀合、允许荧光检测的序列等);为蛋白质(例如,作用于DNA的蛋白质,包括转录激活因子、转录阻遏物、DNA甲基转移酶、DNA去甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白去乙酰化酶等)提供结合位点的修饰或序列;以及它们的组合。
向导RNA可以任何形式提供。例如,gRNA可以RNA的形式(作为两分子(单独的crRNA和tracrRNA)或作为一分子(sgRNA))提供,并任选地以与Cas蛋白的复合物形式提供。gRNA也可以编码RNA的DNA的形式提供。编码gRNA的DNA可编码单个RNA分子(sgRNA)或单独的RNA分子(例如,单独的crRNA和tracrRNA)。在后一情况下,编码gRNA的DNA可作为分别编码crRNA和tracrRNA的单独DNA分子提供。
当将编码gRNA的DNA引入细胞中时,gRNA可在细胞中瞬时地、条件性地或组成型地表达。编码gRNA的DNA可稳定整合在细胞的基因组中,并有效连接至在细胞中有活性的启动子。作为另一种选择,编码gRNA的DNA可有效连接至表达构建体中的启动子。例如,编码gRNA的DNA可以在包含核酸插入物的靶向载体和/或包含编码Cas蛋白的核酸的载体中。另选地,其可以在与包含核酸插入物的靶向载体分离的载体或质粒中,和/或与包含编码Cas蛋白的核酸的载体分离的载体或质粒中。此类启动子例如在人iPS细胞或被转化以表达多能性状态的非多能细胞中是有活性的。此类启动子可为例如条件启动子、诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。在一些情况下,启动子是RNA聚合酶III启动子,例如人U6启动子。
另选地,可通过各种其他方法制备gRNA。例如,可通过采用例如T7RNA聚合酶的体外转录来制备gRNA(参见例如WO 2014/089290和WO2014/065596)。向导RNA也可为通过化学合成制备的合成产生的分子。
CRISPR/Cas体系的靶序列包括靶DNA中存在的这样的核酸序列,只要存在充分的结合条件,gRNA的DNA靶向区段就将与该核酸序列结合。例如,靶序列包括向导RNA被设计成与之具有互补性的序列,其中靶序列与DNA靶向序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。不必要求完全互补性,只要存在足以引起杂交并促进CRISPR复合物形成的互补性即可。靶序列还包括下文更详细说明的Cas蛋白的切割位点。靶序列可包含任何多核苷酸,所述多核苷酸可位于例如细胞的细胞核或细胞质中,或位于细胞的细胞器如线粒体或叶绿体内。
靶DNA内的靶序列可被Cas蛋白或gRNA所靶向(即,与之结合、或与之杂交、或与之互补)。合适的DNA/RNA结合条件包括通常存在于细胞中的生理条件。其他合适的DNA/RNA结合条件(例如,无细胞系统中的条件)是本领域已知的(参见例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al.,Harbor Laboratory Press 2001)(《分子克隆实验指南》,第3版,Sambrook等人,冷泉港实验室出版社,2001年))。与Cas蛋白或gRNA互补并杂交的靶DNA链可称为“互补链”,并且与“互补链”互补(并因此不与Cas蛋白或gRNA互补)的靶DNA链可称为“非互补链”或“模板链”。
Cas蛋白可在将与gRNA的DNA靶向区段结合的靶DNA中存在的核酸序列之内或之外的位点处切割核酸。“切割位点”包括Cas蛋白产生单链断裂或双链断裂的核酸位置。例如,CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与Cas蛋白复合的gRNA)的形成可导致将与gRNA的DNA靶向区段结合的靶DNA中存在的核酸序列之中或附近(例如,在相距1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对内)的一条或两条链切割。如果切割位点位于将与gRNA的DNA靶向区段结合的靶DNA中存在的核酸序列之外,则切割位点仍被视为在“靶序列”内。切割位点可位于核酸的仅一条链上或两条链上。切割位点可位于核酸的两条链上的相同位置处(产生平头末端),或可位于每条链上的不同位点处(产生交错末端)。可例如通过使用在每条链上的不同切割位点处产生单链断裂的两种Cas蛋白来产生交错末端。例如,第一切口酶可在双链DNA(dsDNA)的第一链上形成单链断裂,而第二切口酶可在dsDNA的第二链上形成单链断裂,使得形成悬垂序列。在一些情况下,第一链上的切口酶的靶序列与第二链上的切口酶的靶序列相隔至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、250、500或1,000个碱基对。
Cas9对靶DNA的位点特异性切割可在由以下两者决定的位置处发生:(i)gRNA与靶DNA之间的碱基配对互补性,以及(ii)靶DNA中的短基序,称为前间区序列邻近基序(PAM)。PAM可侧接靶序列。任选地,靶序列可以在3'末端上侧接PAM。例如,Cas9的切割位点可为PAM序列上游或下游的约1至约10或者约2至约5个碱基对(例如,3个碱基对)。在一些情况下(例如,当使用来自化脓性链球菌的Cas9或密切相关的Cas9时),非互补链的PAM序列可为5'-XGG-3',其中X为任何DNA核苷酸,并且X紧邻靶DNA的非互补链的靶序列的3'。因此,互补链的PAM序列将为5'-CCY-3',其中Y为任何DNA核苷酸并且Y紧邻靶DNA的互补链的靶序列的5'。在一些此类情况下,X和Y可为互补的,并且X-Y碱基对可为任何碱基对(例如,X=C且Y=G;X=G且Y=C;X=A且Y=T,X=T且Y=A)。
靶序列的示例包括与gRNA的DNA靶向区段互补的DNA序列、或除PAM序列之外的这种DNA序列。靶序列的一个示例包括核苷酸序列GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG(GN1-20GG;SEQID NO:2)。其他靶序列可具有4-22个核苷酸长的SEQ ID NO:2,包含5’G和3’GG。另外一些靶序列可具有14与20个核苷酸之间长度的SEQ ID NO:2。
靶序列可为细胞内源或外源的任何核酸序列。靶序列可为编码基因产物(例如,蛋白)的序列或非编码序列(例如,调控序列或垃圾DNA)或者可包括两者。
本发明还提供了核酸酶试剂的活性变体和片段(即,经改造的核酸酶试剂)。此类活性变体可与天然核酸酶试剂具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性,其中所述活性变体保留在所需识别位点处切割的能力,从而保留切口或双链断裂诱导活性。例如,本文所述的任何核酸酶试剂可由天然内切核酸酶序列修饰而成,并且可被设计成在不被天然核酸酶试剂识别的识别位点处识别并诱导切口或双链断裂。因此,在一些实施例中,经改造的核酸酶具有在与对应天然核酸酶试剂识别位点不同的识别位点处诱导切口或双链断裂的特异性。针对切口或双链断裂诱导活性的测定法是已知的,并且一般测量内切核酸酶对包含识别位点的DNA底物的总体活性和特异性。
可通过本领域已知的任何方式将核酸酶试剂导入多能细胞中。可将编码核酸酶试剂的多肽直接引入细胞中。另选地,可将编码核酸酶试剂的多核苷酸引入细胞中。当将编码核酸酶试剂的多核苷酸导入细胞中时,核酸酶试剂可在细胞内瞬时地、条件性地或组成性地表达。因此,编码核酸酶试剂的多核苷酸可包含在表达盒中,并有效连接至条件启动子、诱导型启动子、组成型启动子或组织特异性启动子。另选地,将核酸酶试剂作为编码核酸酶试剂的mRNA引入细胞中。
在具体实施例中,编码核酸酶试剂的多核苷酸稳定整合在多能细胞的基因组中,并有效连接至细胞中有活性的启动子。在其他实施例中,编码核酸酶试剂的多核苷酸位于包含核酸插入物的相同靶向载体中,而在其他情况下,编码核酸酶试剂的多核苷酸位于与包含核酸插入物的靶向载体分离的载体或质粒中。
当通过导入编码核酸酶试剂的多核苷酸来向多能细胞提供核酸酶试剂时,可修饰这种编码核酸酶试剂的多核苷酸,以置换与编码核酸酶试剂的天然存在的多核苷酸序列相比在所关注的细胞中具有更高使用频率的密码子。例如,与天然存在的多核苷酸序列相比,可以修饰编码核酸酶试剂的多核苷酸以置换在人细胞中具有更高使用频率的密码子。
b选择标记物
可以在本文所公开的方法和组合物中使用各种选择标记物,所述选择标记物提供用于修饰染色体上的靶基因组基因座。此类标记物在本文其他地方公开,包括但不限于赋予对抗生素的抗性的选择标记物,所述抗生素为诸如G418、潮霉素、杀稻瘟素、新霉素或嘌呤霉素。编码选择标记物的多核苷酸有效连接至在人iPS细胞或被转化以表达原始态的非多能细胞中有活性的启动子。
c靶基因组基因座
提供了可允许将至少一个核酸插入物整合在染色体上的靶基因组基因座处的各种方法和组合物。“染色体上的靶基因组基因座”包括染色体上期望整合核酸插入物的DNA的任何区段或区域。所靶向的染色体上的基因组基因座可以对人iPS细胞或被转化以表达多能性状态的非多能细胞是天然的,或者另选地可以包含被整合到细胞染色体中的异源或外源DNA区段。此类异源或外源DNA区段可包括转基因、表达盒、编码选择标记物的多核苷酸,或者基因组DNA的异源或外源区域。染色体上的靶基因组基因座可包含靶向基因组整合体系中的任一种,包括例如识别位点、选择标记物、此前整合的核酸插入物、编码核酸酶试剂的多核苷酸、启动子等。另选地,染色体上的靶基因组基因座可位于适当宿主细胞中所含的酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体或任何其他经改造的基因组区域内。因此,在具体实施例中,染色体上所靶向的基因组基因座可包含来自人细胞的天然基因序列,或来自非人哺乳动物、非人细胞、啮齿动物、人、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、白鼬、灵长类动物(例如,狨猴、恒河猴)、家养哺乳动物或农业哺乳动物或任何其他所关注的生物体,或者它们的组合的异源或外源基因组核酸序列。
d靶向载体和核酸插入物
如上所述,本文提供的方法和组合物单独或与核酸酶试剂组合地使用靶向载体。“同源重组”常规用于指代在同源区内的交叉位点处两个DNA分子之间的DNA片段交换。
i核酸插入物
一个或多个分开的核酸插入物可以用于本文公开的方法中,并且可以通过分开的靶向载体或在相同的靶向载体上将它们导入细胞。核酸插入物包含待整合到基因组靶基因座的DNA区段。在靶基因座处整合核酸插入物可以导致向靶基因座添加所关注的核酸序列,靶基因座处所关注的核酸序列的缺失,和/或对靶基因座处所关注的核酸序列的替代。
核酸插入物或被替代的靶基因座处的相应核酸可以是编码区、内含子、外显子、非翻译区、调控区、启动子、增强子,或它们的任何组合。此外,核酸插入物或被替代的靶基因座处的相应核酸可以是任何期望的长度,包括例如在10至100个核苷酸之间的长度,100至500个核苷酸的长度,500个核苷酸至1kb的长度,1kb至1.5kb核苷酸的长度,1.5kb至2kb核苷酸的长度,2kb至2.5kb核苷酸的长度,2.5kb至3kb核苷酸的长度,3kb至5kb核苷酸的长度,5kb至8kb核苷酸的长度,8kb至10kb核苷酸的长度。在其他情况下,长度可以为约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约40kb,约40kb至约60kb,约60kb至约80kb,约80kb至约100kb,约100kb至约150kb,约150kb至约200kb,约200kb至约250kb,约250kb至约300kb,约300kb至约350kb,约350kb至约400kb,约400kb至约800kb,约800kb至1Mb,约1Mb至约1.5Mb,约1.5Mb至约2Mb,约2Mb至约2.5Mb,约2.5Mb至约2.8Mb,约2.8Mb至约3Mb。在其他情况下,长度可以为至少100、200、300、400、500、600、700、800或900个核苷酸或至少1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb或更大。
在一些靶向载体中,核酸插入物可以为约5kb至约200kb,约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约30kb,约30kb至约40kb,约40kb至约50kb,约60kb至约70kb,约80kb至约90kb,约90kb至约100kb,约100kb至约110kb,约120kb至约130kb,约130kb至约140kb,约140kb至约150kb,约150kb至约160kb,约160kb至约170kb,约170kb至约180kb,约180kb至约190kb,约190kb至约200kb。另选地,核酸插入物可以为约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约40kb,约40kb至约60kb,约60kb至约80kb,约80kb至约100kb,约100kb至约150kb,约150kb至约200kb,约200kb至约250kb,约250kb至约300kb,约300kb至约350kb,或者约350kb至约400kb。
在一些情况下,替代靶基因座处的核酸导致靶序列缺失在约1kb至约200kb,约2kb至约20kb,或者约0.5kb至约3Mb的范围内。在一些情况下,缺失的程度大于5’同源臂和3’同源臂的总长度。
在一些情况下,靶序列的缺失程度在以下范围内:约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约40kb,约40kb至约60kb,约60kb至约80kb,约80kb至约100kb,约100kb至约150kb,约150kb至约200kb,约20kb至约30kb,约30kb至约40kb,约40kb至约50kb,约50kb至约60kb,约60kb至约70kb,约70kb至约80kb,约80kb至约90kb,约90kb至约100kb,约100kb至约110kb,约110kb至约120kb,约120kb至约130kb,约130kb至约140kb,约140kb至约150kb,约150kb至约160kb,约160kb至约170kb,约170kb至约180kb,约180kb至约190kb,约190kb至约200kb,约200kb至约250kb,约250kb至约300kb,约300kb至约350kb,约350kb至约400kb,约400kb至约800kb,约800kb至1Mb,约1Mb至约1.5Mb,约1.5Mb至约2Mb,约2Mb至约2.5Mb,约2.5Mb至约2.8Mb,约2.8Mb至约3Mb,约200kb至约300kb,约300kb至约400kb,约400kb至约500kb,约500kb至约1Mb,约1Mb至约1.5Mb,约1.5Mb至约2Mb,约2Mb至约2.5Mb,或约2.5Mb至约3Mb。
在其他情况下,核酸插入物或被替代的靶基因座处的相应核酸可以是至少10kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少150kb、至少200kb、至少250kb、至少300kb、至少350kb、至少400kb、至少450kb,或者至少500kb或更多。
核酸插入物可以包含基因组DNA或任何其他类型的DNA。例如,核酸插入物可以来源于:原核生物、真核生物、酵母、禽类(例如,鸡)、非人哺乳动物、啮齿动物、人、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、猫、狗、白鼬、灵长类动物(例如,狨猴、恒河猴)、家养哺乳动物或农业哺乳动物,或任何其他所关注的生物体。在一个示例中,插入多核苷酸可以包含任何人或非人基因组基因座。
核酸插入物和/或靶基因座处的核酸可包含编码序列或非编码序列,诸如调控元件(例如启动子、增强子,或转录阻遏物结合元件)。例如,核酸插入物可以包含内源性基因的至少一个外显子的敲入等位基因,或整个内源性基因的敲入等位基因(即“基因交换敲入”)。
核酸插入物还可以包含条件型等位基因。条件型等位基因为如US2011/0104799中所述的多功能等位基因,该专利全文以引用方式并入本文。例如,条件型等位基因可以包含:(a)相对于靶基因的转录呈有义取向的致动序列;(b)呈有义或反义取向的药物选择盒(DSC);(c)呈反义取向的所关注核苷酸序列(NSI);以及(d)呈反义取向的倒转条件模块(COIN,其利用外显子断裂内含子和可倒转的基因诱捕样模块。参见例如US 2011/0104799,该专利全文以引用方式并入本文。条件型等位基因还可以包含在暴露于第一重组酶后重组以形成条件型等位基因的可重组单元,所述条件型等位基因(i)缺乏致动序列和DSC;并且(ii)含有呈有义取向的NSI和呈反义取向的COIN。参见US 2011/0104799。
一些核酸插入物包含编码选择标记物的多核苷酸。选择标记物可以包含在选择盒中。此类选择标记包括但不限于新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puror)、杀稻瘟菌素S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-k),或者它们的组合。编码选择标记物的多核苷酸可以有效连接至在所靶向的细胞中有活性的启动子。
在一些靶向载体中,核酸插入物包含报告基因。报告基因的示例是编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、DsRed、ZsGreen、MmGFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-Red、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、Cerulean、T-Sapphire、碱性磷酸酶,以及它们的组合的基因。此类报告基因可有效连接至在所靶向的细胞中有活性的启动子。
在一些靶向载体中,核酸插入物包含一个或多个表达盒或缺失盒。给定表达盒可包含所关注的核苷酸序列、编码选择标记物的核酸,和/或报告基因,以及影响表达的各种调控组分。可以包括的选择性标记物和报告基因的示例在本文其他地方详细论述。
在一些靶向载体中,插入核酸包含侧接有位点特异性重组靶序列的核酸。虽然整个插入核酸可侧接这种位点特异性重组靶序列,但该插入核酸内的所关注的任何区域或单独多核苷酸也可侧接此类位点。可位于插入核酸或在插入核酸中的任何所关注多核苷酸两侧的位点特异性重组靶序列可包括例如loxP、lox511、lox2272、lox66、lox71、loxM2、lox5171、FRT、FRT11、FRT71、attp、att、FRT、rox,以及它们的组合。在一个示例中,位点特异性重组位点位于插入核酸内所含的编码选择标记物和/或报告基因的多核苷酸两侧。在所靶向基因座处整合插入核酸之后,可除去位点特异性重组位点之间的序列。
ii靶向载体
可以采用靶向载体将核酸插入物导入靶基因组基因座,并且靶向载体包含核酸插入物和位于核酸插入物两侧的同源臂。靶向载体可以是线形形式或环形形式,并且可以是单链或双链的。为了易于参考,同源臂在本文中称为5’和3’(即上游和下游)同源臂。该术语涉及靶向载体内的同源臂与核酸插入物的相对位置。5'和3'同源臂对应于所靶向的基因座内的区域,所述区域在本文中分别称为“5’靶序列”和“3’靶序列”。
当两个区域彼此共有足够水平的序列同一性时,同源臂和靶序列彼此“对应”,从而充当同源重组反应的底物。术语“同源性”包括DNA序列与对应序列相同或共有序列同一性。给定靶序列与存在于靶向载体上的对应同源臂之间的序列同一性可为允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如,靶向载体的同源臂(或其片段)与靶序列(或其片段)共有的序列同一性的量可为至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性,以使得所述序列经历同源重组。此外,同源臂与对应靶序列之间的对应同源区可具有足以促进在切割的识别位点处同源重组的任何长度。例如,给定同源臂和/或对应靶序列可包含对应同源区,所述对应同源区为至少约5-10kb、5-15kb、5-20kb、5-25kb、5-30kb、5-35kb、5-40kb、5-45kb、5-50kb、5-55kb、5-60kb、5-65kb、5-70kb、5-75kb、5-80kb、5-85kb、5-90kb、5-95kb、5-100kb、100-200kb,或200-300kb长或更长(如在本文其他地方描述的LTVEC载体中所述),以使得同源臂与细胞基因组内的对应靶序列具有足以经历同源重组的同源性。
同源臂可与对细胞为天然的基因座(例如,靶基因座)相对应,或者另选地,它们可与整合到细胞基因组中的异源或外源DNA区段的区域相对应,所述区域包括例如转基因、表达盒或者异源或外源DNA区域。另选地,靶向载体的同源臂可与酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体的区域或在适当宿主细胞中包含的任何其他经改造的区域相对应。更进一步,靶向载体的同源臂可与BAC文库、粘粒文库或P1噬菌体文库的区域相对应,或者可来源于BAC文库、粘粒文库或P1噬菌体文库的区域。在某些情况下,靶向载体的同源臂对应于对人iPS细胞或被转化以表达原始态的非多能细胞是天然、异源或外源的基因座。在一些情况下,同源臂与细胞中的基因座相对应,在不存在核酸酶试剂(例如,Cas蛋白)诱导的切口或双链断裂的情况下,该基因座无法使用常规方法靶向,或仅可不正确地或仅以显著较低效率靶向。在一些情况下,同源臂来源于合成DNA。
在一些靶向载体中,5'和3'同源臂对应于安全港基因座。所整合的外源DNA与宿主基因组之间的相互作用可以限制整合的可靠性和安全性,并且可能会导致明显的表型效应,所述表型效应不是由于靶向基因修饰,而是替代地由于周围内源性基因上的整合的非预期影响。例如,随机插入的转基因可经受位置效应和沉默,使其表达不可靠和不可预测。同样,将外源DNA整合到染色体基因座中可以影响周围的内源性基因和染色质,从而改变细胞行为和表型。安全港基因座包括其中转基因或其他外源核酸插入物可以在所有所关注的组织中稳定和可靠地表达,而不会明显改变细胞行为或表型的染色体基因座。参见例如Sadelain et al.(2012)Nat.Rev.Cancer12:51-58(Sadelain等人,2012年,《自然癌症综述》,第12卷,第51-58页)。例如,安全港基因座可以包括其中外源DNA可以可预测的方式整合并起作用,而不会不利地影响内源性基因结构或表达的染色体基因座。安全港基因座可以包含基因外区域或基因内区域,诸如基因内非必要、可有可无、或能够被破坏而没有明显的表型结果的基因座。
例如,Rosa26基因座及其在人体中的等同物在所有组织中提供了开放的染色质构型,并且在胚胎发育过程中和在成人体内遍在表达。参见Zambrowicz et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3789-3794(Zambrowicz等人,1997年,《美国国家科学院院刊》,第94卷,第3789-3794页)。此外,Rosa26基因座可以高效靶向,并且Rosa26基因的破坏不产生明显的表型。合适的基因座的另一个示例是Ch25h基因座。
靶向载体的同源臂可具有足以促进与对应靶序列的同源重组事件的任何长度,包括例如至少5-10kb、5-15kb、5-20kb、5-25kb、5-30kb、5-35kb、5-40kb、5-45kb、5-50kb、5-55kb、5-60kb、5-65kb、5-70kb、5-75kb、5-80kb、5-85kb、5-90kb、5-95kb、5-100kb、100-200kb,或200-300kb的长度或更长。如下文进一步详细描述,大靶向载体可采用更大长度的靶向臂。
核酸酶试剂(例如,CRISPR/Cas体系)可与靶向载体组合使用,以帮助修饰靶基因座。此类核酸酶试剂可以促进靶向载体和靶基因座之间的同源重组。当核酸酶试剂与靶向载体组合使用时,靶向载体可以包含对应于定位为足够接近核酸酶切割位点的5'和3'靶序列的5'和3'同源臂,以促进在核酸酶切割位点处产生切口或双链断裂后靶序列与同源臂之间的同源重组事件。术语“核酸酶切割位点”包括在其处用核酸酶试剂产生切口或双链断裂的DNA序列(例如,Cas9切割位点)。如果距离是诸如会促进在识别位点处产生切口或双链断裂后在5’和3’靶序列与同源臂之间发生同源重组事件的距离,那么所靶向的基因座内与靶向载体的5’和3’同源臂对应的靶序列“位于足够接近”核酸酶切割位点处。因此,在特定情况下,对应于靶向载体的5’和/或3’同源臂的靶序列在给定识别位点的至少1个核苷酸内,或者在给定识别位点的至少10个核苷酸至约14kb内。在一些情况下,核酸酶切割位点紧邻靶序列中的至少一者或两者。
对应于靶向载体的同源臂的靶序列与核酸酶切割位点的空间关系可变化。例如,靶序列可位于核酸酶切割位点的5’端,靶序列可位于识别位点的3’端,或者靶序列可位于核酸酶切割位点两侧。
与单独使用靶向载体相比,联合使用靶向载体(包括例如大靶向载体)与核酸酶试剂可以提高靶向效率。例如,当与单独使用靶向载体相比时,当靶向载体与核酸酶试剂联合使用时,靶向载体的靶向效率可以提高至少两倍、至少三倍、至少4倍或至少10倍。
iii大靶向载体
一些靶向载体是“大靶向载体”或“LTVEC”,其包括包含对应于和来源于比由旨在在细胞中进行同源重组的其他方法通常使用的那些核酸序列更大的核酸序列的同源臂的靶向载体。使用LTVEC产生靶向基因修饰的示例公开于例如WO 2015/088643、US 2015/0159175、US 2015/0159174、US 2014/0310828、US 2014/0309487和US 2013-0309670中,这些专利中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入本文。LTVEC还包括包含具有比由旨在在细胞中进行同源重组的其他方法通常使用的那些核酸序列更大的核酸序列的核酸插入物的靶向载体。例如,LTVEC使得对大基因座的修饰成为可能,而传统的基于质粒的靶向载体由于有大小限制而无法实现这一点。例如,所靶向的基因座可以是(即,5’和3’同源臂可以对应于)在不存在核酸酶试剂(例如,Cas蛋白)诱导的切口或双链断裂的情况下,无法使用常规方法靶向,或仅可不正确地或仅以显著较低效率靶向的细胞基因座。
LTVEC的示例包括衍生自细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体或酵母人工染色体(YAC)的载体。LTVEC及其制备方法的非限制性示例描述于例如美国专利No.6,586,251;美国专利No.6,596,541;美国专利No.7,105,348;和WO 2002/036789(PCT/US01/45375)中,这些专利每一者均以引用方式并入本文。LTVEC可以是线形形式或环形形式。
LTVEC可以为任何长度,包括例如约50kb至约300kb,约50kb至约75kb,约75kb至约100kb,约100kb至约125kb,约125kb至约150kb,约150kb至约175kb,约175kb至约200kb,约200kb至约225kb,约225kb至约250kb,约250kb至约275kb,或约275kb至约300kb。另选地,LTVEC可以是至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少150kb、至少200kb、至少250kb、至少300kb、至少350kb、至少400kb、至少450kb,或至少500kb或更多。LTVEC的尺寸可能太大,以致无法通过常规测定法如Southern印迹和长片段(例如,1kb-5kb)PCR来筛选靶向事件。
在一些情况下,LTVEC包括在约5kb至约200kb,约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约30kb,约30kb至约40kb,约40kb至约50kb,约60kb至约70kb,约80kb至约90kb,约90kb至约100kb,约100kb至约110kb,约120kb至约130kb,约130kb至约140kb,约140kb至约150kb,约150kb至约160kb,约160kb至约170kb,约170kb至约180kb,约180kb至约190kb,或约190kb至约200kb范围内的核酸插入物。在其他情况下,插入核酸可以在约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约40kb,约40kb至约60kb,约60kb至约80kb,约80kb至约100kb,约100kb至约150kb,约150kb至约200kb,约200kb至约250kb,约250kb至约300kb,约300kb至约350kb,或约350kb至约400kb的范围内。
在一些LTVEC中,上游同源臂和下游同源臂的总和为至少10kb。在其他LTVEC中,上游同源臂在约5kb至约100kb的范围内和/或下游同源臂在约5kb至约100kb的范围内。上游同源臂和下游同源臂的总和可以为例如约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约30kb,约30kb至约40kb,约40kb至约50kb,约50kb至约60kb,约60kb至约70kb,约70kb至约80kb,约80kb至约90kb,约90kb至约100kb,约100kb至约110kb,约110kb至约120kb,约120kb至约130kb,约130kb至140Mb,约140Mb至约150Mb,约150Mb至约160Mb,约170Mb至约180Mb,约180Mb至约190Mb,或约190Mb至约200Mb。
在一些情况下,LTVEC和核酸插入物经设计以允许在靶基因座处约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约40kb,约40kb至约60kb,约60kb至约80kb,约80kb至约100kb,约100kb至约150kb,约150kb至约200kb,约200kb至约300kb,约300kb至约400kb,约400kb至约500kb,约500kb至约1Mb,约1Mb至约1.5Mb,约1.5Mb至约2Mb,约2Mb至约2.5Mb,或约2.5Mb至约3Mb的缺失。另选地,所述缺失可以是至少10kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少150kb、至少200kb、至少250kb、至少300kb、至少350kb、至少400kb、至少450kb,或者至少500kb或更多。
在其他情况下,LTVEC和核酸插入物经设计以允许向靶基因座插入在约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约40kb,约40kb至约60kb,约60kb至约80kb,约80kb至约100kb,约100kb至约150kb,约150kb至约200kb,约200kb至约250kb,约250kb至约300kb,约300kb至约350kb,或约350kb至约400kb的范围内的外源核酸序列。另选地,所述插入可以是至少10kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少150kb、至少200kb、至少250kb、至少300kb、至少350kb、至少400kb、至少450kb,或者至少500kb或更多。
在其他情况下,核酸插入物和/或内源性基因座中所缺失的区域是至少100、200、300、400、500、600、700、800或900个核苷酸或至少1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb或更大。
iv通过同源重组将核酸插入物整合到染色体上的识别位点附近的方法
在一些示例中,用于修饰多能细胞中染色体上的靶基因组基因座的方法可以包括:(a)提供在染色体上包含靶基因组基因座的细胞;(b)向该细胞中导入包含侧接有对应于5'和3'靶序列的5'和3'同源臂的第一核酸插入物的第一靶向载体;以及(c)鉴定在其基因组中包含整合在染色体上的靶基因组基因座处的第一核酸插入物的至少一个细胞。如本文其他地方详细论述的,在具体实施例中,靶向载体的第一同源臂和第二同源臂的总和是约4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、约4kb至约5kb、约5kb至约6kb、约6kb至约7kb、约8kb至约9kb,或者是至少10kb或至少10kb,并且小于150kb。在具体实施例中,采用LTVEC。在一个非限制性实施例中,采用本文所提供的培养基来进行此类方法。
在其他示例中,用于修饰多能细胞中染色体上的靶基因组基因座的方法可以包括:(a)提供在染色体上包含靶基因组基因座的细胞,该靶基因组基因座包含核酸酶试剂的识别位点,(b)将以下物质导入该细胞中(i)核酸酶试剂,其中所述核酸酶试剂诱导所述第一识别位点处的切口或双链断裂;和(ii)第一靶向载体,其包含侧接有5’和3’同源臂的第一核酸插入物,所述5’和3’同源臂对应于位置足够接近所述第一识别位点的5’和3’靶序列;以及(c)鉴定在其基因组中包含整合在染色体上的靶基因组基因座处的第一核酸插入物的至少一个细胞。如本文其他地方详细论述的,在具体实施例中,靶向载体的第一同源臂和第二同源臂的总和是约4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、约4kb至约5kb、约5kb至约6kb、约6kb至约7kb、约8kb至约9kb,或者是至少10kb或至少10kb,并且小于150kb。在具体实施例中,采用LTVEC。在一个非限制性实施例中,采用本文所提供的培养基来进行此类方法。
还可采用各种方法来鉴定具有整合在靶基因组基因座处的核酸插入物的多能细胞。核酸插入物在靶基因组基因座处的插入产生“等位基因修饰”。术语“等位基因修饰”或“MOA”包括基因组中的一个或多个基因座位或者染色体座位的一个等位基因的精确DNA序列的修饰。“等位基因修饰(MOA)”的实例包括但不限于缺失、置换或插入少至单个核苷酸,或者跨一个或多个目标基因座位或者目标染色体座位缺失数千碱基,以及介于这两个极端之间的任何和所有可能的修饰。
在各种实施例中,为了方便靶向修饰的鉴定,采用了高通量定量测定法,即,等位基因修饰(MOA)测定法。本文所述的MOA测定法允许在遗传修饰之后大规模筛选亲本染色体中的一个或多个经修饰的等位基因。MOA测定法可经由各种分析技术进行,包括但不限于定量PCR,例如实时PCR(qPCR)。例如,实时PCR包括识别靶基因座的第一引物-探针组和识别非靶向参考基因座的第二引物-探针组。此外,引物-探针组包含识别扩增序列的荧光探针。定量测定法还可经由多种分析技术进行,包括但不限于荧光介导原位杂交(FISH)、比较基因组杂交、等温DNA扩增、定量固定探针杂交、InvaderMMP分子信标和EclipseTM探针技术。参见例如US2005/0144655,该专利全文以引用方式并入本文。
在各种实施例中,在存在切口或双链断裂的情况下,靶向载体(诸如LTVEC)在靶基因组基因座处的靶向效率是不存在切口或双链断裂(使用例如相同靶向载体和相同同源臂以及所关注的基因组基因座处的对应靶位点,但不含会造成切口或双链断裂的所添加核酸酶试剂)时的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍。
可顺序地重复上述各种方法,以允许任何数量的核酸插入物靶向整合到染色体上给定的所靶向基因组基因座中。因此,所述各种方法可提供以用于向染色体上的靶基因组基因座中插入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核酸插入物。在特定实施例中,此类顺序拼接方法允许将来自动物细胞或来自哺乳动物细胞(即,人、非人、啮齿动物、小鼠、猴、大鼠、仓鼠、家养哺乳动物或农业动物)的大基因组区域重建到染色体上所靶向的基因组基因座中。在此类情况下,包含编码区和非编码区两者的基因组区域的转移和重建允许通过至少部分地保留在天然基因组区域内发现的编码区、非编码区和拷贝数变异来保持给定区的复杂性。因此,各种方法提供了例如在人iPS细胞或被转化以表达多能性状态的非多能细胞中产生“异源”或“外源”基因组区域的方法。
v所关注的多核苷酸
任何所关注的多核苷酸都可包含在各种核酸插入物中并由此整合在染色体上的靶基因组基因座处。本文所公开的方法提供整合到所靶向的基因组基因座中的至少1、2、3、4、5、6个或更多个所关注的多核苷酸。
当在染色体上的靶基因组基因座处整合时,核酸插入物内的所关注多核苷酸可将一个或多个基因修饰导入多能细胞中。所述基因修饰可包括缺失内源核酸序列和/或将外源或异源或直系同源多核苷酸添加到靶基因组基因座中。在一个实施例中,所述基因修饰包括在靶基因组基因座处用所关注的外源多核苷酸替换内源核酸序列。因此,本文所提供的方法允许在染色体上的靶基因组基因座中生成基因修饰,所述基因修饰包括敲除、缺失、插入、替换(“敲入”)、点突变、结构域交换、外显子交换、内含子交换、调控序列交换、基因交换,或它们的组合。此类修饰可在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或任何后续的核酸插入物整合到靶基因组基因座中后发生。
在核酸插入物内的和/或在靶基因组基因座处整合的所关注多核苷酸可包括对于其被导入的多能细胞为天然的或同源的序列;所关注多核苷酸对于其被导入的细胞可为异源的;所关注多核苷酸对于其被导入的细胞可为外源的;所关注多核苷酸对于其被导入的细胞可为直系同源的;或者所关注多核苷酸可来自与其被导入的细胞不同的物种。指涉序列的“同源”包括对所述细胞天然的序列。指涉序列的“异源”包括来源于外来物种的序列,或者,如果序列来源于同一物种,则通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座方面从其天然形式进行了实质性修饰。指涉序列的“外源”包括源于外来物种的序列。“直系同源”包括来自一种物种的在功能上与另一物种中的已知参考序列等效的多核苷酸(即,物种变体)。所关注的多核苷酸可来自任何所关注的生物体,包括但不限于非人、啮齿动物、仓鼠、小鼠、大鼠、人、猴、禽、农业哺乳动物或非农业哺乳动物。目标多核苷酸还可包含编码区、非编码区、调控区或基因组DNA。因此,第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7和/或后续核酸插入物中的任一者可包含此类序列。
在一个实施例中,在核酸插入物内和/或整合在染色体上的靶基因组基因座处的所关注多核苷酸是与人核酸同源的。在更进一步的实施例中,在靶基因座处整合的目标多核苷酸为基因组核酸的片段。在一个实施例中,基因组核酸为小鼠基因组核酸、人基因组核酸、非人核酸、啮齿动物核酸、大鼠核酸、仓鼠核酸、猴核酸、农业哺乳动物核酸或非农业哺乳动物核酸,或者它们的组合。
在一个实施例中,如上所述,所关注的多核苷酸可在约500个核苷酸至约200kb的范围内,如上所述。所关注的多核苷酸可以是约500个核苷酸至约5kb,约5kb至约200kb,约5kb至约10kb,约10kb至约20kb,约20kb至约30kb,约30kb至约40kb,约40kb至约50kb,约60kb至约70kb,约80kb至约90kb,约90kb至约100kb,约100kb至约110kb,约120kb至约130kb,约130kb至约140kb,约140kb至约150kb,约150kb至约160kb,约160kb至约170kb,约170kb至约180kb,约180kb至约190kb,或约190kb至约200kb。
在核酸插入物内和/或插入在染色体上的靶基因组基因座处的所关注多核苷酸可编码多肽,可编码miRNA,可编码非编码的长RNA,或者其可包含任何所关注的调控区或非编码区,包括例如调控序列、启动子序列、增强子序列、转录阻遏物结合序列、或非蛋白编码序列的缺失,但不包含蛋白编码序列的缺失。另外,在核酸插入物内和/或插入在染色体上的靶基因组基因座处的所关注多核苷酸可编码在神经系统、骨骼系统、消化系统、循环系统、肌肉系统、呼吸系统、心血管系统、淋巴系统、内分泌系统、泌尿系统、生殖系统或它们的组合中表达的蛋白。
在核酸插入物内和/或整合在染色体上的靶基因组基因座处的所关注多核苷酸可包含编码序列中的基因修饰。此类遗传修饰包括但不限于编码序列的缺失突变或两个编码序列的融合。
在核酸插入物内和/或整合在染色体上的靶基因组基因座处的所关注多核苷酸可包含编码突变蛋白的多核苷酸。在一个实施例中,所述突变体蛋白的特征在于改变的结合特性、改变的定位、改变的表达和/或改变的表达模式。在一个实施例中,在核酸插入物内和/或整合在染色体上的靶基因组基因座处的所关注多核苷酸包含至少一种疾病等位基因。在此类情况下,所述疾病等位基因可为显性等位基因,或者所述疾病等位基因为隐性等位基因。此外,所述疾病等位基因可包括单核苷酸多态性(SNP)等位基因。编码突变体蛋白的目标多核苷酸可来自任何生物体,包括但不限于编码突变体蛋白的哺乳动物、非人哺乳动物、啮齿动物、小鼠、大鼠、人、猴、农业哺乳动物或家养哺乳动物多核苷酸。
在核酸插入物内和/或整合在染色体上的靶基因组基因座处的所关注多核苷酸还可包含调控序列,包括例如启动子序列、增强子序列、转录阻遏物结合序列,或转录终止子序列。在具体实施例中,在核酸插入物内和/或整合在染色体上的靶基因组基因座处的所关注多核苷酸包括具有非蛋白编码序列缺失但不包含蛋白编码序列缺失的多核苷酸。在一个实施例中,所述非蛋白编码序列的缺失包括调控序列的缺失。在另一个实施例中,所述调控元件的缺失包括启动子序列的缺失。在一个实施例中,所述调控元件的缺失包括增强子序列的缺失。此类目标多核苷酸可来自任何生物体,包括但不限于编码突变体蛋白的哺乳动物、非人哺乳动物、啮齿动物、小鼠、大鼠、人、猴、农业哺乳动物或家养哺乳动物多核苷酸。
上文或下文引用的所有专利申请、网站、其他出版物、登录号等出于所有目的,以如同每个单独项目被特定地和单独地表示为以引用方式并入的相同程度,全文以引用方式并入本文。如果序列的不同版本与不同时间的登录号相关,则与本申请的有效提交日时的登录号相关联的版本是有意义的。有效提交日是指关于登录号的优先权申请(如果适用)的实际在先提交日或提交日。同样地,如果不同版本的出版物、网站等在不同时间被公布,则除非另有说明,否则最近在本申请的有效申请日公布的版本是有意义的。本发明的任何特征、步骤、元件、实施例或方面可以与任何其他项组合使用,除非另有特别说明。在获得以上说明和相关附图中给出的教导的益处后,本发明的方法和组合物所属领域的技术人员可以想到本文叙述的所述方法和组合物的许多修改形式和其他实施例。因此,应当理解,所述方法和组合物并不局限于所公开的具体实施例,并且这些修改形式和其他实施例也包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了专用术语,但是它们仅用于一般的说明性的意义,而不是为了限制。
所描述的发明可以以其他特定形式体现而不脱离本发明的精神或本质属性,因此,应参照所附权利要求而不是上述说明书,来表示本发明的范围。
以下实例以说明性方式而非限制性方式提供。
实例
实例1:人iPS细胞的产生。
该实例描述了从非多能人细胞产生人iPS细胞。抽样协议如表2所示。使用RED和BLUE GeneInTM转染试剂(GlobalStem公司)将包含编码有效连接至CM7启动子的四种重编程因子(hOct4、hSox2、hKLF-4、hMYC)的基因的PiggyBac(SBI公司(System Biosciences))载体(PB-600A_CAGGGS Bst XI(0.64μg/μL)和PB-200(0.99μg/μL))导入新生儿人包皮成纤维细胞中。将转染的细胞在E7培养基(美国生命技术公司)中的NuFF1饲养细胞上孵育以允许并入载体和表达重编程因子。E7培养基的组成为DMEM/F-12、NaHCO3、L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和FGF-2。
在转染后10天,使用2μg/mL嘌呤霉素在E7培养基中开始进行嘌呤霉素选择。在第21天,选择集落并在mTeSRTM培养基(来自STEMCELL技术公司的mTeSRTM1培养基)中培养,所述mTeSRTM培养基包含DMEM/F-12、NaHCO3、L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒、FGF-2、TGF-β1、谷胱甘肽、L-谷氨酰胺、定义的脂质、硫胺素、痕量元素B和C、β-巯基乙醇、牛血清白蛋白、哌可酸,氯化锂,以及GABA。mTeSRTM培养基和E7培养基组分的比较如表3所示。在第29至57天,将细胞在mTeSRTM培养基中增殖和传代,直至在6孔板中达到约50%铺满。在第65至73天,使用mTeSRTM培养基和温和细胞解离试剂(Gentle Cell Dissociation Reagent)(细胞技术公司)继续增殖和传代。在第76天,将培养基改变为低渗透压VG2i培养基以进行包含原始态或原始样态的hiPSC的细胞的进一步增殖、传代和保持。上述方法中的传代时间由细胞形态确定。
表2用于产生人类iPS细胞的抽样协议。
表3mTeSR和E7培养基的组分比较。
实例2人iPS细胞中的LTVEC靶向。
此实施例描述了LTVEC靶向在人iPS细胞中的使用。如图1所示,我们通过电穿孔向在VG2i培养基中增殖的人iPS细胞导入以下核酸分子:(1)LTVEC(0.67μg);(2)编码Cas9核酸内切酶的质粒(5μg);以及(3)编码CRISPR单向导RNA(gRNA)的质粒(10μg)。在一组样品中,排除了Cas9和gRNA。具体地,在700V的电压、25uF的电容和400欧姆的电阻下电穿孔3×106个细胞。LTVEC包含16.7kb核酸,所述核酸包括侧接有同源臂的小鼠Adam6a和Adam6b基因,所述同源臂含有来源于旨在缺失的人ADAM6基因座的4.1kb序列两侧的基因组区的34kb和105kb基因组DNA。LTVEC还携带药物选择盒,所述药物选择盒指导赋予对抗生素药物(潮霉素)的抗性的酶的表达。所用的人ADAM6gRNA具有以下序列:GTATAGCCCTGTTACACATT(SEQID NO:1)。
摄入LTVEC并将其并入其基因组中的细胞能够在GELTREXTM包被的组织培养皿上于含有抗生素药物的生长培养基中生长并形成集落。因为我们导入了是LTVEC分子的500至1,000倍的CRISPR/Cas9编码核酸分子,所以大多数含有LTVEC的耐药集落也至少瞬时地含有CRISPR/Cas9组分。我们挑取耐药性集落并通过等位基因丧失法(Valenzuela et al.(2003)Nat.Biotech.21:652-660(Valenzuela等人,2003年,《自然-生物技术》,第21卷,第652-660页);Frendewey et al.(2010)Methods Enzymol.476:295-307(Frendewey等人,2010年,《酶学方法》,第476卷,第295-307页);这些文献全文以引用方式并入本文)筛选它们以鉴定具有正确靶向的等位基因的克隆。
ADAM6基因座的CRISPR/Cas9辅助的LTVEC靶向的结果示出于表4中。
表4CRISPR/Cas9辅助的LTVEC靶向
靶向条件 | 靶向效率 |
仅LTVEC | 3.1% |
LTVEC+CRISPR | 7.3% |
当将LTVEC单独导入人iPS细胞时,观察到了3.1%的靶向效率。相比之下,结合LTVEC与ADAM6gRNA导向的Cas9导致靶向效率为7.3%。
实例3:低渗透压培养基对人iPS细胞形态的影响
此实例描述了盐浓度、离子强度和/或渗透压对培养中的人iPS细胞的多能性状态的影响。将人iPS细胞在表5中描述的培养基(最终hLIF浓度为100U/mL;最终CHIR99021浓度为3μM,以及最终PD0325901浓度为0.5μM)中或在mTeSRTM-hLIF培养基中于MATRIGELTM或GELTREXTM底物上培养。
表5用于iPS细胞培养的培养基。
表6培养基的渗透压和培养基的组分
当所使用的基础培养基为DMEM时,此培养基被称为2i培养基。当所使用的基础培养基为VG-DMEM时,此低渗透压培养基被称为VG2i培养基。VG2i培养基的渗透压(233mOsm/kg)低于传统的2i培养基的渗透压(261mOsm/kg)。表6示出了这些培养基的渗透压以及不同基础培养基的渗透压和培养基组分。
如图2所示,在2i培养基中于MATRIGELTM上培养养8天(图2A)或12天(图2B)时段的人iPS细胞表现出始发态iPS细胞的形态特征,特别是以上皮细胞单层生长和呈现顶面-底侧极性。
进一步评估了mTeSRTM-hLIF培养基和VG2i培养基对人iPS细胞的形态和多能性状态的影响。在此研究中,将人iPS细胞在mTeSRTM-hLIF培养基(图3A和图3C)或VG2i培养基(图3B和图3D)中于MATRIGELTM或NuFF饲养细胞上培养6天的时段。当在mTeSRTM-hLIF培养基中于MATRIGELTM或NuFF饲养细胞上培养时,人iPS细胞表现出始发多能性状态特征,特别是以上皮细胞单层生长和呈现顶面-底侧极性。在mTeSRTM-hLIF培养基中培养的一些细胞开始表现出三维团聚特征的形态。相比之下,当在VG2i培养基中于MATRIGELTM或NuFF饲养细胞上培养时,人iPS细胞表现出原始多能性状态特征,特别是以圆顶形集落生长并且没有顶面-底侧极性。
实例4:低渗透压培养基对人iPS细胞中多能性标记物表达的影响。
此实例描述了盐浓度、离子强度和/或渗透压对已经从始发态重编程为原始态的人iPS细胞中的多能性标记物的表达的影响。在VG2i培养基中于MATRIGELTM底物上培养24天后,针对碱性磷酸酶或NANOG的表达来对重编程的原始态人iPS细胞进行染色。观察到重编程细胞强效表达碱性磷酸酶(图4A)和NANOG(图4B和图4C)两者,碱性磷酸酶和NANOG表征原始多能性状态。
实例5:低渗透压培养基对人iPS细胞的酶促解离和继代培养的影响。
在此实例中,使用胰蛋白酶将用低渗透压VG2i培养基重编程为原始态的人iPS细胞酶促解离以产生单细胞悬浮液(图5A)。将该细胞悬浮液传代到新的GELTREXTM包被平板上,以用于在VG2i培养基中进行继代培养。观察到在1天后(图5B)和4天后(图5C)继代培养的细胞继续表现出原始多能性状态的细胞的形态学特征。具体地,细胞生长为圆顶形集落并且未表现出顶面-底侧极性。值得注意的是,可以在没有ROCK抑制剂的情况下进行酶促解离,这通常是防止促凋亡途径活化所必需的。这表明促凋亡途径在本文所辨识的条件下培养的原始态人iPS细胞的酶促解离和继代培养期间不那么强效地活化。此外,在VG2i中培养并且在用胰蛋白酶促解离后作为单细胞传代的人iPS细胞保持正常核型。对来自不同克隆并在用胰蛋白酶促解离以产生单细胞悬浮液后产生的两个第10代人iPS细胞进行核型分析,这两个细胞都具有正常的46XY核型(图6A和图6B)。
序列表
<110> 琼科·库诺
沃基特克·奥尔巴赫
大卫·M.·巴伦苏埃拉
<120> 用于产生或维持多能细胞的方法和组合物
<130> 57766/469587
<150> US 62/064,384
<151> 2014-10-15
<160> 2
<170> 适用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
gtatagccct gttacacatt 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)...(21)
<223> n = A,T,C or G
<400> 2
gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种体外培养物,包含:
(a)人诱导多能干细胞(hiPSC)群体;和
(b)包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基,其中所述低渗透压培养基包含:
(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(iii)MEK抑制剂;
其中所述低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。
2.一种在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中制备或维持的人诱导多能干细胞(hiPSC)群体,其中所述低渗透压培养基包含:
(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(c)MEK抑制剂;
其中所述低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。
3.根据权利要求1所述的体外培养物或根据权利要求2所述的群体,
其中所述hiPSC:
(a)包括原始态或原始样态的hiPSC;
(b)表达一种或多种多能性标记物;
(c)表现出致密圆顶形集落特征的形态;
(d)可以分化成内胚层、外胚层或中胚层中任一者的细胞;
(e)具有在约16小时与约24小时之间的倍增时间;或者
(f)(a)至(e)的任何组合。
4.根据权利要求1或权利要求3所述的体外培养物或根据权利要求2或权利要求3所述的群体,其中所述hiPSC具有正常核型。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的体外培养物或群体,其中所述多能性标记物包含NANOG、碱性磷酸酶或它们的组合。
6.根据权利要求1和3至5中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至5中任一项所述的群体,其中所述hiPSC衍生自被转化以表达多能性状态的非多能细胞。
7.根据权利要求6所述的体外培养物或群体,其中所述转化细胞表达包含Oct4、Sox2、Klf4、Myc或它们的任何组合的重编程基因。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的体外培养物或群体,其中所述转化细胞包括始发态的hiPSC。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的体外培养物或群体,其中所述转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,然后在所述低渗透压培养基中培养,其中所述高渗透压培养基包含bFGF。
10.根据权利要求9所述的体外培养物或群体,其中所述高渗透压培养基的渗透压为至少约290mOsm/kg。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的体外培养物或群体,其中:
(a)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养,直至它们表达原始态或原始样态的特征;
(b)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养约2个月的时段;
(c)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养,直至它们表现出三维细胞团块特征的形态;或者
(d)它们的组合。
12.根据权利要求1和3至11中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至11中任一项所述的群体,其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
13.根据权利要求1和3至12中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至12中任一项所述的群体,其中所述基础培养基包含约3mg/ml的NaCl、约2.2mg/mL的碳酸氢钠,并且渗透压为约200mOsm/kg。
14.根据权利要求1和3至13中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至13中任一项所述的群体,其中所述基础培养基包含约4.5mg/mL的葡萄糖。
15.根据权利要求1和3至14中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至14中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约220mOsm/kg至约240mOsm/kg。
16.根据权利要求1和3至15中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至15中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约225mOsm/kg至约235mOsm/kg。
17.根据权利要求1和3至16中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至16中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约233mOsm/kg。
18.根据权利要求1和3至17中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至17中任一项所述的群体,其中:
(a)所述补充剂包含:
(i)F-12培养基;
(ii)N2补充剂;
(iii)NEUROBASAL培养基;
(iv)B-27补充剂;
(v)L-谷氨酰胺;
(vi)2-巯基乙醇;或
(vii)(i)至(vi)的任何组合;
(b)所述LIF多肽是人LIF(hLIF)多肽;
(c)所述GSK3抑制剂包含CHIR99021;
(d)所述MEK抑制剂包含PD0325901;或者
(e)(a)至(d)的任何组合。
19.根据权利要求1和3至18中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至18中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基包含基本上由糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂和MEK抑制剂组成的抑制剂。
20.根据权利要求1和3至19中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至19中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基包含约24.75%(v/v)的基础培养基、约24.75%(v/v)的F-12培养基、约0.5%(v/v)的N2补充剂、约49%(v/v)的NEUROBASAL培养基、约1%(v/v)的B-27补充剂、约2mM的L-谷氨酰胺、约0.1mM的2-巯基乙醇、约100单位/mL的hLIF、约3μM的CHIR99021,以及约0.5μM的PD0325901。
21.根据权利要求1和3至20中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至20中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基不包含以下中的一者或多者:bFGF补充剂、TGF-β1补充剂、JNK抑制剂、
p38抑制剂、ROCK抑制剂和PKC抑制剂。
22.根据权利要求1和3至21中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至21中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基不包含bFGF补充剂。
23.根据权利要求1和3至22中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至22中任一项所述的群体,其中所述hiPSC是在MATRIGEL、NuFF饲养细胞或GELTREX上培养的。
24.根据权利要求1和3至23中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至23中任一项所述的群体,其中可以将所述hiPSC酶促解离成单细胞悬浮液并传代培养。
25.根据权利要求24所述的体外培养物或群体,其中所述酶促解离:
(a)是使用胰蛋白酶进行的;
(b)是在不存在ROCK抑制剂的情况下进行的;或者
(c)它们的组合。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的体外培养物或群体,其中所述传代培养的hiPSC:
(a)继续表达所述一种或多种多能性标记物;
(b)维持原始态或原始样态,并且表现出致密圆顶形集落特征的形态;或者
(c)它们的组合。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的体外培养物或群体,其中所述传代培养的hiPSC维持正常核型。
28.一种制备人诱导多能干细胞(hiPSC)群体的方法,所述方法包括:在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中体外培养被转化以表达多能性状态的非多能细胞群体,其中所述低渗透压培养基包含:
(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(c)MEK抑制剂;
其中所述低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述方法可富集原始态或原始样态hiPSC的群体。
30.一种用于在体外培养物中维持人诱导多能干细胞(hiPSC)群体的方法,所述方法包括:在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养所述hiPSC群体,其中所述低渗透压培养基包含:
(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(c)MEK抑制剂;
其中所述低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法,其中可以将所述hiPSC酶促解离为单细胞悬浮液并传代培养。
32.根据权利要求29所述的方法,其中所述酶促解离:
(a)是使用胰蛋白酶进行的;
(b)是在不存在ROCK抑制剂的情况下进行的;或者
(c)它们的组合。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法,其中所述传代培养的hiPSC:
(a)继续表达一种或多种多能性标记物;
(b)维持原始态或原始样态,并且表现出致密圆顶形集落特征的形态;或者
(c)它们的组合。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法,其中所述传代培养的hiPSC维持正常核型。
35.一种用于修饰人诱导多能干细胞(hiPSC)中的靶基因组基因座的方法,包括:
(a)向所述hiPSC中引入包含插入核酸的靶向载体,所述插入核酸侧接有对应于所述靶基因组基因座处的5'和3'靶位点的5'和3'同源臂;以及
(b)鉴定在其基因组中包含整合在所述靶基因组基因座处的所述插入核酸的经遗传修饰的hiPSC;
其中所述hiPSC是在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养的,其中所述低渗透压培养基包含:
(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(iii)MEK抑制剂;
其中所述低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述靶向载体是大靶向载体(LTVEC),其中所述5'和3'同源臂的总和为至少10kb。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法,其中引入步骤(a)还包括:引入可促进所述hiPSC中所述靶向载体和所述靶基因组基因座之间的同源重组的核酸酶试剂。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法,其中所述靶向遗传修饰包括:
(a)内源性人核酸序列的缺失;
(b)外源核酸序列的插入;或者
(c)用所述外源核酸序列置换所述内源性人核酸序列。
39.根据权利要求38所述的方法,其中所述外源核酸序列包含以下的一种或多种:
(a)与所述内源性人核酸序列同源或直系同源的核酸序列;
(b)嵌合核酸序列;
(c)侧接有位点特异性重组酶靶序列的条件等位基因;和
(d)与在所述hiPSC中有活性的启动子有效连接的报告基因。
40.一种用于修饰人诱导多能干细胞(hiPSC)中的靶基因组基因座的方法,包括:
(a)向所述hiPSC中引入一种或多种可在所述靶基因组基因座的识别位点处诱导一个或多个切口或双链断裂的核酸酶试剂;以及
(b)鉴定在其基因组中包含在所述靶基因组基因座处的修饰的至少一个细胞;
其中所述hiPSC是在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养的,其中所述低渗透压培养基包含:
(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(iii)MEK抑制剂;
其中所述低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的方法,其中在步骤(a)之前,
将所述hiPSC酶促解离成单细胞悬浮液并传代培养。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述酶促解离:
(a)是使用胰蛋白酶进行的;
(b)是在不存在ROCK抑制剂的情况下进行的;或者
(c)它们的组合。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的方法,其中所述传代培养的hiPSC:
(a)继续表达一种或多种多能性标记物;
(b)维持原始态或原始样态,并且表现出致密圆顶形集落特征的形态;或者
(c)它们的组合。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的方法,其中所述传代培养的hiPSC维持正常核型。
45.根据权利要求37至44中任一项所述的方法,其中所述核酸酶试剂包含:
(a)锌指核酸酶(ZFN);
(b)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN);
(c)大范围核酸酶;或
(d)规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白,以及包含识别基因组靶序列的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的向导RNA(gRNA)。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9。
47.根据权利要求35至46中任一项所述的方法,其中所述靶向遗传修饰是双等位基因修饰。
48.根据权利要求28至47中任一项所述的方法,其中所述hiPSC:
(a)包含原始态或原始样态的hiPSC;
(b)表达一种或多种多能性标记物;
(c)表现出致密圆顶形集落特征的形态;
(d)可以分化成内胚层、外胚层或中胚层中任一者的细胞;
(e)具有在约16小时与约24小时之间的倍增时间;或者
(f)(a)至(e)的任何组合。
49.根据权利要求28至48中任一项所述的方法,其中所述hiPSC具有正常核型。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的方法,其中所述多能性标记物包含NANOG、碱性磷酸酶或它们的组合。
51.根据权利要求30至50中任一项所述的方法,其中所述hiPSC衍生自被转化以表达多能性状态的非多能细胞。
52.根据权利要求28、29和51中任一项所述的方法,其中所述转化细胞表达包含Oct4、Sox2、Klf4、Myc或它们的任何组合的重编程基因。
53.根据权利要求28、29、51和52中任一项所述的方法,其中所述转化细胞包含始发态的hiPSC。
54.根据权利要求28、29和51至53中任一项所述的方法,其中所述转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,然后在所述低渗透压培养基中培养,其中所述高渗透压培养基包含bFGF。
55.根据权利要求54所述的方法,其中所述高渗透压培养基的渗透压为至少约290mOsm/kg。
56.根据权利要求54或权利要求55所述的方法,其中:
(a)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养,直至它们表达原始态或原始样态的特征;
(b)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养约2个月的时段;
(c)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养,直至它们表现出三维细胞团块特征的形态;或者
(d)它们的组合。
57.根据权利要求28至56中任一项所述的方法,其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
58.根据权利要求28至57中任一项所述的方法,其中所述基础培养基包含约3mg/ml的NaCl、约2.2mg/mL的碳酸氢钠,并且渗透压为约200mOsm/kg。
59.根据权利要求28至58中任一项所述的方法,其中所述基础培养基包含约4.5mg/mL的葡萄糖。
60.根据权利要求28至59中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约220mOsm/kg至约240mOsm/kg。
61.根据权利要求28至60中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约225mOsm/kg至约235mOsm/kg。
62.根据权利要求28至61中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约233mOsm/kg。
63.根据权利要求28-62中任一项所述的方法,其中:
(a)所述补充剂包含:
(i)F-12培养基;
(ii)N2补充剂;
(iii)NEUROBASAL培养基;
(iv)B-27补充剂;
(v)L-谷氨酰胺;
(vi)2-巯基乙醇;或
(vii)(i)至(vi)的任何组合;
(b)所述LIF多肽是人LIF(hLIF)多肽;
(c)所述GSK3抑制剂包含CHIR99021;
(d)所述MEK抑制剂包含PD0325901;或者
(e)(a)至(d)的任何组合。
64.根据权利要求28至63中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基包含基本上由糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂和MEK抑制剂组成的抑制剂。
65.根据权利要求28至64中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基包含约24.75%(v/v)的基础培养基、约24.75%(v/v)的F-12培养基、约0.5%(v/v)的N2补充剂、约49%(v/v)的NEUROBASAL培养基、约1%(v/v)的B-27补充剂、约2mM的L-谷氨酰胺、约0.1mM的2-巯基乙醇、约100单位/mL的hLIF、约3M的CHIR99021以及约0.5M的PD0325901。
66.根据权利要求28至65中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基不包含以下中的一者或多者:bFGF补充剂、TGF-β1补充剂、JNK抑制剂、p38抑制剂、ROCK抑制剂和PKC抑制剂。
67.根据权利要求28至66中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基不包含bFGF补充剂。
68.根据权利要求28至67中任一项所述的方法,其中所述hiPSC在MATRIGEL、NuFF饲养细胞或GELTREX上培养。
69.一种hiPSC,所述hiPSC用根据权利要求28、29、31至34、48至50和52至68中任一项所述的方法制备。
70.一种经修饰的hiPSC,所述经修饰的hiPSC用根据权利要求35至68中任一项所述的方法制备。
Claims (66)
1.一种体外培养物,包含:
(a)hiPSC群体;和
(b)包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基,其中所述低渗透压培养基包含:
(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(iii)MEK抑制剂;
其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
2.一种在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中制备或维持的hiPSC群体,其中所述低渗透压培养基包含:
(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(c)MEK抑制剂;
其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
3.根据权利要求1所述的体外培养物或根据权利要求2所述的群体,
其中所述hiPSC:
(a)包括原始态或原始样态的hiPSC;
(b)表达一种或多种多能性标记物;
(c)表现出致密圆顶形集落特征的形态;
(d)可以分化成内胚层、外胚层或中胚层中任一者的细胞;
(e)具有在约16小时与约24小时之间的倍增时间;或者
(f)(a)至(e)的任何组合。
4.根据权利要求1或权利要求3所述的体外培养物或根据权利要求2或权利要求3所述的群体,其中所述hiPSC具有正常核型。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的体外培养物或群体,其中所述多能性标记物包含NANOG、碱性磷酸酶或它们的组合。
6.根据权利要求1和3至5中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至5中任一项所述的群体,其中所述hiPSC衍生自被转化以表达多能性状态的非多能细胞。
7.根据权利要求6所述的体外培养物或群体,其中所述转化细胞表达包含Oct4、Sox2、Klf4、Myc或它们的任何组合的重编程基因。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的体外培养物或群体,其中所述转化细胞包括始发态的hiPSC。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的体外培养物或群体,其中所述转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,然后在所述低渗透压培养基中培养,其中所述高渗透压培养基包含bFGF。
10.根据权利要求9所述的体外培养物或群体,其中所述高渗透压培养基的渗透压为至少约290mOsm/kg。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的体外培养物或群体,其中:
(a)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养,直至它们表达原始态或原始样态的特征;
(b)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养约2个月的时段;
(c)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养,直至它们表现出三维细胞团块特征的形态;或者
(d)它们的组合。
12.根据权利要求1和3至11中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至11中任一项所述的群体,其中所述基础培养基包含约3mg/ml的NaCl、约2.2mg/mL的碳酸氢钠,并且渗透压为约200mOsm/kg。
13.根据权利要求1和3至12中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至12中任一项所述的群体,其中所述基础培养基包含约4.5mg/mL的葡萄糖。
14.根据权利要求1和3至13中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至13中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。
15.根据权利要求1和3至14中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至14中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约233mOsm/kg。
16.根据权利要求1和3至15中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至15中任一项所述的群体,其中:
(a)所述补充剂包含:
(i)F-12培养基;
(ii)N2补充剂;
(iii)NEUROBASAL培养基;
(iv)B-27补充剂;
(v)L-谷氨酰胺;
(vi)2-巯基乙醇;或
(vii)(i)至(vi)的任何组合;
(b)所述LIF多肽是人LIF(hLIF)多肽;
(c)所述GSK3抑制剂包含CHIR99021;
(d)所述MEK抑制剂包含PD0325901;或者
(e)(a)至(d)的任何组合。
17.根据权利要求1和3至16中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至16中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基包含基本上由糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂和MEK抑制剂组成的抑制剂。
18.根据权利要求1和3至17中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至17中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基包含约24.75%(v/v)的基础培养基、约24.75%(v/v)的F-12培养基、约0.5%(v/v)的N2补充剂、约49%(v/v)的NEUROBASAL培养基、约1%(v/v)的B-27补充剂、约2mM的L-谷氨酰胺、约0.1mM的2-巯基乙醇、约100单位/mL的hLIF、约3μM的CHIR99021,以及约0.5μM的PD0325901。
19.根据权利要求1和3至18中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至18中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基不包含以下中的一者或多者:bFGF补充剂、TGF-β1补充剂、JNK抑制剂、p38抑制剂、ROCK抑制剂和PKC抑制剂。
20.根据权利要求1和3至19中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至19中任一项所述的群体,其中所述低渗透压培养基不包含bFGF补充剂。
21.根据权利要求1和3至20中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至20中任一项所述的群体,其中所述hiPSC是在MATRIGEL、NuFF饲养细胞或GELTREX上培养的。
22.根据权利要求1和3至21中任一项所述的体外培养物或根据权利要求2至21中任一项所述的群体,其中可以将所述hiPSC酶促解离成单细胞悬浮液并传代培养。
23.根据权利要求22所述的体外培养物或群体,其中所述酶促解离:
(a)是使用胰蛋白酶进行的;
(b)是在不存在ROCK抑制剂的情况下进行的;或者
(c)它们的组合。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的体外培养物或群体,其中所述传代培养的hiPSC:
(a)继续表达所述一种或多种多能性标记物;
(b)维持原始态或原始样态,并且表现出致密圆顶形集落特征的形态;或者
(c)它们的组合。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的体外培养物或群体,其中所述传代培养的hiPSC维持正常核型。
26.一种制备人诱导多能干细胞(hiPSC)群体的方法,所述方法包括:在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中体外培养被转化以表达多能性状态的非多能细胞群体,其中所述低渗透压培养基包含:
(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(c)MEK抑制剂;
其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述方法可富集原始态或原始样态hiPSC的群体。
28.一种用于在体外培养物中维持hiPSC群体的方法,所述方法包括:
在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养所述hiPSC群体,其中所述低渗透压培养基包含:
(a)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(b)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(c)MEK抑制剂;
其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法,其中可以将所述hiPSC酶促解离成单细胞悬浮液并传代培养。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述酶促解离:
(a)是使用胰蛋白酶进行的;
(b)是在不存在ROCK抑制剂的情况下进行的;或者
(c)它们的组合。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法,其中所述传代培养的hiPSC:
(a)继续表达一种或多种多能性标记物;
(b)维持原始态或原始样态,并且表现出致密圆顶形集落特征的形态;或者
(c)它们的组合。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法,其中所述传代培养的hiPSC维持正常核型。
33.一种用于修饰hiPSC中的靶基因组基因座的方法,包括:
(a)向所述hiPSC中引入包含插入核酸的靶向载体,所述插入核酸侧接有对应于所述靶基因组基因座处的5'和3'靶位点的5'和3'同源臂;以及
(b)鉴定在其基因组中包含整合在所述靶基因组基因座处的所述插入核酸的经遗传修饰的hiPSC;
其中所述hiPSC是在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养的,其中所述低渗透压培养基包含:
(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(iii)MEK抑制剂;
其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述靶向载体是大靶向载体(LTVEC),其中所述5'和3'同源臂的总和为至少10kb。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法,其中引入步骤(a)还包括:引入可促进所述hiPSC中所述靶向载体和所述靶基因组基因座之间的同源重组的核酸酶试剂。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法,其中所述靶向遗传修饰包括:
(a)内源性人核酸序列的缺失;
(b)外源核酸序列的插入;或者
(c)用所述外源核酸序列置换所述内源性人核酸序列。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述外源核酸序列包含以下的一种或多种:
(a)与所述内源性人核酸序列同源或直系同源的核酸序列;
(b)嵌合核酸序列;
(c)侧接有位点特异性重组酶靶序列的条件等位基因;和
(d)与在所述hiPSC中有活性的启动子有效连接的报告基因。
38.一种用于修饰hiPSC中的靶基因组基因座的方法,包括:
(a)向所述hiPSC中引入一种或多种可在所述靶基因组基因座的识别位点处诱导一个或多个切口或双链断裂的核酸酶试剂;以及
(b)鉴定在其基因组中包含在所述靶基因组基因座处的修饰的至少一个细胞;
其中所述hiPSC是在包含基础培养基和补充剂的低渗透压培养基中培养的,其中所述低渗透压培养基包含:
(i)白血病抑制因子(LIF)多肽;
(ii)糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂;和
(iii)MEK抑制剂;
其中所述基础培养基的渗透压为约180mOsm/kg至约250mOsm/kg。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的方法,其中在步骤(a)之前,将所述hiPSC酶促解离成单细胞悬浮液并传代培养。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述酶促解离:
(a)是使用胰蛋白酶进行的;
(b)是在不存在ROCK抑制剂的情况下进行的;或者
(c)它们的组合。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的方法,其中所述传代培养的hiPSC:
(a)继续表达一种或多种多能性标记物;
(b)维持原始态或原始样态,并且表现出致密圆顶形集落特征的形态;或者
(c)它们的组合。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的方法,其中所述传代培养的hiPSC维持正常核型。
43.根据权利要求35至42中任一项所述的方法,其中所述核酸酶试剂包含:
(a)锌指核酸酶(ZFN);
(b)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN);
(c)大范围核酸酶;或
(d)规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白,以及包含识别基因组靶序列的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)的向导RNA(gRNA)。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述Cas蛋白是Cas9。
45.根据权利要求33至44中任一项所述的方法,其中所述靶向遗传修饰是双等位基因修饰。
46.根据权利要求26至45中任一项所述的方法,其中所述hiPSC:
(a)包含原始态或原始样态的hiPSC;
(b)表达一种或多种多能性标记物;
(c)表现出致密圆顶形集落特征的形态;
(d)可以分化成内胚层、外胚层或中胚层中任一者的细胞;
(e)具有在约16小时与约24小时之间的倍增时间;或者
(f)(a)至(e)的任何组合。
47.根据权利要求26至46中任一项所述的方法,其中所述hiPSC具有正常核型。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的方法,其中所述多能性标记物包含NANOG、碱性磷酸酶或它们的组合。
49.根据权利要求28至48中任一项所述的方法,其中所述hiPSC衍生自被转化以表达多能性状态的非多能细胞。
50.根据权利要求26、27和49中任一项所述的方法,其中所述转化细胞表达包含Oct4、Sox2、Klf4、Myc或它们的任何组合的重编程基因。
51.根据权利要求26、27、49和50中任一项所述的方法,其中所述转化细胞包含始发态的hiPSC。
52.根据权利要求26、27和49至51中任一项所述的方法,其中所述转化细胞首先在高渗透压培养基中培养,然后在所述低渗透压培养基中培养,其中所述高渗透压培养基包含bFGF。
53.根据权利要求52所述的方法,其中所述高渗透压培养基的渗透压为至少约290mOsm/kg。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的方法,其中:
(a)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养,直至它们表现出原始态或原始样态的特征;
(b)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养约2个月的时段;
(c)所述转化细胞首先在所述高渗透压培养基中培养,直至它们表现出三维细胞团块特征的形态;或者
(d)它们的组合。
55.根据权利要求26至54中任一项所述的方法,其中所述基础培养基包含约3mg/ml的NaCl、约2.2mg/mL的碳酸氢钠,并且渗透压为约200mOsm/kg。
56.根据权利要求26至55中任一项所述的方法,其中所述基础培养基包含约4.5mg/mL的葡萄糖。
57.根据权利要求26至56中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约200mOsm/kg至约250mOsm/kg。
58.根据权利要求26至57中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基的渗透压为约233mOsm/kg。
59.根据权利要求26-58中任一项所述的方法,其中:
(a)所述补充剂包含:
(i)F-12培养基;
(ii)N2补充剂;
(iii)NEUROBASAL培养基;
(iv)B-27补充剂;
(v)L-谷氨酰胺;
(vi)2-巯基乙醇;或
(vii)(i)至(vi)的任何组合;
(b)所述LIF多肽是人LIF(hLIF)多肽;
(c)所述GSK3抑制剂包含CHIR99021;
(d)所述MEK抑制剂包含PD0325901;或者
(e)(a)至(d)的任何组合。
60.根据权利要求26至59中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基包含基本上由糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂和MEK抑制剂组成的抑制剂。
61.根据权利要求26至60中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基包含约24.75%(v/v)的基础培养基、约24.75%(v/v)的F-12培养基、约0.5%(v/v)的N2补充剂、约49%(v/v)的NEUROBASAL培养基、约1%(v/v)的B-27补充剂、约2mM的L-谷氨酰胺、约0.1mM的2-巯基乙醇、约100单位/mL的hLIF、约3μM的CHIR99021,以及约0.5μM的PD0325901。
62.根据权利要求26至61中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基不包含以下中的一者或多者:bFGF补充剂、TGF-β1补充剂、JNK抑制剂、p38抑制剂、ROCK抑制剂和PKC抑制剂。
63.根据权利要求26至62中任一项所述的方法,其中所述低渗透压培养基不包含bFGF补充剂。
64.根据权利要求26至63中任一项所述的方法,其中所述hiPSC在MATRIGEL、NuFF饲养细胞或GELTREX上培养。
65.一种hiPSC,所述hiPSC用根据权利要求26、27、29至32、46至48和50至64中任一项所述的方法制备。
66.一种经修饰的hiPSC,所述经修饰的hiPSC用根据权利要求33至64中任一项所述的方法制备。
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