ES2831424T3 - Células madre pluripotentes naif aisladas y métodos para generarlas - Google Patents

Células madre pluripotentes naif aisladas y métodos para generarlas

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Abstract

Una célula madre pluripotente (PSC) naif humana aislada, que comprende: un gen de transcrito específico de X inactivo (XIST) no metilado, en donde: (i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces dicha PSC femenina naif tiene dos alelos no metilados de dicho gen XIST que tienen menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST; y (ii) cuando dicha PSC naif es una PSC masculina, entonces dicha PSC masculina naif tiene un alelo no metilado de dicho gen XIST que tiene menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST; y el nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) se caracteriza por una relación de expresión de núcleo a citoplasma que es igual o superior a 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.

Description

DESCRIPCIÓN
Células madre pluripotentes naif aisladas y métodos para generarlas
Campo y antecedentes de la descripción
La presente descripción, en algunos aspectos de la misma, se refiere a células madre pluripotentes naif aisladas, un medio de cultivo nuevo que se puede usar para generarlas y a métodos para generarlas y cultivarlas y, más en particular, pero no exclusivamente, a métodos para mejorar la desdiferenciación de células somáticos para la generación de células madre pluripotentes inducidas.
Las células tipo ESC, denominadas células pluripotentes inducidas (iPS) se pueden generar a partir de células somáticas por expresión ectópica de diferentes factores de transcripción, originalmente Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (Takahashi y Yamanaka, 2006), que comparten todas las características definitorias con las ESC naif de ratones (Takahashi y Yamanaka, 2006; Hanna et al., 2009a). El proceso de reprogramación típicamente requiere una proliferación celular extensa de un periodo de al menos una semana, después de la cual una cierta fracción de la progenie celular se convierte con éxito a un estado similar a ES en un patrón impredecible y con diferentes latencias de tiempo (Hanna et al., 2009b). Se ha logrado un gran progreso en la identificación de factores transcripcionales adicionales y alternativos y moléculas pequeñas que pueden sustituir algunos de los factores exógenos o reforzar la eficiencia de la reprogramación cuando se combinan con Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (OSKM) (Orkin y Hochedlinger, 2011). Se ha identificado una variedad de enzimas y remodeladores de cromatina que cooperan con los factores de reprogramación para facilitar los cambios de cromatina iniciales y tardíos requeridos que conducen a una reprogramación auténtica de las iPSC en una fracción de la progenie de células del donante (p. ej., Wdr5, Utx, Tet2) (Ang et al., 2011; Mansour et al., 2012; Onder et al., 2012).
A pesar de estos avances, la eficacia de la reprogramación de las células somáticas sigue siendo baja, incluso en las recetas de reprogramación más optimizadas usadas (hasta 0.1-20%) (Hanna et al., 2010b). Además, para un epigenoma somático individual inicial desafiado con la sobreexpresión de factores de reprogramación, el resultado es muy estocástico y la mayoría de las células asumen diferentes niveles de reprogramación (Hanna et al., 2009b). Esto último ha permitido el aislamiento de una variedad de poblaciones intermedias identificadas mediante marcadores de superficie que se pueden desafiar y perturbar aún más para generar iPSC de una manera aleatoria (Polo et al., 2012). Los enfoques basados en sistemas biológicos para modelar la naturaleza de los elementos estocásticos y la progresión de la reprogramación han puesto de manifiesto que, aunque la reprogramación de las células somáticas implica miles de cambios moleculares, tan solo un suceso limitante de la velocidad puede recapitular adecuadamente la cinética observada experimentalmente mediante el seguimiento de células clonales (Hanna et al. al., 2009b). Queda por definir la identidad de dicho o dichos elementos limitantes de la velocidad estocástica.
Además, el hecho de que solo las células ES totalmente reprogramadas se hayan obtenido mediante enfoques de reprogramación de fusión celular o transferencia nuclear sin evidencia de células parcialmente reprogramadas, sugiere que la reprogramación por transferencia nuclear o fusión celular puede seguir un patrón más sincronizado y determinista, en comparación con la reprogramación inducida por OSKM (Hanna et al., 2010b). Lo anterior plantea la hipótesis de si es factible idear enfoques de reprogramación directa de iPSC determinista, y si manipulaciones genéticas adicionales junto con la transducción de factores de transcripción pueden permitir la sincronización y reprogramación determinista in vitro.
Las células madre embrionarias (ESC) se aislaron por primera vez de embriones de ratón por explantación de la masa celular interna (ICM) de los embriones en desarrollo in vitro en presencia de la citoquina del factor inhibidor de la leucemia (LIF) y células alimentadoras embrionarias de ratón (MEF) (Hanna et al., 2010a; Takahashi y Yamanaka, 2006). Las ESC de ratón recapitulan las firmas moleculares de la ICM naciente y, por lo tanto, se denominan "células pluripotentes naif' (Hanna, 2010; Hanna et al., 2010a; 2009a; Takahashi y Yamanaka, 2006). Esto incluye la expresión de los genes de pluripotencia Oct4, Nanog y Klf, la falta de marcadores específicos de linaje temprano somático y epiblasto, y el mantenimiento de un estado de pre-inactivación de X con ambos cromosomas X activos en las células femeninas. Además, las células retienen un potencial de desarrollo no restringido, ya que pueden diferenciarse firmemente en todos los tipos de células in vitro y, tras inyección en el blastocisto de ratón, contribuyen eficazmente a las tres capas germinales y a la línea germinal de los animales quiméricos (Hanna et al., 2010a; 2009b). Finalmente, la alta tasa de crecimiento y la confirmación de cromatina abierta de las células ES de ratón, ha convertido a estas células en una de las herramientas más valiosas para la genética de ratón al permitir el direccionamiento específico de genes eficiente mediante recombinación homóloga (Hanna et al., 2010a; Orkin y Hochedlinger, 2011).
Recientemente, se obtuvo un tipo drásticamente diferente de células pluripotentes, denominadas EpiSC, al explantar el epiblasto post-implantación en condiciones de crecimiento complementadas con FGF2 [también conocido como "factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)"] y activina (Ang et al., 2011; Mansour et al., 2012; Onder et al., 2012; Tesar et al., 2007). Aunque las EpiSC son pluripotentes, tienen un potencial de desarrollo restringido en comparación con las ESC y, por lo tanto, se denominan como "células pluripotentes cebadas". Las EpiSC son muy ineficientes para generar quimeras animales, ya han experimentado la inactivación del cromosoma X y demuestran una expresión heterogénea de marcadores de compromiso de linaje temprano (Hanna et al., 2009a; 2010a). Hanna Y. et al. (2009a) han definido recientemente las relaciones entre los dos tipos distintos de estados pluripotentes.
Aunque las células pluripotentes murinas naif se pueden diferenciar a un estado de tipo EpiSC cebado in vitro promoviendo la señalización de activina y FGF2, las EpiSC pueden revertir epigenéticamente a una pluripotencia naif similar a las ESC mediante estímulos de señalización definidos.
Notablemente, las ESC derivadas de seres humanos casi comparten varias características definitorias con las células EpiSC, en lugar de las ESC de ratón. A diferencia de las ESC de ratón, el mantenimiento de las células madre embrionarias humanas requiere FGF2 y activina (en lugar de la señalización LIF/Stat3), son muy sensibles a los pases como células individuales, muestran una expresión heterogénea de marcadores de compromiso de linaje y epiblasto y usan el elemento potenciador proximal para dirigir la expresión de Oct4 en el epiblasto post-implantación (en lugar del potenciador de Oct4 distal activo en la ICM) (Hanna et al., 2009a; 2009b). Por lo tanto, las similitudes moleculares y biológicas de las ESC humanas con las EpiSC del epiblasto de ratón sugieren que las ESC humanas corresponden al estado pluripotente cebado más que al estado naif de las ESC de ratón y que esta podría ser la razón subyacente de las propiedades biológicas de las ESC humanas convencionales que impiden su uso para la investigación relacionada con enfermedades (Hanna et al., 2010b; Polo et al., 2012). Esto incluye condiciones de cultivo laboriosas, bajas eficiencias de direccionamiento de genes por recombinación homóloga y espectacular heterogeneidad en la propensión a la diferenciación entre diferentes líneas de ESC e iPSC humanas (Hanna et al., 2009b; 2010a).
El hecho de que las ESC humanas convencionales/cebadas se deriven de la ICM ha sugerido erróneamente que el estado cebado es el único estado o estado "predeterminado" de pluripotencia que se puede aislar en seres humanos (Hanna et al., 2010a). Sin embargo, el trabajo de los autores de la presente invención provocó a continuación la revisión de este concepto en la definición de estabilidad in vitro e identidad del estado pluripotente en cepas de ratón relativamente "no permisivas" para la derivación de ES naif (producían exclusivamente células pluripotentes de tipo EpiSC hasta hace poco) (Hanna et al., 2009a). Las células ESC naif de ratón se pueden derivar de blastocistos de ratones diabetogénicos no obesos (NOD) solo si se proporcionan de forma exógena moléculas de señalización o factores de transcripción adicionales junto con la citoquina LIF (p. ej. las ESC NOD y las iPSC naif podrían propagarse en las condiciones de PD0325901/c H iR99021/LIF o Kenopaulona/CHIR99021/LIF o expresión constitutiva de Klf4/Lif y c-Myc/LIF) (Hanna et al., 2009a). En ausencia de estos factores adicionales (o en condiciones de solo LIF), el estado naif, incluso si se aísla de la ICM de ratón, está enmascarado por la adquisición in vitro de un estado pluripotente que es casi indistinguible de las células EpiSC en un proceso que probablemente imita la diferenciación in vivo durante el desarrollo temprano normal (Hanna et al., 2009a). Estos hallazgos permitieron la generación de células ES e iPS naif totalmente pluripotentes a partir de cepas previamente consideradas "no permisivas". Los experimentos en ratones NOD han planteado la cuestión de si todavía no se han ideado las condiciones adecuadas que permitan la derivación de células madre naif o similares a ESC de ratón en seres humanos y que la estabilización de un estado pluripotente humano naif requiere factores adicionales indefinidos (similares o diferentes de los aplicados a las ESC/iPSC de ratón NOD y rata) (Hanna et al., 2009a). Generó un mayor respaldo a la posibilidad de que los blastocistos explantados se diferencien in vitro a un estado cebado mediante un estrecho seguimiento de la dinámica del cromosoma X en líneas de ESC femeninas humanas derivadas in vitro y demostró que las células sufren la inactivación del cromosoma X como parte de un proceso de adaptación in vitro después de esta derivación, y esto se puede acelerar con concentraciones altas de oxígeno y atenuar parcialmente mediante la adición de LIF o tipos específicos de células alimentadoras que proporcionan señales indefinidas (Lengner et al., 2010; Okamoto et al., 2011; Tomoda et al., 2011; Tomoda et al. al., 2012). Estos resultados indicaron que las células naif XaXa (X-activo, X-activo, basado en la ausencia de cuerpos XIST) podrían estar presentes en la ICM humana, y que las ESC humanas convencionales capturadas in vitro reflejan pobremente sus homólogas de ICM (Okamoto et al., 2011).
Estas observaciones han planteado la posibilidad de que no se hayan ideado las condiciones adecuadas para permitir el aislamiento de células madre naif de una variedad de especies que hasta ahora han producido células cebadas o similares a EpiSC, posiblemente incluidas las humanas (Hanna et al., 2009a). De hecho, en un trabajo de seguimiento se proporcionó evidencia de la posibilidad de derivar estados celulares pluripotentes humanos alternativos que comparten características definitorias de manera más extensa con las ESC murinas. Como se ha mostrado anteriormente (Hanna et al., 2010b), se consideró un enfoque de cribado que implicaba la introducción de factores de reprogramación y/o moléculas pequeñas que respaldan que el estado pluripotente naif conduce a una estabilización in vitro de un nuevo estado celular pluripotente que comparte varias características definitorias con las ESC murinas (Hanna et al., 2010b). La propagación en citoquina LIF y el inhibidor de ERK1/2 PD0325901 y el inhibidor de GSK3b CHIR99021 (abreviado como condiciones complementarias 2i, dos inhibidores de moléculas pequeñas de la señalización de ERK1/2 y GSK3p para promover la señalización de WNT, abreviado como condiciones "PD/CH" o "2i") junto con la sobreexpresión de OCT4/KLF4 o KLF2/KLF4 indujeron la conversión de células ES e iPS humanas convencionales a lo que luego se denominó erróneamente un estado pluripotente naif humano que recuerda al de las ESC de ratón (Hanna et al., 2010b). Estas ESC humanas naif descritas previamente eran pluripotentes según varios criterios disponibles que incluían la diferenciación de cuerpos embrionarios y formación de teratoma in vivo. Es importante destacar que eran epigenética y molecularmente distintas de las ESC/iPSC humanas "cebadas" convencionales. Las hPSC "naif" generadas por Hanna et al., 2010b presentaban metilación de XIST en ambos alelos X, alta eficiencia de clonación de células individuales y mostraban un patrón de expresión génica que se parece al de las células ES de ratón naif (falta de expresión de MHC de clase I, y agrupadas con ESC naif murinas en agrupaciones de genes no sesgadas de especies cruzadas para 9773 genes ortólogos expresados) (Hanna et al., 2010b). No obstante, quedan importantes limitaciones y cuestiones sin resolver que ponen en duda la verdadera pluripotencia de líneas previamente publicadas/establecidas y su estabilidad. Solamente las ESC/iPSC naif dependientes de transgén se podían mantener durante más de 18 pases. La forskolina permitía la sustitución de factores exógenos junto con 2i/LIF, pero solo durante no más de 19 pases y los cultivos mantenían una alta propensión a la diferenciación (Hanna et al., 2010b). XIST estaba completamente metilado en las ESC/iPSC humanas naif previamente mencionadas y las células carecían de cualquier transcripción de XIST (Hanna et al., 2010b), lo cual no está de acuerdo con los resultados in vivo en blastocistos humanos que muestran claramente la transcripción de XIST (sin formar cuerpos XIST, es decir, cromosomas X recubiertos con XIST) (Okamoto et al., 2011). En conjunto, estos hallazgos sugieren que las células aisladas hasta ahora no reflejan las características auténticas de la ICM humana y conservan una pluripotencia comprometida y una mayor propensión a la diferenciación. Los datos publicados sustanciales generados por muchos grupos diferentes destacan el razonamiento detrás del concepto de que las células madre humanas naif pluripotentes genéticamente no modificadas no se han aislado adecuadamente hasta ahora, y que las condiciones que permiten la expansión de dichas células y sus propiedades moleculares (si es que se ha demostrado que existen) no se conocen (De Los Ángeles et al., 2012; Hanna et al., 2010b).
La técnica anterior adicional incluye Xu Y., et al., 2013 (Journal of Biological Chemistry, 288: 9767-9778); Luo M., et al., 2013 (Stem Cells. 26 de marzo. Doi: 10.1002/stem.1374. [Publicación electrónica antes de la impresión]); Solicitud internacional n° PCT/US08/04516 ("Reprogramming of Somatic Cells", Jaenisch; Rudolf; et al).
J. Hanna et al., se refieren a "Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs", Proceedings Of The National Academy Of Sciences, (20100518), vol. 107, no. 20, doi:10.1073/pnas.1004584107, ISSN 0027-8424, páginas 9222 -209227.
Christopher J. Lengner et al., se refieren a "Derivation of Pre-X Inactivation Human Embryonic Stem Cells under Physiological Oxygen Concentrations", Cell, (20100501), vol. 141, no. 5, doi:10.1016/j.cell.2010.04.010, ISSN 0092­ 8674, páginas 872 - 883.
El documento WO 2010/077955 proporciona la generación y mantenimiento de células pluripotentes cultivando 25 las células en presencia de un inhibidor de ALK5.
Ohad Gafni et al., se refieren a "Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells", Nature, (20131030), vol. 504, no. 7479, doi:10.1038/nature12745, ISSN 0028-0836, pages 282 - 286.
El documento WO 98/43679 se refiere a células germinales primordiales aisladas de tejido embrionario humano, tal como 30 de las crestas gonadales de embriones humanos. Se cultivan las células germinales primordiales dando como resultado células que se parecen a las células madre embrionarias o células germinales embrionarias en morfología y pluripotencia. Las células se mantienen varios meses en cultivo y se pueden manipular genéticamente usando tecnología transgénica para insertar material genético heterólogo.
El documento US 6090622 se refiere a células germinales primordiales extraídas de embriones humanos postblastocisto, tal como 35 de las crestas gonadales de un embrión humano LMP de 8-11 semanas. Las células germinales primordiales se cultivan en un cultivo a largo plazo (más de 30 días) dando como resultado células que se parecen a las células madre embrionarias en morfología y pluripotencia. Las células se mantienen durante varios meses en cultivo y se pueden manipular genéticamente usando tecnología transgénica para insertar material genético heterólogo.
Eguizabal C et al., se refieren a "Generation of primordial germ cells from pluripotent stem cells", Differentiation, Springer Verlag, DE, vol. 78, no. 2-3, 5 doi:10.1016/J.DIFF.2009.07.001, ISSN 0301-4681, (20090901), páginas 116 - 123.
Ahn K S et al., se refieren a "Production of human CD59-transgenic pigs by embryonic germ cell nuclear transfer", Biochemical And Biophysical Research Communications, Academic Press INC. Orlando, FL, EE.UU., vol. 400, no. 4, doi:10.1016/J.BBRC.2010.08.125, ISSN 0006-291X, (20101001), páginas 667 - 672.
10 Park Tae Sub et al., se refieren a "Derivation of Primordial Germ Cells from Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Is Significantly Improved by Coculture with Human Fetal Gonadal Cells", Stem Cells (miamisburg), (2009), vol. 27, no. 4, ISSN 1066-5099, páginas 783-795.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a una célula madre pluripotente (PSC) naif humana aislada,
que comprende:
un gen de transcrito específico de X inactivo (XIST) no metilado, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces dicha PSC femenina naif tiene dos alelos no metilados de dicho gen XIST que tienen menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST; y
(ii) cuando dicha PSC naif es una PSC masculina, entonces dicha PSC masculina naif tiene un alelo no metilado de dicho gen XIST que tiene menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST;
y
el nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) se caracteriza por una relación de expresión de núcleo a citoplasma que es igual o superior a 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.
Preferiblemente, cuando la PSC naif aislada se incuba en presencia de un agente seleccionado del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), inhibidor de JNK e inhibidor de P38, la PSC naif mantiene un fenotipo pluripotente.
Preferiblemente, dicha PSC naif humana se caracteriza por una metilación reducida de islas de CpG en comparación con un nivel de metilación de dichas islas de CpG en una PSC cebada humana.
La presente invención se refiere también a una población aislada de PSC naif que comprende al menos 10% de las células PSC naif humanas aisladas de la reivindicación 1, 2 o 3.
La presente invención se refiere también a un cultivo celular que comprende las PSC naif aisladas de la reivindicación 1, 2 o 3, o la población aislada de PSC naif de la reivindicación 4 y un medio de cultivo.
La presente invención se refiere también a un medio de cultivo seleccionado del grupo que consiste en:
(i) Un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3p, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un activador de STAT3 y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFpl), un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC), un inhibidor de ROCK y un inhibidor de NOTCH, y
(ii) Un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3p, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un activador de STAT3 y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC), un inhibidor de ROCK y un inhibidor de NOTCH, en donde el medio de cultivo es capaz de mantener la célula madre pluripotente naif aislada de la reivindicación 1 en un estado indiferenciado durante al menos 2 pases.
Preferiblemente, dicho activador de STAT3 se selecciona del grupo que consiste en factor inhibidor de la leucemia (LIF) e interleuquina 6 (IL6).
Preferiblemente, comprende al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), un inhibidor de la señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP), un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH), un inhibidor de ERK5, forskolina, Kenpaulona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Preferiblemente, comprende al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH), un inhibidor de ERK5, forskolina, kenpaulona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Preferiblemente, dicho activador de STAT3 comprende dicho LIF, y en donde dicho al menos un agente comprende dicho inhibidor de PKC.
Preferiblemente, comprende además inhibidor de FGFR.
Preferiblemente, comprende además inhibidor de TGFR.
La presente invención también se refiere a un cultivo celular que comprende células y el medio de cultivo.
La presente invención se refiere también a un método para generar una célula madre pluripotente (PSC) naif, que comprende:
incubar una célula PSC no naif en condiciones que permitan la generación de la PSC naif a partir de dicha PSC no naif, en donde dichas condiciones comprenden cultivar en el medio de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, y en donde:
(i) cuando dicha PSC naif es una PSC femenina, entonces dicha PSC femenina naif tiene dos alelos no metilados de un gen de transcrito específico de X inactivo (XIST) que tiene menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST; y
(ii) cuando dicha PSC naif es una PSC masculina, entonces dicha PSC masculina naif tiene un alelo no metilado de dicho gen XIST que tiene menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST,
y
el nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) en dicha PSC naif se caracteriza por una relación de expresión de núcleo a citoplasma que es igual o superior a 1 determinado por un ensayo de inmunotinción, generando así la PSC naif.
Breve descripción de los dibujos
Algunos aspectos de la descripción se describen en el presente documento, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con el propósito de una discusión ilustrativa de aspectos de la descripción. En relación con esto, la descripción considerada con los dibujos hace evidente para los expertos en la técnica cómo se pueden llevar a la práctica los aspectos de la descripción.
En los dibujos:
Las figs. 1A-N de referencia muestran que la inhibición de Mbd3 impulsa la reversión epigenética de células pluripotentes cebadas de ratón a pluripotencia naif. Las figs. 1A-B: un cribado de ARNip para los factores que pueden impulsar la reversión epigenética de las EpiSC cebadas en ESC naif. Se usaron EpiSC de ratón Nanog-GFP para el cribado, y la reactivación de Nanog-GFP se usó como un marcador específico para la formación de pluripotencia naif después de la expansión en condiciones 2i/LIF. Fig. 1A: Ilustración esquemática que muestra el cribado de ARNip. Fig. 1B: un histograma que representa el porcentaje de células que expresan Nanog-GFP como resultado de la inhibición con los ARNip ensayados. Obsérvese que la inhibición de Mbd3 condujo a un aumento notable de EpiSC que se reprogramaban en ESC naif. Fig. 1C-G: Se ensayó la reversión de EpiSC Mbd3+K y Mbd3flox/- en células naif en 2i/LIF. Fig. 1C: Ilustración esquemática del ensayo de reversión de EpiSC en colonias similares a ES naif. Figs.
1D-G: Fotografías de microscopía que representan la formación de colonias similares a ES naif a partir de EpiSC Mbd3+/+ (Fig. 1D) o EpiSC Mbd3flox/_ (Fig. 1E). Obsérvese la eficiencia de reprogramación notablemente mayor en células empobrecidas en Mbd3. Fig. 1F-G: Se muestran células Mbd3flox/' Rosa26-CreER+/_ Nanog-GFP+/_ con microscopía de fase (Fig. 1F) y microscopía de fluorescencia (Fig. 1G). Obsérvese la reactivación homogénea del marcador Nanog-GFP (Fig. 1G). Fig. 1H: Eficacia de clonación de células individuales y cuantificación de la eficacia de reprogramación de EpiSC en ESC naif de diferentes líneas mutantes. En particular, las construcciones de rescate de pBRY-Mbd3 expresadas de manera estable en las líneas indicadas, reducían la eficiencia de reprogramación de nuevo a la observada en células WT Mbd3+/+. Se muestra un histograma que representa el porcentaje promedio de células Nanog-GFP+ tras la reversión de las diversas líneas mutantes hacia células naif en condiciones 2i/LIF. Las Figs. 1I-J son análisis de transferencia Western que indican niveles de expresión de Mbd3 en diferentes líneas ES mutantes. Las células Mbd3flox/' tenían más de 80% de reducción en los niveles de expresión de Mbd3 en comparación con células Mbd3+/+. Las células Mbd3'A tienen ausencia completa de proteína Mbd3.Las Figs. 1K-L son fotografías de quimeras coloreadas de agutí obtenidas de EpiSC reprogramadas después del agotamiento de Mbd3. Se muestran dos ejemplos de ratones quiméricos generados después de microinyección de células revertidas a pluripotencia naif. El color del pelaje del agutí se origina a partir de las células inyectadas, mientras que el color del pelaje negro se origina a partir del ratón hospedante. Estos resultados indicaban que las células revertidas son funcionalmente pluripotentes como células naif y pueden dar lugar a células diferenciadas tras la diferenciación in vivo. La Fig. 1M es una ilustración esquemática que representa la generación de quimeras con el propósito de aislar PGC del día E8.5. Las líneas ESC Mbd3flox/' y Mbd3+/+ (con o sin el alelo de rescate pBRY-Mbd3 de sobreexpresión de Mbd3, como se indica) se seleccionaron como diana con el indicador Oct4-GFP y se inyectaron en quimeras hospedantes. Fig. 1N -un histograma que representa la evaluación de la generación de células similares a ES naif a partir de PGC. Las células germinales primordiales (PGC) del día E8.5 se separaron en condiciones naif [N2B27 y 2i/LIF/SCF (factor de células madre, 10 ng/ml)/bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico, 8 ng/ml)] y se evaluó la eficiencia para generar células germinales embrionarias similares a ES (células EG). Las PGC agotadas en Mbd3 se convirtieron ex vivo en células similares a ES naif con una eficiencia cercana al 100%.
Las Figs. 1O-T son imágenes que representan el análisis de inmunotinción confocal para la expresión temporal de Mbd3 en embriones de ratón en desarrollo. Fig. 10 - etapa de cigoto; Fig. 1P - etapa de 2 células; Fig. 1T - etapa de 8 células; Fig. 1R - Estadio de mórula; Fig. 1S - Blastocisto en el día embrionario 3.25; Fig. 1T - Blastocisto en el día embrionario 3.75. Las flechas indican cuerpo polar. Obsérvese la reducción en la expresión de Mbd3 después de la fertilización y cómo se vuelve a expresar en la etapa tardía de blastocisto. Los paneles de la derecha representan la ampliación de las áreas de trazos resaltadas.
Las Figs. 2A-O muestran la derivación de ESC a partir de blastocistos Mbd3'/\ Fig. 2A - una ilustración esquemática de la generación de ESC de ratones naif. Se aparearon ratones heterocigotos Mbd3+/_ y las ESC se derivaron de blastocistos en condiciones 2i/LIF definidas naif. Las ESC Mbd3'/_ se obtuvieron con la proporción mendeliana esperada. Las Figs. 2B-C son imágenes de la colonia inicial de células ES Mbd3'/_ el día 9 (Fig. 2B) y de las ESC Mbd3'/_ naif establecidas e imágenes generadas en el pase 4 (Fig. 2C), que muestran una morfología similar a ES.
Figs. 2D-E de referencia: imágenes de ESC MBD3 de tipo natural (+/+) y agotadas (-/-) teñidas para el marcador de células madre pluripotentes fosfatasa alcalina (AP). Obsérvese la tinción de AP significativa en las ESC MBD3'/_ que demuestra que normalmente expresan marcadores de células madre. Figs. 2F-G de referencia - imágenes de inmunotinción para Oct4 de MBD3+/-(heterocigotos) (Fig. 2F) y MBD3'/' (agotado) (Fig. 2G). Estos resultados indican que Mbd3 es prescindible para establecer pluripotencia in vivo e in vitro, y que las células ES agotadas en Mbd3 son indistinguibles de las células ES de tipo natural e iPS. Las Figs. 2H-O de referencia son análisis de transferencia Western para marcadores de pluripotencia de ESC MBD3 de tipo natural (+/+) o agotadas (-/-). Fig. 2H - Mbd3; Fig. 2I - Gapdh; Fig. 2J - Sox2; Fig. 2K - Sall4; Fig. 2L - Klf4; Fig. 2M: Mi2P; Fig. 2N - Klf5; Fig. 2O - c-Myc.
Las Figs. 3A-G representan sistemas de ingeniería genética para la reprogramación determinista en células de ratón. Fig. 3A - Los autores de la presente invención han establecido líneas de iPSC Mbd3+/+ y Mbd3flox/' de ratón reprogramables que llevan (1) un indicador Oct4-GFP, (2) marcador expresado constitutivamente mCherry, (3) m2RtTa y (4) un casete policistrónico OKSM inducible por TetO. Estas líneas se inyectaron en blastocistos hospedantes y sus derivados diferenciados se volvieron a aislar in vitro. Posteriormente, se puede analizar la eficacia y la progresión de la reprogramación tras la inducción con DOX. Este sistema exacto permite la reprogramación de 100% en 6 días como se muestra en las Figs. 4A-O. Además, este sistema transgénico permite la derivación no restringida de células somáticas homogéneas, que se recogerán cada 24 horas durante el curso de 7 días de finalización de iPSC después del tratamiento con DOX. Figs. 3B-D - fotografías de ESC Mbd3flox/' aisladas en microscopía de contraste de fases (Fig. 3B) y de fluorescencia. Fig. 3C - tinción para la expresión de mCherry (rojo); Fig. 3D - tinción para la expresión Oct4-GFP (verde). Figs. 3E-F - Análisis de transferencia Western usando tinción anti-Mbd3 (Fig. 3E) y anti-Hsp90 (Fig. 3F). Se muestra la expresión de Mbd3 en ESC/iPSC Mbd3'/', con o sin adición del transgén de rescate pBRY-Mbd3 (clones de recuperación). Fig. 3G - Análisis de transferencia de Southern que muestra el direccionamiento correcto del gen del locus Rosa26 con la construcción insertada (knock-in) de Cre-ER introducida en ESC Mbd3flox/'. En conjunto, los resultados muestran sistemas de ingeniería genética para la reprogramación determinista en células de ratón.
Las Figs. 4A-P de referencia muestran la reprogramación determinista y sincronizada de fibroblastos de ratón en iPSC después del agotamiento de Mbd3. Fig. 4A - Células Mbd3 WT y agotadas (flox/- o -/-) se infectaron directamente con lentivirus que expresaban un casete de OKSM policistrónico y se expandieron en condiciones 2i/LIF naif de ratón. La eficacia de la reprogramación se evaluó midiendo el porcentaje de células Oct4-GFP+, y se indica que se observaron niveles de > 95% Oct4-GFP+ en células agotadas en Mbd3. Fig. 4B de referencia - Los fibroblastos reprogramables secundarios, que llevaban un indicador Oct4-GFP y un marcador expresado constitutivamente mCherry, se separaron en células individuales y se sometieron a reprogramación con DOX. La eficacia de reprogramación el día 10 se calculó dividiendo el número de pocillos Oct4-GFP+ entre los pocillos mCherry+ (mCherry se usó para normalizar la eficacia de la siembra en placa). Las condiciones 2i/LIF se aplicaron a partir del día 2. Por favor, tenga en cuenta que en las muestras agotadas en Mbd3 (flox/- o -/-) todos los clones mcherry+ se convirtieron en células Oct4-GFP+ (indicadas en verde). Solo las muestras Mbd3+/+ tenían poblaciones clonales mCherry+ que no activaban el marcador de pluripotencia específico Oct4-GFP (y por lo tanto se indican como cuadros de color rojo). Las Figs. 4C-E de referencia representan análisis de inmunotinción de clones de las iPSC Mbd3+/+ (Fig. 4C), las ípSc Mbd3flox/-(Fig. 4D) o las iPSC Mbd3'/' (Fig. 4E) para los marcadores de pluripotencia Oct4 (izquierda), Nanog (centro) o fosfatasa alcalina (AP) (derecha). Obsérvese que las iPSC obtenidas después del agotamiento de Mbd3 expresan normalmente todos los marcadores de pluripotencia ensayados como en las células Mbd3+/+ de tipo natural. Las Figs. 4F-G de referencia son fotografías de la quimera coloreada del pelaje de agutí (Fig. 4F) y la transmisión de la línea germinal de las iPSC Mbd3flox/' derivadas (figura 4G). Esto indica que las iPSC agotadas en Mbd3 pueden dar lugar a animales quiméricos adultos después de la inyección en ratones hospedantes, y son pluripotentes. Las Figs. 4H-I son imágenes que representan la generación de imágenes in vivo de la reprogramación de células Mbd3+/+ (Fig. 4H) y Mdb3flox/' (Fig. 4I), después de sembrar en placa 50 células por pocillo. Obsérvese la formación notablemente aumentada de colonias similares a ES en células Mbd3flox/\ Las Figs. 4J-O son imágenes que representan la inmunofluorescencia de células Mdb3+/+ (Figs. 4J, 4K y 4L) o Mdb3flox/-(Figs. 4M, 4N y 4O) teñidas para mCherry (Figs. 4J y 4M), Oct4-GFP (Figs. 4K y 4N) y mCherry Oct4-GFP (Figs. 4L y 4o ). El día 6 casi > 90% de mCherry+ y Oct4-GFP+ se localizan conjuntamente en células Mbd3flox/- y no en células WT. Fig. 4P - un gráfico que indica la formación de colonias Oct4-GFP+ acumulada cercana a 99% en células Mbd3flox/' (gráfico rojo) el día 6 basado en el seguimiento por generación de imágenes en vivo. Obsérvese la estrecha ventana de activación sincronizada de Oct4-GFP los días 4-5 (línea roja y barra azul).
Las Figs. 4Q-R representan una reprogramación de iPSC radicalmente eficaz y sincronizada a la pluripotencia. Fig. 4Q - Un gráfico que indica las colonias acumuladas Oct4-GFP+ para Mbd3flox/' (gráfico rojo) y Mbd3+/+ (gráfico azul) basado en el seguimiento por generación de imágenes en vivo. Se calcularon los datos estadísticas de activación de Oct4-GFP a partir de todas las colonias segmentadas. Obsérvese la estrecha ventana de activación sincronizada de Oct4-GFP los días 4-5. Fig. 4R - Un gráfico que indica la fracción media de células Oct4-GFP+ dentro de colonias individuales medidas con seguimiento por generación de imágenes en vivo. Aproximadamente 85% de las células dentro de la población clonal Mbd3flox/' individual se convirtió en células Oct4-GFP+ el día 6. Los valores del gráfico indican la media y las barras de error indican la desviación estándar calculada para 4 repeticiones (pocillos) en cada muestra y punto de tiempo.
Las Figs. 5A-F de referencia muestran un análisis comparativo de las propiedades de las células somáticas agotadas en Mbd3 durante la reprogramación. Fig. 5A - Un histograma que representa los resultados del análisis de RT-PCR que demuestran los niveles de inducción transgénica relativos en diferentes células somáticas (de los sistemas reprogramables transgénicos BU-V19-OSKM) en presencia o ausencia de DOX como se indica. Los resultados se presentan con /- s.d. (desviación estándar) de 3 repeticiones por muestra. El nivel de inducción transgénica no se alteró en células B o MEF agotadas en Mbd3 en DOX durante 8 días. Figs. 5B-C - Análisis de transferencia Western usando anticuerpos anti-proteína de choque térmico 90 (Hsp90) (Fig. 5B) y anti-Mbd3 (Fig. 5C), que valida la reducción de la proteína Mbd3 en células con expresión reducida (KD, por sus siglas en inglés KnockDown) de NGFP1. Fig. 5D - Un histograma que representa los resultados del análisis de RT-PCR que demuestran los niveles de inducción transgénica relativos en diferentes células somáticas (de sistemas reprogramables transgénicos NGFP1) en presencia o ausencia de DOX como se indica. Los resultados se presentan con /- s.d. de 3 repeticiones por muestra. El nivel de inducción transgénica no se alteraba en MEF (fibroblastos embrionarios de ratón) agotados en Mbd3 o células B con DOX durante 8 días. La Fig. 5E es un histograma que representa los resultados de una detección de apoptosis basada en citometría de flujo en células MEF y B de tipo natural y agotadas en Mbd3 después de la inducción con DOX. Los resultados indican que los niveles de apoptosis fueron similares tras la inducción del transgén en ambas muestras de células. En general, los resultados presentados en las Figs. 5A-E excluyen cambios o defectos en la inducción o proliferación de transgenes como causas subyacentes para una reprogramación mejorada en células somáticas agotadas en Mbd3. Fig. 5F - Se observó una cinética de crecimiento similar en MEF Mbd3+/+ y Mbd3flox/- tras la inducción de transgén mediada por DOX. Se muestra un experimento representativo de los 2 realizados. En general, los resultados presentados en las Figs. 5A-E excluyen los cambios en la inducción o proliferación de transgenes como causas predominantes de una reprogramación mejorada en células somáticas agotadas en Mbd3.
Las Figs. 6A-B muestran que la deleción de Mbd3 produce una reprogramación determinista y completa de múltiples tipos de células somáticas adultas. Se aislaron células somáticas indicadas de quimeras adultas de control NGFP1 (Fig. 6A), NGFP1-Mbd3 KD [inactivado (KD)] (Fig. 6B) y se sometieron a reprogramación de células individuales y evaluación de la expresión de Nanog-GFP después de 8 días de DOX. "EpiSC" - células madre del epiblasto; "NPC": precursores neuronales; "HSC" - Célula madre hematopoyéticas; "CMP": progenitor mieloide común; "Monocitos" -macrófagos de células sanguíneas; "Linfocitos Pro-B"; "B maduros": linfocitos B maduros; "T madura": células T maduras. Se obtuvo una eficacia cercana a 100% de todos los tipos de células somáticas Mbd3flox/' (agotadas en Mbd3) ensayados. Se muestra el promedio de 2-3 experimentos independientes por cada tipo de célula.
La Fig. 7 de referencia muestra que las células agotadas en Mbd3 son reprogramadas completamente y transcripcionalmente indistinguibles de las ESC/iPSC a los 8 días de inducción con DOX. El análisis de la expresión génica se llevó a cabo en las muestras de ratón genéticamente emparejadas indicadas. Los MEF Mbd3flox/-, pero no Mbd3+/+, se agrupaban de manera diferente a los MEF somáticos del donante solo después de 4 días de la inducción de OKSM (DOX). El día 8, las células flox/- eran transcripcionalmente indistinguibles de las líneas de ESC e iPSC establecidas. La población Mbd3+/+, incluso después de 11 días de reprogramación más prolongada, no se agrupó con líneas de ESC-iPSC pluripotentes. Estos hallazgos apoyan la reprogramación completa en las células somáticas del donante después de la sobreexpresión de OSKM junto con la inhibición de Mbd3.
Las Figs. 8A-Q de referencia muestran la reprogramación determinista y sincronizada tras el agotamiento de Mbd3 en células humanas y de ratón. Figs. 8A-D - Imágenes de células Mbd3flox/' (Figs. 8A y 8C de referencia) y Mbd3+/+ el día 8 (Figs. 8A y 8B de referencia) o en el pase 2 (Figs. 8C y 8D de referencia). Obsérvese que las colonias obtenidas después de la reprogramación de células somáticas Mbd3flox/- tienen una morfología similar a las ESC y se vuelven GFP homogéneas para la expresión de Nanog en el pase 1. En las células WT, la mayoría de las colonias no están completamente reprogramadas y no tienen una morfología similar a ES. Fig. 8E - Un histograma que representa la cuantificación de células positivas para Nanog-GFP. Cuando se cuantifica la cantidad de células positivas para Nanog-GFP en el momento de la detección (día 8 para las células Mbd3-KD), es notable que >99% de las células dentro de cada población clonal el día 8 en las células Mbd3KD son positivas. Para otras combinaciones de reprogramación mostradas, cuando una población clonal se vuelve positiva (por encima del 0.5% del umbral establecido), una minoría de células activa Nanog-GFP, lo que indica que solo una fracción del clon se reprogramó con éxito. Estos hallazgos apoyan la finalización determinista y sincronizada de la reprogramación por inhibición de la expresión y función de Mbd3 en condiciones de crecimiento que promueven la pluripotencia naif. Las Fig. 8F-K muestran análisis de citometría de flujo de un clon de célula parcialmente reprogramada que contiene transgenes OSKM, sin reactivación del indicador Oct4-GFP después del tratamiento con: Fig. 8F - sin tratar; Fig. 8G - día 20 ARNip desordenado; Fig. 8H - día 20 sin tratar; Fig. 8I - Día 205-aza TSA; Fig. 8J de referencia - Día 5 ARNip de Mbd3; Fig. 8K - Día 6 ARNip de Mbd3. La reducción de la expresión de Mbd3 daba como resultado la finalización completa y rápida de la reprogramación. El tratamiento con4- Aza y TSA, que se había descrito previamente que promovía la reprogramación, solo activa una fracción de las células. Estos resultados demuestran que la eliminación de Mbd3 abre potentemente la puerta de entrada de la reprogramación a la pluripotencia. Fig. 8L - Se generaron células ES humanas Mbd3flox/- por ingeniería genética con efectores de nucleasa TALE. Se muestra la estrategia de direccionamiento para un alelo floxed condicional. Figs. 8M-N - Análisis de transferencia Western de clon MBD3flox/- correctamente dirigido, basado en la verificación de transferencia Southern, usando anticuerpo anti-MBD3 (Fig. 8M) o anticuerpo anti-HSP90 (Fig. 8N). Obsérvese la reducción de más de 90% en los niveles de expresión de la proteína MBD3 (reducción comparable a la observada en las células flox/- de ratón, Figs- 1I-J. Fig. 8O - iPSC MBD3+/+ y MBD3flox/' que llevaban el transgén OKSM inducible por DOX se marcaron con mCherry expresada de forma constitutiva y se seleccionaron como diana con un alelo con OCT4-GFP insertado. Los fibroblastos diferenciados in vitro de las últimas líneas se reprogramaron como se indica en el esquema. 98-100% de los fibroblastos Mbd3flox/- humanos se convierten en IPSC GFP+ después de 8 días de inducción del transgén. Estos resultados demuestran un efecto similar en la reprogramación en ratones y seres humanos para la inhibición de Mbd3. Las barras de error indican s.d. de 2 repeticiones biológicas. *Indica valor P significativo <0.01 en comparación con muestras MBD3 (n = 2). Figs. 8P-Q de referencia - Imágenes de células MBD3flox/' en medio WIS-NHSM. Las células madre pluripotentes humanas agotadas en MBD tienen una morfología similar a la ESC de ratón redonda notable y crecen de manera homogénea. Estos resultados indican que la inhibición de Mbd3 podría mejorar más las condiciones de crecimiento naif de WIS-NHSM (descritas en el presente documento).
Fig. 8R-S El alivio de la expresión de Mbd3 facilita la transición a la pluripotencia del estado fundamental en células humanas y de ratón. Fig. 8R - Matriz de correlación de Spearman entre las muestras de ratón genéticamente emparejadas indicadas, medidas sobre los niveles de expresión genética de los 16620 genes expresados. La matriz está agrupada con agrupación jerárquica que produce el dendrograma que se muestra. Obsérvese que después de 4 días de inducción de o Ks M (DOX), los MEF Mbd3flox/', pero no Mbd3+/+ eran más similares a las líneas ESC e iPSC establecidas que a los MEF somáticos originales. Para el día 8, las células Mbd3flox/' son transcripcionalmente indistinguibles de las ESC y las iPSC. La población Mbd3+/+ no se agrupaba con ESC e iPSC incluso después de 11 días de inducción de OKSM. Fig. 8S de referencia - Líneas monoclonales establecidas a partir de células secundarias Mbd3+/+ y flox/- y reprogramadas en 2i-LIF DOX. Se muestra la fracción de clones pre-iPS que no reactivaban los marcadores Oct4 o Nanog GFP (SSEA1 positivo o negativo). No se pudieron establecer clones negativos para GFP a partir de células agotadas en Mbd3, ya que todos estaban completamente reprogramados el día 10.
La Fig. 9 es una presentación esquemática del análisis evolutivo del complejo NuRD y otras proteínas asociadas. Los autores de la presente invención asignaron ortólogos para muchas proteínas humanas que se sabe que son parte del complejo NuRD (o están relacionadas con estas proteínas), de 15 especies de metazoos representativas (ratón -M.musculus, ornitorrinco - O.anatinus, diamante cebra - T.guttata, pollo - G.gallus, rana - X. tropicalis, pez cebra -D.rerio, pez globo - T.nigroviridis, lanceta - B.floridae, erizo de mar púrpura - S.purpuratus, mosquito - A.gambiae, mosca de la fruta - D. melanogaster, abeja europea - A.mellifera, escarabajo - T.castaneum, anémona de mar - N. vectensis, placozoos - T. adhaerens) y la levadura S. cerevisiae, como un grupo externo. El último metazoo de esta lista, T. adhaerens, representa un grupo basal de metazoos y se usa para estudiar los orígenes de la multicelularidad animal. Es probable que las proteínas que tienen un ortólogo en T. adhaerens estén presentes en los animales multicelulares basales, mientras que las proteínas que aparecen en la levadura preceden a la multicelularidad animal. El análisis indica que Mbd3 y otros componentes de NuRD se conservan en todos los organismos multicelulares y, por tanto, la inhibición de la función de Mbd3 puede promover potencialmente la reprogramación directa en muchos (o incluso en todos) los organismos multicelulares. La escala de colores indica el grado de homología, es decir, el porcentaje de similitud de secuencia entre proteínas.
Las Figs. 10A-P demuestran que la inhibición del ARNip de MBD3 promueve la reprogramación de iPSC humana por OSKM. Fig. 10A - Una ilustración esquemática que representa fibroblastos reprogramables humanos secundarios que portan transgenes OSKM inducibles por DOX, que se someten al protocolo de reprogramación representado con DOX. Figs. 10B-C - Análisis de transferencia Western usando anticuerpo anti-MBD3 (Fig. 10B) o anticuerpo anti-Hsp90 (Fig. 10C) de células tratadas con ARNip de MBD3, con un ARNip de control, o que permanece sin tratar. Obsérvese la reducción de MBD3 en células tratadas con ARNip de MBD3, pero no en células tratadas con ARNip de control o en células no tratadas. Fig. 10D - En condiciones de crecimiento WIS-NHSM, la reducción de la expresión de Mbd3 los días 2 y 4, pero no con ARNip de control desordenado, aumentó notablemente la formación de clones de iPSC fosfatasa alcalina+. Fig. 10E - Ilustración esquemática de una reprogramación de una sola ronda. Fibroblastos humanos se someten a tratamiento con ARNip de MBD3 a los 7 y 2 días antes de la transfección del ARNm con los factores OSKM y Lin28. Las Figs. 10F-O son imágenes de las iPSC formadas. Fig. 10F - Colonia de iPS el día 7, pase 0; Fig. 10G - iPSC en pase 3; Figs. 10I-J - IPSC (pase 7) teñidas con Dapi (azul, tinción nuclear) (Fig. 10I) y con OCT4 (rojo) (Fig. 10J); Figs. 10L-M - IPSC (pase 10) teñidas con Dapi (azul, tinción nuclear) (Fig. 10L) y con Nanog (rojo) (Fig. 10M); Figs. 10N-O - IPSC (pase 10) teñidas con Dapi (azul, tinción nuclear) (Fig. 10N) y con TRA1-60 (verde) (Fig. 10O); Figs.
10H, 10K y 10P: tinción histológica de células diferenciadas de las iPSC. Formación de teratoma in vivo generado a partir de iPSC P8 que muestran diferenciación en capas germinales embrionarias del ectodermo (Fig. 10H), mesodermo (Fig. 10K) y ectodermo (Fig. 10P). Estos resultados muestran que el día 7 el tratamiento con ARNip de MBD3 de fibroblastos humanos permite la generación de iPSC en condiciones WIS-NHSM, por una única ronda de reprogramación con transfección de ARNm con factores OSKM y Lin28, y alivia la necesidad de muchas rondas de transfecciones de ARNm repetidas. Estos resultados indican que la inhibición de la expresión y/o función de MBD3 promueve la formación de iPSC mediante ARNm transitorio u otros protocolos de transfección transitoria (con proteína o ADNc).
Las Figs. 11A-P demuestran mecanismos de la función e influencia de Mbd3 en la reprogramación a pluripotencia. Las Figs. 11A-H son análisis de inmunotransferencia que usan anticuerpo anti-MBD3 (Figs. 11A-D) o anticuerpo anti-FLAG (Figs. 11E-11). Las construcciones que codifican OCT4 marcado con Flag (Figs. 11A y 11E), o KLF4 (Figs. 11C y 11G) o SOX2 (Figs. 11B y 11F) o HDAC1 (usado como control positivo; Figs. 11D y 11H) se transfectaron en células HEK293T en combinación con MBD3. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron (IP) con un anticuerpo anti-Flag (o anti-IgG como control), seguido de un análisis de inmunotransferencia (IB). Los niveles de expresión en lisados de células completas o extracto de IP se determinaron mediante IB anti-Flag (Figs. 11E-H) o anti-Mbd3 (Figs. 11A-D). Este análisis demuestra la interacción directa de Mbd3 con factores de pluripotencia OSK. Figs. 11I-P - son análisis de inmunotransferencia que usan anticuerpo anti-MBD3 (Figs. 11I-L) o anticuerpo anti-FLAG (Figs. 11M-P). Reproduciendo el experimento en las Figs. 11A-H, pero sobreexpresando Mbd2, en lugar de Mbd3. Las construcciones que codifican OCT4 marcado con Flag (Figs. 11I y 11M), o KLF4 (Figs. 11K y 11O) o SOX2 (Figs. 11J y 11N) o HDAC1 (usado como un control positivo; Figs. 11L y 11P) se transfectaron en células HEK293T en combinación con MBD2. Este análisis demostraba la falta de interacción enriquecida o específica para MBD2 con los factores de reprogramación OSK. Estos resultados indican que Mbd3 interacciona directamente con los factores de pluripotencia de la reprogramación y, por lo tanto, al reclutar el complejo NuRD, inhibe su actividad y previene la reactivación de sus genes diana secuencia abajo.
Las Figs. 12A-V demuestran la estabilización in vitro de células pluripotentes humanas naif, independientes de transgén y estables a largo plazo. Fig. 12A - Una ilustración esquemática que representa la estrategia usada para calibrar las condiciones para aislar iPSC naif independientes de transgén en presencia de inhibición de ERK. Los autores de la presente invención usaron una línea de iPSC humana C2 que porta lentivirus inducibles por DOX (TetO) que codifican Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. A esta línea celular se dirigió la nucleasa efectora TALE para insertar un alelo GFP-2A-Puro en el locus OCT4 endógeno. Las células C2 GFP+ se pueden cultivar en condiciones 2i/LIF pero solo con la presencia de DOX, y aproximadamente el 60% de los clones dirigidos correctamente expresaron específicamente GFP. Los autores de la presente invención cribaron la adición de factores moléculas pequeñas y citoquinas que permiten obtener células positivas para Oct4-GFP en ausencia de DOX y en presencia de inhibición de ERK. Se usaron dos grupos de factores combinados para el cribado como se indica. Grupo 1: ERKi, GSK3pI, LIF, BMP4, IGF, P38i. JNKi, forskolina. Grupo 2: FGFi, TGFi, Kenpaullona, Go6983, BayK8644, Bix1294, ROCKi y SCF. Figs. 12B-C - imágenes de microscopio que representan contraste de fases (Fig. 12B) y tinción de fluorescencia de GFP (verde, Fig. 12C) de los clones de iPS dirigidos correctamente a C2 usados para el cribado. Fig. 12D: un histograma que representa el porcentaje de colonias Oct4-GFP+ el día 14 (s.d.m.; n = 3) en presencia de diferentes combinaciones de factores como se indica.
Las células se expandieron en DOX 2iLIF así como en varios medios tales como DOX solo (DOX se usa para inducir factores transgénicos OSKM), 2i/LIF solo, 16F (grupos 1 y 2 combinados); con el medio 16F con los siguientes factores omitidos (marcados con "-") o añadidos (marcados con "+"): -2i/LIF, -pool1, -pool2, -TGFi/-FGFi, -TGFi/-FGFi FGF2 (bFGF) y TGFp1; con el grupo 2 con los siguientes factores omitidos: -TGFi, -FGFi; y grupo 1 con FGF2 y TGFpl. Obsérvese que la presencia de 2i/LIF o pool1 es esencial para mantener las células OCT4-GFP+ independientes de DOX. Obsérvese también, que TGFi y FGFi influyen negativamente en las células OCT4-GFP+ independientes de DOX, y que la adición de TGFpl y FGF2 respalda positivamente el mantenimiento de las células OCT4-GFP+ independientes de DOX en el contexto del medio 2i/LIF. Fig. 12E - Un histograma que representa el porcentaje de colonias Oct4-GFP+ el día 20 en relación con las células de control en presencia de diferentes combinaciones de factores como se indica. Las células se expandieron en el medio 14F bFGF/TGFpl que incluye los 14 factores [que son los 16 factores de los grupos 1 y 2, pero sin inhibidores de las rutas de FGF y TGF] y con TGFpl y bFGF. A continuación, a partir de esta combinación de medios (14F bFGF/TGFp1), los autores de la presente invención han eliminado los factores mostrados cerca del eje "X", p. ej., ERKi (mostrado como "-ERki" en la Fig. 12E), etc., con el fin de determinar los factores esenciales necesarios para mantener células Oct4-GFP+ en ausencia de DOX. Este análisis indica que ERKi, CHIR, P38i, JNKi, LIF, bFGF y TGFB eran componentes esenciales. La eliminación de cualquiera de ellos daba como resultado el deterioro y diferenciación significativos de células C2 Oct4-GFP+ en ausencia de DOX. Fig. 12F - Un histograma que representa el porcentaje de colonias Oct4-GFP+ el día 8 en relación con las células de control. Para optimizar más las condiciones de crecimiento naif y sustituir el reemplazo de suero KnockOut, el reemplazo de suero KnockOut se puede sustituir solo con el uso de un suplemento N2 y albumax al 1 % o concentrado de mezcla de ácidos grasos definidos al 1% (FAA) (Invitrogen). Fig. 12G - Resumen de elementos esenciales calibrados para expandir células pluripotentes naif humanas a largo plazo y sin transgenes exógenos. Este medio se denomina WIS-NHSM (Instituto de Ciencia Weizmann - Medio de células madre humanas naif). Fig. 12H - Un histograma que representa el porcentaje de colonias Oct4-GFP+ el día 8 en relación con las células de control cultivadas en diversas condiciones como se indica. Obsérvese que las iPSC humanas naif se pueden cultivar sin células alimentadoras en placas recubiertas con Matrigel o en placas recubiertas con gelatina al 0.2% vitronectina 1 ng/ml (pero no gelatina sola). Fig. 12I - Cariotipo de la línea celular pluripotente naif C1 independiente de transgén en medio WIS-NHSM. Figs. 12J-K - Imágenes que representan microscopía de contraste de fases (Fig. 12J) o de fluorescencia (Fig. 12K) de clones de iPSC C2 expandidos en WIS-NHSM independientes de DOX y muestran una expresión de Oct4-GFP homogénea. Obsérvese la expresión de Oct4-GFP (tinción verde, Fig. 12K) que demuestra que las células son pluripotentes. Figs. 12L-N - Imágenes de tinción morfológica de la formación de teratoma a partir de la línea de clones de iPS C2 mostrada en las Figs. 12I-K. Obsérvese la diferenciación en células del mesodermo (Fig. 12L), endodermo (Fig. 12M) y ectodermo (Fig. 12N) de las capas germinales embrionarias, demostrando la pluripotencia de la línea celular de iPSC C2 naif. Las Figs. 12O-R son imágenes que representan iPSC que se derivaron de fibroblastos BJ. Las iPSC humanas naif se pueden formar directamente a partir de fibroblastos BJ humanos, después de infección directa con un casete policistrónico de OKSM suministrado por un lentivirus. Fig. 12O - Contraste de fases de colonias de iPSC el día 6 d Ox en medio WIS-NHSMP3; Fig. 20P - Contraste de fases de iPSC BJ en el pase 3; Fig. 12Q - microscopía fluorescente que muestra la expresión de Nanog (tinción verde) de células iPS derivadas de fibroblastos BJ en el pase 8. El recuadro muestra tinción DAPI (azul); Fig. 12R - microscopía fluorescente que muestra la expresión de SSEA4 (tinción roja) de células iPSC BJ en el pase 13. El recuadro muestra tinción DAPI (azul); En conjunto, las Figs. 12O-R muestran que la línea de iPSC BJ establecida expresaba todo marcador de pluripotencia ensayado. Fig. 12S - Las células se expandieron en presencia de factores bFGF/TGFp y Pool1, y los factores esenciales necesarios para mantener las células OCT4-GFP+ en ausencia de DOX se determinaron mediante cribado de la pérdida de GFP tras retirar estos componentes (fuente verde). Se muestra uno de cada tres experimentos repetidos independientes. * prueba t valor P <0.01 (entre las muestras indicadas marcadas por líneas de conexión). Las barras de error indican s.d.m (n = 4). Fig. 12T - Resumen de elementos esenciales calibrados para expandir células pluripotentes naif humanas a largo plazo y sin transgenes exógenos. Este medio optimizado se denomina WIS-NHSM (Weizmann Institute of Science - Medio de células madre humanas naif). Fig. 12U - Componentes de condiciones optimizadas de WIS-NHSM. Fig. 12V - Vista representativa de campo grande de colonias de hiPSC OCT4-GFP+ cultivadas en medio WIS-NHSM.
Las Figs. 13A-W demuestran la derivación de iPSC y ESC naif humanas a partir de líneas de ESC cebadas/convencionales ya establecidas o blastocistos. Fig. 13A - Una ilustración esquemática que representa la reversión epigenética de ESC humanas cebadas/convencionales al estado naif estado fundamental y sin modificaciones genéticas. Las líneas celulares ya establecidas hESC H1, H9, BGO1, WIBR2, WIBR3 y las iPSC C1, C2 se sembraron en placas recubiertas con gelatina/vitronectina y se cultivaron en condiciones WISNHSM. En 5 días, se diferencian muchas células, pero emergen colonias de cúpula redonda. Después de tripsinización y pases, se pueden establecer líneas ESC/iPSC naif homogéneas. Las Fig. 13B-E son imágenes de microscopio de contraste de fases. Fig. 13B - hESC BG01 cebadas; Fig. 13C - Línea celular BGO1 naif en el pase 2; Fig. 13D - Línea celular BGO1 el día 5 en el medio WIS-NHSM; Fig. 13E - Línea celular BGO1 en el pase 31. Las Figs. 13F-J son imágenes de microscopio que demuestran la expresión de marcadores pluripotentes por BGO1 naif, como ejemplo representativo. Fig. 13F - hESC BG01 naif teñidas con Hoechst (panel izquierdo, tinción nuclear azul) Nanog (panel central, tinción verde) y una imagen combinada de Hoechst y Nanog (panel derecho). Fig. 13G - hESC BG01 naif en el pase 41 (46 XY) teñidas con Hoechst (panel izquierdo, tinción nuclear azul), SSEA3 (panel central, tinción roja) y una imagen combinada de Hoechst y SSEA3 (panel derecho). Fig. 13H - hESC BG01 naif en el pase 41 (46 Xy ) teñidas con Hoechst (panel izquierdo, tinción nuclear azul), SSEA4 (panel central, tinción roja) y una imagen combinada de Hoechst y SSEA4 (panel derecho). Fig. 24I - hESC BG01 naif en el pase 41 (46 XY) teñidas con Hoechst (panel izquierdo, tinción nuclear azul), TRA1-60 (segundo desde el panel izquierdo, tinción roja), una imagen combinada de Hoechst y TRA1-60 (tercero desde el panel izquierdo) y tinción con fosfatasa alcalina (AP) (tinción rosa-violeta, panel derecho). Fig. 13J - hESC BG01 naif en el pase 41 (46 XY) teñidas con Hoechst (panel izquierdo, tinción nuclear azul), Oct4 (segundo desde el panel izquierdo, tinción roja), TRA1-81 (tercero desde el panel izquierdo) y una imagen combinada de tinción de TRA -81 y Oct4 (panel derecho). Los resultados presentados en las Figs. 13F-J demuestran que las células madre pluripotentes (PSC) naif expresan todos los marcadores pluripotentes humanos conocidos y retienen un cariotipo masculino 46XY normal después de muchos pases en ausencia de transgenes exógenos. Todas las líneas naif descritas en el presente documento no muestran signos de deterioro, crisis o decadencia con la expansión (durante más de 70 pases hasta ahora). Las Fig. 13K-M son imágenes que representan la tinción morfológica de teratomas formados a partir de las PSC naif. Se muestran células del mesodermo (Figura 13K), ectodermo (Figura 13L) y endodermo (Figura 13M) de las capas germinales embrionarias, demostrando que las PSC naif son pluripotentes, como se muestra por su capacidad para generar teratomas diferenciados in vivo. Fig. 13N - una ilustración esquemática que representa la generación de una PSC naif humana a partir de un blastocisto. Se sembró un ICM-blastocisto humano en células alimentadoras en condiciones WIS-NHSM. El día 6-8, se tripsinizó el crecimiento original y se establecieron líneas celulares pluripotentes naif en condiciones WIS-NHSM en placas recubiertas de gelatina/vitronectina independientes de los alimentadores (se muestran imágenes representativas en P3 de las líneas establecidas). Fig. 13O - Imágenes que representan la microscopía de contraste de fases de una PSC naif en los pases 0 (día 6) y 3, formada a partir de un blastocisto humano que se cultivó en medio WIS-NHSM. Fig. 13P - imágenes de microscopía de fluorescencia que muestran una hESC WIS1 naif teñida con Hoechst (panel superior, tinción azul), nanog (segundo desde el panel superior, tinción verde), SSEA4 (tercero desde el panel superior, tinción roja) y una imagen combinada de Hoechst, Nanog y SSEA4 (panel inferior). Fig. 13Q - imágenes de una microscopía de fluorescencia que muestran una hESC WIS1 naif teñida con Hoechst (panel superior, tinción azul), OCT4 (tinción verde, panel central) y una imagen combinada de Hoechst y OCT4 (panel inferior). Fig. 13R: imágenes de microscopía de fluorescencia que muestran una hESC WIS1 naif teñida con Hoechst (panel superior, tinción azul), SSEA3 (tinción verde, panel central) y una imagen combinada de Hoechst y SSEA3 (panel inferior). Figs. 13S-U -imágenes que representan la tinción morfológica de teratomas formados a partir de la línea de hESC WIS1 naif. Se muestran células de las capas germinales embrionarias del endodermo (Fig. 13S), mesodermo (Fig. 13T) y ectodermo (Fig. 13U). Los resultados mostrados en las Figs. 13P-U demuestran que la línea de hESC WIS1 naif es pluripotente basado en la expresión del marcador de pluripotencia (Figs. 13P-R) y la diferenciación de teratoma in vivo (Figs. 13S-U). Fig. 13V - Las hiPSC naif se pueden formar directamente a partir de fibroblastos BJ humanos, tras la reprogramación con transfección de ARNm en condiciones de WIS-NHSM. Obsérvese la colonia en bóveda que emerge 10 días después de la transducción del factor. Fig. 13W - Las hiPSC naif se pueden formar directamente a partir de fibroblastos BJ humanos en condiciones WIS-NHSM.
Las Figs. 14A-D son imágenes (microscopía de contraste de fases) que representan la morfología de líneas celulares pluripotentes humanas cebadas y naif emparejadas genéticamente. Figs. 14A-B - Imágenes representativas que muestran una morfología distinta para las hESC naif derivadas de embriones en condiciones WIS-NHSM (marcadas como "WIS1 hESC", "WIS2 hESC", "LIS1 hESC" y "LIS2 hESC" cultivadas en células alimentadoras (Fig. 14B) o sin células alimentadoras (Fig. 14A). Figs. 14C-D - Imágenes representativas que muestran morfología distinta para líneas de células pluripotentes convencionales/cebadas (Fig. 14C), frente a hESC y hiPSC naif emparejadas genéticamente cultivadas en condiciones WIS-NHSM (Fig. 14D). Las células naif presentan una morfología más abovedada y con un límite célula-célula menos distinguible. P indica el número de pase. Para células naif, P indica el número de pases ya conseguidos en condiciones de WIS-NHSM naif. Para las células cebadas, P incluye el número de pases ya logrados en condiciones de WIS-NHSM naif (6 pases) y en condiciones cebadas.
Las Figs. 15A-M demuestran el estado de señalización y el cariotipo de iPSC y ESC naif humanas. Análisis de transferencia Western de células pluripotentes humanas cebadas o naif (pase 25) (WIBR3 hESC) usando anticuerpos dirigidos contra formas totales y fosforiladas de distintos adaptadores de señalización. Fig. 15A - pERK1/242,44; Fig. 15B - ERK1/2 total; Fig. 15C - HSP90; Fig. 15D - p38 total; Fig. 15E -pP38 180,182; Fig. 15F - HSP90. Fig. 15G -pSTAT3705; Fig. 15H - Total STAT3; Fig. 15I - ppCatenina 33,37; Fig. 15J - pcatenina; Fig. 15K - pJNK1,2; Fig. 15L - JNK; Fig. 15M - HSP90. Obsérvese que las hESC naif WIBR3 humanas que se cultivan en condiciones WIS-NHSM muestran una actividad bloqueada y reducida específica para ERK1, P38 y JNK en pluripotencia naif. De acuerdo con la esencia de LIF en WIS-NHSM, los niveles de STAT3 fosforilado se acumulan en hESC naif. Las muestras se cargaron por triplicado para demostrar consistencia. Se obtuvieron resultados similares al analizar hiPSC C1 naif y cebadas, hESC WIS2 (no mostradas). Las Figs. 15H-I son cariotipos de diferentes ESC y iPSC humanas naif.
Las Figs. 15N-S demuestran cariotipo y estabilidad clonal de células pluripotentes naif humanas. Se muestran resultados de análisis de cariotipos representativos que indican cariotipos normales de diferentes hESC y hiPSC naif. Fig. 15N - C1 hiPSC naif; Fig. 15O - WIS1 HESC naif; Fig. 15P - WIBR3 HESC naif; Fig. 15Q - BG01 hESC naif; Fig. 15R - LIS1 HESC naif; Fig. 15S - LIS2 HESC naif. Se indica el número de pases (p) en el que se recogieron las células para el cariotipado. Estos datos indican que se pueden establecer hESC y hiPSC naif de ambos sexos y mantener un cariotipo normal sin una tendencia drástica a adquirir anomalías cromosómicas.
Figs. 15T-U - Inmunotinción para marcadores de pluripotencia en líneas subclonadas individualmente (marcadas 1-4) a partir de líneas de hESC naif WIBR3 (Fig. 15T) y BGO1 (Fig. 15UO). Obsérvese que ambas líneas de hESC naif expresan OCT4, nanog, Tra-1-60, Tra-1-81 y SSeA4.
Las Figs. 16A-H son imágenes que representan análisis de inmunotinción para marcadores de pluripotencia en hESC WIBER3 naif. Fig. 16A - Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), TRA1-80 (tinción verde, panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 16B - Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), TRA1-80 (tinción verde, panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 16C: Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), KLF4 (tinción roja, panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 16D: Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), KLF4 (tinción roja, panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 16E - Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), SSEA1 (panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 16F: Hoechst (tinción azul, panel superior), TRA1-60 (tinción verde, segundo panel), Nanog (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 16G -Hoechst (tinción azul, panel superior), E-cadherina (tinción verde, segundo panel), Oct4 (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 16H: Hoechst (tinción azul, panel superior), SSEA4 (tinción verde, segundo panel), OCT4 (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Los resultados de la inmunotinción muestran que la línea de hESC naif presenta una tinción positiva para todos los marcadores de pluripotencia humanos conocidos ensayados. En particular, SSEA1, que es específico para células pluripotentes de ratón y no humanas, no se expresa en ESC e iPSC humanas naif (Fig. 16E, panel central).
Las Figs. 17A-H son imágenes que representan análisis de inmunotinción para marcadores de pluripotencia en hiPSC C1 naif. Fig. 17A - Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), TRA1-80 (tinción verde, panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 17B - Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), TRA1-80 (tinción verde, panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 17C: Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), KLF4 (tinción roja, panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 17D: Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), Nanog (tinción roja, panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 17E - Hoechst (tinción azul, panel izquierdo), SSEA1 (panel central) y una imagen combinada (panel derecho); Fig. 17F - Hoechst (tinción azul, panel superior), TRA1-60 (tinción verde, segundo panel), Nanog (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 17G: Hoechst (tinción azul, panel superior), E-cadherina (tinción verde, segundo panel), Oct4 (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 17H - Hoechst (tinción azul, panel superior), SSEA4 (tinción verde, segundo panel), OCT4 (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Los resultados de la inmunotinción muestran que la línea de hiPSC C1 naif presenta tinción positiva para todos los marcadores de pluripotencia humanos conocidos ensayados. En particular, SSEA1, que es específico para células pluripotentes de ratón y no humanas, no se expresa en iPSC y ESC naif humanas (Fig. 17E, panel central).
Las Figs. 18A-F son imágenes que representan análisis de inmunotinción para marcadores de pluripotencia en hiPSC C2 naif (Figs. 18A-F). Fig. 18A -Hoechst (tinción azul, panel superior), KLF4 (tinción roja, segundo panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 18B - Hoechst (tinción azul, panel superior), TRA1-81 (tinción amarilla, segundo panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 18C - Fosfatasa alcalina (AP; panel superior), Hoechst (tinción azul, segundo panel), SSEA1 (tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 18D - Hoechst (tinción azul, panel superior), TRA1-60 (tinción amarilla, segundo panel), Nanog (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 18E - Hoechst (tinción azul, panel superior), E-cadherina (tinción verde, segundo panel), Oct4 (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 18F - Hoechst (tinción azul, panel superior), SSEA4 (tinción verde, segundo panel), Oct4 (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Los resultados de la inmunotinción muestran que la línea de hiPSC C2 naif presenta tinción positiva para todos los marcadores de pluripotencia humanos conocidos ensayados. En particular, SSEA1, que es específico para células pluripotentes de ratón y no humanas, no se expresa en iPSC y ESC naif humanas (Fig. 18C, tercer panel desde la parte superior).
Las Figs. 19A-I son imágenes que demuestran el potencial de diferenciación in vitro de las ESC e iPSC humanas naif. Se muestran imágenes para las estructuras de e B del día 6 de las líneas celulares indicadas (definidas por nombre y número de pases). Las imágenes indican estructuras corporales embrionarias diferenciadas. Fig. 19A - EB WIBR3 naif (pase 21); Fig. 19B - EB HI naif (pase 51); Fig. 19C - EB BG01 naif (pase 41); Fig. 19D - EB C1 naif (pase 21); Fig. 19E - EB C2 naif (pase 27); Fig. 19F - EB WIS1 naif (pase 13); Fig. 19G - EB WIS2 naif (pase 21); Fig. 19H - EB LIS1 naif (pase 17); Fig. 19I - EB LIS2 naif (pase 11). Estos resultados demuestran que las iPSC y ESC naif humanas se pueden diferenciar en cuerpos embrionarios (EB) in vitro.
Figs. 19J-O - Análisis de qRT-PCR para la expresión de marcadores de diferenciación de linaje (Fig. 19J -BRACHYURY; Fig. 19K - SOX17; Fig. 19L - PAX6; Fig. 19M - AFP; Fig. 19N - SOX1) y un marcador de pluripotencia (Fig. 19O - OCT4). Los EB se generaron a partir de las siguientes líneas celulares: ESC WIBR3, ESC HI, ESC BG01, iPSC C1, iPSC C2, ESC WIS1, ESC WIS2, ESC LIS1 y ESC LIS2. Todas las líneas celulares ensayadas mostraron una marcada regulación por aumento de los genes de compromiso del linaje y una regulación por disminución del marcador de pluripotencia OCT4, de acuerdo con la diferenciación del linaje. Los niveles de expresión relativos de qRT-PCR se normalizaron a niveles expresados en células pluripotentes naif antes de la diferenciación.
Las Figs. 20A-L son imágenes que demuestran el potencial de diferenciación in vivo de las ESC e iPSC naif humanas. Las iPSC y ESC naif humanas se expandieron en condiciones WIS-NHSM durante el número de pases indicado. Las células se recogieron e inyectaron en ratones inmunodeficientes por vía subcutánea y se examinaron para determinar la formación de teratomas. Fig. 20A - hESC WIBR3 naif (pase 9); Fig. 20B - hESC WIBR3 naif (pase 22); Fig. 20C -hESC WIBR3 naif (pase 40); Fig. 20D - hESC H1 naif (pase 22); Fig. 20E - hESC BG01 naif (pase 38); Fig. 20F -hESC H9 naif (pase 20); Fig. 20G - hESC WIBR1 naif (pase 21); Fig. 20H - hiPSC C2 naif (pase 41); Fig. 20I - hiPSC C1 naif (pase 51); Fig. 20J - HiPSC BJ1 naif (pase 25); Fig. 20K - HESC LIS1 naif (pase 9); Fig. 20L - HESC LIS2 naif (pase 9). Todas las líneas ensayadas dieron lugar a teratomas maduros bien diferenciados con células de los tres linajes germinales: endodermo, mesodermo y ectodermo. "P" indica el número de pases en condiciones WIS-NHSM en las que se recogieron e inyectaron las células.
Figs. 20M-T: Las líneas individuales subclonadas naif a partir de líneas de hESC WIBR3 (Figs. 20M-P) y BGO1 (Figs.
20Q-T) (subclones numerados 1-4) también se encontraron pluripotentes con competencia para formar teratomas maduros.
Las Figs. 21A-L demuestran dependencia y respuesta de señalización distintas para las ESC/iPSC naif humanas que se parecen a las ESC/iPSC murinas. Se muestran histogramas que representan la formación de colonias de líneas celulares pluripotentes en varios medios. Las poblaciones de células se dividieron por igual y se sembraron en placas recubiertas con gelatina/vitronectina en el medio de crecimiento indicado en el que estas líneas celulares se mantienen normalmente (células naif de ratón en un medio que contiene 2i/LIF, hESC/iPSC naif en un medio WIS-NHSM, EpiSC de ratón y ESCS/iPSC cebadas humanas en un medio KSR/bFGF/TGFp). 36 horas después, los pocilios se complementaron con los inhibidores o factores de crecimiento indicados. Después de 14 días (2 pases), se analizó en los pocillos r la expresión del marcador de pluripotencia Oct4-GFP por FACS, para determinar el porcentaje relativo de colonias pluripotentes. La frecuencia de células pluripotentes se normalizó respecto a un control interno, indicado por "Medio de crecimiento" solo en la columna del extremo izquierdo (para las células naif, el medio de crecimiento era WIS-NHSM, y para las células cebadas era el medio convencional que contenía KSR/bFGF/TGFp como se especifica en métodos). Cuando se complementaron los componentes ya incluidos en WIS-NHSM, esto produjo un aumento de 2 veces en su concentración relativa. Los porcentajes normalizados inferiores a 50% se definen como "sensibles" a la presencia del inhibidor complementado. Fig. 21A - mESC 129 Naif; Fig. 21B - mEpiSC 129 cebadas; Fig. 21C - hESC WIBR3 naif; Fig. 21D - HESC WIBR3 cebadas/convencionales; Fig. 21E - HiPSC C1 naif; Fig. 21F -HiPSC C1 cebadas/convencionales; Fig. 21G - hESC C1 naif; Fig. 21H hESC C1 cebadas; Fig. 21I - hESC WIS1 naif; Fig. 21J - HESC WIS1 cebadas; Fig. 21K - hESC LIS1; Fig. 21L hESC LIS1 cebadas. Obsérvese que las ESC naif humanas siguen siendo pluripotentes en presencia de diferentes inhibidores de ERK, GSK3p y RAF. Las células pluripotentes naif humanas no se diferencian en respuesta a BMP4 (hasta 5-10 ng/ml de BMP4) o la complementación con forskolina. Las ESC/iPSC humanas cebadas se diferenciaban tras la inhibición de ERK, GSK3b, RAF o estimulación con BMP4 o forskolina. Es importante destacar que las ESC/iPSC humanas naif son únicas de cualquier línea pluripotente naif previamente descrita, en cuanto que se basan en la señalización de LIF y bFGF/TGFp (junto con la presencia de múltiples inhibidores de ERK, p38 y JNK).
Las Figs. 22A-K demuestran un requisito de señalización y respuesta únicos para hESC/iPSC naif. Las hESC/iPSC naif cultivadas en condiciones WIS-NHSM complementadas con 5 ng/ml de BMP4 siguen siendo pluripotentes y pueden diferenciarse en teratomas en vivo. Se muestran imágenes de tinción morfológica de los teratomas formados por las PSC naif. Figs. 22A-C - hESC HI naif [Pase 32 con BMP4 (5 ng/ml]; Figs. 22D-F - hiPSC C1 naif [pase 25 con BMP4 (5 ng/ml)]; Fig. 22G - HI naif Stat 3 constitutivamente activa (expandida en "condiciones naif" de WIS-NHSM sin LIF). Fig. 22H: WIS1-Stat3-CA naif (expandidas en condiciones WIS-NHSM naif sin LIF). Obsérvese la diferenciación en endodermo (Figs. 22A, 22D, 22G (panel izquierdo) y 22H (panel izquierdo)), mesodermo (Figs. 22B, 22E, 22G (panel central) y 22H (panel central)) y ectodermo (Figs. 22C, 22F, 22G (panel derecho) y 22H (panel derecho)) capas germinales embrionarias. Las Fig. 22I-K son imágenes de inmunofluorescencia que representan la expresión de marcadores pluripotentes en hESC/iPSC naif que llevan un mutante Stat3 activado constitutivamente. Fig. 22I -Hoechst (tinción azul, panel superior), Nanog (tinción verde, segundo panel), SSEA4 (tinción roja, tercer panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 22J - Hoechst (tinción azul, panel superior), Oct4 (tinción verde, segundo panel) y una imagen combinada (panel inferior); Fig. 22K: Hoechst (tinción azul, panel superior), SSEA3 (tinción verde, segundo panel) y una imagen combinada (panel inferior). Los resultados muestran que las hESC/iPSC naif que llevan un muíante Stat3 activado constitutivamente permanecen pluripotentes en ausencia de LIF exógeno de los medios WIS-NHSM, basándose en la formación de teratomas y la inmunotinción para marcadores de pluripotencia. Estos resultados muestran que las hESC/iPSC naif descritas en el presente documento comparten características definitorias con las PSC naif de roedores en su dependencia de la señalización LIF/Stat3 para permanecer pluripotentes en condiciones WIS-NHSM, y tolerancia a la citoquina BMP4 exógena, al menos en niveles bajos de BMP4 hasta 5 ng/ml - 10 ng/ml como se ensaya en el presente documento.
Las A-D demuestran que las hESC/iPSC naif femeninas conservan un estado de inactivación pre-X único en condiciones WIS-NHSM. Fig. 23A - Se muestran los análisis de secuenciación por bisulfito de seis sitios CpG en clones individuales de un amplicón del promotor de XIST (paneles inferiores). Obsérvese que en las células naif ambos alelos se desmetilan, mientras que en las células cebadas uno de los alelos queda silenciado. La metilación de CpG del locus de Oct4 se muestran como controles (paneles superiores). Fig. 23B - Un histograma que representa la cuantificación de un análisis de RT-PCR del transcrito XIST en varias células somáticas y naif. Obsérvese los bajos niveles de expresión de XIST en hESC/iPSC naif, en comparación con las células de fibroblastos diferenciados femeninos que regulan por aumento la expresión de XIST. Figs. 23C-D - Análisis de inmunofluorescencia que muestra la presencia de cuerpos H3K27me3/polycomb. Fig. 23C - hESC WIBR3 naif; Fig. 23D - Células diferenciadas a partir de hESC WIBR3 naif. Obsérvese el número pequeño de células que se encontró que tenían cuerpos H3K27me3/polycomb en núcleos de células naif (Fig. 23C) en comparación con la presencia significativa de cuerpos H3K27me3/polycomb en las células diferenciadas a partir de las mismas. Por lo tanto, tras la diferenciación, el número de cuerpos H3K27me3/polycomb aumenta drásticamente, lo que indica que las células naif humanas femeninas son capaces de iniciar la inactivación del cromosoma X después de la diferenciación. Los resultados indican que el cromosoma X en iPSC/hESC naif femeninas cultivadas en condiciones WIS-NHSM está en un estado preactivado similar al descrito en la ICM humana.
Las Figs. 24A-C demuestran que las ESC/iPSC humanas naif presentan un programa transcripcional distinto. Fig. 24A - Agrupación jerárquica de genes expresados diferencialmente en diferentes líneas de hESC/hiPSC convencionales/cebadas y naif como se indica. Observe cómo todas las hESC/iPSC naif se agrupaban independientemente de todas las muestras cebadas. Observe cómo las hESC WIBR3 naif, cuando se transfieren de nuevo (se vuelven a cebar) a condiciones de crecimiento de cebado convencionales, se agrupan con todas las demás muestras cebadas, lo que indica que estos estados son interconvertibles por condiciones de crecimiento. Figs. 24B-C - Histogramas de expresión de superficie de MHC de clase I usando análisis FACS en las líneas celulares naif y cebadas indicadas. Fig. 24B - hESC WIBR3; Fig. 24C - hiPSC C1. Las células 293HEK se usaron como control para las células diferenciadas (que normalmente expresan niveles altos de MHC de clase I). Se indican los valores de intensidad de fluorescencia medianos (MFI). Esto muestra que las células naif no expresan o expresan niveles bajos de MHC de clase I, mientras que las células cebadas expresan niveles medios y más altos de MHC de clase I. También se incluyen curvas de no tinción para cada línea celular para tener controles precisos para las muestras teñidas de MHC de clase I.
Las Figs. 25A-M demuestran la presencia del uso de un potenciador Oct4 único en hESC/hiPSC naif. Fig. 25A - Un histograma que representa la evaluación de la actividad del gen indicador del potenciador distal y del potenciador proximal de Oct4 humano en las líneas celulares pluripotentes indicadas. La actividad inicial se analizó por transfección con un vector vacío. El uso predominante del potenciador distal es claramente evidente en hESC/iPSC cultivadas en condiciones de WIS-NHSM naif. Figs. 25B-M - análisis de citometría de flujo de hESC WIBR3 que se transfectaron de manera estable con: 1) indicador Oct4-GFP-2A que marca todos los tipos de células pluripotentes [naif y cebadas; (Figs. 25C, 25E, 25G)]; 2) deltaDE-Oct4-GFP-2A-Puro que típicamente es más activo en células pluripotentes cebadas [basado en datos en ratones (Figs. 25I, 25K y 25M)]; 3) DeltaPE-OCT4GFP-2A-Puro que típicamente es más activo en células pluripotentes naif [Figs. 25H, 25J y 25L) o hESC WIBR3 no transfectadas [Figs. 25B, 25D y 25F]. Figs. 25B-C y 25H-I - células cultivadas en condiciones de crecimiento WIS-NHSM naif. Figs. 25D-E y 25J-K - células cultivadas en un medio bFGF/TGFp convencional/cebado. Figs. 25F-G y 25L-M - células cultivadas en un medio de diferenciación; las células se sometieron a análisis de citometría de flujo después de 21 días en un medio de diferenciación, cuando las células se diferenciaron en fibroblastos. Estos análisis muestran que el indicador detaPE-Oct4-GFP es más activo en condiciones WIS-NHSM naif (Fig. 25H), en relación con condiciones cebadas/convencionales (Fig. 25J), o con células diferenciadas en fibroblastos (Fig. 25L). Por otro lado, el indicador delatDE-OCT4-GFP es activo en condiciones cebadas/convencionales (Fig. 25K) en lugar de condiciones naif (Fig. 25I) o en células diferenciadas en fibroblastos (Fig. 25M). Estos resultados indican que las hESC/iPSC naif de acuerdo con algunos aspectos de la descripción conservan una configuración y estabilidad epigenéticas únicas. MFI = Intensidad de fluorescencia mediana.
Las Figs. 26A-K representan embriones quiméricos de ratón-ser humano de especies cruzadas. Figs. 26A-C: muestran imágenes que demuestran que las iPSC humanas naif pueden contribuir al desarrollo del ratón in vivo. Las iPSC C2 naif humanas se marcaron constitutivamente con el vector de sobreexpresión de GFP y BCL-2. Las células se añadieron con mórulas de embrión de ratón en desarrollo, y las células con GFP de 24 horas eran viables en el desarrollo de embriones de ratón tempranos. Estos resultados indican que las células naif humanas cultivadas en condiciones WIS-NHSM pueden contribuir a organismos quiméricos de especies cruzadas. Las Figs. 26D-K muestran cómo las iPSC naif humanas marcadas con GFP se pueden inyectar en mórulas de ratón E2.5 y permanecer integradas en blastocistos en E3.5. Fig. 26D - carga de iPSC GFP+ (positivas) naif humanas; Fig. 26E - inyección de las células mostradas en la Fig. 26D en mórula de ratón; Figs. 26F-H muestran las células inyectadas en la mórula de ratón el día de la inyección (Iny.) bajo campo brillante (Fig. 26F), EGFP (Proteína fluorescente verde mejorada) (Fig. 26G) y una imagen combinada (Fig. 26H). Las Figs. 26I-K muestran las células inyectadas en la mórula de ratón un día después de la inyección. Fig. 26I - campo brillante; Fig. 26J - EGFP; Fig. 26K - Imagen combinada.
La Fig. 27 representa la secuencia de ácido nucleico del amplicón de XIST (SEQ ID NO: 70) formado usando secuenciación por bisulfito de acuerdo con algunos aspectos de la descripción, con las islas de CpG resaltadas en amarillo. Obsérvese que en el amplicón mostrado hay seis islas de CpG.
Las Figs. 28A-C representan la relación nuclear/citoplasma en el nivel de expresión de transcritos en ESC humanas naif. Figs. 28A-B - Las hESC naif y cebadas se tiñeron doblemente para TFE3 y OCT4. Las células se tiñeron por contraste para DAPI (tinción nuclear). Se muestran imágenes confocales representativas para la línea de hESC LIS2 cebada y la línea de hESC LIS2 naif. Los recuadros son ampliaciones de los cuadros punteados. Se observó una localización nuclear predominante en hESC naif pero no en células cultivadas en condiciones de cebado. Fig. 28C -Se llevó a cabo un análisis de imágenes cuantitativo no sesgado de la localización nuclear preferencial en 200 células seleccionadas aleatoriamente de marcos de imagen independientes por muestra. Se muestran gráficos de caja y bigotes de las proporciones de TFE3 nuclear/citoplásmico en ESC de ratón y humanas naif y cebadas. Las hESC naif mostraron distribuciones similares a las de las mESC naif, y el enriquecimiento nuclear se perdió en las ESC humanas y de ratón cebadas * prueba t valores de P <1 * 10'100.
Las Figs. 29A-D representan la configuración epigenética de la pluripotencia humana naif. Las Figs. 29A-B son análisis de inmunotinción para OCT4 y DNMT3B [ADN (citosina-5-)-metiltransferasa 3 beta] en células humanas naif (Fig. 29B) y cebadas (Fig. 29A). Las células naif humanas regulan por disminución la expresión de la proteína DNMT3B, pero no la expresión de la proteína OCT4. Las Figs. 29C-D son histogramas del cambio en la metilación entre muestras cebadas y naif en seres humanos y ratones. Los histogramas representan la distribución de la diferencia de metilación por CpG, calculada para todos los CpG que residen en regiones ricas en CpG (contenido de CpG> 4%) y que tienen una cobertura de >10x en ambas muestras. Para mayor claridad, solo se incluyen en el histograma los CpG con un cambio de metilación distinto de cero. La distribución está sesgada a la izquierda, lo que indica una reducción general de la metilación en las muestras naif.
Las Figs. 30A-I representan cambios de metilación del ADN en pluripotencia humana naif. Las Figs. 30A-C son análisis de transferencia Western para niveles de DNMT3A (Fig. 30A), Dn Mt 3B (Fig. 30B) y HSP90 (Fig. 30C) en ESC/iPSC humanas cebadas y naif. Obsérvese la regulación por disminución significativa de los niveles de expresión de DNMT3A (Fig. 30A), DNMT3B (Fig. 30B) en las PSC humanas naif en comparación con las PSC cebadas. Fig. 30D: histograma del cambio en la metilación entre las células WIBR3 cebadas y las células LIS2 naif. El histograma representa la distribución de la diferencia en la metilación por CpG, calculada para todos los CpG que residen en regiones ricas en CpG (> 4% de contenido de CpG) y que tienen una cobertura de >10x en ambas muestras. Para mayor claridad, solo se incluyen en el histograma los CpG con un cambio de metilación distinto de cero. El gráfico de barras de la derecha cuenta el número de CpG en los que esta diferencia supera dos desviaciones estándar y la muestra naif tiene menor metilación (azul) o la muestra cebada tiene menor metilación (verde). La línea de puntos indica el número esperado de CpG con una diferencia que supera dos desviaciones estándar asumiendo una distribución normal. Fig. 30e - Se aplicó el mismo análisis que en la Fig. 30D anterior a las dos muestras, esta vez considerando que todos los CpG tienen una cobertura >10x en ambas muestras, independientemente del contenido de CpG de la región. Fig. 30F -Composición de medio WIS-NHSM naif que carece de citoquinas FGF2 y TGFB y, en cambio, retiene PKCi, FGFRi y TGFRi. El medio incluye: LIF (20 ng/ml), ERK1/2i (PD0325901 1 pM), GSK3pi (CHIR99021 3 pM), JNKi (SP600125 10 pM), P38i (BIRB7962 pM), FGFRi (PD1730740.2 pM), TGFpl (8 ng/ml) /- ROCKi (Y276322 pM). Fig. 30G - Las iPSC y ESC naif humanas expandidas durante 8 días en estas condiciones (con el medio que tiene la composición descrita en la Figura 30F anterior) muestran una reducción notable en los niveles totales de citosina metilada (mdC), determinado por análisis cuantitativo de LC-MS y normalizado respecto a los niveles de abundancia de dG. Fig. 30H - Se expandieron células naif y cebadas humanas y de ratón en presencia o ausencia de inhibidores para la metilación del ADN (5d-AZA) o el componente polycomb EED (DzNEP). Sólo las células naif conservan su pluripotencia después de someterlas a pases en presencia de estos inhibidores. La medición de la pluripotencia se llevó a cabo siguiendo los niveles de indicador específicos de Oct4-GFP. Fig. 30I - Metilación relativa de la región promotora de FMR1 en iPSC humanas naif y cebadas derivadas de fibroblastos de pacientes varones con síndrome de X frágil. Las iPSC de X frágil humano naif muestran una pérdida predominante de metilación en el promotor de FMR1 en pacientes con síndrome de X frágil. * prueba t Valor de P <0.05.
Las Figs. 31A-E de referencia representan una descripción numérica de la reprogramación directa de iPSC después del agotamiento de Mbd3. Fig. 31A - NGFP1-control secundario (Mbd3+/+), sobreexpresión de Nanog (NGFP1-NanogOE) y Mbd3 agotado (NGFP1-Mbd3KD) Las células pre-B se sometieron a reprogramación con DOX y se midieron semanalmente usando FACS (para pocillos monoclonales), y también con seguimiento policlonal diario de Nanog-GFP en los primeros 8 días de reprogramación. Figs. 31B-C - Porcentaje acumulado de pocillos de Nanog-GFP+ frente al tiempo en DOX, medido para varias poblaciones clonales derivadas de células B. Las latencias de NGFP1-control, NGFP1-NanogOE y NGFP1-Mbd3KD muestran distribuciones acumuladas claramente diferentes. Se muestra un experimento representativo de los 2 realizados. Fig. 31B - días con DOX; Fig. 31C - Divisiones celulares en DOX. Figs.
31D-E - Ajuste de reprogramación de latencias (medidas en días) de NGFP1-control (Fig. 31D) y NGFP1-Mbd3KD (Fig. 31E) a un modelo de función escalón determinista, usando el estadístico R2 ajustado (véase detalles en métodos) para la bondad de ajuste. NGFP1-Mbd3KD se ajusta estrechamente a un modelo determinista de función escalón (R2 > 0.9) en comparación con el NGFP1-control (R2 =0.55).
Las Figs. 32A-H representan los mecanismos del efecto inhibidor de Mbd3 sobre OSKM durante la reprogramación a pluripotencia. Figs. 32A-B - Se transfectaron construcciones que codifican OCT4, c-MYC, KLF4, s Ox 2, NANOG o HDAC1 (usado como control positivo) marcados con Flag en células HEK293T en combinación con Mbd3. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron (IP) con un anticuerpo anti-Flag (o anti-IgG como control), seguido de un análisis de inmunotransferencia (IB). Los niveles de expresión en lisados de células completas o extracto de IP se determinaron mediante IB con anti-Flag (Fig. 32B) o anti-Mbd3 (Fig. 32A). Este análisis demuestra la interacción directa de Mbd3 con factores de pluripotencia OSKM, pero no con Nanog. Se usó Hdac1 como control positivo. Fig. 32C -Enriquecimiento funcional de objetivos directas de Mbd3 como se midió en MEF somáticos antes y después de la inducción de OSKM. Fig. 32D - Enriquecimiento funcional de objetivos directas de MÍ2p (Chd4) como se midió en MEF somáticos antes y después de la inducción de OSKM. Los niveles de color indican valores P de enriquecimiento (calculados por la prueba exacta de Fisher) que superan el umbral de FDR de 0.0001%. El blanco indica enriquecimientos que caen por debajo de ese umbral. Fig. 32E - Distribución del cambio de la expresión génica en relación con MEF de muestras Mbd3+/+ (azul) y muestras Mbd3flox/-(rojo) durante la reprogramación (0, 4 días, 8 días, 11 días e iPSC/ESC). Los centros del diagrama de caja indican el valor mediano y los bordes de las caja indican los percentiles 25 y 75. Los valores de P de las diferencias de distribución indicados en el gráfico se estimaron con la prueba t de muestras emparejadas. Este análisis se calculó con todos los objetivos de unión identificados de Mbd3 (1400 genes) a partir de células Mbd3+/+ después de la inducción de OSKM. Los resultados muestran la activación general de los objetivos de Mbd3 a lo largo del proceso de reprogramación y la activación específicamente acelerada de los objetivos de Mbd3 en las muestras Mbd3fíox/~. Fig. 32F - distribución de marcas de histonas y niveles de unión de Oct4 en valores de puntuación z el día 4 después de la inducción de OSKM (DOX). Este análisis se hizo a lo largo de todos los objetivos de unión identificados de Mbd3 (1400 genes) a partir de muestras Mbd3+/+. Los centros del diagrama de caja indican el valor mediano y los bordes de las caja indican los percentiles 25 y 75. Los valores P de las diferencias de distribución indicados en el gráfico se estimaron con la prueba t de muestras emparejadas. Los resultados muestran una inducción significativa de H3K27ac y H3K4me3 mientras que la reducción de H3K27me3 en la muestra Mbd3flox/', en comparación con Mbd3+/+, así como la inducción de la unión de Oct4 en muestras Mbd3flox/'. Fig. 32G - Eficacia de reprogramación de MEF Mbd3flox/- después de la infección con lentivirus que codifican insertos de Mbd3 de tipo natural y diferentes mutantes como se indica en el panel. Las barras de error indican s.d. de triplicados biológicos. *Indica valor P significativo <0.001 en comparación con la muestra de control no infectada. Fig. 32H: esquema que representa un modelo mecanicista para inducir pluripotencia en células somáticas.
Las Figs. 33A-G representan el cribado de reducción de la expresión para represores epigenéticos en EpiSC. Fig. 33A -Eficacia de reducción de la expresión de los grupos de ARNip indicados en EpiSC medido por qRT-PCR. Los valores de expresión para cada gen se normalizaron respecto a los medidos en el ARNip de control. Las barras de error indicaron s.d. * indica valor P de la prueba t de Student <0.05. Figs. 33B-C - Imágenes de fase de líneas EpiSC Mbd3+/+ (Fig. 33B) y Mbd3flox/-(Fig. 33C) en este estudio. Las líneas celulares tenían una morfología plana típica cuando se expandían sobre placas recubiertas con gelatina/vitronectina o Matrigel (condiciones sin alimentador). Figs. 33D-E - Inmunotinción de Oct4 en líneas EpiSC. EpiSC Mbd3+/+ (Fig. 33D), EpiSC Mbd3flox/-(Fig. 33E); Figs. 33F-G - Las líneas EpiSC eran pluripotentes como es evidente por su capacidad para formar teratomas diferenciados maduros tras la microinyección por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. EpiSC Mbd3+/+ (Fig. 33F), EpiSC Mbd3flox/' (Fig. 33G).
Las Figs. 34A-C representan la derivación de ESC a partir de blastocistos Mbd3'/_. Figs. 34A-B: histogramas que representan análisis de RT-PCR para la expresión de marcadores Oct4 y de trofoblasto de ESC Mbd3+/+ (Fig. 34A) y Mbd3'/_ (Fig. 34B) expandidas en condiciones FBS/LIF o 2i/LIF. Solo las ESC Mbd3'/_ y solo en condiciones de suero regulan por aumento los marcadores de diferenciación del trofoblasto. Las condiciones rigurosas de 2i/LIF sin suero mantienen las ESC Mbd3'/' indistinguibles de las ESC Mbd3+/+. Las barras de error indican s.d. de muestras biológicas por triplicado. Fig. 34C - Quimera agutí derivada después de microinyección del blastocisto con la línea de ESC Mbd3‘ /_ que lleva el transgén de expresión de rescate para Mbd3.
Las Figs. 35A-C representan la expresión transcripcional de Mbd3 durante el desarrollo previo a la implantación. Figs.
35A-B - Análisis de RT-PCR que demuestran la expresión de Mbd3 (Fig. 35B) y Nanog (Figs. 35A) durante el desarrollo temprano del ratón, presentado como un esquema de columnas de cuantificación relativa. Las barras de error indican s.d. de triplicados biológicos. El transcrito de Mbd3 se detecta en niveles bajos en ovocitos mientras que la proteína Mbd3 se detecta fácilmente por inmunotinción en ovocitos y cigotos (Figs. 36A-D y Figs. 1O-T), de acuerdo con la herencia materna. La transcripción de Mbd3 se vuelve mayor hacia el final del desarrollo previo a la implantación en las etapas de mórula y blastocisto, de acuerdo con la reexpresión de la proteína Mbd3 en la etapa tardía de blastocisto (Figs. 1O-T). Fig. 35C - Niveles transcripcionales relativos de MBD3 en embriones humanos previo a la implantación basados en mediciones de transcripción del repositorio disponibles en embriones humanos en desarrollo temprano [intranet (dot) cmrb (dot) eu/Human_embryos/home.html], y que muestran una tendencia similar a la medida en embriones de ratón. Estos datos muestran que la transcripción de Mbd3 aumenta en las etapas tardías del desarrollo previo a la implantación, de acuerdo con los datos de inmunotinción de proteínas que muestran una expresión prominente en la etapa tardía de blastocisto (Figs. 1O-T).
Las Figs. 36A-J representan el análisis de inmunotinción para Mbd3. Figs. 36A-D: inmunotinción para Mbd3 en ovocitos de ratón, que indica la herencia materna de Mbd3. Figs. 36E-H - Inmunotinción para Mbd3 y marcadores de linaje en el epiblasto post-implantación E5.5, que indica una expresión prominente como se ve en la etapa de blastocisto tardío (Figs. 1O-T). Fig. 36I-J: análisis de inmunotinción para Mbd3, que muestra una expresión nuclear prominente en células pluripotentes expandidas en condiciones definidas de crecimiento cebadas y naif. Estos resultados excluyen la perturbación de la localización nuclear de la proteína Mbd3 en condiciones 2i/LIF naif.
Las Figs. de referencia 37A-C representan un análisis comparativo de las propiedades de las células somáticas agotadas en Mbd3 durante la reprogramación. Fig. 37A - Eficacia de reprogramación después de infección con las líneas de MEF indicadas con retrovirus de Moloney que codifican factores individuales. Fig. 37B - Eficacia de reprogramación después de infección con las líneas de MEF indicadas con lentivirus que codifica OKSM policistrónico. Fig. 37C - Los MEF Mbd3flox/' se infectaron con el vector de OKSM policistrónico en medio de ES que contenía LIF con o sin los suplementos exógenos indicados. * Indica prueba t de Student valor de P <0.01 con respecto al control Mbd3+/+. La eficacia de la reprogramación se evaluó mediante los niveles de Oct4-GFP el día 9 después de la transducción sin división celular durante el proceso.
Las Figs. de referencia 38A-B muestran que el agotamiento de Mbd3 produce una reprogramación determinista y radicalmente eficiente de múltiples tipos de células somáticas adultas. Fig. 38A - Se ensayó en MEF Mbd3+/+, Mbd3'/' y Mbd3flox/-, fibroblastos derivados de la punta de la cola de adulto (TTF) y células precursoras neurales (NPC) la formación de iPSC en 2i/LIF con o sin transducción lentiviral de OKSM. Este análisis indica que OKSM es esencial para la formación de iPS, y que el agotamiento de Mbd3 por sí solo no es suficiente para reprogramar ninguno de estos tipos de células a la pluripotencia (incluso después de 30 días de seguimiento). Fig. 38B - Eficacia de la reprogramación de MEF después de la transducción con las combinaciones indicadas de factores de reprogramación el día 10. Se usaron vectores lentivirales policistrónicos para combinaciones OSK y OSKM. Las barras de error indican s.d. de muestras repetidas.
Las Figs. 39A-D representan la formación de teratoma por iPSC Mbd3'/\ Figs. 39A-C - Los clones de iPSC Mbd3'/' seleccionado al azar (clones 1,2 y 3) se expandieron y se inyectaron por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. Todas las líneas generaron teratomas que contenían células diferenciadas de los tres linajes germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo). Estos resultados están de acuerdo con los resultados obtenidos de ESC Mbd3'/_ (Kaji et al. Development 2007). Estas últimas células (sin reconstitución de la expresión de Mbd3) tienen un potencial de desarrollo restringido cuando se trata de la formación de quimeras de alta contribución, pero pueden hacerlo para teratomas diferenciados (Kaji et al. Development 2007). Además, obsérvese que las células somáticas Mbd3flox/' también se reprograman con una eficacia de 100%, y se pueden obtener quimeras adultas con transmisión de la línea germinal sin sobreexpresión exógena de Mbd3. Desde el punto de vista técnico, se espera que se descubran en el futuro inhibidores moléculas pequeñas de Mbd3, ya que permitirán una regulación más fácil de la expresión y actividad de Mbd3 sin manipulaciones genéticas durante la reprogramación y diferenciación. Fig. 39D - Las iPSC Mbd3'/_ pueden retener el cariotipo normal (40) después de la expansión en condiciones definidas 2i/LIF. P indica el número de pase.
Las Figs. 40A-E representan imágenes de microscopio en tiempo real de intervalo de tiempo y seguimiento de la reprogramación celular. Representación esquemática de las principales etapas del protocolo de segmentación automatizada. Este protocolo se usó para analizar automáticamente datos de mosaico de pocillos completos de intervalo de tiempo, medidos para dos longitudes de onda fluorescentes. Las etapas principales del protocolo incluyen: filtrar los márgenes de la placa, aplicar detección adaptativa para cada canal y punto de tiempo, aislar colonias densas usando un filtro morfológico específico, agrupar usando un filtro de paso bajo (LPF) y agrupar componentes conectados, extraer información de la colonia e información de activación de Oct4-GFP por colonia y llevar a cabo el análisis estadístico de toda la información de puntos de tiempo (véase métodos).
Las Figs. 41A-D representan la evolución temporal de la reactivación de mCherry y Oct4-GFP en mosaico de pocillos completo (Fig. 41A) y 3 colonias Mbd3flox/' individuales representativas (Figs. 41B-D) de aproximadamente 100 colonias rastreadas.
Figs. 42A-E - Imágenes en tiempo real de intervalos de tiempo de la reprogramación determinista de iPSC. Figs. 42A-C - Imágenes de mosaico de pocillos completos de mCherry (Fig. 42A), Oct4-GFP (Fig. 42B) y canales combinados (Fig. 42C) en el día 6 después de DOX en condiciones de 2i/LIF 5% pO2. Las colonias mCherry+ similares a ES son abundantes y se localizan conjuntamente con la señal de Oct4-GFP en células Mbd3flox/\ Fig. 42D - Distribución acumulada de las colonias Oct4-GFP+ (gráfico rojo) y función de densidad de la activación de Oct4-GFP+ (gráfico de barras azules) para Mbd3flox/', se analizaron las estadísticas de todas las colonias detectadas (aproximadamente 100 colonias segmentadas por pocillo). Los resultados muestran una ventana muy estrecha de activación sincronizada de Oct4-GFP alrededor del día 4.5, más de 50% de las colonias reactivaron Oct4-GFP en un intervalo de 0.5 días. Se muestra un experimento representativo de los 4 realizados. Fig. 42E - Gráfico de diagrama de caja que muestra la distribución de la activación de Oct4-GFP de la progenie intracolonia (que son las proporciones de píxeles de Oct4-GFP+ y mCherry+ de todos los píxeles de mCherry+ dentro de cada colonia segmentada), en función del tiempo después de la inducción, los centros del diagrama de caja indican los valores medianos y los bordes de las caja indican los percentiles 25 y 75. Las estadísticas se calcularon a partir de 100 colonias segmentadas (todas las colonias detectadas). El día 6, 95% de las colonias Mbd3flox/' tienen más de 85% de células de progenie positivas para Oct4-GFP.
Las Figs. 43A-B representan la reactivación de Oct4-GFP y la formación de iPSC radicalmente mejoradas. Mediciones de citometría de flujo de la dinámica de reactivación de Oct4-GFP en 2i/LIF después de inducción con DOX (OSKM) en células Mbd3flox/' (Fig. 43B) o Mbd3+/+ (Fig. 43A). Las células secundarias Mbd3flox/' reactivan de forma rápida y sincrónica Oct4-GFP el día 7 en toda la población de células del donante. Es importante destacar que en los puntos de tiempo indicados los pocillos se recogieron para el análisis sin pase y división previos durante el transcurso de la reprogramación. Se muestra 1 de 3 experimentos independientes. (FSC - dispersión frontal). Obsérvese la notable reactivación de Oct4-GFP que se produce en la estrecha ventana de tiempo los días 4-5, como también se observa en las mediciones de microscopio de imágenes en vivo de intervalo de tiempo.
Las Figs. 44A-B representan la caracterización del efecto de la reconstitución de la expresión de Mbd3 durante la reprogramación determinista de células somáticas a pluripotencia. Fig. 44A - El esquema demuestra una estrategia experimental para definir la capacidad temporal de Mbd3 durante la reprogramación para inhibir la formación de iPS. Fig. 44B - Se ensayó en MEF Mbd3flox/- reprogramable con OSKM secundarios la posibilidad de reprogramarlos después de la sobreexpresión de lentivirus FUW con Mbd3, Mbd2 o vacío en diferentes puntos de tiempo durante la reprogramación. La transfección con vector de Mbd2 o simulado no dio como resultado una disminución en la eficacia de reprogramación de iPSC. La introducción de Mbd3 redujo drásticamente la formación de iPSC cuando se suministró antes del día 5 en la reprogramación. Se muestra 1 de 2 experimentos representativos. Se muestra el promedio de duplicados por condición. Las barras de error indican s.d.
Las Figs. 45A-B representan el análisis de expresión génica durante la reprogramación de iPSC después del agotamiento de Mbd3. Fig. 45A - Se midió la expresión génica en fibroblastos de donantes antes y después de la inducción con DOX y se comparó con líneas de iPSC y ESC pluripotentes establecidas. Agrupación de la firma génica completa (16620 genes) por agrupación jerárquica usando la correlación de Spearman como métrica de distancia y enlace promedio. Los resultados muestran que los MEF Mbd3flox/-, pero no Mbd3+/+, se agrupaban de manera diferente a los MEF somáticos del donante solo después de 4 días de inducción de OKSM (DOX). El día 8, las células Mbd3flox/-eran transcripcionalmente indistinguibles de las líneas de ESC e iPSC establecidas. La población Mbd3+/+ se agrupa con células de 4 días Mbd3flox/- incluso después de 11 días de reprogramación más prolongada, y no se agrupaban con líneas ESC-iPSC pluripotentes. Fig. 45B - Agrupación de la firma de expresión génica completa (16620 genes) mediante análisis de componentes principales (PCA) que detecta los componentes principales con la mayor variación en los datos. La representación gráfica de los componentes principales explica más de 80% de la variación de datos. Las muestras en cada elipse de color muestran dinámicas similares, donde las células Mbd3flox/' del día 8 son indistinguibles transcripcionalmente de las líneas ESC e iPSC establecidas. (KO = Mbd3^ , HET = Mbd3flox/-, WT = Mbd3+/+).
Las Figs. 46A-E representan cambios en el patrón de expresión génica durante la reprogramación de iPSC. La progresión de la expresión de un solo gen describe el grado con que cada gen alcanza su valor de expresión en iPSC. Estos valores se cuantificaron usando la siguiente transformación
Figure imgf000018_0001
Esta transformación representa una distancia desde los valores de expresión de MEF (establecidos en 0) hacia los valores de iPS (establecidos en 1). Un grupo seleccionado de genes relacionados con la pluripotencia o dianas seleccionadas de Mbd3 se representan gráficamente en diferentes puntos de tiempo después de la inducción con DOX. Las barras rojas representan la progresión de la expresión génica en Mbd3flox/' y las barras azules representan la progresión de la expresión génica en Mbd3+/+. Fig. 46A - La ausencia de transcripción inicial de genes de pluripotencia bona fide se puede ver en muestras de MEF (tanto Mbd3flox/- como Mbd3+/+). Fig. 46B - la inducción rápida de múltiples genes relacionados con la pluripotencia, que incluyen Sall4, Lin28a, Utf1 y Nanog, puede verse 4 días después de la inducción de OSKM en Mbd3flox/-, pero no Mbd3+/+. Fig. 46C - Estos genes alcanzan los niveles observados en las células iPS/ES (aproximadamente 1) el día 8, en Mbd3flox/' pero en la mayoría de los casos no en Mbd3+/+. Figs. 46D-E - Análisis de qRT-PCR de célula única para la detección de marcadores de genes de pluripotencia. El análisis se llevó a cabo en MEF Mbd3+/+(Fig. 46D) y Mbd3flox/' (Fig. 46E) antes (día 0) y 6 días después de la inducción con DOX. Los genes que se expresaron por encima del nivel de detección están marcados en verde (y los no detectados están marcados en rojo). Solo en las muestras Mbd3flox/- y solo después de DOX, 12/12 células analizadas mostraron reactivación de todos los marcadores de pluripotencia ensayados. Se observa que la reactivación de Sox2 endógeno por RT-PCR es fuerte en 2 í/LIF+d Ox en células WT, lo que indica que no refleja estrictamente la reactivación de la pluripotencia auténtica.
Las Figs. 47A-B representan la agrupación de todos los valores de marcas de histonas, medidos en genes expresados diferencialmente. La IP-Seq (IP = inmunoprecipitación) de cromatina se realizó en fibroblastos de donantes antes y después de la inducción con DOX y se comparó con la ChIP-Seq de cromatina de las líneas de iPSC pluripotentes establecidas y ESC. Los perfiles de genes de H3K4me3, H3K27me3 y H3K27ac se extrajeron y se normalizaron respecto a la puntuación z. Para el análisis actual, se eligió el valor de cada gen y cada marca de histona como el valor máximo del perfil de puntuación z adecuado. La agrupación se llevó a cabo en vectores concatenados que incluían todas las marcas de histonas (H3K4me3, H3K27me3 y H3K27ac) para cada gen. Fig. 47A - Agrupación jerárquica de H3K4me3, H3K27me3 y H3K27ac centrándose en los 1323 genes superiores cuya expresión génica diferenciaba entre muestras de MEF de tipo natural y ESC (véase métodos). La agrupación jerárquica se calculó usando la correlación de Spearman como métrica de distancia y unión promedio. Los resultados muestran que para el día 8 Mbd3flox/-, pero no Mbd3+/+, eran epigenéticamente similares a las líneas de ESC e iPSC establecidas. Fig. 47B - Correlación de Spearman entre los vectores descritos anteriormente (1323 genes con todas las marcas de histonas). Aquí también, los MEF Mbd3flox/-, pero no Mbd3+/+, se agrupaban de manera diferente a los MEF somáticos de donante solo después de 4 días de inducción de OKSM (DOX). El día 8, las células Mbd3flox/- muestran una firma epigenética que se correlaciona fuertemente con las línea de ESC y iPSC establecidas. La población Mbd3+/+ no muestra una fuerte correlación con las líneas ESC-iPSC pluripotentes incluso después de 8 días de reprogramación.
Las Figs. 48A-C representan la agrupación de cada marca de histona por separado. Agrupación jerárquica de valores de puntuación z de H3K27me3 (Fig. 48A), H3K27ac (Fig. 48B) y H3K4me3 (Fig. 48C) que se centran en los 1323 genes superiores cuya expresión génica diferenciaba entre muestras de MEF y ES de tipo natural (véase métodos). La agrupación jerárquica se calculó usando la correlación de Spearman como métrica de distancia y unión promedio. Los resultados muestran que incluso cuando se considera cada marca de histona por separado, el día 8 Mbd3flox/-, pero no Mbd3+/+, eran epigenéticamente similares a las líneas de ESC e iPSC establecidas.
Las Figs. 49A-B representan cambios en el nivel de metilación del ADN durante la reprogramación determinista. Fig. 49A - El nivel promedio de metilación del ADN cae después de 8 días de inducción de OSKM (DOX) en células Mbd3flox/-, pero no en las Mbd3+/+. Los niveles de metilación de todo el genoma se ensayaron usando secuenciación por bisulfito de representación reducida (RRBS, véase métodos). El nivel de metilación se calculó por separado para cada dinucleótido CpG y luego se promedió en todos los CpG que estaban cubiertos por 5 o más lecturas de secuenciación distintas (34522 sitios CpG en total). El nivel de metilación promedio de iPSC Mbd3+/+ de bajo número de pases (calculado en el mismo conjunto de CpG) se proporciona como una línea discontinua como referencia. Fig. 49B - Se repitió el mismo análisis de metilación promedio que en (a). Sin embargo, solo se usaron los 18749 CpG (de 34 522) que residen en áreas ricas en CpG (es decir, abundancia de CpG >4%).
Las Figs. 50A-C de referencia representan la reprogramación de iPSC determinista y sincronizada después del agotamiento de Mbd3 en condiciones 2i/LIF. Fig. 50A - Ejemplos representativos de (líneas Pre-iPSC) parcialmente reprogramadas generadas a partir de MEF Mbd3+/+ secundarios y expandidos en condiciones 2i/LIF DOX. Obsérvese la falta de expresión de Oct4-GFP en las líneas pre-iPSC mCherry+. La línea subclonada de iPSC Oct4-GFP+/mCherry+ se muestra como un control positivo (fila del panel inferior). Fig. 50B: las líneas celulares BIV1, MCV6 y MCV8 parcialmente reprogramadas (pre-iPS intermedias) descritas previamente (Mikkelsen, T.S. et al. Nature 454, 49-55, 2008) se sometieron a 2 rondas de transfección con ARNip de control (desordenado) o de Mbd3 y expandido en condiciones 2i/LIF. El agotamiento de Mbd3 dio como resultado una conversión espectacular de la mayoría de las células en iPSC pluripotentes. Las barras de error indican s.d. de repeticiones biológicas. Fig. 50C - Quimera adulta generada a partir de iPSC BIV1 rescatadas como es evidente por la contribución del color del pelaje de agutí.
La Fig. 51 de referencia representa la mejora de la reprogramación basada en la fusión celular mediante el agotamiento de Mbd3 en condiciones 2i/LIF. La inhibición de la expresión de Mbd3 promueve una reprogramación robusta a la pluripotencia a través del ensayo de reprogramación de fusión celular entre MEF somáticos y ESC. Las ESC Mbd3+/+ y Mbd3'/' (que no llevan el indicador Oct4-GFP) se hicieron transgénicas con una construcción que codifica el casete de resistencia a la higromicina dirigido por el promotor CAAGS constitutivo. Se evaluó su capacidad para reprogramar MEF de tipo natural agotados en Mbd3 (Mbd3flox/_) (que llevan el indicador Oc4-GFP y el casete de resistencia a puromicina constitutivo) mediante fusión celular mediada por PEG. Se llevó a cabo la fusión de células por PEG y las células se incubaron en puromicina higromicina para seleccionar colonias de doble resistencia. Se usó la reactivación de transgenes Oct4-GFP en MEF reprogramados en condiciones 2i/LIF para cuantificar la eficacia de la reprogramación de fusión celular. Los resultados indican claramente que el agotamiento de Mbd3 y las células de donante y receptor da como resultado una aceleración radical de la reprogramación de las células somáticas a la pluripotencia Nanog+ en 2i/Lif. Para cada uno de los paneles, se muestra uno de cada 2 experimentos realizados de forma independiente. * indica prueba t de Student valor P <0.01. Las barras de error indican s.d.
Las Figs. 52A-C demuestran el direccionamiento basado en nucleasa TALE del locus de MBD3 en células pluripotentes humanas. Fig. 52A - Visión general esquemática que representa la estrategia de direccionamiento para generar un alelo inactivado condicional de MBD3 que permite la escisión del exón 2 después de la transfección de la recombinasa Cre. Las sondas de transferencia Southern se muestran como líneas negras, los exones como cajas azules. Se indican los sitios de digestión para Nhe1 y HindIII. Figs. 52B-C - Análisis de transferencia Southern después de direccionamiento de líneas de hESC WIBR3 humanas con la sonda 5' (Fig. 52B) y con la sonda 3' (Fig. 52C). La eficacia del direccionamiento era alta y permitía el aislamiento de clones donde ambos alelos se modificaron correctamente después de una única ronda de direccionamiento. El análisis de transferencia Southern indica el direccionamiento correcto en 5' y 3' de ambos alelos de Mbd3 en los clones n° 33 y n° 37 de hESC WIBR3. Se seleccionó el clon n° 37 que mostraba la expresión hipomórfica de la proteína MBD3 (Figs. 8M-N) para un seguimiento experimental y análisis adicionales.
Las Figs. 53A-E de referencia demuestran que el agotamiento de la expresión de Mbd3 facilita la formación de iPSC humanas a partir de fibroblastos diferenciados in vitro. Fig. 53A - Las iPSC MBD3+/+ y MBD3flox/' que llevaban el transgén OKSM inducible por DOX se marcaron con mCherry expresado de manera constitutiva y se dirigieron con un alelo introducido de OCT4-GFP54 (Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 29, 731-734, 2011). Los fibroblastos diferenciados in vitro de estas últimas líneas se reprogramaron como se indica en el esquema. >95% de los fibroblastos Mbd3flox/' humanos se convirtieron en IPSC NANOG/TRA1-60+ después de 8 días de inducción del transgén. Las barras de error indican s.d. de repeticiones biológicas. * Indica valor P significativo <0.001 en comparación con muestras MBD3+/+. Fig. 53B - Cariotipo normal de clon de iPSC Mbd3flox/- mantenido en condiciones de crecimiento WIS-NHSM. Figs. 53C-E - La pluripotencia de los clones de iPSC seleccionados aleatoriamente (1, 2 y 3) como es evidente por la formación de teratomas y la generación de células diferenciadas forman tres linajes germinales (mesodermo, endodermo y ectodermo).
Las Figs. 54A-G demuestran que la inhibición del ARNip de MBD3 promueve la reprogramación de iPSC humanas por OSKM. Figs. 54A-B - El tratamiento con ARNip de MBD3 de fibroblastos primarios humanos permite la generación de iPSC mediante solo dos rondas de reprogramación con transfección de ARNm con factores OSKM y LIN28 (STEMGENT) y alivia la necesidad de muchas rondas de transfecciones repetidas de ARNm con factores de pluripotencia. Obsérvese el número de colonias nanog+/SSEA4+ el día 8 en células tratadas con ARNip de MBD3, pero no en células tratadas con el ARNip de control (Fig. 54B). Fig. 54C - Se muestran clones de iPSC humanas representativos (1 y 2) en diferentes puntos de tiempo y pases (P indica el número de pases; día 7 y pase 11). Figs.
54D-F - La pluripotencia de clones seleccionados aleatoriamente (1 y 2) se muestra mediante tinción específica para marcadores de pluripotencia OCT4 y SSEA4 (Fig. 54D) y formación de teratomas (Figs. 54E y 54F). Fig. 54G - Se inyectaron células naif humanas por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes SCID y se formaron después de 4­ 8 semanas tumores de teratoma bien diferenciados con diferenciación en los tres linajes [(endodermo (izquierda), ectodermo (medio) y mesodermo (derecha)]. Esto indica que las células son funcionalmente pluripotentes. Estos resultados indican que la inhibición de la expresión y/o función de MBD3 promueve la formación de iPSC mediante ARNm transitorio u otros protocolos de transfección transitoria para la reprogramación de iPSC.
Las Figs. 55A-D de referencia representan cinéticas de reprogramación después de agotamiento de Mbd3. Fig. 55A -Porcentaje acumulado de pocillos GFP+ frente al tiempo (en días), medido por FACS. Dos repeticiones de NGFP1-control y NGFP1-Mbd3KD) medido diariamente durante 10 días. Los resultados muestran una activación rápida de Nanog-GFP de >95% de células NGFP1-Mbd3KD entre el día 4 y 6. Fig. 55B - La reprogramación de células pre-B NGFP1-Mbd3KD medida por FACS y la reprogramación de MEF Mbd3flox/' medida por microscopía de imágenes en vivo muestran una cinética similar. Los valores del gráfico indican la media y las barras de error indican la desviación estándar calculada para 4 repeticiones de MEF y 2 repeticiones de células B. Figs. 55C-D - Las latencias de reprogramación de NGFP1-control (Fig. 55C) y NGFP1-Mbd3KD (Fig. 55D) (medidas en días), se ajustaban a modelos de etapa limitante de velocidad en tándem múltiples. Fig. 55C (centro): gráfico de ajuste de NGFP1-Mbd3+/+ a proceso multifásico con dos transiciones exponenciales y un solo estado intermedio. Fig. 55D (centro) - Gráfico de ajuste de NGFP1-Mbd3KD a una transición exponencial única sin estados intermedios. El ajuste se hizo usando tanto regresión no lineal con el estadístico R2 ajustado como ajuste no lineal ponderado por minimización de chi2 (véanse los detalles en métodos). Obsérvese que NGFP1-Mbd3+/+ se ajusta mal a un proceso de transición único y se adapta mejor a un proceso con 1-2 fases intermedias (Figs. 56A-F, 57A-D). NGFP1-Mbd3KD por otro lado, se ajusta de manera óptima a una transición exponencial única sin estados intermedios (ajuste R2 =0.992). La velocidad de reprogramación calculada a partir de la velocidad de transición del ajuste del modelo se indica en la parte inferior de los paneles. Obsérvese que las velocidades están a escalas diferentes debido a las diferencias en las mediciones de ensayos policlonales y monoclonales (véanse métodos).
Las Figs. 56A-F representan análisis estadísticos usando distribución gaussiana. Las latencias de reprogramación de NGFP1-control y NGFP1-Mbd3KD se ajustaban a la distribución gaussiana. Figs. 56A-B - Bondad de los gráficos de ajuste para el ajuste de NGFP1-Mbd3+/+ (Fig. 56A) y NGFP1-Mbd3KD (Fig. 56B) a la distribución gaussiana. Figs. 56C-D - Los gráficos que muestran una reducción de 12 veces en el tiempo medio de reprogramación (Fig. 56C) y una reducción de 80 veces en la desviación estándar de Mbd3KD (Fig. 56D). Figs. 56E-F - Gráficos que muestran la transformación sincronizada del estado somático a iPS después de 6 ciclos celulares (Fig. 56E) con variabilidad (desviación estándar) menor que la mitad del ciclo celular (Fig. 56F). Las barras de error representan intervalos de confianza al 95% para los parámetros, estimados por máxima verosimilitud.
Las Figs. 57A-E representan la cuantificación de la reprogramación de iPSC después de integrar la variabilidad del ciclo celular. La variabilidad observada en las mediciones de latencia de reprogramación se cuantificó y después se comparó con la variabilidad inherente del ciclo celular. Fig. 57A - El coeficiente de variación (CV = std/media) de cada muestra (Mbd3KD y Mbd3+/+, colores rojo oscuro y azul) se comparó con el coeficiente de variación del ciclo celular medido para esa muestra (colores rojo claro y azul). El gráfico muestra que mientras el coeficiente de variación en la muestra Mbd3+/+ es 0.5, el coeficiente de variación en Mbd3KD se reduce a 0.09, muy próximo al coeficiente de variación estimado del ciclo celular (0.08). Las barras de error representan intervalos de confianza al 95% para el coeficiente de variación, estimado por máxima verosimilitud y calculado por propagación del error (véase métodos). Fig. 57B -Usando un modelo de movimiento browniano (Bm ), los autores de la presente invención han estimado la variabilidad dinámica para cada muestra (véase métodos). Esta variabilidad es la relación de la desviación estándar del movimiento browniano (o) dividido entre el parámetro de deriva del movimiento browniano (v), dónde a/v > 1 corresponde a una dinámica de alta variabilidad. Los autores de la presente invención muestran que aunque la variabilidad dinámica en la muestra Mbd3+/+ es o/v > 5, las mediciones de Mbd3KD y del ciclo celular muestran ambos una variación dinámica de o/v “ 0.5. Las barras de error representan intervalos de confianza al 95% para el coeficiente de variación, estimado por la máxima verosimilitud y calculado por propagación de error (véase métodos). Fig. 57C - Ilustración del modelo de tiempo de primer pase. En este modelo de movimiento browniano (BM), los autores de la presente invención asumen que el tiempo de reprogramación depende de la primera vez que algún regulador maestro (es decir, Nanog u Oct4) pasa de su estado inactivo bajo al estado de alta expresión al pasar un umbral de expresión fijo. Figs. 57D-E -Los autores de la presente invención han ajustado después la distribución del tiempo del ciclo celular (véase métodos) a la latencia de reprogramación observada. Mediante este método, los autores de la presente invención muestran un ajuste perfecto (R2 = 0.999) entre el modelo dinámico y de ciclo celular de Mbd3KD (Fig. 57E), pero no en la dinámica del control Mbd3+/+ (R2 = 0.73) (Fig. 57D).
Las Figs. 58A-D representan la modelización de un proceso limitante de la velocidad múltiple en el contexto de la reprogramación de iPSC. Las latencias de reprogramación de NGFP1-Mbd3+/+ y NGFP1-Mbd3KD se ajustaron a modelos de etapa limitante de velocidad en tándem múltiples. Cada conjunto de datos experimentales se probó frente a modelos con 1 a 5 transiciones exponenciales. El ajuste se realizó con regresión no lineal y estadística R2 ajustado (véase métodos). Fig. 58A - Ajuste de NGFP1-Mbd3+/+ a una transición exponencial única sin estados intermedios. Obsérvese que NGFP1-Mbd3+/+ se ajusta mal (R2 aj. = 0.94) a un solo proceso de transición. Fig. 58B - Ajuste de NGFP1-Mbd3+/+ a proceso multifásico con dos transiciones exponenciales y un solo estado intermedio. Obsérvese que NGFP1-Mbd3+/+ se ajusta razonablemente (R2 aj. = 0.996) a dos procesos de transición exponenciales. Fig. 58C - Ajuste de NGFP1-Mbd3+/+ a proceso multifásico con tres transiciones exponenciales y dos estados intermedios. Obsérvese que NGFP1-Mbd3+/+ se ajusta de forma óptima (R2 aj. = 0.998) a tres procesos de transición exponenciales. Fig. 58D - valores de R2 ajustado obtenidos con los diferentes modelos para NGFP1-Mbd3+/+ (azul) y NGFP1-Mbd3KD (rojo), lo que indica que el modelo de mejor ajuste para NGFP1-Mbd3KD es una única transición exponencial sin estados intermedios y el modelo de mejor ajuste para NGFP1-Mbd3+/+ es un proceso multifase con tres transiciones exponenciales y dos estados intermedios.
Las Figs. 59A-G representan la modelización de un proceso limitante de la velocidad múltiple en el contexto de la reprogramación de iPSC. Los resultados del ajuste se validaron usando un segundo procedimiento de ajuste basado en el ajuste no lineal ponderado por minimización de chi2 (véase métodos). Para cada modelo, la bondad de la gráfica de ajuste se da en los paneles de la izquierda (Figs. 59A, C, E), y los errores de observación (residuales) se dan en los paneles de la derecha (Figs. 59B, D, F). Figs. 59A-B - Ajuste de NGFP1-Mbd3+/+ a una sola transición exponencial sin estados intermedios. Figs. 59C-D - Ajuste de NGFP1-Mbd3+/+ a proceso multifásico con dos transiciones exponenciales y un solo estado intermedio. Figs. 59E-F - Ajuste de NGFP1-Mbd3+/+ a proceso multifásico con tres transiciones exponenciales y dos estados intermedios. Fig. 59G - Valores de Chi2 obtenidos con los diferentes modelos para NGFP1-Mbd3+/+ (azul) y NGFP1-Mbd3KD (rojo), que indican que el modelo de mejor ajuste para NGFP1-Mbd3KD es una única transición exponencial sin estados intermedios y el modelo de mejor ajuste para NGFP1-Mbd3+/+ es un proceso multifásico con tres transiciones exponenciales y dos estados intermedios.
Las Figs. 60A-C representan la interacción directa de Mbd3/NuRD con factores de pluripotencia OSKM durante la reprogramación. Fig. 60A - A la sobreexpresión de Mbd3 marcado con Flag simultáneamente con Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc o Nanog en células HEK293 le siguió un ensayo de co-inmunoprecipitación (co-IP). El análisis de inmunotransferencia (IB) usando anticuerpos contra Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc y Nanog mostraba unión específica entre Mbd3 y los factores pluripotentes excepto Nanog. Fig. 60B - Una estrategia de inserción dirigida en ESC V6.5 murinas con una construcción de direccionamiento que genera el alelo de Oct4 marcado con Flag marcado de forma endógena. Esta línea muestra la co-IP específica para Mbd3 con Oct4 en condiciones 2i/LIF. La co-IP con Nanog se muestra como un control positivo. Fig. 60C - Ensayo de co-IP de Chd4 (Mi2b), la subunidad central del complejo NuRD, en fibroblastos Mbd3+/+ secundarios 3 días después de la inducción con Dox y aplicando las condiciones 2i/LIF. La co-IP para el componente NuRD, Chd4, seguido del análisis de IB, indicó una bajada específica de otros componentes Mbd3/NuRD (Mbd3 y Mta2) y factores de reprogramación de OSKM.
Las Figs. 61A-C demuestran que Mbd3 se une a proteínas pluripotentes en ESC pero no a Mbd2. Fig. 61A - Los autores de la presente invención establecieron una línea de ESC que lleva la recuperación del transgén Mbd3 marcado con Flag insertado en la línea de ESC Mbd3'/\ La co-inmunoprecipitación usando perlas con Flag seguida de transferencia Western muestra que Mbd3 se une fuertemente a los miembros Mi2b y Mta2 del complejo NuRD, pero no a Mbd2. Además, Mbd3 interacciona con el factor de reprogramación de pluripotencia Sall4 en las ESC. Figs. 61B-C - Una línea de ESC de control muestra que Mta2, un miembro del complejo NuRD, se une a Mbd3 o Mbd2 (Fig. 61B). Pero la bajada de Mbd2 no muestra ninguna interacción con Mbd3 (Fig. 61C). Estos ensayos recapitulan la observación en muchas otras líneas celulares donde Mbd2 y Mbd3 forman complejos mutuamente excluyentes (Le Guezennec, X. et al. Mol. Cell. Biol. 26, 843-851,2006; Aguilera, C. et al. Nature 469, 231-235, 2011).
Las Figs. 62A-C demuestran que el dominio MBD de Mbd3 es crítico para la interacción directa con los factores de reprogramación de OSKM. Se diseñaron mutaciones por deleción en el sitio MBD de Mbd3 con el fin de encontrar la región de unión de Mbd3. Se cotransfectaron construcciones de mutación marcada con Flag con Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc en células HEK 293T durante 48 horas, seguido de co-inmunoprecipitación con perlas anti-Flag e inmunotransferencia contra Oct4, Klf4, Sox2 y c-Myc. Este análisis mostró pérdida de unión e interacción entre Mbd3 y OSKM cuando se usaban deleciones que cubrían la región de 25-49 aminoácidos de Mbd3 (como se muestra esquemáticamente en la Figura 62C).
La Fig. 63 representa el análisis de enriquecimiento de motivos para la unión de Mbd3 después de la reprogramación. Los motivos superiores abundan entre las regiones de unión de Mbd3 después de la inducción de OSKM. Se muestran los logos de secuencia de motivos seleccionados, junto con los factores asociados, la puntuación Z y el valor P. Los motivos se infirieron usando el software SeqPos en el paquete Cistrome (véase métodos).
Las Fig. 64A-H de referencia representan el efecto del agotamiento de Mbd3 en objetivos comunes a OSKM y Mi2b. Figs. 64A-D - Perfiles de densidades de lectura de unión de Mi2b (Chd4) el día 4 para muestras Mbd3+/+ (azul) y Mbd3flox/-(rojo). Los perfiles describen la densidad de lectura normalizada respecto a la puntuación z entre 1 Kb secuencia arriba y secuencia abajo de TSS. Cada gráfico incluye genes que han sido caracterizados previamente (Sridharan, R., et al., Cell 36: 364-77, 2009) como dianas de unión de uno de los factores OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc), el perfil de puntuación z se promedia para todos los genes incluidos en el conjunto de diana de unión al factor. Las Figs. muestran una reducción en la unión de Mi2b a los objetivos de OSKM tras el agotamiento de Mbd3. Figs.
64E-F - Transferencia Western que indica la eficacia del agotamiento de proteínas tras la transfección de ARNip de conjuntos de ARNip dirigidos a Mbd3 o Chd4. Figs.64G-H - Eficacia de reprogramación de MEFS Mbd3+/+ secundarios, después de reducción de la expresión de Mbd3 o Chd4 (como se representa en el esquema). Las barras de error indican s.d. * Indica valor P de la prueba t de Student <0.01.
Las Figs. 65A-E de referencia representan el efecto del agotamiento de Mbd3 en los genes diana de OSKM. Figs.
65A-B - los centros del diagrama de caja indican el valor mediano y los bordes de las cajas indican los percentiles 25 y 75. Los valores P de las diferencias de distribución indicados en el gráfico (en cada panel) se estimaron con la prueba t de muestras emparejadas. Fig. 65A - Distribución del cambio de expresión génica en relación con muestras de MEF Mbd3+/+ (azul) y muestras de Mbd3flox/' (rojo) durante la reprogramación (0, 4 días, 8 días y iPS/ES) como se describe en la Fig. 32F, pero aquí calculado en 2928 genes que se encontró previamente que eran unidos por al menos uno de los siguientes factores en MEF o ESC inducidas por OSKM: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc y Nanog (Sridharan, R., et al. Cell, 36: 364-77, 2009) y son regulados por aumento durante la reprogramación de células naturales. Fig. 65B -Distribución de las marcas de histonas y los niveles de unión de Oct4 en los valores de puntuación z el día 4 después de la inducción de OSKM (DOX), calculada a partir del mismo conjunto de 2928 genes descrito anteriormente. Los resultados muestran una activación mejorada de la transcripción de los objetivos de OSKM en muestras Mbd3flox/', y una inducción significativa de H3K27ac y H3K4me3 a la vez que reducción de H3K27me3 en muestra Mbd3flox/', en comparación con Mbd3+/+, así como una leve inducción de la unión de Oct4 en muestras Mbd3flox/'. Figs. 65C-E - Los perfiles de densidades de lectura de H3K27me3 (Fig. 65C), H3K27ac (Fig. 65D) y H3K4me3 (Fig. 65E) el día 4 se representan para cuatro genes diana de OSKM representativos (Sall4, Klf5, Prdm14 y Tbx3). Los perfiles describen la densidad de lectura normalizada respecto a la puntuación z entre 1 Kb secuencia arriba de TSS y TES. Los perfiles de Mbd3flox/- de H3K27ac y H3K4me3 (área roja) aumentan significativamente (> 3 Std) y de H3K27me3 se reducen significativamente, en comparación con muestra de Mbd3+/+ (área azul).
Las Figs. 66A-F de referencia representan el efecto del agotamiento de Mbd3 en OSKM y Mbd3. Los centros del diagrama de caja indican el valor mediano y los bordes de las cajas indican los percentiles 25 y 75. Los valores P de las diferencias de distribución indicados en el gráfico se estimaron con la prueba t de muestras emparejadas. Fig. 66A - Igual que en la Fig. 65A, pero calculado sobre genes que están unidos por dianas tanto OSKM como Mbd3 (n = 320 genes) Fig. 66B - Igual que en 65B pero calculado sobre genes que están unidos por Mbd3 y son regulados por aumento durante la reprogramación (firma genética expresada diferencialmente descrita en los métodos). Los resultados aquí muestran tendencias similares a las descritas en las Figs. 65A-B. Figs. 66C-F - Distribución de marcas de histonas y niveles de unión de Oct4 en valores de puntuación z en células agotadas en Mbd3 (Mbd3flox/-) o de tipo natural (Mbd3+/+). Los resultados presentados en las Figs. 66C-F demuestran que en las muestras agotadas en Mbd3, durante la reprogramación, las dianas de Mbd3 y/o las dianas de OSKM adquieren más cromatina abierta y se reactivan de forma fácil y completa.
Las Figs. 67A-D demuestran que los activadores epigenéticos que promueven la pluripotencia son esenciales para la formación de iPSC tanto determinista como estocástica. Fig. 67a - Requisito para la inducción de transgén mediada por DOX durante la reprogramación de iPSC a partir de la forma de MEFs Mbd3+/+y Mbd3flox/- secundarios. El porcentaje de colonias Oct4-GFP se cuantificó en el punto de tiempo de configuración final el día 9. Se requería un marco de tiempo similar para la inducción mínima con DOX para la formación de iPSC en ambas muestras de células. Figs. 67B-D - Reducción de la expresión específica de los reguladores epigenéticos Utx [desmetilasa 6A específica de lisina (K); KDM6A, ID de gen: 7403] y Wdr5 [dominio de repetición 5 de WD; ID de gen: 11091] que son necesarios para la formación de iPSC (Mansour et al. 2012, Nature 488, 409-413; Ang Y.-S. et al. 2011, Cell 145, 183-197) inhibieron significativamente la formación de iPSC tanto en células Mbd3+/+como Mbd3flox/\ * indica valor p <0.01 en comparación con la muestra de ARNip de control. Se muestra uno de 2 experimentos independientes. La s.d. se basó en mediciones en muestras idénticas por duplicado.
Las Figs. 68A-K demuestran que las células madre humanas naif comparten características epigenéticas definitorias con las ESC de ratón. Fig. 68A-B - Como ejemplos representativos, se muestra la caracterización de las hESC naif WIS1 (Fig. 68A) y WIS2 (Fig. 68B). Las células se tomaron en el número de pase indicado (Pase 31 para WIS1 y Pase 27 para WIS2) y expresan todos los marcadores de pluripotencia humanos ensayados (es decir, NANOG, TRA-1-60, OCT4, TRA-1-81, SSEA3, SOX2 y SSEA4) y no expresan SSEA1. Ninguna de las líneas naif descritas en el presente documento muestra signos de deterioro, crisis o decaimiento con la expansión (durante más de 30-70 pases ensayados hasta ahora). Figs. 68C-H - La capacidad pluripotente de las células humanas naif WIS1 en el pase 33 (Figs. 68C, E y G) y WIS2 en el pase 19 (Figs. 68D, F, H) se evaluó mediante la capacidad de formar teratomas con células de las tres capas germinales embrionarias. Se muestra la tinción representativa de hematoxilina y eosina de secciones de teratoma. Figs. 68C-D - diferenciación en endodermo; Figs. 68E-F - diferenciación en mesodermo; Figs.
68G-H: diferenciación en ectodermo. Figs. 68I-K - Imágenes confocales representativas obtenidas después de doble inmunotinción para OCT4 y H3K27me3 en muestras naif (Fig. 68I), cebadas (Fig. 68J) y diferenciadas (cuerpos embrioides, obtenidos de células naif; figura 68K). Las células pluripotentes femeninas naif casi carecen de la formación de focos de H3K27m3 que marcan el alelo X inactivo (Fig. 68I, menos de 2% de las células presentan los focos de H3K27m3). Las células cebadas, aunque retienen la expresión del marcador de pluripotencia OCT4, los focos de H3K27me3 (uno por núcleo) se volvían claramente detectables en la mayoría de las células (Fig. 68J, panel izquierdo, punta de flecha). Tras la diferenciación en células somáticas, las células pluripotentes naif pierden la expresión de OCT4 y adquieren focos nucleares de H3K27m3 (Fig. 68K). Se indican los porcentajes promedio de núcleos contados positivos de 150-200 células por muestra.
Las Figs. 69A-I representan el perfil transcripcional global de pluripotencia humana naif. Fig. 69A - Categorías de Go enriquecidas significativamente para genes regulados por aumento en líneas celulares humanas cebadas en comparación con naif, con su valor P corregido por FDR (-log10). Se indican los valores respectivos de número de veces de enriquecimiento en el ratón para las categorías que también son significativas en el ratón. Fig. 69B -Agrupación jerárquica de especies cruzadas de células pluripotentes primarias y naif de ratones y seres humanos. La expresión génica en las mESC naif y las hESC/hiPSC naif formaron un grupo distinto aparte de las mEpiSC y las hESC y las hiPSC cebadas/convencionales. Las células de ratón incluyen "129" y "NOD"; todo el resto son células humanas. La matriz de correlación de la expresión génica se agrupó usando la correlación de Spearman y la unión media. La barra de color indica la fuerza de la correlación. Figs. 69C-D - La expresión génica en diferentes muestras naif tiene menos ruido y es más homogénea que en diferentes muestras cebadas. Un diagrama de caja que muestra la mediana y los cuartiles de las distribuciones de los coeficientes de varianza (a/|j) calculados para cada uno de los genes homólogos. Las distribuciones naif son significativamente más pequeñas (prueba t unilateral, p = 0) que las cebadas. Fig. 69C - células madre pluripotentes humanas naif frente a humanas cebadas; Fig. 69D - células madre pluripotentes naif de ratón frente a cebadas de ratón. Fig. 69E-F - Las hESC humanas naif (Fig. 69F) y humanas cebadas (Fig. 69E) se inmunotiñeron doblemente para TFE3 y OCT4. Se muestran imágenes confocales representativas para la línea de hESC LIS2. Los recuadros son ampliaciones de los cuadros punteados. La tinción con Oct4 se localiza en el núcleo en ambos estados de las células (cebado y naif). Por otro lado, se muestra una localización nuclear predominante para TFE3 en hESC naif pero no en condiciones cebadas, lo que demuestra que TFE3 es transportado y cambia entre los estados de las células. Fig. 69G - Se llevó a cabo un análisis de imágenes cuantitativo sin sesgo para la localización nuclear preferencial en 200 células seleccionadas aleatoriamente de marcos de imagen independientes por muestra. Se muestran diagramas de caja y bigotes de las relaciones de TFE3 nuclear/citoplásmico en ESC de ratón y humano naif y cebadas. Las hESC naif mostraron distribuciones similares a las de las mESC naif, y el enriquecimiento nuclear se perdió en las ESC humanas y de ratón cebadas, * prueba t valores de P <1 x 10-100. Fig. 69H - Comparación transcripcional de células pluripotentes humanas aisladas in vitro e in vivo. Agrupación jerárquica del perfil de expresión medio de genes expresados diferencialmente entre muestras naif y cebadas (FDR <0.05), en los diferentes grupos [Naif (este estudio), cebadas (este estudio), ESC cebadas de Belmonte e ICM humana (Belmonte et al. (Vassena, R. et al., "Waves of early transcriptional activation and pluripotency program initiation during human preimplantation development". Development. 138, 3699-3709, 2011)], usando la correlación de Spearman. Obsérvese que mientras que las muestras de ESC cebadas previamente obtenidas por Belmonte y colaboradores se agrupan con las muestras cebadas derivadas del presente documento, las muestras de ICM humana se agrupan con las muestras naif expandidas en condiciones WIS-NHSM. Fig. 69I - Análisis de componentes principales que muestra que las muestras de ICM humana están más cerca de las muestras naif que de las cebadas (a lo largo del eje del primer componente principal). Las muestras cebadas también están más dispersas, mostrando una mayor variabilidad y heterogeneidad, y no están tan agrupadas como lo están las muestras naif e ICM humanas.
Las Figs. 70A-J representan la configuración epigenética de la pluripotencia humana naif. Figs. 70A-B - Perfiles de la marca de cromatina H3K27me3 de genes del desarrollo en seres humanos (Fig. 70A) y ratón (Fig. 70B), naif (azul) y cebados (rojo), representados como densidad de lectura normalizada. Los perfiles humanos indican la media y s.d. (barras de error) calculadas en 5 líneas celulares diferentes (C1, LIS2, WIBR3, WIBR3-MBD3mut y BGO1). La diferencia promedio entre gráficos se indica junto con la varianza y los valores P (calculados con prueba t de muestras unilaterales). Figs. 70C-D - Paisaje de cromatina de 5 genes pluripotentes de ejemplo. Se muestran las marcas H3K27me3 y H3K4me3 para las líneas celulares naif (azul) y cebadas (rojo), tanto en seres humanos (Fig. 70C) como en ratones (Fig. 70D), mostrando una alta consistencia entre los organismos. Figs. 70E-F - Igual que en las Figs. 70C-D para 5 genes de desarrollo. Fig. 70E - ser humano; Fig. 70F - ratón; Fig. 70G - Niveles de transcrito relativos representativos en células WIBR3 naif y cebadas humanas. * prueba t valor P <0.01. Las barras de error indican s.d. (n = 3). Fig. 70H - Inmunotinción para OCT4 (paneles izquierdos) y DNMT3B (paneles derechos) en células naif (paneles inferiores) y células cebadas (paneles superiores) humanas. Las células naif humanas regulan por disminución la expresión de la proteína MBD3, pero no OCT4. Figs. 70I-J - histogramas del cambio en la metilación entre muestras cebadas y naif en seres humanos (Fig. 70I) y ratón (Fig. 70J). Los histogramas representan la distribución de la diferencia de metilación por CpG, calculada para todos los CpG que residen en regiones ricas en CpG (contenido de CpG > 4%) y que tienen una cobertura de >10x en ambas muestras. Para mayor claridad, solo se incluyen en el histograma los CpG con un cambio en la metilación distinto de cero. La distribución está sesgada a la izquierda, lo que indica una reducción general de la metilación en las muestras naif.
Las Figs. 71A-G de referencia representan las características de señalización y funcionales de la pluripotencia naif humana. Fig. 71A - Se requiere LIF/Stat3 para la estabilización de la estabilidad in vitro de hESC/hiPSC naif en WIS-NHSM. Las mESC NOD V6.5 naif, hESC W iS1 y H1 naif y hiPSC naif BJ se electroporaron con un plásmido de control de simulación pBRY-CAGGS-flox-DsRedT4-IRES-Puro, un plásmido que codifica un mutante Stat3 Y705F negativo dominante (Stat3-DN), o un mutante constitutivamente activo del plásmido Stat3-C (pBRY-Stat3-CA). Las células se sometieron a pases tres veces en presencia de selección con puromicina. Después de 20 días, se contaron las colonias positivas para los marcadores de pluripotencia OCT4 y se normalizaron respecto a colonias de células electroporadas con vector vacío. (n = 3 para cada condición y las barras de error indican s.d.). * Valor P de la prueba t de Student <0.01. Figs. 71B-C - Los paneles superiores indican esquemas para el direccionamiento génico de los locus de OCT4 (Fig. 71C) y COL1A (Fig. 71B). Las tablas indican el número y el porcentaje de clones de ES correctamente dirigidos, determinado por estrategias de validación de transferencia Southern tanto 5' como 3'. Fig. 71D - Eficacia de reprogramación de iPSC secundarias de células de tipo natural y agotadas en MBD3 (MBD3mut) cuando se reprograman en condiciones naif (esquema azul) o cebado/convencional (esquema rojo). Las barras de error indican s.d.m (n = 3). * Indica prueba t valor P <0.01. Fig. 71E - Expresión relativa de transcritos de genes FMR1 y NANOG en células aisladas de pacientes con sanos o X frágil. Las barras de error indican s.d.m (n = 3). Figs. 71F-G - Estrategia de direccionamiento por recombinación homóloga del locus de COL1A en ESC H9. Se muestra la eficacia de direccionamiento correcto en diferentes repeticiones experimentales de células pluripotentes cebadas y naif H9. Se puntuó el direccionamiento correcto después de la confirmación con análisis de transferencia Southern tanto 5' como 3' en el ADN extraído de los clones analizados. ** Indica significativo valor P significativo <0.02. b, como en a, pero para el locus de OCT4. * Indica valor P significativo <0.05.
Las Figs. 72A-D demuestran la definición y optimización de las condiciones para capturar iPSC pluripotentes naif humanas independientes de transgén. Fig. 72a - Análisis por qRT-PCT de la expresión relativa del marcador de pluripotencia OCT4 endógeno y marcadores neurales SOX1. Se muestran los valores relativos a los medidos en líneas de iPSC 1.2 cebadas/convencionales. En presencia de DOX, las células expresan OCT4 de pluripotencia endógena (de acuerdo con los resultados descritos previamente y la capacidad de formación de teratomas de estas células (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010), sin embargo, SOX1 está significativamente regulado por aumento, de acuerdo con el mantenimiento de pluripotencia inestable en estas condiciones (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010). Las condiciones de WIS-NHSM que se optimizaron en este estudio mantienen la expresión de OCT4 y no adquieren una regulación por aumento de SOX1 aberrante. Las barras de error indican s.d., se muestra un experimento representativo de los dos realizados. Fig. 72B - La línea de hiPSC naif de BJ1 genéticamente no modificada generada por un procedimiento de reprogramación de ARNm, mostró una dependencia similar a la observada con la línea de hiPSC naif de C1.2 (expandida sin DOX), en condiciones WIS-NHSM (Fig. 12S). Estos resultados excluyen la pérdida en la línea C1 como un parámetro independiente que contribuye a la pluripotencia naif en WIS-NHSM. Estos datos están de acuerdo con la capacidad de generar de forma robusta hESC naif genéticamente no modificadas a lo largo del estudio en condiciones WIS-NHSM. * valor P de la prueba t de Student <0.01 relativo a las condiciones de control WIS-NHSM. Fig. 72C - Para optimizar más las condiciones de crecimiento naif, se puede sustituir Albumax al 1% usando bien KSR al 15% (reemplazo de suero KnockOut) o concentrado de lípidos químicamente definido al 1% (Invitrogen). Se usó Albumax al 1% en WIS-NHSM definido a lo largo del estudio y se usó para el análisis molecular de células naif. Fig. 72D - Niveles de OCT4-GFP+ para células pluripotentes naif expandidas en medio WIS-NHSM en placas de cultivo tisular recubiertas con los componentes indicados. Las hiPSC naif se pueden cultivar sin células alimentadoras bien en placas recubiertas con matrigel, placas recubiertas con vitronectina o placas recubiertas con gelatina al 0.2% vitronectina 1 ng/ml (pero no gelatina sola). * valor P de la prueba t de Student <0.01 relativo a las condiciones de control de gelatina células alimentadoras (MEF). Se muestra un experimento representativo de 3 realizados.
Las Figs. 73A-F representan la inmunotinción para marcadores de pluripotencia en hESC naif recién derivadas de embriones. Figs. 73A-B - Se analizaron las líneas de ESC LIS1 (Fig. 73B), LIS2 (Fig. 73A), WIS1 y WIS2 establecidas a partir de ICM humana en condiciones WIS-NHSM, y mostraron una tinción uniforme fuerte para todos los marcadores de pluripotencia humana indicados (OCT4, NANOG, SSEA3, SSEA4, TRA1-60, TRA1-81 y Sox2). En particular, SSEA1, que es específico para ratón (tanto células madre naif como cebadas) y no células pluripotentes humanas, no se expresa en hESC naif. Fig. 73C-F - Expresión de factores de pluripotencia KLF2 y ESRRB en hESC naif. Fig. 73C - hESC LIS2 naif; Fig. 73D - hESC WIBr 3 naif; Fig. 73E - mESC V6.5 naif; Fig. 73F - mEpiSC cebadas. Imágenes de doble inmunotinción confocales representativas que demuestran la expresión de factores de pluripotencia KLF2 y ESRRB en ESC naif de ratones y humanas.
Las Figs. 74A-D representan la velocidad de crecimiento mejorada y eficacia de clonación de células individuales de células madre pluripotentes naif humanas. Fig. 74A - Tiempo de duplicación de la población de varias líneas de células madre pluripotentes humanas y de ratón. Después de sembrar en placa cada línea celular en repeticiones, las células se recogieron los días 2, 4 y 6 y su crecimiento se normalizó contando el número de células en cada etapa y calculando la velocidad de crecimiento en relación con el número de células recogidas y contadas el día 2 (en lugar del número de células sembradas en placa para tener en cuenta la variabilidad en la supervivencia después de la siembra en placa). Las barras de error representan la s.d., y los valores P representan la prueba t de la media de las líneas de hESC/hiPSC cebadas a la media de las líneas de hESC/hiPSC naif. Fig. 74B - Eficacia de clonación de células individuales de diferentes líneas de células madre pluripotentes determinada por el número de pocillos que contienen colonias NANOG+ 6 días después de la siembra en placa (con o sin inhibidor de ROCK como se indica en la figura).
* indica valor P de la prueba t de Student <0.01 entre el promedio de los grupos comparados. Las barras de error indican s.d. Estos resultados destacan una mayor supervivencia de células individuales y eficacia de clonación de células pluripotentes naif, en comparación con las hESC/hiPSC convencionales. Fig. 74c - Las diferencias entre especies cruzadas en la expresión de la proteína ERAS influyen en las diferencias de las propiedades de crecimiento restantes entre las PSC naif no modificadas genéticamente humanas y ratón. Eficacia de clonación de células individuales de diferentes líneas de células madre pluripotentes determinada por el número de pocillos que contienen colonias Nanog+ 6 días después de la siembra en placa (sin usar el inhibidor de ROCK como se indica en la figura). * indica valor P de la prueba t de Student <0.01 entre el promedio de los grupos comparados. Las barras de error indican s.d. Estos resultados destacan una supervivencia de células individuales relativamente comprometida y la eficacia de clonación de mESC naif con inactivación génica de Eras, en comparación con las ESC/iPSC convencionales. La reconstitución de ERAS en hESC naif rescata su deficiencia relativa en el ensayo de formación de colonias de células individuales. Fig. 74D - Eficacia de derivación de ESC de ratón en condiciones de alimentador 2i/LIF/MEF, a partir de ICM WT o KO para Eras. Las barras de error indican s.d.m. Se indica el valor P de la prueba t de Student.
Las Figs. 75A-I representan el uso predominante del elemento potenciador distal en pluripotencia naif de ratón y ser humano. Fig. 75A - Ilustración esquemática que demuestra la localización relativa de los elementos potenciadores distales y proximales conservados evolutivamente en el locus de OCT4 humano. El potenciador distal (DE) y el potenciador proximal (PE) están destacados en el locus OCT4 humano y, en consecuencia, se eliminaron en las construcciones indicadoras APE y ADE usadas en este estudio. Se indica el sitio de inserción del casete de resistencia a GFP-2A-puromuicina mediante recombinación de BAC. Figs. 75B-E - hESC naif WIS1 (Figs. 75B y 75C) y LIS2 (también denominado "LIS39" en el presente documento) (Figs. 75D-E) se transfectaron establemente con la construcción indicadora APE-OCT4-GFP-2A que marca la configuración de pluripotencia naif. La expresión de GFP se detectó específicamente por citometría de flujo en células pluripotentes naif (Figs. 75B y 75D), mientras que sus células cebadas genéticamente emparejadas generadas después de 10 días en condiciones de hESC cebadas/convencionales no mostraron expresión de GFP (Figs. 75C y 75E). Fig. 75F-G: se obtuvieron resultados similares cuando se insertó el indicador APE en ESC V6.5 murinas naif, que mostraban una regulación por disminución específica de la actividad de GFP después de transferir las células al medio cebado con mEpiSC (Fig. 75G). Por lo tanto, el indicador APE-Oct4-GFP-2A-PURO humano mostró actividad específica similar en las mESC expandidas en 2i/LIF, pero no las mEpiSC cebadas (Figs. 75F y G), respaldando más la especificidad del indicador usado y la similitud entre configuraciones pluripotentes naif de ratón y humanas. Fig. 75H-I - hiPSC C1.2 naif propagadas en medio WIS-NHSM mostraban expresión específica del marcador GFP (Fig. 75H), mientras que las células C1 cultivadas en condiciones 2i/LIF DOX descritas anteriormente (para inducir transgenes de OSK) regulan por disminución la actividad GFP y tenían un patrón de expresión heterogéneo (Fig. 75I). Esto último está de acuerdo con los datos de las Figs. 12A-C y 72A-D, que indican que las células pluripotentes naif dependientes de transgén descritas previamente (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010) son relativamente inestables con respecto a las células no modificadas genéticamente e independientes de transgén descritas en este estudio.
Las Figs. 76A-C demuestran que las hESC/hiPSC naif femeninas conservan un estado de pre-inactivación de X único en condiciones WIS-NHSM. Fig. 76A - Las imágenes confocales obtenidas después de inmunotinción doble para OCT4 y H3K27me3 en muestras naif, cebadas y diferenciadas se analizaron y se cuantificó la fracción de células con focos nucleares de H3K27me3 que marcan el alelo X inactivo. Se muestran los porcentajes promedio de 150-200 células individuales contadas por muestra de al menos diez marcos independientes. Las barras de error indican s.d. * indica valor P de la prueba t de Student <0.01 cuando se comparan muestras con células pluripotentes naif. Las células pluripotentes femeninas naif tienen focos de H3K27m3 muy bajos. En células cebadas y diferenciadas, los focos de H3K27me3 (uno por núcleo) se volvieron claramente detectables en la mayoría de las células. Las líneas masculinas no presentan focos/nubes de H3K27me3 en ninguno de los estados como se esperaba. Fig. 76B - El análisis de qRT-PCR indica niveles bajos/nulos de expresión de XIST en hESC/iPSC naif, en comparación con células fibroblastos diferenciadas femeninas que regulan por aumento la expresión de XIST. Las barras de error indican s.d.m (n = 3) * indican valor P de la prueba t de Student <0.01. Fig. 76C - Distribuciones de los niveles de H3K9m3 [RPKM (lecturas por kilobase por millón de lecturas)] de todos los genes del cromosoma X. Distribuciones de los niveles de RPKM de H3K9me3 en genes del cromosoma X, medidos en las diferentes líneas celulares. Cajas - percentiles 25 y 75, líneas horizontales - mediana, cruces - valores atípicos. Se midieron las RPKM para cada gen entre 1 Kb secuencia arriba de TSS (sitio de inicio de transcripción) y TES (sitio de finalización de transcripción). Se muestran 4 líneas celulares humanas (WIBR3, C1, LIS2, WIS2). Azul - líneas celulares naif, Rojo - líneas celulares cebadas. Las líneas WIBR3, C1 y LIS2 son femeninas y BGO1 es una línea celular masculina. Las distribuciones de H3K9me3 en células cebadas femeninas son significativamente mayores en comparación con sus homólogas naif, mientras que en las células masculinas son iguales. Los valores P se calcularon con la prueba t unilateral de muestras emparejadas.
Las Figs. 77A-B representan el transcriptoma distinto para ESC/iPSC naif humanas. Fig. 77A - Perfil transcripcional de micromatrices de pluripotencia seleccionados y genes marcadores específicos de linaje, su relación de expresión media en hESC cebadas y hESC naif con respecto a la mediana de todas las muestras. Los valores se muestran a escala natural. Las barras de error representan SEM de cada gen. Los asteriscos indican genes expresados diferencialmente estadísticamente significativos en los que la tasa de falso descubrimiento era <0.05 entre los grupos de muestras naif y cebadas. El panel fue generado por el software R. Fig. 77B - Análisis de validación de qRT-PCR para genes regulados por aumento o por disminución en células pluripotentes humanas naif frente a cebadas. * Indica valor P de la prueba t de Student <0.01 para comparaciones entre muestras naif y cebadas. Las barras de error indican s.d.m (n = 3).
La Fig. 78 representa el análisis de ontología GO para genes regulados por disminución en pluripotencia naif humana. Categorías de ontología GO enriquecidas en y genes regulados por disminución en pluripotencia naif, comprobados y visualizados usando la herramienta en línea GOrilla. La barra de color muestra los valores p, la Fig. muestra solo árboles que contienen términos GO con valores p <10-5, que producen valores de p corregidos por FDR <0.05.
Las Fig. 79A-D representan la comparación transcripcional de células pluripotentes humanas aisladas in vitro e in vivo. Fig. 79A - Agrupación jerárquica de expresión génica de genes expresados diferencialmente entre muestras naif y cebadas, en líneas celulares humanas y en la masa celular interna humana (ICM), usando la correlación de Spearman. Obsérvese que mientras que las muestras de ESC obtenidas previamente por Belmonte y colaboradores se agrupan con las muestras cebadas derivadas en el presente documento, las muestras de ICM humanas se agrupan con las muestras naif. Fig. 79B - Agrupación jerárquica del perfil de expresión medio de todos los genes en los diferentes grupos (ESC naif, cebadas, de Belmonte e iCm ), usando la correlación de Spearman. Fig. 79C - Agrupación jerárquica del perfil de expresión medio de genes expresados diferencialmente en todas las muestras individuales. Fig. 79D -Análisis de componentes principales que muestra que las muestras de ICM humanas están más cerca de las muestras naif que de las cebadas (a lo largo del eje del primer componente principal). Las muestras cebadas también están más dispersas, mostrando una mayor variabilidad y heterogeneidad, y no están agrupadas tan cerca como las muestras naif e ICM.
Las Figs. 80A-D representan un patrón de localización celular de proteína MHC de clase I y TFE3 distinto en células pluripotentes humanas naif. Se muestran imágenes confocales representativas de inmunotinción doble para OCT4 y TFE3 seguido de perfil de intensidad de fluorescencia del área del recuadro con trazos amarillos. Fig. 80A - mESC naif; Fig. 80B - hESC WIBR3 naif; Fig. 80C - mEpiSC cebadas; Fig. 80D - hESC WIBR3 cebadas. Este análisis demostró el solapamiento entre la expresión nuclear de OCT4 con TFE3 en células pluripotentes de ratón y humanas (naif y cebadas). Estas imágenes representativas ponen de manifiesto la localización nuclear estricta de TFE3 en pluripotencia naif, mientras que la pluripotencia cebada se asocia con una mayor localización citoplásmica de TFE3 en líneas celulares cebadas tanto de ratones como humanas. El eje Y representa la intensidad de la fluorescencia, perfil medido con el software Zen blue 2011. Véase la Fig. 3e y Métodos para cuantificaciones sistemáticas sin sesgo.
Las Figs. 81A-D representan la expresión de E-cadherina de superficie mejorada en células pluripotentes naif humanas. Imágenes de inmunotinción confocales representativas para la expresión de E-cadherina y OCT4 en hESC genéticamente emparejadas naif (Figs. 81A y 81C) y cebadas (Figs. 81B y 81D). Las muestras se procesaron simultáneamente y se analizaron en condiciones idénticas. Los insertos representan ampliaciones de las áreas encuadradas. Mientras que la E-cadherina es expresada en hESC cebadas, su expresión se distribuye de manera homogénea y mejora más en hESC naif humanas expandidas en condiciones WIS-NHSM.
Las Figs. 82A-B representan la agrupación de especies cruzadas de pluripotencia naif y cebada. Fig. 82A - Agrupación jerárquica de expresión génica de especies cruzadas de todos los 9803 genes ortólogos representados en las matrices de genes de ratón y ser humano usados en este estudio, agrupados usando la correlación de Pearson. Las células pluripotentes naif humanas y de ratón formaban un grupo distinto aparte de las mEpiSC cebadas y las hESC y hiPSC convencionales/cebadas. Mapa térmico que muestra los niveles de expresión normalizados por filas (relación logarítmica) con colores rojo y verde que representan genes regulados por aumento y por disminución, respectivamente. Las células naif están marcadas en azul, las células cebadas están marcadas en rojo. Se obtuvieron muestras de ratón de las cepas 129 o NOD. Este análisis confirma sorprendentemente que las líneas celulares pluripotentes se agrupan preferentemente en función de la configuración naif y cebada, en lugar de por la especie de origen. Fig. 82B - Diagrama de caja de los niveles de expresión génicos específicos de genes en muestras cebadas que muestran mayor ruido y heterogeneidad que en muestras naif. Este patrón está de acuerdo coherente con los datos de todo el genoma de las Figs. 69A-G. Cinco de nueve genes son significativamente más variables, ensayados por la prueba F de igualdad de varianzas).
Las Figs. 83A-D representan la deposición global de H3K27me3 y H3K4me3 en células pluripotentes naif y cebadas. Perfiles de modificaciones de cromatina de H3K27me3 (Figs. 83A-B) y H3K4me3 (Figs. 83C-D) de todos los genes RefSeq en seres humanos (n = 43463; Figuras 83A y 83C) y ratón (n = 30480; Figuras 83B y 83D), naif (azul) y cebadas (rojo), representado como densidad de lectura normalizada. Los perfiles humanos indican promedio y s.d. (barras de error) calculadas sobre 5 líneas celulares diferentes (C1, LIS2, WIBR3, WIBR3-MBD3mut y BGO1). La diferencia promedio entre gráficos se indica junto con la varianza y los valores P (calculados con la prueba t de muestras emparejadas).
Las Figs. 84A-G representan la redistribución amplia de gnomos de H3K27me3 en pluripotencia naif humana. Fig. 84A-B - Distribución de los picos de H3K27me3 en diferentes componentes genómicos (promotor, cuerpo de gen y región intergénica), en función de la densidad máxima (representada como RPKM, lecturas por kilobase por millón de lecturas), en líneas celulares humanas (WIBR3, C1 y BGO1). Además de una reducción en el número total de picos en condiciones naif, los picos se distribuyen de manera diferente a las cebadas, con un menor número de picos en promotores y cuerpos de genes, en comparación con las condiciones cebadas. Fig. 84C - Análisis de transferencia Western para cuantificar los niveles totales de H3K27me3 en muestras de hESC LIS2 naif y cebadas. Los niveles totales de H3K27me3 no se alteraban significativamente entre las muestras naif y las cebadas (similar a lo que se observaba en ratones). Se observaron resultados similares en las líneas celulares WIBR3 y C1 (datos no mostrados). Figs. 84D-E - Número de potenciadores de clase I (transcripción activa) y clase II (preparado) en naif (azul) frente a cebadas (rojo) humanas (Fig. 84D) y ratón (Fig. 84E). En seres humanos, los números corresponden a potenciadores comunes en las líneas WIBR3 y C1. El número de lecturas se normalizó mediante muestreo descendente de modo que el número de lecturas en todas las muestras humanas fuera idéntico, y también lo fuera el número de lecturas en todas las muestras de ratón. Se puede ver una disminución drástica de los potenciadores de clase II en células naif tanto en seres humanos como en ratones. Fig. 84 F-G - Distribución del nivel de expresión de genes asociados con potenciadores de clase I y clase II, presentes en células naif solamente (azul) o en células cebadas solamente (rojo) en células humanas (Fig. 84F) o de ratón (Fig. 84G). La distribución del nivel de expresión de todos los genes se presenta como control. Las cajas representan cuantiles 25 y 75 y los bigotes representan valores mínimos y máximos que no son valores atípicos. El análisis muestra que los potenciadores de clase II específicos del estado cebado continúan reteniendo niveles de expresión muy bajos tanto en los estados naif como cebado (a pesar de la pérdida de la marca H3K27me3 en la pluripotencia naif frente a su potenciador). Los valores P (prueba t) indican diferencias significativas entre las distribuciones en células naif y cebadas.
Las Figs. 85A-C - Las ESC humanas WIBR3 cebadas/convencionales se sometieron a pases en 12 condiciones diferentes basadas en WIS-NHSM. La Fig. 85A representa las composiciones de las diferentes variaciones de las condiciones WIS-NHSM usadas en este experimento, además del medio básico de KO-DMEM, complementado con ALBUMAX al 1%, ácido L-ascórbico 50 microgramos/ml (gg/ml), complemento N2 (Invitrogen) y 6.25 mg adicionales de insulina humana. Se incluyeron moléculas pequeñas y citoquinas como se indica en combinaciones de las condiciones 1-12. Las células se expandieron sobre placas recubiertas con gelatina al 0.2% durante 25 días (6 pases). Fig. 85B - Un histograma que representa los niveles de OCT4-GFP+ evaluados por el análisis FACS para medir el mantenimiento de la pluripotencia en estas condiciones. Las barras de error indican s.d. n = 2. Fig. 85C - Un histograma que representa el porcentaje de citosina metilada. Se recogió el ADN genómico y se sometió a cuantificación de la frecuencia de citosina metilada por espectrometría de masas. Las barras de error indican s.d. n = 2 repeticiones. Se usaron células cebadas como una muestra de control de referencia.
Las Figs. 86A-C representan la influencia de la perturbación de la señalización de MAPK en células pluripotentes naif y cebadas humanas. Fig. 86A - qRT-PCR para la expresión de los genes de compromiso del linaje indicado en diferentes condiciones. La complementación de las hESc cebadas con ERKi, GSK3pi (CHIR99021) o ambos (2i) da como resultado una regulación por aumento del marcador neural SOX1, de acuerdo con su tendencia a la diferenciación tras la inhibición de ERK. Fig. 86B - las hESC WIS1 naif expandidas en condiciones WIS-NHSM, se expandieron después de omitir los factores indicados de las condiciones WIS-NHSM durante 72 horas. Se muestra qRT-PCR de genes de compromiso de linaje. Los resultados indican que TGFp bloquea el efecto inductivo de SOX1 inducido por la presencia de ERKi en el medio. Fig. 86C - Análisis de qRT-PCR para la regulación por aumento de genes de compromiso del linaje 72 horas después de la retirada de p38i y/o JNKi de las condiciones WIS-NHSM. Estos resultados indican que los componentes en las condiciones WIS-NHSM promueven cooperativamente la estabilidad de la pluripotencia y contrarrestan y neutralizan los efectos de pro-diferenciación inducidos por algunos de los ingredientes. Las barras de error indican s.d.m (n = 3). Se muestran los resultados representativos de uno de tres experimentos repetidos biológicos. * indica valor P de la prueba t de Student <0.01.
Las Figs. 87A-B representan requisitos de señalización para el mantenimiento de hESC y hiPSC naif. Fig. 87A - hESCs naif WIS1 y LIS1 se dirigieron con el indicador APE-OCT4-GFP y se analizó la capacidad de retener la pluripotencia naif en diferentes condiciones como se indica. Se promediaron los niveles de OCT4-GFP+ detectados por FACS de dos repeticiones experimentales. Las barras de error indican s.d. Los resultados indican que la inhibición de ERK es esencial para mantener las hESC en WIS-NHSM, y este efecto se puede lograr usando dos inhibidores de ERK diferentes (PD 0325901 o PD184352). b, la inhibición de p38 es esencial para mantener las hESC en WIS-NHSM, y este efecto se puede lograr usando dos inhibidores de quinasa p38 diferentes (SB203580 o SB202190). Fig. 87B - Se usaron diferentes líneas de hESC y hiPSC que llevan indicador OCT4-GFP o APE-OCT4 GFP para evaluar diferentes condiciones para su capacidad para mantener la pluripotencia y específicamente la pluripotencia naif (por APE-Construct). Solo las condiciones WIS-NHSM permitieron el mantenimiento de todas las líneas celulares ensayadas mientras se activaban tanto el indicador OCT4-GFP como APE-OCT4-GFP. * Indica valores P de la prueba t de Student <0.01 entre las muestras/grupos comparados indicados. Las barras de error indican s.d.m entre las repeticiones de los pocillos (n = 3).
Las Figs. 88A-J demuestran diferentes condiciones de crecimiento definidas que permiten el mantenimiento de la pluripotencia naif de ratón. Figs. 88A-G - Las mESC V6.5 que llevan el indicador APF-Oct4-GFP específico de pluripotencia naif se mantuvieron en distintas condiciones de crecimiento definidas químicamente como se indica en las etiquetas del panel. Fig.88A - N2B27 LIF; Fig. 88B - N2B27 ERKi/GSK3pi (2i)/LIF; Fig. 88C - N2B27 p38i/GSK3pi/UF; Fig. 88D - N2B27 JNKi/GSK3pi/LIF; Fig. 88E - WIS-NHSM; Fig. 88F - WIS-NHSM sin FGF2/TGFp; Fig. 88G - medio de mEpiSC (con FGF2/TGFp). El análisis indica que las mESC GFP+ naif se pueden mantener en LIF, GSK3pi junto con ERK1/2i, p38i o JNKi. Figs. 88H-J - Imágenes representativas de quimeras de alta contribución generadas tras la microinyección del blastocisto de las líneas indicadas. Fig. 88H - N2B27 p38i/GSK3pi/LIF; Fig. 88I - N2B27 JNKi/GSK3pi/LIF; Fig. 88J - WIS-NHSM. El color del pelaje del agutí indica un alto nivel contribución de quimera.
Las Fig. 89A-D representan la competencia de diferentes condiciones de crecimiento naif de ratón en el ensayo de complementación de embriones tetraploides. Fig. 89A - Las mESCs V6.5 naif se expandieron en las condiciones indicadas durante 12 pases, después de lo cual se ensayaron para el ensayo de complementación tetraploide para formar animales totalmente ESC. El análisis indica que el potencial de desarrollo no restringido se obtiene de forma equivalente a nivel funcional cuando las mESCs naif se expanden con p38i, JNKi o ERK1/2i (junto con la complementación de LIF y GSK3pi en todas las condiciones). Figs. 89B-C - Se obtuvieron imágenes representativas de animales de color de pelaje agutí "totalmente ESC". Fig. 89D - Competencia de diferentes condiciones de crecimiento naif de ratón en el ensayo de complementación de embriones tetraploides. Las mESC v6.5 naif se expandieron en las condiciones indicadas durante 12 pases, después de lo cual se ensayaron para el ensayo de complementación tetraploide para formar animales totalmente ESC. El análisis indica que el potencial de desarrollo no restringido se obtiene de manera equivalente a nivel funcional cuando las mESCs naif se expanden con p38i, Jnki o Erk1/2i (junto con la complementación de LIF y GSK3 pi en todas las condiciones).
La Fig. 90 representa la dependencia de la señalización de LIF/STAT3 mediante hESC/iPSC naif. Niveles de qRT-PCR de los genes de compromiso del linaje indicados después de someter las hESC WIS1 naif a retirada de LIF y/o complementación con el inhibidor molécula pequeña JAK (jAKi 0.6 pM) durante 72 horas. Se indican los promedios de triplicados biológicos, como niveles normalizados para el control no estimulado. Las barras de error indican s.d.m (n = 3). Interferir con la señalización de LIF/STAT3 da como resultado una regulación por aumento específica de genes de compromiso de linaje en hESC naif. * Indica valores P de la prueba t de Student <0.01 en comparación con las condiciones de control WIS-NHSM. Las barras de error indican s.d.
Las Figs. 91A-C representan el requisito de señalización único y la respuesta a BMP4 para hESC/iPSC naif. Fig. 91A-B - Niveles de qRT-PCR de los genes de compromiso indicados después de someter hESC WIS1 naif (Fig. 91B) y cebadas (Fig. 91A) a BMP4 durante 72 horas. Se indican los promedios de triplicados biológicos, como niveles normalizados para el control no estimulado. Las barras de error indican s.d.m (n = 3). Las hESCs WIBR3 naif regularon por aumento ID3 (inhibidor de la unión al ADN 3, proteína dominante de hélice-bucle-hélice negativa; ID del gen: 3399) en respuesta a BMP4 (proteína morfogenética ósea 45-10 ng/ml), pero no a los marcadores tempranos de trofoblasto CDX2 (homeosecuencia 2 de tipo caudal; ID de gen: 1045) y HAND1 (derivados del corazón y de la cresta neural expresados 1; ID de gen: 9421). Esto recuerda a las mESC naif para BMP4 donde se mostró que apoya y mantiene su pluripotencia regulando por aumento Id3 [Ying, Q.-L., et al. Cell 115, 281-292 (2003). "BMP Induction of Id Proteins Suppresses Differentiation and Sustains Embryonic Stem Cell Self-Renewal in Collaboration with STAT3]. Las hESC WIBR3 cebadas regulan por aumento los marcadores de diferenciación de trofoblasto CDX2 y HAND1 en respuesta a BMP4 y no regulan por aumento ID3. Fig. 91C - El análisis de expresión génica global indica que WIS2, H9 y BGO1 naif expandidos con adición de BMP4 durante 12 pases, retienen un programa transcripcional que se agrupa con hESC y hiPSC naif, en lugar de células cebadas. Agrupación jerárquica de expresión génica de líneas celulares humanas en todo el genoma, usando la distancia euclidiana. Las hESC y hiPSC naif con o sin BMP4 se agrupaban por separado de las hESC/hiPSC convencionales/cebadas, como se muestra en el dendrograma. Mapa térmico que muestra los niveles de expresión normalizados por filas con colores rojo y verde que representan genes regulados por aumento y por disminución, respectivamente. Obsérvese las dos muestras genéticamente idénticas más a la izquierda que se usaron para la corrección del efecto por lotes, lo que permite unir dos conjuntos de datos diferentes para un análisis posterior (véase Métodos en línea). En conjunto, estos descubrimientos indican una tolerancia única para las células pluripotentes humanas naif para BMP4 que no compromete el mantenimiento del estado pluripotente naif.
Las Figs. 92A-D de referencia representan la eficacia de reprogramación de MEF Mbd3+'+ secundarios después de la reducción de la expresión de Mbd3 (ARNip de Mbd3) o Chd4 (ARNip de Chd4). Fig. 92A - Los MEF se sometieron a reprogramación con STEMCCA-OKSM con inducción con DOX y el día 3 se añadió el medio 2i/LIF. Los ARNip indicados se añadieron los días 2, 4 y 6. Figs. 92B-C - Análisis de transferencia Western que indican la eficacia de reducción de proteínas en la transfección de ARNip de conjuntos de ARNip dirigidos a Mbd3 (Fig. 92C) o Chd4 (Fig. 92B). Fig. 92D - Un histograma que representa la eficacia de la reprogramación. La eficacia de la reprogramación se midió por la cuantificación de las células positivas para OCT4-GFP (analizadas por FACS). Se muestran barras de error que indican s.d. del promedio (n = 3). Los asteriscos indican valor P de la prueba t de Student <0.01.
La Fig. 93 muestra que P66a-CC interrumpe la unión de Mbd3 a Chd4. Las células293T se transfectaron tanto con Flag-Mbd3 (WT) como P66a-CC (SEQ ID NO: 71; N° de acceso en GenBank NM_017660.3) o con un vector de control (mCherry), las proteínas que interaccionan con Mbd3 se separaron por inmunoprecipitación (IP) usando perlas magnéticas-Flag. Los resultados indican pérdida específica de la interacción de Chd4 con Mbd3 después de transfección de p66a-CC.
Las Figs. 94A-B representan la generación de un alelo de indicador mCherry insertado en el locus Nanos3 de una ESC humana naif (WIS1). Fig. 94A -Una ilustración esquemática que representa la ingeniería genética a través de TALEN en ESC humanas naif WIS1 para generar el alelo de indicador mCherry insertado en el locus Nanos3. El esquema indica la estrategia de direccionamiento. Fig. 94B - Análisis de transferencia Southern que representa el alelo (mut) dirigido correctamente en una serie de clones de WIS (2h, 4g, 8a y 8e).
La Fig. 95 ilustra la estrategia de diferenciación de ESC humanas indicadoras EIS1 NANOS3-cherry naif en células similares a células germinales primordiales (PGC) (abreviadas como PGCLC). Se muestran imágenes de las células/colonias durante el proceso de diferenciación.
Las Figs. 96A-I representan el proceso de diferenciación de las ESC humanas en células similares a células germinales primordiales. Fig. 96A - ilustración esquemática del proceso de diferenciación. Figs. 96B-I - Análisis de FACS para detectar la expresión del marcador Pg ClC NANOS3-Cherry. Fig. 96B - ESC naif; Fig. 96C - EpiLC cebado; Figs. 96D-F- las células se cultivaron en un medio de PGC que incluía BMP4; Figs. 96G-I - Se cultivaron células en un medio de PGC que no incluía BMP4. Se muestran los resultados de FACS después de 2 (Figs. 96D y 96G), 4 (Figs. 96E y 96H) y 6 (Figs. 96F y 96I) días en el medio de PGC. Las Figs. muestran la inducción específica del indicador mCherry el Día 2 4 y solo cuando se incluye BMP4 en el medio de diferenciación (Fig. 96E). Obsérvese que las ESC naif no expresan mCherry (Fig. 96B), ni las células EpiLC (Fig. 96C). Se muestra un experimento representativo de los cinco realizados. /- indica s.d. (n = 5).
Las Figs. 97A-H representan la expresión de marcadores de PGC en células PGCLC humanas. Se muestran análisis de PCR en tiempo real para la expresión de diferentes marcadores de PGC durante el protocolo de inducción. Fig. 97A - TFAP2c (también conocido como AP2gamma; Fig. 97B - BLIMP 1 (también conocido como PRDM1 - dominio PR que contiene 1, con dominio ZNF: ID de gen: 639); Fig. 97C - PRDM14 (dominio PR que contiene 14); Fig. 97D -STELLA (asociada a pluripotencia del desarrollo 3); Fig. 97E - DND1 (inhibidor 1 de represión mediada por microARN DND); Fig. 97F - NANOS3 (homólogo 3 nanos); Fig. 97G - INTEGRInA B3 [integrina, beta 3 (glucoproteína plaquetaria IIIa, antígeno CD61)]; Figura 97H - VASA; los resultados muestran claramente que los marcadores de PGCLC son inducidos en el protocolo aplicado en ESC humanas naif, incluyendo STELLA (Fig. 97D), INTEGRINAB3 (Fig. 97G), BLIMP1 (Fig. 97B) y VASA (Fig. 97H).
Las Figs. 98A-B representan análisis de FACS de ESC humanas convencionales/cebadas que se sometieron al mismo protocolo de inducción que se describe en el Ejemplo 11 de la sección de Ejemplos que sigue, y en las Figs. 95-97 anteriores. Fig. 98A - Análisis de FACS después de 4 días en medio de PGC. Fig. 98B - Análisis de FACS después de someter las ESC cebadas a medio de epiblastos (medio de EpiLC) durante 2 días, seguido de 4 días más en el medio de PGC. Obsérvese el bajo porcentaje de nano-cherry de las células en la Fig. 98A (0.25%) y el ligero aumento de células positivas para nano-cereza en la Fig. 98B (1.74%). Estos resultados muestran que las ESC humanas convencionales/cebadas sometidas a BMP4, incluyendo el protocolo de inducción de PGCLC, no activan con éxito el indicador NANOS3 mCherry. Los resultados indican la importancia de usar células pluripotentes naif humanas como material de partida para la inducción de PGCLC humanas.
Las Figs. 99A-G representan la reprogramación de fibroblastos humanos de expresión reducida de MBD3. Fig. 99A -Se infectaron fibroblastos BJ humanos con lentivirus de ARNhc TRIPZ MBD3 (3.1, 3.2, 3.3 indican tres construcciones de horquilla diferentes dirigidas a MBD3). Se muestra un histograma con cuantificación de la expresión por PCR en tiempo real para MBD3 que se llevó a cabo después de 72 horas con o sin inducción con DOX. Los resultados validan la regulación por disminución de MBD3 en fibroblastos humanos de una manera dependiente de DOX. Fig. 99B-G -Se infectaron fibroblastos dérmicos adultos humanos con mezcla lentiviral de ARNhc de FUW-RtTA, TetO-OKSM, TetO-ERAS y Tripz-MBD3. Se usaron los siguientes clones lentivirales con reducción de la expresión de MBD3 inducibles por DOX: ARNhc MBD3 humano TRIPZ ID del clon: V3THS_392206 (n° 1); V3THS_392209 (n.° 2); V3THS_392210 (n.° 3). Los primeros 3 días de reprogramación fueron en presencia de medio DMEM complementado con FBS al 15% (suero bovino fetal) vitamina C 50 microgramos/ml d Ox (2 microgramos/ml). Después de 3 días, se aplicaron las condiciones NHSM (usando el medio de NHSM) con inducción continua por DOX. Fig. 99B-C -Reprogramación de fibroblastos humanos con expresión reducida de MBD3. Se muestran las células reprogramadas que expresan shMBD3-proteína fluorescente roja (RFP) en fluorescencia roja (Fig. 99B) o en campo brillante (BF; Figura 99C). Figs. 99D-G - Reprogramación de fibroblastos humanos primarios MBD3 KD con sobreexpresión de OKSM y ERAS en condiciones de NHSM. Se muestran las poblaciones clonales con morfología similar a ES aparecidas en los días 5 (Figs. 99D-E) y 11 (Figs. 99F-G). Las imágenes de contraste de fase se muestran en las Figs.
99D y 99F. Las imágenes de fluorescencia roja se muestran en las Figs. 99E y 99G. Los clones de expresión reducida de MBD3 que sobreexpresan ERAS se desarrollan en 5 días y se sometieron a análisis de seguimiento de iPSC.
Las Figs. 100A-T muestran tinción para marcadores de pluripotencia OCT4, SSEA4, TRA1-60 y TRA1-81 en células de reprogramación en condiciones NHSM después de 10 días de inducción con DOX de ARNhc de OKSM, RtTa, ERAS y MBD3. Figs. 100A-D - Las células se tiñeron para DAPI (Fig. 100A), OCT4 (Fig. 100B) y SSEA4 (Fig. 100C). Fig. 100D - imagen combinada. Obsérvese la coexpresión de OCT4 y SSEA4. Figs. 100E-I - Las células se tiñeron para DAPI (Fig. 100E), OCT4 (Fig. 100F), SSEA4 (Fig. 100G). Fig. 100H: imagen combinada que muestra la coexpresión de OCT4 y SSEA4. Fig. 100I - tinción para el indicador de inducción de ARNhc-MBD3. Obsérvese la colocalización de shMBD3 con células que expresan los marcadores de pluripotencia OCT4 y SSEA4. Figs. 100J-N -las células se tiñeron para DAPI (Fig. 100J), Oc T4 (Fig. 100K), TRA1-60 (Fig. 100L). Fig. 100M - imagen combinada que muestra la coexpresión de OCT4 y TRA1 -60. Fig. 100N - Tinción para el indicador de inducción de MBD3-ARNhc. Nótese la colocalización de shMBD3 con células que expresan los marcadores de pluripotencia OCT4 y TRA1-60. Figs. 100O-S - las células se tiñeron para DAPI (Fig. 100O), OCT4 (Fig. 100P), TRA1-81 (Fig. 100Q). Fig. 100R -Imagen combinada con que muestra la coexpresión de OCT4 y TRA1-81. Fig. 100S - tinción para el indicador de inducción de MBD3-ARNhc. Obsérvese la colocalización de shMBD3 con células que expresan los marcadores de pluripotencia OCT4 y TRA1-81. Fig. 100T - Un histograma que representa la cuantificación de las colonias de iPSC humanas Nanog /TRA1-60+ el día 10. Se transdujeron células fibroblastos dérmicos adultos femeninos primarios (línea n° 13) con vectores RtTa, OSKM y ERAS en condiciones WIS-NHSM, con o sin reducción de la expresión de MBD3 a través de ARNhc de TRIPZ-MBD3 1+3 que se añadieron a la reprogramación. El número de colonias de iPSC se contó el día 10 mediante tinción para los marcadores NANOG y TRA1-60 (Fig. 100T). Obsérvese el aumento espectacular en la formación de iPSC a partir de células somáticas humanas primarias cuando se introduce la inhibición de MBD3.
Las Figs. 101A-B de referencia son análisis de transferencia Western que muestran la expresión de MBD3 (Fig. 101B) y de HSP90 (Fig. 101A) en células ES de ratón v6.5 después de diferentes tratamientos. Se expandieron células ES de ratón V6.5 durante 4 días en las condiciones indicadas y se sometieron a análisis de transferencia Western para la expresión de la proteína MBD3. Las condiciones se indican en la figura encima de las bandas. A continuación, se dan las abreviaturas y concentraciones de los factores y agentes indicados. PBS = solución salina tamponada con fosfato; "LIF" = factor inhibidor de la leucemia, proporcionado en una concentración de 20 nanogramos/mililitro (ng/ml); KSR = reemplazo de suero KnockOut; "2i/LIF" = inhibidores de molécula pequeña CHIR99021 (CH, 3 pM - Axon Medchem) y PD0325901 (PD, 1 pM - TOCRIS), con 20 ng/ml de LIF; "DMSO" = dimetilsulfóxido en una concentración del 0.1%; TGFRi (inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante; SB431542 en 5 micromolar); PKC-i (inhibidor de la proteína quinasa C; Go6983 en 5 micromolar). Obsérvese que el agotamiento significativo de los niveles de proteína MBD3 en las células tratadas con el inhibidor de PKC (Go6983 5 microM) (PKCi). Los resultados muestran que la inhibición de PKC conduce a una regulación por disminución en la expresión de MBD3 en células madre embrionarias de ratón.
Fig. 102 - Un histograma que representa el efecto de los diversos medios WIS-NHSM que se especifican en la Tabla 3 (Ejemplo 13 de la sección de ejemplos que sigue) sobre la metilación del ADN (% de los niveles totales de citosina metilada (5 mdC) normalizados respecto a dG.
Fig. 103 - Un histograma que representa el efecto de los diversos medios WIS-NHSM que se especifican en la Tabla 3 (Ejemplo 13 de la sección de ejemplos que sigue) sobre la expresión relativa de ARNm de DNMT3L (normalizada respecto a células cebadas).
Fig. 104 - Un histograma que representa el efecto de los diversos medios WIS-NHSM que se especifican en la Tabla 3 (Ejemplo 13 de la sección de ejemplos que sigue) sobre la expresión relativa de ARNm de DNMT3B (normalizada respecto a células cebadas).
Fig. 105 - Un histograma que muestra el efecto de los diversos medios WIS-NHSM que se especifican en la Tabla 3 (Ejemplo 13 de la sección de ejemplos que sigue) en el % de células WIBR3 OCT4+ después de 9 pases en placas de gelatina al 0.2%.
Fig. 106A-D - Análisis de FACS para la expresión de anticuerpo anti-CD61 humano (integrina B3) en ESC naif humanas (Figs. 106A-B) y PGCLC (día 4 después de la inducción; Figs. 106C-D) que llevan el indicador insertado NANOs3 mCherry. Figs. 106A y 106C - células de control (no teñidas con el anticuerpo); Figs. 106B y 106D - células teñidas con anticuerpo anti-CD61 humano (Alexa-647).
Figs. 107A-B - Análisis de FACS para la expresión de anticuerpo anti-SSEA4 humano (Fig. 107A) o CD61 (integrina p3; figura 107B) en PGCLC humanas (día 2+4 después de la inducción a partir de células humanas naif) que llevan el indicador NANOS3mCherry insertado.
Figs. 108A-C - Características de señalización y funcionales de la pluripotencia naif humana. Fig. 108A -Mantenimiento de la pluripotencia por diferentes líneas celulares pluripotentes cultivadas en diversas condiciones de medios. Para definir las características de señalización de células pluripotentes humanas y de ratón, los presentes autores de la invención ensayaron el mantenimiento de la pluripotencia mediante diferentes líneas celulares pluripotentes cultivadas en diversas condiciones de medios. Las poblaciones de células se dividieron por igual y se sembraron en placas recubiertas de gelatina/vitronectina en el medio de crecimiento indicado en el que estas líneas celulares se mantienen normalmente (células naif de ratón - N2B27-2i/LIF, hESCs/hiPSC naif - WIS-Nh SM, mEpiSC y hESC/hiPSC cebadas - en condiciones KSR/bFGF/TGFp). 36 horas después, los pocilios se complementaron con los inhibidores o factores de crecimiento indicados. Después de 14 días (2 pases), los pocillos se analizaron por inmunotinción de OCT4 de detección directa de la expresión del indicador de pluripotencia OCT4-GFP, para determinar el porcentaje relativo de células pluripotentes indiferenciadas. La formación de colonias se normaliza respecto a un control interno, como se indica en "Medio de crecimiento" solo en la columna más a la izquierda. Cuando se los componentes ya incluidos en WIS-NHSM se complementaron, esto produjo un aumento de 2 veces en su concentración relativa. Los porcentajes normalizados inferiores a 50% se definen como "sensibles" a la presencia del inhibidor complementado. Fig. 108B - Se requiere LIF/Stat3 para la estabilización de la estabilidad in vitro de las hESC/hiPSC naif en WIS-NHSM. Las mESC v6.5 naif, hESC W iS1 y H1 naif, y hiPSC naif BJ se electroporaron con un plásmido de control de simulación pBRY-CAGGS-flox-DsRedT4-IRES-Puro, un plásmido que codifica un mutante Stat3 Y705F negativo dominante (Stat3-DN), o un plásmido que codifica el mutante constitutivamente activo Stat3-CA (pBRY-Stat3-CA). Las células se pasaron tres veces en presencia de selección con puromicina. Después de 20 días, se contaron las colonias positivas para los marcadores de pluripotencia OCT4 y se normalizaron respecto a colonias de células electroporadas con vector vacío. (n = 3 para cada condición y las barras de error indican s.d.). Fig. 108C -Imágenes representativas que muestran la integración de células derivadas de iPSC marcadas con GFP humanas naíve en diferentes ubicaciones en la parte anterior de un embrión de ratón E10.5. La 1a columna muestra el embrión completo (el intervalo de apilamiento en z es 30 um, 18 planos focales en total). La 2a columna muestra una ampliación en las imágenes centradas en la región de la cabeza (cuadrado blanco R1) donde se señalan las células derivadas de hiPSC (células positivas para GFP) (puntas de flecha, el intervalo de apilamiento en z es de 20 pm, 11 apilamientos en total). La 3a columna muestra la parte posterior del embrión (cuadrado amarillo R2) donde no se detectaron células positivas para GFP (el intervalo de apilamiento en z es 20 pm, 9 planos focales en total). El cuadrado azul claro en las dos primeras imágenes de la 2a columna representa el área que se muestra en el inserto en la esquina de cada imagen. (ov-vesícula óptica, op-fosa óptica, fba-primer arco branquial, flb- brote de extremidades anteriores, ssomitas). La barra de escala en todas las imágenes es de 50 pm.
Figs. 109A-E - Quimerismo con células derivadas de iPSC naif humanas después de microinyección de mórula de ratón. Fig. 109A - Las iPSC naif humanas C1 se dirigieron con EGFP dirigido por el promotor CAGGS constitutivamente al locus de AAVS1 humano mediante usando ZFN. Posteriormente, se microinyectaron células en mórulas tempranas de ratón E2.5, y se permitió que los embriones micromanipulados se recuperaran y se convirtieran en blastocistos in vitro durante 24 horas adicionales. Las imágenes muestran la supervivencia e integración de células humanas GFP+ específicas en embriones de ratón antes de la implantación. Fig. 109B - Un histograma que muestra la supervivencia de iPSC humanas GFP+ naif y cebadas in vitro, 24-36 horas después de microinyección en mórulas de ratón. * Valor P de la prueba t de Student <0.01. Las barras de error indican s.d. (n = 3). Obsérvese que mientras que las iPSC naif sobreviven en blastocistos de ratón 24-36 horas después de la inyección (casi 80% de las células), solo una fracción minoritaria (menos de 5%) de las PSC cebadas sobrevive en el blastocisto. Fig. 109C - Se hizo un análisis confocal representativo después de inmunotinción para GFP (verde) OCT4 (rojo) y CDX2 (magenta) 24 horas después de las microinyecciones de mórula de ratón con hiPSC naíve marcadas con GFP. Obsérvese las células GFP+ que sobreviven (flecha blanca) que se integran específicamente y se tiñen positivamente para OCT4, pero no CDX2 (no se observó colocalización entre GFP y Cdx2). Barra de escala 10 pm. Fig. 109D - Posteriormente, se implantaron blastocistos de ratón in vivo en ratones y se dejó que se desarrollaran durante 7 días adicionales in vivo (como se indica), antes de disección y análisis confocal. Imágenes representativas que muestran una fuerte integración de la integración de células derivadas de hiPSC en los pliegues neurales de un embrión de ratón E8.5 (paneles superiores). En particular, no se detectó GFP en los embriones de ratón no inyectados de control (n = 3, paneles inferiores), el intervalo de apilamiento en z es de 20 pm; 17 planos focales en total (nf - pliegues neurales). Barra de escala 50 pm. Fig. 109E - Las células derivadas de hiPSC naif se integran en diferentes ubicaciones en la región craneofacial de un embrión de ratón E10.5. Una secuencia de diferentes planos focales de 108C, que muestran múltiples células derivadas de hiPSC integradas en diferentes ubicaciones en la región craneofacial (puntas de flecha). La primera imagen de cada fila muestra la proyección de intensidad máxima de todos los apilamientos en z. La distancia entre los diferentes planos focales aparece en la esquina superior derecha de cada uno. (ov-vesícula óptica, op-fosa óptica, fba-primer arco branquial). Barra de escala 50 pm.
Descripción de aspectos específicos de la descripción
La presente descripción, en algunos de sus aspectos, se refiere a una célula madre pluripotente naif de primate (p. ej., humana) aislada, a un medio de cultivo novedoso que se puede usar para generar las mismas y a métodos para generarlas y cultivarlas y, más en particular, pero no exclusivamente, a métodos para mejorar la desdiferenciación de células somáticas para la generación de células madre pluripotentes inducidas.
Antes de explicar al menos un aspecto de la descripción en detalle, debe entenderse que la descripción no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ilustrados por los ejemplos. La descripción puede tener otros aspectos o se puede poner en práctica o llevar a cabo de diversas formas.
Los autores de la presente invención han descubierto las condiciones que se requieren para aislar y generar una célula madre pluripotente naif de primate (p. ej., humana) y mantenerla en el estado naif.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona una célula madre pluripotente (PSC) naif de primate (p. ej., humana) aislada que comprende:
un gen de transcrito específico de X inactivo no metilado (XIST), en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos no metilados del gen XIST; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo no metilado del gen XIST,
y/o
un nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) caracterizado por una relación de la expresión del núcleo al citoplasma que es igual o mayor que 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.
Como se usa en el presente documento, la frase "célula madre pluripotente (PSC)" se refiere a una célula indiferenciada (p. ej., una célula de primate, una célula de mamífero) capaz de diferenciarse en las tres capas de células germinales embrionarias, es decir, en las capas germinales embrionarias del mesodermo, ectodermo y endodermo.
Según algunos aspectos de la descripción, la célula madre pluripotente se selecciona del grupo que consiste en célula madre embrionaria (ESC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y célula germinal embrionaria (EGC).
Según algunos aspectos de la descripción, la célula madre pluripotente naif de primate es de homo sapiens (humana), mono, chimpancé, gorilas, rhesus y/o babuino.
La frase "célula madre pluripotente (PSC) naif" se refiere a una célula capaz de formar una PSC, y que presenta un estado de pre-inactivación de X, y por lo tanto se considera que es el origen de la PSC.
El estado de pre-inactivación de X según algunos aspectos de la descripción se caracteriza por la presencia de dos alelos de un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilados en la célula femenina, y la presencia de un alelo no metilado del gen XIST en una célula masculina.
El gen XIST se encuentra en el cromosoma Xq13.2 humano y tiene la secuencia representada en el clon NC_000023.10 (73040486..73072588, complemento, basado en la versión de GenBank GRCh37.p10. El gen XIST tiene un ARN no codificante que se proporciona en el n° de acceso en GenBank NR_001564.2 (SEQ ID NO: 20).
Según algunos aspectos de la descripción, la presencia de dos alelos no metilados del gen XIST en una célula femenina se refiere a tener por debajo de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST, p. ej., por debajo de aproximadamente 19%, por debajo de aproximadamente 18%, por debajo de aproximadamente 17%, por debajo de aproximadamente 16%, por debajo de aproximadamente 15%, por debajo de aproximadamente 14%, por debajo de aproximadamente 13%, por debajo de aproximadamente 12%, por debajo de aproximadamente 11%, por debajo de aproximadamente 10%, por debajo de aproximadamente 9%, por debajo de aproximadamente 8%, por debajo de aproximadamente 7%, por debajo de aproximadamente 6%, por debajo de aproximadamente 5%, por debajo de aproximadamente 4%, por debajo de aproximadamente 3%, por debajo de aproximadamente 2%, por debajo de aproximadamente 1%, p. ej., 0% (p. ej., ausencia completa) de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST.
Según algunos aspectos de la descripción, la presencia de un alelo no metilado del gen XIST en una célula masculina se refiere a tener por debajo de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST, p. ej., por debajo de aproximadamente 19%, por debajo de aproximadamente 18%, por debajo de aproximadamente 17%, por debajo de aproximadamente 16%, por debajo de aproximadamente 15%, por debajo de aproximadamente 14%, por debajo de aproximadamente 13%, por debajo de aproximadamente 12%, por debajo de aproximadamente 11%, por debajo de aproximadamente 10%, por debajo de aproximadamente 9%, por debajo de aproximadamente 8%, por debajo de aproximadamente 7%, por debajo de aproximadamente 6%, por debajo de aproximadamente 5%, por debajo de aproximadamente 4%, por debajo de aproximadamente 3%, por debajo de aproximadamente 2%, por debajo de aproximadamente 1%, p. ej., 0% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST.
Un ejemplo no limitado del promotor de XIST que incluye islas CpG que pueden estar metiladas o no metiladas se proporciona en el amplicón del promotor de XIST expuesto por la SEQ ID NO: 70.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la PSC naif humana se caracteriza por una metilación reducida de islas CpG en comparación con un nivel de metilación de las islas CpG en una PSC cebada humana.
Por lo tanto, como se muestra en la Figura 30G, las iPSC naif humanas y las ESC naif humanas se caracterizan por niveles significativamente bajos de citosinas metiladas totales de los nucleótidos de guanina totales en cada célula (p. ej., 1-2%, Figura 30G) determinado por análisis cuantitativo por cromatografía líquida - espectrometría de masas (LC-Ms ).
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif humana se caracteriza por 0-3% de citosinas metiladas totales de los nucleótidos de guanina totales en la célula PSC naif. A modo de comparación, la PSC cebada o una célula somática tiene entre 3.5%-5% de citosinas metiladas totales de los nucleótidos de guanina totales en la célula PSC cebada.
Por tanto, la célula madre pluripotente naif de algunos aspectos de la descripción está en un estado naif.
Como se usa en el presente documento, la frase "estado naif" se refiere a estar en un estado indiferenciado en el que ambos alelos del gen del transcrito específico del X inactivo (XIST) de la célula femenina no están metilados, o en el que el alelo XIST de la célula masculina no está metilado.
Debe observarse que las PSC naif de algunos aspectos de la descripción (que están en un estado de pre-inactivación de X y naif) pueden, tras la diferenciación, inactivar uno de los alelos del cromosoma X y metilar uno de los genes XIST.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif mantiene el estado naif (como define en lo que antecede) mientras se mantiene (p. ej., cultivada) en presencia de inhibidores de ERK1/2 (p. ej., como se ilustra en el presente documento a continuación).
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la PSC naif mantiene el estado naif (como define en lo que antecede) mientras se mantiene (p. ej., cultivada) en ausencia de inhibición de señalización de TGFp (p. ej., en ausencia de TGFpi).
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif mantiene el estado naif (como define en lo que antecede) mientras se mantiene (p. ej., cultivada) en presencia de estimulación de TGFp, p. ej., en presencia de estimulación de TGFpl y/o FGF2.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif mantiene el estado naif (como define en lo que antecede) mientras se mantiene (p. ej., cultivada) en presencia de inhibidores de ERK1/2 y en presencia de estimulación de TGFpl (p. ej., por adición de TG Fpl) y/o estimulación FGF2.
La frase "PSC cebada" o "PSC convencional" que se usan indistintamente en el presente documento se refiere a una PSC que se conoce hasta la fecha, p. ej., células madre embrionarias humanas (hESC), células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) y células germinales embrionarias humanas (hEGC), que se caracterizan por un alelo de XIST metilado y un alelo de XIST no metilado en la célula femenina, y por un alelo metilado en la célula masculina.
Como se usa en el presente documento, el término "aislado" se refiere a separado al menos parcialmente del entorno natural, p. ej., del embrión de primate (p. ej., mamífero) o del cuerpo de primate (p. ej., mamífero).
La frase "células madre embrionarias" se refiere a células embrionarias que son capaces de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias. (es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo), o permanecer en un estado indiferenciado. La frase "células madre embrionarias" puede comprender células que se obtienen del tejido embrionario formado después de la gestación (p. ej., blastocisto) antes de la implantación del embrión (es decir, un blastocisto pre-implantación), células de blastocisto extendidas (EBC) que se obtienen de un blastocisto en etapa postimplantación/pre-gastrulación (véase el documento WO2006/040763) y células germinales embrionarias (EG) que se obtienen del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación, preferiblemente antes de las 10 semanas de gestación.
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS; células madre de tipo embrionario) son células obtenidas por desdiferenciación de células somáticas adultas que están dotadas de pluripotencia (es decir, son capaces de diferenciarse en las tres capas de células germinales embrionarias, es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo). Según algunos aspectos de la descripción, dichas células se obtienen de un tejido diferenciado (p. ej., un tejido somático tal como la piel) y se someten a desdiferenciación por manipulación genética que reprograma la célula para adquirir características de células madre embrionarias. Según algunos aspectos de la descripción, las células madre pluripotentes inducidas se forman induciendo la expresión de Oct-4, Sox2, Kfl4 y c-Myc en una célula madre somática.
Las células madre embrionarias de algunos aspectos de la descripción se pueden obtener usando métodos de cultivo celular bien conocidos. Solo como referencia, las células madre embrionarias humanas se pueden aislar de blastocistos humanos. Los blastocistos humanos se obtienen típicamente de embriones humanos in vivo pre­ implantación o de embriones fertilizados in vitro (IVF). Solo como referencia, un embrión humano de una sola célula se puede expandir a la etapa de blastocisto. Para el aislamiento de células madre embrionarias humanas, se extrae la zona pelúcida del blastocisto y se aísla la masa celular interna (ICM) por inmunocirugía, en la que las células del trofectodermo se lisan y se separan del ICM intacto mediante pipeteo suave. Después, la ICM se siembra en un matraz de cultivo tisular que contiene el medio adecuado que permite su desarrollo. Después de 9 a 15 días, el crecimiento derivado de la ICM se disocia en grupos por disociación mecánica o por degradación enzimática y las células se vuelven a sembrar en un medio de cultivo tisular nuevo. Las colonias que demuestran morfología indiferenciada se seleccionan individualmente mediante micropipeta, se disocian mecánicamente en grupos y se vuelven a sembrar. Las células ES resultantes después se dividen de forma rutinaria cada 4-7 días. Para más detalles sobre los métodos de preparación de células ES humanas, véase Thomson et al., [patente de EE.UU. N° 5843780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso et al., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; y Gardner et al., [Fertil. Esteril. 69: 84, 1998].
Otro método para preparar células ES se describe en Chung et al., Cell Stem Cell, Volumen 2, número 2, 113-117, 7 de febrero de 2008. Este método comprende extraer una sola célula de un embrión durante un proceso de fertilización in vitro. El embrión no se destruye en este proceso.
Se apreciará que las células madre disponibles en el mercado también están disponibles solo como referencia. Las células ES humanas se pueden adquirir del registro de células madre embrionarias humanas de NIH [Hypertext Transfer Protocol://grants (dot) nih (dot) gov/stem_cells/registry/current (dot) htm]. Los ejemplos no limitantes de líneas de células madre embrionarias disponibles en el mercado son BG01, BG02, Bg 03, Bg 04, Cy 12, CY30, CY92, CY10, TE03, TE32, CHB-4, CHB-5, CHB-6, CHB-8, CHB-9, CHB-10, CHB-11, CHB-12, HUES 1, HUES 2, HUES 3, HUES 4, HUES 5, HUES 6, HUES 7, HUES 8, HUES 9, HUES 10, HUES 11, HUES 12, HUES 13, HUES 14, HUES 15, HUES 16, HUES 17, HUES 18, HUES 19, HUES 20, HUES 21, HUES 22, HUES 23, HUES 24, HUES 25, HUES 26, HUES 27, HUES 28, CyT49, RUES3, WA01, UCSF4, NYUES1, NYUES2, NYUES3, NYUES4, NYUES5, NYUES6, NYUES7, UCLA 1, UCLA 2, UCLA 3, WA077 (H7), WA09 (H9), WA13 (H13), WA14 (H14), HUES 62, HUES 63, HUES 64, CT1, CT2, CT3, CT4, MA135, Eneavour-2, WIBR1, WIBR2, WIBR3, WIBR4, WIBR5, WIBR6, HUES 45, Shef 3, Shef 6, BJNhem19, BJNhem20, SA001, SA001.
Además, las células ES se pueden obtener también de otra especie, que incluye ratón (Mills y Bradley, 2001), hámster dorado [Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 127: 224-7], rata [Iannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92] conejo [Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8; Graves y Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 36: 424-33], varias especies de animales domésticos [Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60; Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8; Mitalipova et al., 2001, Cloning. 3: 59-67] y especies de primates no humanos (mono Rhesus y tití) [Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA. 92: 7844-8; Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9].
Solo como referencia, se pueden obtener células de blastocisto extendidas (EBC) de un blastocisto de al menos nueve días después de fertilización en una etapa previa a la gastrulación. Antes de cultivar el blastocisto, la zona pelúcida se digiere [por ejemplo, mediante solución ácida de Tyrode (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.)] para así exponer la masa celular interna. Después, los blastocistos se cultivan como embriones completos durante al menos nueve y no más de catorce días después de la fertilización (es decir, antes del suceso de gastrulación) in vitro usando métodos convencionales de cultivo de células madre embrionarias.
Solo como referencia, las células EG se preparan a partir de células germinales primordiales obtenidas de fetos de aproximadamente 8-11 semanas de gestación (en el caso de un feto humano) usando técnicas de laboratorio conocidas por cualquier experto en la técnica. Las crestas genitales se disocian y se cortan en pequeños trozos que luego se desagregan en células por disociación mecánica. Después, las células EG se cultivan en matraces de cultivo tisular con el medio apropiado. Las células se cultivan con reemplazo diario de medio hasta que se observa una morfología celular consistente con células EG, típicamente después de 7-30 días o 1-4 pases. Para detalles adicionales sobre los métodos de preparación de células EG humanas, véase Shamblott et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998] y la patente de EE.UU. N° 6090622.
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) (células madre de tipo embrionario) se pueden generar a partir de células somáticas por manipulación genética de células somáticas, p. ej., por transducción retroviral de células somáticas tales como fibroblastos, hepatocitos, células epiteliales gástricas con factores de transcripción tales como Oct-3/4, Sox2, c-Myc y KLF4 [Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1): 39-49; Aoi T, et al., "Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells". Science. 14 de Feb 2008. (Epub ya disponible); IH Park, Zhao R, West JA, et al. "Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors". Nature 2008;451:141-146; K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M, et al. "Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors". Cell 2007;131:861-872]. Se pueden generar otras células madre de tipo embrionario por transferencia nuclear a ovocitos, fusión con células madre embrionarias o transferencia nuclear a cigotos si las células receptoras se detienen en la mitosis.
La inactivación del cromosoma X es un proceso de desarrollo temprano en las hembras de mamíferos que silencia transcripcionalmente uno del par de cromosomas X, proporcionando así una equivalencia de dosis entre machos y hembras. El proceso está regulado por varios factores, que incluyen una región del cromosoma X llamada el centro de inactivación X (XIC). El XIC comprende varios genes no codificantes y que codifican proteínas, y el gen XIST fue el primer gen no codificante identificado dentro del XIC.
Cuando están presentes cuerpos de XIST, entonces XIST se expresa exclusivamente a partir del XIC del cromosoma X inactivo y es esencial para la propagación de la inactivación de X.
El estado de metilación del gen XIST se puede determinar por varios métodos tales como secuenciación por bisulfito [Lengner Cell 141, 872-883 (2010); Hanna et al., Cell 143, 508-525 (2010)] de la región promotora del gen XIST. La región promotora de XIST se puede amplificar mediante los siguientes cebadores de PCR: cebador directo (usado en ADN tratado con bisulfito): 5'-taa att tta aat taa tta aat tat (SEQ ID NO: 22), y cebador inverso (usado en ADN tratado con bisulfito): 5'- tgt ttt aga aag aat ttt aag tgt aga ga (SEQ ID NO: 23). La región de amplicón amplificada por los cebadores anteriores (203 pb que cubren el sitio de inicio de la transcripción de XIST humano) se proporciona en la SEQ ID NO: 70. En la Figura 23A se muestra un resultado representativo de dicha secuenciación por bisulfito de XIST. Las islas CpG en el amplicón del promotor de XIST se resaltan en amarillo en la Figura 27.
A continuación se da una descripción no limitante de un ensayo de PCR específico de metilación para el gen XIST. El tratamiento con bisulfito del ADN genómico se lleva a cabo con el kit EpiTect Bisulfite (Qiagen, Alemania). La PCR específica de metilación (MS-PCR) usa este tratamiento con bisulfito sódico para distinguir el ADN metilado del no metilado. Las referencias de ADN humano purificado, no metilado y metilado (para controles negativos y positivos en la aplicación de detección de metilación) incluyen el conjunto de ADN humano metilado y no metilado (Zymo Research, EE.UU.). Cada muestra se analiza en dos reacciones independientes de MS-PCR. Las reacciones de PCR incluían 25 pl de mezcla de reacción de PCR que contenía 2X tampón de premezcla de inicio en caliente de PCR (Takara, Tokio, Japón), cebador directo M 0.5 pM y cebador inverso M 0.5 pM en la reacción de PCR que amplifica la huella metilada específicamente o cebador directo U 0.5 pM y cebador inverso U 0.5 pM en la PCR para no metilado, y 2 pl de ADN modificado con bisulfito. Los pares de cebadores para PCR específica de metilación y no metilación para el gen XIST incluyen: directo de no metilación 5'-TGTTTTTTTGTTTATTGGGGTTGTG (SEQ ID NO:21; M97168, 691­ 715), e inverso de no metilación 5'-ACAACTAACCTAAACCAAATTATACA (SEQ ID NO: 67; M97168, 944-970); directo de metilación 5'-T GTTTTTTT GTTT ATCGGGGTCGCG (SEQ ID NO:68; M97168, 691-715) e inverso de metilación 5'-CGAATTATACGACAAATCTAAAATAACG (SEQ ID NO:69; M97168, 927-954) se pueden usar como se describe en otra parte (Kawakami T, et al., Lancet. 2004 Jan 3; 363(9402):40-2. "XIST unmethylated DNA fragments in malederived plasma as a tumour marker for testicular cancer"), y con las siguientes condiciones de PCR: La polimerasa se activa a 95°C durante 5 minutos. El ADN se amplifica en 35 ciclos a 94°C, 60°C, 72°C durante 45 segundos cada uno, seguido de una extensión final a 72°C durante 5 minutos. Los fragmentos de PCR resultantes tienen 264 pb (pares de bases) para el alelo metilado (M) y 280 pb para el alelo no metilado (U). Los productos de la PCR se separan en un gel de agarosa al 2%, se tiñen con bromuro de etidio y se visualizan con iluminación UV.
Adicional o alternativamente, el estado de metilación del gen XIST se puede determinar usando análisis de transferencia Southern usando enzimas de restricción sensibles a la metilación y sondas específicas para el gen XIST (o islas CpG), esencialmente como se describe en Lengner Cell 141, 872-883 (2010); y Hanna et al., Cell 143, 508­ 525 (2010). A continuación se da una descripción no limitante de un ensayo de metilación que se puede usar para determinar el estado de metilación del gen XIST en una célula (TAKASHI sA d O et al., Developmental Dynamics 205: 421-434 (1996). "Mosaic Methylation of Xist Gene Before Chromosome Inactivation in Undifferentiated Female Mouse Embryonic Stem and Embryonic Germ Cells"). El ADN genómico se prepara a partir de las células usando métodos conocidos (p. ej., Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992)). En resumen, se digieren 10 pg de ADN con una de las enzimas sensibles a la metilación (HpalI, Cfol, MZul, SaclI y Aual) en combinación con EcoRI o EcoRI PuulI de acuerdo con la recomendación de los fabricantes. La digestión se lleva a cabo durante la noche con un exceso de 10 veces de cada enzima en un volumen de reacción de 300 pl. El ADN restringido se purifica por extracción con fenol, se precipita con etanol, se somete a electroforesis en gel de agarosa al 1% o 2%, se transfiere a Hybond N+ (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) y se hibrida con sonda mediante un fragmento de ADNc de la parte 5' de Xist (sonda 1) o un fragmento genómico HpaI-MluI de la región 5' secuencia arriba (sonda 2) marcada por cebado aleatorio. Los lavados posteriores se llevan a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante de la membrana.
Por lo tanto, el experto en la técnica es capaz de distinguir entre un alelo no metilado de XIST y un alelo metilado de XIST, y por lo tanto puede distinguir fácilmente entre una célula femenina que tiene dos alelos no metilados del gen XIST o una célula femenina que tiene un alelo de XIST metilado y uno no metilado. De manera similar, los expertos en la técnica pueden distinguir fácilmente entre una célula masculina que tiene un alelo de XIST metilado o una célula masculina que tiene un alelo de XIST no metilado.
Como se ha mencionado, la PSC naif de primate aislada (p. ej., humana) está en un estado indiferenciado y pluripotente (capaz de diferenciarse en las tres capas germinales embrionarias).
Las PSC humanas cebadas tales como las hiPSC o hESC son inducidas a la diferenciación tras la incubación con proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), inhibidor de JNK e inhibidor de P38 [Hanna et al., Cell 143, 508-525 (2010); De Los Ángeles et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 22, 272-282 (2012)].
Al contrario que la PSC cebada conocida, la PSC naif de algunos aspectos de la descripción es "resistente" a la inducción de diferenciación por BMP4, inhibidor de JNK y/o inhibidor de P38. Por tanto, como se muestra en las Figuras 21 (A-L) - 22 (A-H), la incubación de la PSC naif con BMP4 o forskolina no alteraba el estado indiferenciado y pluripotente de las PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, cuando la PSC naif aislada se incuba en presencia de un agente seleccionado del grupo que consiste en la proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), el inhibidor de JNK y el inhibidor de P38, la PSC naif permanece en el estado pluripotente.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la PSC naif tiene una ruta de p38 inhibida en comparación con una PSC cebada. Por ejemplo, la actividad de p38 está inhibida en la PSC naif.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, el nivel de ARN de p38 y/o proteína p38 fosforilada en la PSC naif es menos de aproximadamente 30%, p. ej., menos de aproximadamente 20%, p. ej., menos de aproximadamente 5%, p. ej., menos de aproximadamente 0.5%, p. ej., menos de aproximadamente 0.1% en comparación con el nivel de ARN de p38 y/o proteína p38 fosforilada, respectivamente, en una PSC no naif incubada y/o cultivada en las mismas condiciones, pero sin estar sujeta a inhibición de p38.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif tiene una ruta de JNK inhibida en comparación con una PSC cebada. Por ejemplo, la actividad de JNK está inhibida en la PSC naif.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, el nivel de ARN de JNK y/o proteína JNK fosforilada en la PSC naif es menos de aproximadamente 30%, p. ej., menos de aproximadamente 20%, p. ej., menos de aproximadamente 5%, p. ej., menos de aproximadamente 0.5%, p. ej., menos de aproximadamente 0.1% en comparación con el nivel de ARN de JNK y/o proteína JNK fosforilada, respectivamente, en una PSC no naif incubada y/o cultivada en las mismas condiciones, pero sin estar sujeta a inhibición de JNK.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la PSC naif tiene una ruta de ROCK inhibida en comparación con una PSC cebada. Por ejemplo, la actividad ROCK está inhibida en la PSC naif.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, el nivel de ARN de ROCK y/o proteína ROCK fosforilada en la PSC naif es menos de aproximadamente 30%, p. ej., menos de aproximadamente 20%, p. ej., menos de aproximadamente 5%, p. ej., menos de aproximadamente 0.5%, p. ej., menos de aproximadamente 0.1% en comparación con el nivel de ARN de ROCK y/o proteína ROCK fosforilada, respectivamente, en una PSC no naif incubada y/o cultivada en las mismas condiciones, pero sin estar sujeta a inhibición de ROCK.
Seguimiento del estado de diferenciación de las células madre pluripotentes - Durante la etapa de cultivo, las células madre pluripotentes se hace además el seguimiento de su estado de diferenciación. La diferenciación celular se puede determinar tras el examen de marcadores específicos de células o tejidos que se sabe que son indicativos de diferenciación. Por ejemplo, las PSC de primate pueden expresar el antígeno embrionario específico de etapa (SSEA) 4, el antígeno de rechazo tumoral (TRA)-1-60 y TRA-1-81. Las células madre pluripotentes indiferenciadas expresan en gran medida los marcadores SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81 y regulan por disminución su expresión tras la diferenciación.
Los marcadores específicos de tejido/célula se pueden detectar usando técnicas inmunológicas bien conocidas en la técnica [Thomson JA et al., (1998). Science 282: 1145 - 7]. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a citometría de flujo para marcadores unidos a membrana, inmunohistoquímica para marcadores extracelulares e intracelulares e inmunoensayo enzimático, para marcadores moleculares secretados.
La determinación de la diferenciación de PSC también se puede realizar mediante mediciones de la actividad de la fosfatasa alcalina. Las células ES humanas indiferenciadas tienen actividad de fosfatasa alcalina que se puede detectar fijando las células con paraformaldehído al 4% y revelando con el kit de sustrato Vector Red según las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, California, EE.UU.).
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona una población aislada de PSC naif que comprende al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 14%, al menos aproximadamente 16%, al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 22%, al menos aproximadamente 24%, al menos aproximadamente 26%, al menos aproximadamente 28%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 32%, al menos aproximadamente 34%, al menos aproximadamente 36%, al menos aproximadamente 38%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 42%, al menos aproximadamente 44%, al menos aproximadamente 46%, al menos aproximadamente 48%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, p. ej., 100% de las células naif humanas aisladas de algunos aspectos de la descripción.
Según un aspecto específico de la descripción, la población aislada de células es positiva para uno o más marcadores. Positivo también se abrevia con (+). Positivo para un marcador significa que al menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de las células de la población presentan niveles detectables del marcador (p. ej., OCT4, NANOG, TRA1-81, TRA1-60, SSEA3, SSEA4) analizados por un método conocido por los expertos en la técnica [p. ej., análisis por separador de células activadas por fluorescencia (FACS), inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, análisis de transferencia Western]. Por lo tanto, por ejemplo, las células se tiñen positivamente con el anticuerpo anti-SSEA3 según se determina usando FACS o se tiñen positivamente por inmunofluorescencia o inmunohistoquímica usando el anticuerpo para OCT4. Las células positivas para OCT4, NANOG, TRA1-81, TRA1-60, SSEA3, SSEA4 según este aspecto, se tiñen negativamente para uno o más marcadores, p. ej., SSEA1. Negativo también se abrevia con (-). Negativo para un marcador significa que no más de aproximadamente 30%, no más de aproximadamente 25%, no más de aproximadamente 20%, no más de aproximadamente 15%, no más de aproximadamente 10%, no más de aproximadamente 5%, no más de aproximadamente 4%, no más de aproximadamente 3%, no más de aproximadamente 2%, no más de aproximadamente 1%, de las células en la población presentan niveles detectables del marcador (p. ej., SSEA1) analizados por un método conocido por los expertos en la técnica tal como inmunofluorescencia o FACS. Esta presentación de marcadores de una sola célula o de una población aislada de células también se denomina una firma.
Como se muestra en las Figuras 12F y 25B-M, los autores de la presente invención han mostrado una población de células madre que tienen aproximadamente 99% de PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif expresa XIST.
Los métodos para detectar la expresión de XIST son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el análisis de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) usando cebadores de PCR específicos de XIST, p. ej., el cebador directo: 5'-AGGGAGCAGTTTGCCCTACT (s Eq ID NO: 24), y el cebador inverso: 5'-CACATGCAGCGTGGTATCTT (SEQ ID NO: 25), como se muestra en la Figura 23B.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif carece de cuerpos de XIST.
Como se usa en el presente documento, la frase "cuerpos de XIST" se refiere a un cromosoma X inactivo recubierto con XIST.
Los métodos para detectar cuerpos de XIST son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ARN fluorescente en el lugar hibridación. La hibridación fluorescente in situ (FISH) de ARN se lleva a cabo como se describió previamente [Hanna J., et al., Cell 143, 508-525]. Brevemente, se recogen células madre pluripotentes humanas, se agotan en MEF y se citocentrifugan en portaobjetos de vidrio antes de fijación. Se generan sondas de ADNc para el exón 1 de XIST (número de acceso en GenBank U80460: 61251-69449, SEQ ID NO: 26) y el exón 6 (número de acceso en GenBank U80460: 75081-78658, SEQ ID NO: 27) y se marcan mediante traslado de mella (Roche) con Cy3-dUTP (Amersham), y el ADN de Cot-1 se marca con fluoresceína-12-dUTP usando el kit de marcaje con flúor Prime-It (Stratagene).
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif carece de un foco H3K27me3/polycomb.
Como se usa en el presente documento, la frase "foco de H3K27me3/polycomb" se refiere al foco nuclear obtenido después de la inmunotinción que corresponde al cromosoma X inactivo condensado.
Los métodos para detectar el foco de H3K27me3/polycomb son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el uso de análisis de inmunofluorescencia usando anticuerpos anti-H3K27me3 (p. ej., de conejo anti-H3K27me3, Millipore, CA, EE.UU. Número de catálogo 07-449), como se muestra para ejemplo en las Figuras 23C-D.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif tiene un nivel de expresión de XIST bajo está en el estado naif, sin inactivación de ninguno de los cromosomas X y sin presencia de cuerpos de XIST.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la PSC naif es capaz de inactivar X cuando se induce a diferenciarse.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la PSC naif es capaz de diferenciarse en las capas germinales embrionarias endodérmica, mesodérmica y ectodérmica.
Los métodos para determinar la capacidad de las células madre para diferenciarse en las capas germinales embrionarias endodérmica, mesodérmica y ectodérmica incluyen, por ejemplo, la generación de cuerpos embrioides. (in vitro) o teratomas (en vivo) como se muestra en la sección de Ejemplos que sigue y en Figuras tales como 12L-N, 13K-M, 13S-U, 19A-I y 20A-T.
Como se usa en el presente documento, la frase "cuerpos embrioides" (EB) se refiere a agregados multicelulares tridimensionales de células diferenciadas e indiferenciadas derivadas de las tres capas germinales embrionarias.
Los cuerpos embrioides se forman tras la separación de las PSC naif de las capas de alimentación o de los sistemas de cultivo sin células alimentadoras. La separación de las PSC naif se puede llevar a cabo usando tratamiento con colagenasa tipo IV o tripsina durante un tiempo limitado. Después de la disociación de la superficie de cultivo, las células se transfieren a placas de cultivo tisular que contienen un medio de cultivo complementado con suero y aminoácidos.
Durante el período de cultivo, se vigila además el estado de diferenciación de los EB. La diferenciación celular se puede determinar tras el examen de marcadores específicos de células o tejidos que se sabe que son indicativos de diferenciación. Por ejemplo, las células diferenciadas derivadas de EB pueden expresar el neurofilamento 68 KD, que es un marcador característico del linaje celular del ectodermo.
El nivel de diferenciación de las células EB se puede vigilar siguiendo la pérdida de expresión de Oct-4 y el aumento del nivel de expresión de otros marcadores tales como a-fetoproteína, NF-68 kDa, a-cardíaco y albúmina. Los métodos útiles para vigilar el nivel de expresión de genes específicos son bien conocidos en la técnica e incluyen RT-PCR, RT-PCR semicuantitativa, transferencia Northern, hibridación in situ de ARN, análisis de transferencia Western e inmunohistoquímica.
Teratomas: La capacidad pluripotente de las PSC naif de algunos aspectos de la descripción también se puede confirmar inyectando células en ratones SCID [Evans MJ y Kaufman M (1983). "Pluripotential cells grown directly from normal mouse embryos"C. Cáncer Surv. 2: 185-208], que tras la inyección forman teratomas. Los teratomas se fijan usando paraformaldehído al 4% y se examinan histológicamente las tres capas germinales (es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo).
Además de vigilar un estado de diferenciación, a menudo también se vigila en las PSC naif el cariotipo, con el fin de verificar la euploidía citológica, en donde todos los cromosomas están presentes y no se alteran de forma detectable durante el cultivo. Las PSC naif cultivadas se pueden cariotipar usando una tinción de Giemsa estándar y comparar con cariotipos publicados de las especies correspondientes.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif es capaz de mantenerse en el estado indiferenciado y pluripotente, mientras mantiene el estado naif (como se define en lo que antecede) durante más de aproximadamente 20 pases en cultivo, p. ej., durante al menos aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75 y aproximadamente 80 pases mientras está en cultivo.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la PSC naif que se mantiene en el estado indiferenciado, pluripotente y naif (como se define en lo que antecede), expresa niveles significativamente más bajos de SOX1 en comparación con el nivel de expresión presente en la PSC cebada (p. ej., ESC cebada) en condiciones de ensayo de SOX1 idénticas, y en donde la PSC cebada presenta un alelo de XIST metilado y uno no metilado (en una célula femenina) o un alelo de XIST metilado (en una célula masculina); expresa XIST; presenta cuerpos de XIST; y presenta un foco H3K27me3/polycomb.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la PSC naif expresa un nivel más bajo de MHC de clase I en comparación con una PSC cebada en condiciones de ensayo de detección idénticas, y en donde la PSC cebada presenta un alelo de XIST metilado y uno no metilado (en una célula femenina) o un alelo de XIST metilado (en una célula masculina); expresa XIST; presenta cuerpos de XIST; y presenta un foco H3K27me3/polycomb.
El nivel de MHC de clase I se puede determinar por varios métodos conocidos en la técnica, tales como el análisis de FACS usando anticuerpos específicos para detectar la expresión de superficie de las moléculas MHC de clase I (p. ej., véase las Figuras 24B y 24c ), y usando anticuerpo anti-HLA-A,B,C marcado con fluorescencia (BD Biosciences).
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif se caracteriza por al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% más de ARN polimerasa II que se detiene en los cromosomas en comparación con una PSC cebada en condiciones de ensayo idénticas, y en donde la PSC cebada presenta un alelo de XIST metilado y uno no metilado (en una célula femenina) o un alelo de XIST metilado (en una célula masculina); expresa XIST; presenta cuerpos de XIST; y presenta un foco H3K27me3/polycomb.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la PSC naif presenta un estado de pre-inactivación de X similar al estado de pre-inactivación de X de una masa celular interna humana (ICM).
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un cultivo celular que comprende la PSC naif aislada de algunos aspectos de la descripción, o la población aislada de PSC naif de algunos aspectos de la descripción y un medio de cultivo.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo es capaz de mantener la PSC naif en un estado indiferenciado y pluripotente durante al menos 10 pases.
El cultivo celular se puede mantener in vitro, en condiciones de cultivo, en las que las células se someten a pases durante períodos prolongados de tiempo (p. ej., durante al menos 20 pases, p. ej., al menos aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 pases o más), mientras se mantienen las células en su estado pluripotente e indiferenciado naif.
Como se usa en el presente documento, la frase "medio de cultivo" se refiere a una sustancia sólida o líquida usada para el soporte del crecimiento de las células madre y mantenerlas en un estado indiferenciado. Preferiblemente, la frase "medio de cultivo" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia líquida capaz de mantener las células madre en un estado indiferenciado. El medio de cultivo usado por la presente descripción puede ser un medio basado en agua que incluye una combinación de sustancias tales como sales, nutrientes, minerales, vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, proteínas tales como citoquinas, factores de crecimiento y hormonas, todos los cuales son necesarios para la proliferación celular y son capaces de mantener las células madre en un estado indiferenciado. Por ejemplo, un medio de cultivo puede ser un medio de cultivo de tejidos sintético tal como Ko-DMEM (Gibco-Invitrogen Corporation products, Grand Island, NY, EE.UU.), DMEM/F12 (Gibco-Invitrogen Corporation products, Grand Island, NY, EE.UU.), o DMEM/F12 (Biological Industries, Biet Haemek, Israel), complementado con los aditivos necesarios como se describe adicionalmente en lo sucesivo. Preferiblemente, todos los ingredientes incluidos en el medio de cultivo de la presente descripción son sustancialmente puros, con una calidad para cultivo de tejidos.
Los autores de la presente invención han identificado un medio de cultivo novedoso que se puede usar para generar PSC naif y mantenerlas en un estado pluripotente e indiferenciado. Por lo tanto, como se muestra en las Figuras 12A-G, 85A-C, 102, 103, 104 y 105, y en las Tablas 3, 4 y 5 en la sección de Ejemplos a continuación, después de laboriosos experimentos, los autores de la presente invención han descubierto los factores necesarios para manteniendo las PSC naif en el "estado naif', como se puso de manifiesto por la expresión de células OCT4-GFP+ (positivas) y el porcentaje de citosina metilada total (% de 5mdC).
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3p, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un activador de STAT3 y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento transformante beta 1 (TG Fpl), un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC), un inhibidor de ROCK y un inhibidor de NOTCH. Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ERKl/2, un inhibidor de GSK3p, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un activador de STAT3 y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC), un inhibidor de ROCK y un inhibidor de NOTCH.
Como se usa en el presente documento, el término "STAT3" se refiere al transductor de señales y activador del producto del gen de la transcripción 3 (factor de respuesta de fase aguda) (ID de gen 6774). En respuesta a las citoquinas y factores de crecimiento, los miembros de la familia STAT son fosforilados por las quinasas asociadas al receptor y luego forman homo o heterodímeros que son traslocados al núcleo celular donde actúan como activadores de la transcripción. Los activadores de STAT3 conocidos incluyen, pero no se limitan a interferón (IFN), factor de crecimiento epidérmico (EGF), interleuquina 5 (IL5), interleuquina 6 (IL6), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor inhibidor de leucemia (LIF) y proteína morfogenética ósea 2 (BMP2).
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3, que usan el medio, las células y/o los métodos de algunos aspectos de la descripción, se selecciona del grupo que consiste en LIF, IL6 y EGF.
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3, que usan el medio, las células y/o los métodos de algunos aspectos de la descripción, se selecciona del grupo que consiste en LIF e IL6.
Según algunos aspectos de la descripción, el activador STAT3, que usan el medio, las células y/o los métodos de algunos aspectos de la descripción es LIF.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), un inhibidor de señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP), un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH), un inhibidor de ERK5, forskolina, Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH), un inhibidor de ERK5, forskolina, Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF, y en donde el al menos un agente comprende el inhibidor de PKC.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además inhibidor de FGFR.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además inhibidor de TGFR.
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF y en donde el al menos un agente comprende el TGFpl y el inhibidor de la proteína quinasa C.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de FGFR.
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF, y en donde el al menos un agente comprende el bFGF y el TGFpl.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de la proteína quinasa C. Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF y en donde el al menos un agente comprende el bFGF, el inhibidor de ROCK, un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), el inhibidor de NOTCH y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFR).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH).
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF y en donde el al menos un agente comprende el inhibidor de NOTCH y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR). Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un agente seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), factor de células madre (SCF) y factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFpl).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende el factor inhibidor de leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK y un inhibidor de proteína quinasa C. Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende el factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK y un inhibidor de la proteína quinasa C, comprende además un inhibidor del receptor del factor crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende el factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK y un inhibidor de proteína quinasa C, comprende además un inhibidor del receptor del factor crecimiento transformante (TGFRi).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende el factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK y un inhibidor de la proteína quinasa C, comprende además un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi) y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende el factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, TGFpl y un inhibidor de la proteína quinasa C.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio que comprende el factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, TGFpl y un inhibidor de la proteína quinasa C comprende además inhibidor de FGFR (FGFRi).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende el factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento transformante beta 1 (TG Fpl).
Como se usa en el presente documento, el término "factor inhibidor de la leucemia (LIF)" se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el n° de acceso en GenBank NP_001244064.1 (SEQ ID NO: 119), codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en el n° de acceso en GenBank NM_001257135 (SEQ ID N°: 30). Preferiblemente, el LIF usado por el método según algunos aspectos de la descripción es capaz de soportar, junto con otros factores que se describen en el presente documento, el crecimiento indiferenciado de PSC de primates (p. ej., humanas) naif, mientras mantiene su capacidad pluripotente. LIF se puede obtener de varios fabricantes tales como Millipore, Peprotech y R&D Systems.
Según algunos aspectos de la descripción, el LIF se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.5 nanogramos por mililitro (ng/ml) a aproximadamente 1000 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1­ 1000 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-900 ng/ml, p. ej., aproximadamente de 1-800 ng/ml, p. ej., aproximadamente de 1-700 ng/ml, p. ej., aproximadamente de 1-600 ng/ml, p. ej., aproximadamente de 1-500 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-400 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-300 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-200 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-100 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-50 ng/ml, p. ej., aproximadamente 2-50 ng/ml, p. ej., aproximadamente 4-50 ng/ml, p. ej., aproximadamente 5-50 ng/ml, p. ej., aproximadamente 10-50 ng/ml, p. ej., aproximadamente 10-40 ng/ml, p. ej., aproximadamente 10-30 ng/ml, p. ej., aproximadamente 20 ng/ml.
Como se usa en el presente documento, el término "interleuquina 6 (IL6)" se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en el n° de acceso en GenBank NP_000591.1 (SEQ ID NO: 120), que está codificada por el ácido nucleico expuesto en el n° de acceso en GenBank NM_000600.3 (SEQ ID N°: 111). Preferiblemente, la IL6 usada por el método según algunos aspectos de la descripción es capaz de soportar, junto con otros factores que se describen en el presente documento, el crecimiento indiferenciado de PSC de primates (p. ej., humanas) naif, mientras mantiene su capacidad pluripotente. La IL6 se puede obtener de varios fabricantes, tales como Speed BioSystems, Millipore, Peprotech y R&D Systems.
Según algunos aspectos de la descripción, la IL6 se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-90 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-80 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-70 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-50 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-40 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-30 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-20 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-10 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-8 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-7 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-6 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-5 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-4 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-3 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-4 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.5-4 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.5-4 ng/ml, p. ej., aproximadamente 3 ng/ml.
Como se usa en el presente documento, la frase "TGFpl" se refiere a una isoforma beta-1 (p1) del factor de crecimiento transformante beta (p. ej., TGFp1 de homo sapiens, n° de acceso en GenBank NP_000651; SEQ ID NO:28, que es codificado por la secuencia representada en el n° de acceso en GenBank NM_000660.5; SEQ ID NO:31). El TGFp actúa en la inducción de la transformación y solo actúa como un factor de crecimiento autocrino. La isoforma TGFpl se puede obtener de diferentes fuentes comerciales tales como R&D Systems Minneapolis MN, EE.UU.
Según algunos aspectos de la descripción, el TGFpl se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 nanogramos por mililitro (ng/ml) a aproximadamente 500 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1­ 400 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-300 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-200 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-100 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-50 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-30 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-20 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-10 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-8 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1­ 7 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-6 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-5 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-4 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-3 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.1-2 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.5-2 ng/ml, p. ej., aproximadamente 0.5-1.5 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1 ng/ml.
Según algunos aspectos de la descripción, los activadores de la ruta de TGF/ACTIVINA que incluye ACTIVINA A (también conocida como Inhibina beta A, INHBA, ID de gen: 3624; n° de acceso en GenBank Nm_002192.2 (SEQ ID No :123), que codifica el n° de acceso en GenBank NP_002183.1; SEQ ID NO:117) se pueden usar para sustituir el TGFpl.
Según algunos aspectos de la descripción, la citoquina TGFpl se puede sustituir por Nodal y/o Activina recombinantes.
Las frases "factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)" o "FGF2" que se usan indistintamente en el presente documento, se refieren a un polipéptido de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), que se une a la heparina y tiene amplias actividades mitogénicas y angiogénicas. El ARNm para el gen BFGF contiene múltiples sitios de poliadenilación y se traduce alternativamente a partir de codones de inicio no AUG (CUG) y AUG, lo que da como resultado cinco isoformas diferentes con propiedades distintas. Las isoformas iniciadas por CUG se localizan en el núcleo y son responsables del efecto intracrino, mientras que la forma iniciada por AUG es principalmente citosólica y es responsable de los efectos paracrinos y autocrinos de este FGF.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, el bFGF usado por el medio de algunos aspectos de la descripción se proporciona en el n° de acceso en GenBank NP_001997 (SEQ ID NO: 29). El BFGF se puede obtener de varios fabricantes tales como Peprotech, RnD Systems, Millipore. Según algunos aspectos de la descripción, el bFGF usado por el medio de algunos aspectos de la descripción procede de R&D Systems (Número de catálogo: 233-FB).
Según algunos aspectos de la descripción, el bFGF se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.5 nanogramos por mililitro (ng/ml) a aproximadamente 500 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-500 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-400 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-300 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-200 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-100 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-80 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-70 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-70 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-60 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-50 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-40 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-30 ng/ml, p. ej., aproximadamente 1-20 ng/ml, p. ej., aproximadamente 2-20 ng/ml, p. ej., aproximadamente 2-10 ng/ml, p. ej., aproximadamente 3-10 ng/ml, p. ej., aproximadamente 4-10 ng/ml, p. ej., aproximadamente 8 ng/ml.
Se apreciará que cualquiera de los factores proteicos usados en el medio de cultivo de algunos aspectos de la descripción (p. ej., LIF, IL6, TGFpl o bFGF) se puede expresar de manera recombinante o sintetizar bioquímicamente. Además, los factores proteicos de origen natural tales como bFGF y TGFp se pueden purificar a partir de muestras biológicas (p. ej., de suero humano, cultivos celulares) usando métodos bien conocidos en la técnica.
La síntesis bioquímica de los factores proteicos de la presente descripción (p. ej., LIF, IL6, TGFpl o bFGF) se puede llevar a cabo usando técnicas convencionales en fase sólida. Estos métodos incluyen síntesis exclusiva en fase sólida, métodos de síntesis parcial en fase sólida, condensación de fragmentos y síntesis clásica en solución.
La expresión recombinante de los factores proteicos de la presente descripción (p. ej., LIF, IL6, TGFpl o bFGF) se puede generar usando técnicas recombinantes como las descritas por Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol.
153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680, Brogli et al., (1984) Science 224:838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pág. 421-463.
Por ejemplo, para generar el LIF, IL6, TG Fpl, o bFGF, una secuencia de polinucleótido que codifica el LIF, IL6, TG Fpl, o bFGF [p. ej., el polinucleótido expuesto por la SEQ ID NO: 30 (LIF, n° de acceso en GenBank NM_001257135), SEQ ID NO: 3 l (TGFpl, n° de acceso en GenBank NM_000660), SEQ ID NO: 32 (BFGF, n° de acceso en GenBank NM_002006), s Eq ID NO:111 (IL6, n° de acceso en GenBank NM_000600.3)] se liga preferiblemente en una construcción de ácido nucleico adecuada para la expresión en una célula hospedante [es decir, una célula en la que se expresa el polinucleótido que codifica el polipéptido de elección (p. ej., el LIF, IL6, TGFpl o bFGF)]. Preferiblemente, para generar un LIF, IL6, TGFpl, o bFGF con la cantidad y patrón de glucosilación como el LIF, IL6, TGFpl o bFGF de origen natural, la célula hospedante usada es una célula hospedante eucariota, más preferiblemente una célula hospedante de mamífero tal como una célula humana o célula CHO). Se proporciona en lo sucesivo descripción adicional de construcciones de ácidos nucleicos (o vectores de expresión) que se pueden usar para producir un polipéptido de interés (p. ej., los factores proteicos descritos antes).
Como se usa en el presente documento el término "ERK1" se refiere a la isoforma 1 de una proteína quinasa 3 activada por mitógenos (MAPK3) expuesta por el n° de acceso en GenBank NP_002737.2 (SEQ iD NO: 33), la isoforma 2 de MAPK3 expuesta por el n° de acceso en GenBank NP_001035145.1 (SEQ ID No : 34), la isoforma 3 de MAPK3 expuesta por el n° de acceso en GenBank NP_001103361.1 (SEQ ID n 0: 35) y/o ERK1 expuesta en el n° de acceso en GenBank M84490 (SEQ ID NO: 36) que tiene actividad de señalización de Ma PK.
Como se usa en el presente documento el término "ERK2" se refiere a la proteína quinasa 1 activada por mitógenos (MAPK1) expuesta por el n° de acceso en GenBank NP_002736.3 (SEQ ID NO: 37) y/o n° de acceso en GenBank NP_620407.1 (SEQ ID NO: 38) que tiene actividad de señalización de MAPK.
Como se usa en el presente documento el término "inhibidor de ERK1/2" se refiere a cualquier molécula capaz de inhibir la actividad de ERK1/2 determinada por detección de proteína por transferencia Western de las proteínas ERK1/2 fosforiladas.
Los ejemplos no limitantes de inhibidores de ERK1/2 incluyen PD0325901 (AXONMEDCHEM - AXON 1408), PD98059 (AXONMEDCHEM - Axon 1223), y PD184352 (AXONMEDCHEM - AXON 1368); o incluso inhibidores de RAF (que está secuencia arriba de ERK) tales como Sorafenib o SB (AXONMEDCHEM -a Xo N 1397).
Según algunos aspectos de la descripción, PD0325901 se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.01 microM (pM) a aproximadamente 50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.05-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-35 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-30 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-25 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-20 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-15 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.3-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.4-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.6­ 10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.7-10 pM, p. ej., entre 0.8-10 pM, p. ej., entre 0.9-10 pM, p. ej., entre 0.9-9 pM, p. ej., entre 0.9-8 pM, p. ej., entre 0.9-7 pM, p. ej., entre 0.9-6 pM, p. ej., entre 0.8-5 pM, p. ej., entre 0.8-4 pM, p. ej., entre 0.8-3 pM, p. ej., entre 0.8-2 pM, p. ej., entre 0.8-1.5 pM, p. ej., entre 0.9-1.2 pM, p. ej., aproximadamente 1 pM.
Según algunos aspectos de la descripción, PD98059 se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 microM (pM) a aproximadamente 70 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-65 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-55 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-35 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-30 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-25 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-20 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1­ 15 pM, p. ej., entre aproximadamente 2-20 pM, p. ej., entre aproximadamente 5-15 pM, p. ej., aproximadamente 10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.3­ 10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.4-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.6-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.7-10 pM, p. ej., entre 0.8-10 pM, p. ej., entre 0.9-10 pM, p. ej., entre 0.9-9 pM, p. ej., entre 0.9-8 pM, p. ej., entre 0.9-7 pM, p. ej., entre 0.9-6 pM, p. ej., entre 0.8-5 pM, p. ej., entre 0.8-4 pM, p. ej., entre 0.8-3 pM, p. ej., entre 0.8-2 pM, p. ej., entre 0.8-1.5 pM, p. ej., entre 0.9-1.2 pM.
Según algunos aspectos de la descripción, PD184352 se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 microM (pM) a aproximadamente 70 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-60 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-35 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5­ 30 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-25 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-20 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-15 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-10 pM, p. ej., entre 0.5-9 pM, p. ej., entre 0.5-8 pM, p. ej., entre 0.5-7 pM, p. ej., entre 0.9-6 pM, p. ej., entre 0.8-5 pM, p. ej., entre 0.8-4 pM, p. ej., entre 0.8-3 pM, p. ej., aproximadamente 3 pM. p. ej., entre 0.8-2 pM, p. ej., entre 0.8-1.5 pM, p. ej., entre 0.9-1.2 pM.
Según algunos aspectos de la descripción, Sorafenib se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1 microM (pM) a aproximadamente 70 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-60 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-35 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5­ 30 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-25 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-20 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-15 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-10 pM, p. ej., entre 0.5-9 pM, p. ej., entre 0.5-8 pM, p. ej., entre 0.5-7 pM, p. ej., entre 0.9-6 pM, p. ej., entre 0.8-5 pM, p. ej., aproximadamente 5 pM, p. ej., entre 0.8-4 pM, p. ej., entre 0.8-3 pM, p. ej., entre 0.8-2 pM, p. ej., entre 0.8-1.5 pM, p. ej., entre 0.9-1.2 pM.
Como se usa en el presente documento el término "GSK3b" se refiere a la proteína glucógeno sintasa quinasa 3 beta definida por los n° de acceso en GenBank NP_002084.2 (SEQ ID NO: 121) y/o NP_001139628.1 (SEQ ID NO: 122) que tiene la actividad reguladora de la señalización de WNT a través de su actividad de quinasa.
Como se usa en el presente documento la expresión "inhibidor de GSK3b" se refiere a cualquier molécula capaz de inhibir la actividad de GSK3b determinada por los niveles de inhibición específicos de GSK3b fosforilado (del GSK3b total presente en una célula)
Ejemplos no limitantes de inhibidores de GSK3b incluyen CHIR99021 (AXONMEDCHEM - AXON 1386), BIO (AXONMEDCHEM - Axon 1693), y Kenpaullona (TOCRIS - n° cat. 1398).
Según algunos aspectos de la descripción, CHIR99021 se proporciona en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0.1-50 pM, p. ej., de aproximadamente 0.2 pM a aproximadamente 50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-35 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2 30 |jM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-25 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-20 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-15 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.3-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.4-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.5­ 10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.6-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.7-10 j M, p. ej., entre 0.8-10 j M, p. ej., entre 0.9-10 j M, p. ej., entre 0.9-9 j M, p. ej., entre 1-8 j M, p. ej., entre 1-7 j M, p. ej., entre 1-6 j M, p. ej., entre 1­ 5 j M, p. ej., entre 2-4 j M, p. ej., aproximadamente 3 j M.
Según algunos aspectos de la descripción, BIO se proporciona en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0.1-70 j M, p. ej., de aproximadamente 0.2 j M a aproximadamente 70 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-60 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-55 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-50 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-45 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-40 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2­ 35 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-30 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-25 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-20 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-15 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.3-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.4-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.5­ 10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.6-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.7-10 j M, p. ej., entre 0.8-10 j M, p. ej., entre 0.9-10 j M, p. ej., entre 0.9-9 j M, p. ej., entre 1-8 j M, p. ej., entre 1-7 j M, p. ej., entre 1-6 j M, p. ej., entre 1­ 5 j M, p. ej., aproximadamente 5 j M, p. ej., entre 2-4 j M.
Según algunos aspectos de la descripción, Kenpaullona se proporciona en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0.1-70 j M, p. ej., de aproximadamente 0.2 j M a aproximadamente 70 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-60 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-55 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-50 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-45 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-40 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2­ 35 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-30 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-25 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-20 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-15 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.2-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.3-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.4-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.5­ 10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.6-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 0.7-10 j M, p. ej., entre 0.8-10 j M, p. ej., entre 0.9-10 j M, p. ej., entre 0.9-9 j M, p. ej., entre 1-8 j M, p. ej., entre 1-7 j M, p. ej., entre 1-6 j M, p. ej., entre 1­ 5 j M, p. ej., entre 2-4 j M, p. ej., aproximadamente 5 j M.
Como se usa en el presente documento el término "p38" se refiere a la proteína quinasa activada por mitógenos 14 "p38a (alfa)" (MAPK14), que incluye la isoforma 1 de MAPK14 definida por el n° de acceso en GenBank NP_001306.1 (SEQ ID NO: 39), isoforma 2 de Ma PK14 definida por el n° de acceso en GenBank NP_620581.1 (SEQ ID NO: 40), isoforma 3 de MAPK14 definida por el n° de acceso en GenBank NP_620582.1 (SEQ ID NO: 41) e isoforma 4 de MAPK14 definida por el n° de acceso en GenBank NP_620583.1 (SEQ ID NO: 42); "p38p (beta)" (MAPK11), que se definida por el n° de acceso en GenBank NP_002742.3 (SEQ ID NO: 43); "p38Y (gamma)" (MAPK12) que se definida por el n° de acceso en GenBank NP_002960.2 (SEQ ID NO: 44); y/o "p38¿ (delta)" (MApK13) que se define en el n° de acceso en GenBank NP_002745.1 (SEQ ID NO: 45), teniendo todas actividad de quinasa e implicadas en la transducción de señales.
Como se usa en el presente documento la expresión "inhibidor de p38" se refiere a cualquier molécula (p. ej., moléculas pequeñas o proteínas) capaces de inhibir la actividad de miembros de la familia de p38 determinado por cuantificación por transferencia Western de los niveles de p38 fosforilado.
Ejemplos no limitantes de inhibidores de p38 incluyen SB203580 (AXONMEDCHEM - Axon 1363), y SB 202190 (AXONMEDCHEM - Axon 1364), LY 2228820 (AXONMEDCHEM- Axon 1895), BIRB796 (Axon Medchem 1358) y PD169316 (AXONMEDCHEM - Axon 1365).
Puesto que la señalización por BMP es un activador para la señalización por p38, los ejemplos de inhibidores de p38 también incluyen inhibidores de BMP como dorsomorfina (AXONMEDCHEM - Axon 2150) y LDN193189 (AXON MEDCHEM AXo N 1509) o se pueden usar otros inhibidores de la ruta de BMP tales como la proteína n Og GIN recombinante [n° de acceso en GenBank NP_005441.1 (SEQ ID NO: 118)] para sustituir inhibidores de moléculas pequeñas de la señalización por BMP.
Según algunos aspectos de la descripción, PDSB203580 se proporciona en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0.5-70 j M, p. ej., de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 70 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-60 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-55 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-50 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-45 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-40 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-35 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-30 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-25 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-20 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-15 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 2-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 3-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 4-10 j M, p. ej., entre aproximadamente 4­ 6 j M, p. ej., aproximadamente 5 j M, p. ej., aproximadamente 10 j M.
Según algunos aspectos de la descripción, SB 202190 se proporciona en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0.1 j M a aproximadamente 50 j M, p. ej., de aproximadamente 0.5 j M a aproximadamente 50 j M, p. ej., de aproximadamente 1 j M a aproximadamente 50 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-45 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-40 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-35 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-30 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-25 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-20 j M, p. ej., entre aproximadamente 1-15 j M, p.
ej., entre aproximadamente 1-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-9 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-8 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-7 pM, p. ej., entre aproximadamente 2-7 pM, p. ej., entre aproximadamente 3-7 pM, p. ej., entre aproximadamente 4-7 pM, p. ej., entre aproximadamente 4-6 pM, p. ej., aproximadamente 5 pM.
Según algunos aspectos de la descripción, BIRB796 se proporciona en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0.05 a aproximadamente 30 pM, p. ej., de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-30 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-25 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-20 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-15 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-8 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.2-6 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-6 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-5 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-4 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-3 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.5-2 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-3 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-2.5 pM, p. ej., aproximadamente 2 pM.
Como se usa en el presente documento el término "JNK" se refiere a la proteína quinasa activada por mitógenos 8 (MAPK8) definida por el n° de acceso en GenBank NP_620637.1 (isoforma alfa2) (SEQ ID NO: 46), NP_620635.1 (isoforma beta2) (SEQ ID NO: 47), NP_620634.1 (isoforma beta1) (SEQ ID NO: 48), NP_002741.1 (isoforma alfa1) (SEQ ID NO: 49) que están implicadas en una amplia variedad de procesos celulares tales como proliferación, diferenciación, regulación de la transcripción y desarrollo.
Como se usa en el presente documento la expresión "inhibidor de JNK" se refiere a cualquier molécula capaz de inhibir la actividad de JNK determinado por la fosforilación de proteínas miembro de la familia de JNK por análisis de transferencia Western.
Ejemplos no limitantes de inhibidores de JNK incluyen SP600125 (TOCRIS - n° cat. 1496), AEG3482 (AXONMEDCHEM- AXON 1291), y BIRB796 (AXONMEDCHEM - Axon 1358).
Según algunos aspectos de la descripción, SP600125 se proporciona en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0.5-100 pM, p. ej., de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-90 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-80 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-70 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-60 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-55 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-50 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-35 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-30 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-25 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-20 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-15 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 2­ 10 pM, p. ej., entre aproximadamente 3-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 4-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 4-6 pM, p. ej., aproximadamente 5 pM.
Como se usa en el presente documento la expresión "proteína quinasa C (PKC)" se refiere a las isoformas de proteína PKCa (alfa), PKCp (beta), PKCy (gamma), PKCó (delta), PKCZ (zeta) y PKCp (mu).
Como se usa en el presente documento el término "inhibidor de la proteína quinasa C" se refiere a cualquier molécula capaz de inhibir la actividad de la proteína quinasa C determinado por la reducción de los niveles de las isoformas de PKC fosforiladas frente a las no fosforiladas.
Un ejemplo no limitante de un inhibidor de la proteína quinasa C es Go6983 (CAS 133053-19-7), un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC) potente, permeable a la célula, reversible y competitivo de ATP, con un amplio espectro de inhibidor de la proteína quinasa C (Pk C) (los valores de IC50 son 7, 7, 6, 10, 60 y 20000 nM para PKCa, PKCp, PKCy, PKCó, PKCZ y PKCp respectivamente). Go6983 está disponible de varios proveedores tales como Calbiochem (número de catálogo 365251-500UG), y TOCRIS (número de catálogo 2285).
Según algunos aspectos de la descripción, Go6983 se proporciona en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0.5-100 pM, p. ej., de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-90 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-80 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-70 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-60 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-55 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-50 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-35 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-30 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-25 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-20 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-15 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 2­ 10 pM, p. ej., entre aproximadamente 3-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 4-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 4-6 pM, p. ej., aproximadamente 5 pM.
Como se usa en el presente documento la expresión "receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR)" se refiere a FGFR1, FGFR2 y FGFR3.
Como se usa en el presente documento la expresión "inhibidor de FGFR (o FGFRi)" se refiere a una molécula capaz de inhibir la expresión del FGFR y/o el nivel de actividad determinado por los niveles de FGFR1, 2 y 3 fosforilados.
Los ejemplos no limitantes de inhibidores de FGFR incluyen PD173074 y SU5401.
Según algunos aspectos de la descripción, el inhibidor de FGFR (FGFRi) es PD173074 y se proporciona en un intervalo de concentración entre aproximadamente 0.01-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.02-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.05-40 pM, p. ej., entre, aproximadamente 0.1-40 pM, aproximadamente 0.5-40 pM, aproximadamente 1-40 pM, p. ej., aproximadamente 2-40 pM, aproximadamente 5-40 pM, aproximadamente 10-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.05-5 pM, p. ej., aproximadamente 0.1-5 pM.
Según algunos aspectos de la descripción, el inhibidor de FGFR (FGFRi) es SU5401 y se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1-40 pM, p. ej., aproximadamente 0.5-40 pM, aproximadamente 1-40 pM, p. ej., aproximadamente 2-40 pM, aproximadamente 5-40 pM, aproximadamente 10-40 pM.
Como se usa en el presente documento la expresión "receptor del factor de crecimiento transformante (TGFR)" se refiere al receptor de TGF-p tipo I ALK5, receptor de activina/nodal tipo I ALK4 y receptor nodal de tipo I ALK7.
Como se usa en el presente documento la expresión "inhibidor de TGFR (o TGFRi)" se refiere a una molécula capaz de inhibir la expresión de TGFR y/o el nivel de actividad determinado por ALK4, 5 y 7 fosforilados.
Ejemplos no limitantes de inhibidores de TGFR incluyen SB431542 y el compuesto molécula pequeña A 83-01.
Según algunos aspectos de la descripción, el inhibidor de TGFR se proporciona en un intervalo de concentración de aproximadamente 0.1-30 pM, p. ej., aproximadamente 1-30 pM, p. ej., 5-25 pM, p. ej., 5-10 pM, p. ej., 0.1-5 pM, p. ej., 0.2-4 pM, p. ej., 0.5-3 pM.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de ROCK.
Como se usa en el presente documento el término "ROCK" se refiere a la proteína definida por el n° de acceso en GenBank NP_005397.1 (P160ROCK; SEQ ID NO: 50); y NP_004841.2 (ROCK2; SEQ ID NO: 51) que tiene la actividad de serina/treonina quinasa, y regula la citoquinesis, contracción de músculo liso, la formación de fibras de estrés de actina y adhesiones focales y la activación del elemento de respuesta sérico c-fos.
Como se usa en el presente documento el término "inhibidor de ROCK" se refiere a cualquier molécula capaz de inhibir la actividad de ROCK determinado por la inhibición de los niveles de fosforilación de ROCK (detectados por análisis de transferencia Western).
Ejemplos no limitantes de inhibidores de ROCK incluyen Y27632 (TOCRIS, número de catálogo 1254).
Según algunos aspectos de la descripción, Y27632 se proporciona en un intervalo de concentración de entre aproximadamente 0.1-100 pM, p. ej., de aproximadamente 0.1 pM a aproximadamente 90 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-85 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-80 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-70 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-60 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-55 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1­ 50 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-45 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-40 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-35 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-30 pM, p. ej., entre aproximadamente 0.1-25 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-20 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-15 pM, p. ej., entre aproximadamente 1-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 2-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 3-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 4-10 pM, p. ej., entre aproximadamente 4-6 pM, p. ej., aproximadamente 5 pM.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, y un inhibidor de la proteína quinasa C, comprende además un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un inhibidor de la proteína quinasa C, y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi) comprende además un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un inhibidor de la proteína quinasa C, y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi) comprende además un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un inhibidor de la proteína quinasa C, un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi) y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi) comprende además un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, TGFpl y un inhibidor de la proteína quinasa C comprende además un inhibidor de ROCK.
S e g ú n a lg u n o s a s p e c to s d e la d e s c r ip c ió n , e l m e d io d e c u lt iv o q u e c o m p re n d e fa c to r in h ib id o r d e la le u c e m ia (L IF ) , un in h ib id o r d e E R K 1 /2 , un in h ib id o r d e G S K 3 b , un in h ib id o r d e p 38 , un in h ib id o r d e J N K , T G F p l , un in h ib id o r d e la p ro te ín a q u in a s a C y un in h ib id o r d e l re c e p to r d e l fa c to r d e c re c im ie n to d e f ib ro b la s to s (F G F R ) c o m p re n d e a d e m á s un in h ib id o r d e R O C K .
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFp1) comprende además un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de la proteína quinasa C.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFp1) comprende además un inhibidor de la proteína quinasa C.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFpl) y un inhibidor de ROCK comprende además un inhibidor de la proteína quinasa C.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un factor seleccionado del grupo que consiste en: proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), forskolina, inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi), inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi), Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, y un inhibidor de la proteína quinasa C comprende además al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), forskolina, inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi), inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi), Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un inhibidor de la proteína quinasa C y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi) comprende además al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), forskolina, inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi), Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un inhibidor de la proteína quinasa C y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi) comprende además al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), forskolina, inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi), Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un inhibidor de la proteína quinasa C, un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi) y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi) comprende además al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), forskolina, Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, TGFpl y un inhibidor de la proteína quinasa C comprende además al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), forskolina, inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi), inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi), Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFp 1) comprende además al menos un factor seleccionado del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), forskolina, inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (FGFRi), inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFRi), Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (Sc F).
S e g ú n a lg u n o s a s p e c to s d e la d e s c r ip c ió n , e l m e d io d e c u lt iv o c o m p re n d e a d e m á s á c id o a s c ó rb ic o .
Como se usa en el presente documento, la frase "ácido ascórbico" o "vitamina C" que se usan indistintamente en el presente documento, se refiere a2-fosfato del ácido L-ascórbico. El ácido ascórbico se puede obtener p. ej., de Sigma (número de catálogo A8960).
La concentración de ácido ascórbico que se usa con el medio de algunos aspectos de la descripción puede ser de aproximadamente 1-300 pg/ml, p. ej., aproximadamente 50 pg/ml.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además ácido oleico. Debe observarse que el ácido oleico se puede usar en lugar de ALBUMAX® (Life Technologies) o junto con ALBUMAX®.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además ácido linoleico. Debe observarse que el ácido linoleico se puede usar en lugar de ALBUMAX® (Life Technologies) o junto con ALBUMAX®.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además ácido pipecólico. Debe observarse que el ácido pipecólico se puede usar en lugar de ALBUMAX® (Life Technologies) o junto con ALBUMAX®.
Según algunos aspectos de la descripción, el ácido oleico (01257, Sigma Aldrich) se puede usar en una concentración de aproximadamente 1-200 pg/ml, p. ej., aproximadamente 10 pg/ml en el medio de cultivo.
Según algunos aspectos de la descripción, el ácido oleico [01008 Sigma Aldrich, disuelto en DMSO), se puede usar en una concentración de 1-200 pg/ml p. ej., aproximadamente 10 pg/ml en el medio de cultivo.
Según algunos aspectos de la descripción, el ácido pipecólico [P2519 Sigma Aldrich, disuelto en DMSO), se puede usar en una concentración de 1-200 pg/ml p. ej., aproximadamente 10 pg/ml en el medio de cultivo.
Según algunos aspectos de la descripción, el ácido oleico-albúmina (03008 Sigma Aldrich) se puede usar en una concentración de aproximadamente 1-200 pg/ml, p. ej., aproximadamente 10 pg/ml en el medio de cultivo.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende complemento de linoleico/oleico/albúmina (L9655 Sigma Aldrich) en una concentración de aproximadamente 1-200 pg/ml, p. ej., aproximadamente 10 pg/ml en el medio de cultivo.
Un ejemplo no limitante de un medio de cultivo que se puede usar para mantener células madre pluripotentes (e inducir el estado naíve) incluye: factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFpl), y uno o más de los siguientes componentes:
a) IGFII (concentración final en el intervalo 0.1-100 ng/ml);
b) IGF1 [factor de crecimiento similar a la insulina 1 (somatomedina C)] (concentración final en el intervalo 0.1-100 ng/ml); c) SCF (concentración final en el intervalo 0.1-100 ng/ml);
d) inhibidor de señalización por BMP [los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: LDN193189 (AXON 1509 -concentración final 0.01-20 microM), K02288 (Axon 2189; concentración final 0.1-20 microM), hidrocloruro de dorsomorfina (AXON 2150 concentración final 0.1-20 microM);
e) inhibidores de señalización por NOTCH [los ejemplos incluyen, pero no se limitan a los siguientes inhibidores de gamma secretasa: DAPT (Axon Medchem 1484 - concentración final 0.05-50 microM), hidrocloruro de LY2886721 (Axon Medchem 1964 - concentración final 0.05-50 microM)], DBZ (Axon Medchem - Axon 1488-concentración final 0.05-50 microM);
f) inhibidores de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH) [los ejemplos incluyen, pero no se limitan a los siguientes: GANT61 (SigmaAldrich - concentración final 0.05-50 microM), RU-SKI 43 (Axon Medchem - Axon 2035 -concentración final 0.05-50 microM)];
g) inhibidores de ERK5 (BIX02189 Axon 1809; concentración final en el intervalo 0.1-100 microM);
h) inhibidor de ROCK [Y27632 (AXON 1683) - final 0.05-100 microM];
i) inhibidor de la señalización por FGF: Ejemplos no limitantes de inhibidores de FGFR incluyen PD173074 y SU5401; y
j) inhibidor de la ruta de TGF: Ejemplos no limitantes de inhibidores de TGFR incluyen SB431542 y compuesto molécula pequeña A 83-01 (Como se usa en el presente documento el término " inhibidor de TGFR (o TGFRi)" se refiere a una molécula capaz de inhibir la expresión y/o el nivel de actividad de TGFR determinado por ALK4, 5 y 7 fosforilados).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo de la descripción se define por una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y 7-17 como se describe en las tablas 3-5 en la sección de ejemplos a continuación.
S e g ú n a lg u n o s a s p e c to s d e la d e s c r ip c ió n , e l m e d io d e c u lt iv o c o m p re n d e a d e m á s un in h ib id o r d e M B D 3.
Como se usa en el presente documento el término "MBD3" se refiere a la proteína 3 con dominio de unión a metil-CpG definida por el n° de acceso en GenBank NP_003917.1 (SEQ ID NO: 7) que tiene la actividad funcional corepresora y de remodelación de la cromatina.
Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor de MBD3" se refiere a cualquier agente (p. ej., una molécula) capaz de regular por disminución el nivel de expresión y/o actividad de MBD3, y/o capaz de interferir entre la interacción de MBD3 con OCT4 y/o MBD3 con SOX2, y/o MBD3 y KLF4 y/o MBD3 y C-Myc, y/o inhibir la unión de MBD3 al remodelador de nucleosoma y desacetilasa (NuRD). La regulación por disminución de MBD3 se puede hacer a nivel genómico y/o de transcrito usando una variedad de moléculas que interfieren con la transcripción y/o traducción [(p. ej., agentes silenciadores de ARN (p. ej., antiparalelo, ARNip, ARNhc, micro-ARN), ribozima y DNAzima], o en el nivel de proteína usando p. ej. un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo neutralizante), un antagonista, p. ej., moléculas pequeñas que inhiben la actividad de MBD3 o la capacidad de interaccionar directamente con cualquiera de los factores de reprogramación (Oct4, Sox2, Klf4 o c-Myc), enzimas que escinden el polipéptido y similares.
Los ejemplos no limitantes de inhibidores de MBD3 incluyen ARNip dirigido contra ARNm de MBD3, tales como los proporcionados por Invitrogen, mBD3HSS147581(3 _RNAI) (Invitrogen): AGGUCAAGGGCAAGCCCGACCUGAA (SEQ ID NO: 52); y MBD3HSS147581(3_RNAI) (Invitrogen): UUCAGGUCGGGCUUGCCCUUGACCU (SEQ ID NO:53). Otro ARNip adecuado dirigido contra el ARNm de Mb D3 que se puede usar son los ARNip Stealth de MBD3 que incluyen los componentes HSS147580 y HSS147581 (Life Technologies™, número de catálogo 1299001) que se encontró que eran eficaces para reducir la expresión de MBD3 en células humanas.
Según algunos aspectos de la descripción, la inhibición de la unión de Mbd3 al complejo NuRD se realiza usando un inhibidor de la proteína helicasa con cromodominio de unión a ADN 4 (CHD4).
Los ejemplos no limitantes de inhibidores de CHD4 incluyen el ARNip de CHD4 humano, tal como el ARNip Stealth de CHD4 HSS101850 disponible de Life Technologies™, que se encontró que reduce la expresión eficazmente de CHD4 en células humanas.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, la inhibición de la unión de Mbd3 al complejo NuRD se realiza usando un dominio superenrollado alfa P66 (P66a-CC).
El péptido de P66a-CC (SEQ ID NO: 114) se puede añadir al medio tal como está, o se puede expresar de manera recombinante a partir de un vector que codifica la secuencia de P66a-CC (p. ej., un vector que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 113).
Según algunos aspectos de la descripción, la inhibición de la expresión de Mbd3 se realiza usando un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC) (p. ej., usando los agentes y moléculas como se ha descrito anteriormente).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un agente que aumenta la expresión de ERAS endógeno y/o un ERAS recombinante.
Según algunos aspectos de la descripción, el inhibidor de MBD3 se proporciona en una cantidad suficiente para regular por disminución el nivel de expresión del ARN de MBD3 y/o proteína en la célula, en al menos aproximadamente 30%, p. ej., al menos aproximadamente 35%, p. ej., al menos aproximadamente 40%, p. ej., al menos aproximadamente 45%, p. ej., al menos aproximadamente 50%, p. ej., al menos aproximadamente 55%, p. ej., al menos aproximadamente 60%, p. ej., al menos aproximadamente 65%, p. ej., al menos aproximadamente 70%, p. ej., al menos aproximadamente 75%, p. ej., al menos aproximadamente 80% en comparación con el nivel de expresión del ARN de MBD3 y/o proteína, respectivamente, en la misma célula cuando se incuban y/o cultivan en las mismas (p. ej., idénticas) condiciones aunque sin el inhibidor de MBD3.
Según algunos aspectos de la descripción, el inhibidor de MBD3 se proporciona en una cantidad suficiente para regular por disminución el nivel de expresión del ARN de MBD3 y/o proteína en la célula en aproximadamente 30-90%, p. ej., aproximadamente 30-85%, p. ej., aproximadamente 40-85%, p. ej., aproximadamente 50-85%, p. ej., aproximadamente 60-85%, p. ej., aproximadamente 70-85%, p. ej., aproximadamente 80-85%, p. ej., aproximadamente 85% en comparación con el nivel de expresión del ARN de MBD3 y/o proteína, respectivamente, en la misma célula cuando se incuban y/o cultivan en las mismas (p. ej., idénticas) condiciones aunque sin el inhibidor de MBD3.
El nivel de expresión de MBD3 en la célula se puede determinar por diversos métodos tales como la PCR con transcripción inversa en tiempo real, transferencia Western y similares. Un ejemplo no limitante para dicho ensayo se proporciona en la sección de ejemplos que sigue, y en las figuras 1I-J, que demuestran aproximadamente 85% de inhibición del nivel de proteína MBD3 en células transformadas con la construcción MBD3flox/'.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo carece de suero, p. ej. carece de cualquier suero animal.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo carece de cualquier contaminante animal, es decir, células, fluidos o patógenos animales (p. ej., virus que infectan células animales), p. ej., es xeno-exento (Xeno-free.) Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo carece de suero derivado humano.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un reemplazo de suero (es decir, un sustituto de suero) tal como el reemplazo de suero KNOCKOUT™ (Gibco-Invitrogen Corporation, Grand Island, NY EE.UU.), ALBUMAX®II (Gibco®; Life Technologies - Invitrogen, n° de catálogo 11021-029; albúmina de suero bovino rica en lípidos para cultivo celular) o un concentrado lipídico químicamente definido (Gibco®; Invitrogen, Life Technologies - Invitrogen, n° de catálogo 11905-031).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además complemento N2 (Gibco®; Life Technologies - Invitrogen, n° de catálogo 17502-048) un complemento exento de suero, químicamente definido. Para 500 ml de medio de cultivo se pueden añadir 5 ml de la mezcla N2 (Invitrogen).
Alternativamente, se pueden añadir los siguientes materiales (sustitutos del complemento N2) a un medio de cultivo de 500 ml: se añaden insulina recombinante (Sigma 1-1882) en una concentración final de 12.5 microg/ml (pg/ml); Apo-Transferrina (Sigma T-1147) en una concentración final de 500 pg/ml; progesterona (Sigma-P8783) en una concentración final de 0.02 pg/ml; putrescina (Sigma- P5780) en una concentración final de 16 pg/ml; y 5 microL (pl) de solución madre de selenito sódico 3 mM (Sigma - S5261) por 500 ml de medio de cultivo (p. ej., el WIS-NHSM).
Según algunos aspectos de la descripción, el reemplazo de suero KNOCKOUT™ se proporciona en una concentración de al menos 0.5%, p. ej., en el intervalo de aproximadamente 0.5%-25%, p. ej., aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20% o aproximadamente 25%.
Según algunos aspectos de la descripción, el ALBUMAX™ se proporciona en una concentración de al menos 0.01%, p. ej., en el intervalo de aproximadamente 0.01 %-10%, p. ej., aproximadamente 0.1%, aproximadamente 0.2%, aproximadamente 0.3%, aproximadamente 0.4%, aproximadamente 0.5%, aproximadamente 0.6%, aproximadamente 0.7%, aproximadamente 0.8%, aproximadamente 0.9%, aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, aproximadamente 6%, aproximadamente 7%, aproximadamente 8%, aproximadamente 9% o aproximadamente 10%, p. ej., 1%.
Según algunos aspectos de la descripción, el concentrado de lípidos definido se proporciona en una concentración de al menos aproximadamente 0.1%, p. ej., en el intervalo de 0.1-5%, p. ej., aproximadamente 0.2%, aproximadamente 0.3%, aproximadamente 0.4%, aproximadamente 0.5%, aproximadamente 0.6%, aproximadamente 0.7%, aproximadamente 0.8%, aproximadamente 0.9%, aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 4%, aproximadamente 5%, p. ej., 1%.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende el complemento N2 (p. ej., 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) y el concentrado de lípidos definido (5 ml de concentrado de lípidos definido por 500 ml de medio).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende el complemento N2 (p. ej., 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) y ALBUMAX®II (p. ej., Albumax®II al 1%; Gibco®; Life Technologies - Invitrogen).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo puede incluir además antibióticos (p. ej., pen-estrep), L-glutamina, NEAA (aminoácidos no esenciales).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende KO-DMEM con complemento N2 (p. ej., aproximadamente 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) con aproximadamente 5 ml de concentrado de lípidos definido por 500 ml de medio, LIF (aproximadamente 20 ng/ml), bFGF (aproximadamente 8 ng/ml), TGFpl (aproximadamente 1 ng/ml), ERK1/2i (aproximadamente 1 pM de PD0325901), GSK3bi (CHIR99021, aproximadamente 3 pM), p38i (SB203580, aproximadamente 5 pM), y JNKi (SP600125, aproximadamente 5-10 pM).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende KO-DMEM con complemento N2 (p. ej., aproximadamente 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) con aproximadamente Albumax®II al 1-2%, LIF (aproximadamente 20 ng/ml), bFGF (aproximadamente 8 ng/ml), TGFpl (aproximadamente 1 ng/ml), ERK1/2Í (aproximadamente 1 pM de PD0325901), GSK3bi (CHIR99021, aproximadamente 3 pM), p38i (SB203580, aproximadamente 5 pM), y JNKi (SP600125, aproximadamente 5- 10 pM).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende KO-DMEM con complemento N2 (p. ej., aproximadamente 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) con aproximadamente 15% de KnockOut SR (Gibco), LIF (aproximadamente 20 ng/ml), bFGF (aproximadamente 8 ng/ml), TGFpl (aproximadamente 1 ng/ml), ERK1/2i (aproximadamente 1 pM de PD0325901), GSK3bi (CHIR99021, aproximadamente 3 pM), p38i (SB203580, aproximadamente 5 pM), JNKi (SP600125, aproximadamente 5-10 pM).
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un cultivo celular que comprende células y el medio de cultivo de algunos aspectos de la descripción.
Según algunos aspectos de la descripción, las células pueden ser cualquier célula, p. ej., células procariotas y eucariotas, p. ej., células de primarte, p. ej., células de mamífero, p. ej., células humanas.
Según algunos aspectos de la descripción, las células pueden ser células somáticas, células madre, células madre pluripotentes cebadas y/o células madre pluripotentes naif.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo es capaz de mantener la célula madre pluripotente naif en un estado indiferenciado durante al menos 2 pases, p. ej., durante al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 pases.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para generar una célula madre pluripotente (PSC) naif, que comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que permitan la generación de la PSC naif a partir de la PSC no naif, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos de un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo no metilado del gen XIST, generando así la PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC es una PSC de primate (p. ej., mamífero, p. ej., ser humano). Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden el medio de cultivo de algunos aspectos de la descripción.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden el crecimiento de las células en presencia de 1-20% de oxígeno (O2) y 5% de CO2.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden hipoxia. Se pueden inducir condiciones hipóxicas (hipoxia) en presencia de menos de 10% de O2 (oxígeno) en el entorno de crecimiento.
El entorno de crecimiento (p. ej., incubadora de cultivo de tejidos) puede incluir aproximadamente 37°C, 5% de CO2 e hipoxia (menos de 10% de O2 en el aire).
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3p, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un activador de STAT3 y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento transformante beta 1 (TG Fpl), un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC), un inhibidor de ROCK y un inhibidor de NOTCH.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3p, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un activador de STAT3 y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC), un inhibidor de ROCK y un inhibidor de NOTCH.
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 se selecciona del grupo que consiste en LIF, IL6 y EGF. Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 se selecciona del grupo que consiste en LIF y IL6. Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 es LIF.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que además comprende al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), un inhibidor de la señalización por la proteína morfogenética ósea (BMP), un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH), un inhibidor de ERK5, forskolina, Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo que además comprende al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH), un inhibidor de ERK5, forskolina, Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF, y en donde el al menos un agente comprende el inhibidor de PKC.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo además comprende inhibidor de FGFR.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo además comprende inhibidor de TGFR.
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF y en donde el al menos un agente comprende el TGFpl y el inhibidor de la proteína quinasa C.
S e g ú n a lg u n o s a s p e c to s d e la d e s c r ip c ió n , e l m e d io d e c u lt iv o a d e m á s c o m p re n d e un in h ib id o r d e F G F R .
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF, y en donde el al menos un agente comprende el bFGF y el TGFpl.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo además comprende un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo además comprende un inhibidor de la proteína quinasa C. Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF y en donde el al menos un agente comprende el bFGF, el inhibidor de ROCK, un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), el inhibidor de NOTCH, y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFR).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo además comprende un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH).
Según algunos aspectos de la descripción, el activador de STAT3 comprende el LIF y en donde el al menos un agente comprende el inhibidor de NOTCH, y un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR). Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un agente seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), factor de células madre (SCF) y factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFpl).
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende LIF, un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, y un inhibidor de la proteína quinasa C.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo además comprende un inhibidor de FGFR (FGFRi). Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo además comprende un inhibidor de TGFR (TGFRi). Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende LIF, un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, y un inhibidor de la proteína quinasa C, comprende además un inhibidor de FGFR (FGFRi).
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende LIF, un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, y un inhibidor de la proteína quinasa C, comprende además un TGFRi.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende LIF, un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, y un inhibidor de la proteína quinasa C, comprende además un inhibidor de FGFR y un TGFRi.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende LIF, un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, TGFpl y un inhibidor de la proteína quinasa C.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende LIF, un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, TGFpl y un inhibidor de la proteína quinasa C, que además comprende inhibidor de FGFR (FGFRi).
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende LIF, un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, bFGF y TG Fpl.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, y un inhibidor de la proteína quinasa C.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un inhibidor de FGFR.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un inhibidor de TGFR.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, TGFpl y un inhibidor de la proteína quinasa C.
S e g ú n a lg u n o s a s p e c to s d e la d e s c r ip c ió n , e l m e d io c o m p re n d e a d e m á s in h ib id o r d e F G F R .
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento transformante beta-1 (TG Fpl). Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un inhibidor de la proteína quinasa C. Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un factor seleccionado del grupo que consiste en: proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), IGF1, forskolina, inhibidor de FGFR, TGFR inhibidor Kenpaullona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un ácido ascórbico.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un ácido oleico.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un ácido linoleico.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo carece de suero animal (p. ej., carece de suero bovino, suero de ratón, siendo xeno-exento, carece de contaminantes animales).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además reemplazo de suero.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de MBD3.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento transformante beta-1 (TG Fpl). Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además un inhibidor de MBD3.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC no naif se selecciona del grupo que consiste en una PSC cebada, un blastocisto, una célula madre pluripotente inducida (una iPSC cebada) y una célula somática.
Debe observarse que cuando la PSC no naif es una PSC cebada (p. ej., un blastocisto, una célula madre embrionaria, una célula germinal embrionaria o una célula madre pluripotente inducida) no hay necesidad de expresión exógena de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, ni de la adición de los factores Oct4, Sox2, Klf4 y/o c-Myc aislados al medio.
Según algunos aspectos de la descripción, cuando la PSC no naif es una PSC cebada, un blastocisto o una célula madre pluripotente inducida (una iPSC cebada), el medio no incluye los factores Oct4, Sox2, Klf4 y/o c-Myc.
Según algunos aspectos de la descripción, cuando la PSC no naif es una PSC cebada, un blastocisto o una célula madre pluripotente inducida (una iPSC cebada), las células no se modifican genéticamente para expresar los factores Oct4, Sox2, Klf4 y/o c-Myc.
Según algunos aspectos de la descripción, cuando la PSC no naif comprende una célula somática, entonces el método comprende además someter la célula somática a condiciones de desdiferenciación, para obtener así una célula madre pluripotente inducida.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones de desdiferenciación comprenden expresar de forma exógena dentro de la célula somática al menos dos factores de crecimiento seleccionados del grupo que consiste en OCT4 [n° de acceso en GenBank NP_002692.2 (SEQ ID NO: 54) y NM_002701.4 (SEQ ID NO: 55)], SOX2 [n° de acceso en GenBank NP_003097.1 (SEQ ID NO: 56) y NM_003106.3 (SEQ ID NO: 57)], KLF4 [n° de acceso en GenBank NP_004226.3 (SEQ ID NO: 58) y NM_004235.4 (SEQ ID NO: 59)] y c-Myc [n° de acceso en GenBank NP_002458.2 (SEQ ID NO: 60) y NM_002467.4 (SEQ ID NO: 61)].
Como se usa en el presente documento, la frase "expresión exógena" se refiere a expresar una secuencia de ácido nucleico heteróloga que no se puede expresar naturalmente dentro de la célula o cuya sobreexpresión en la célula se desea. El polinucleótido exógeno se puede introducir en la célula de una manera estable o transitoria, para así producir una molécula de ácido ribonucleico (ARN) y/o una molécula de polipéptido. Debe indicarse que el polinucleótido exógeno puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o parcialmente homóloga a una secuencia de ácido nucleico endógena de la célula.
El término "endógeno", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier polinucleótido o polipéptido que esté presente y/o sea expresado naturalmente dentro de la célula.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones de desdiferenciación comprenden la expresión dentro de la célula somática de Klf4 y Oct4.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones de desdiferenciación comprenden la expresión dentro de la célula somática de Oct4, Sox2 y Klf4.
Según algunos aspectos de la descripción, las condiciones de desdiferenciación comprenden la expresión dentro de la célula somática de Oct4, Klf4 y cMyc.
Según algunos aspectos de la descripción, la expresión de los factores de crecimiento se realiza usando la transfección de ADN de los factores de crecimiento.
Los métodos de transfecciones de ADN en células de mamíferos se conocen en la técnica e incluyen los descritos, por ejemplo en la Figura 1a y en la Referencia (Mansour et al. 2012). Se proporciona en lo sucesivo una descripción adicional de la preparación de vectores de expresión y modos de administrarlos en células.
Según algunos aspectos de la descripción, la expresión de los factores de crecimiento se realiza usando transfección de ARN de los factores de crecimiento.
Los métodos de transfecciones de ARN en células de mamíferos se conocen en la técnica e incluyen los descritos, por ejemplo en (Warren et al. 2010).
Una vez obtenidas, las células se cultivan en un medio y se someten a pases seriados.
Debe observarse que cultivar la PSC naif implica reemplazar el medio de cultivo con un medio "de nueva aportación" (de composición idéntica) cada 24-48 horas y pasar cada plato de cultivo (p. ej., una placa) a 2 o 3 platos de cultivo (p. ej., placas) cada 3-5 días. Por lo tanto, cuando las células en el cultivo alcanzan aproximadamente 60-90% de confluencia, el líquido sobrenadante se descarta, las placas de cultivo se lavan [(p. ej., con solución salina tamponada con fosfato (PBS)] y las células se someten a disociación enzimática de la placa de cultivo, (p. ej., usando tripsinización (0.25% o 0.05% de Try sin EDTA), p. ej., hasta que las células individuales o los grupos de células se separen entre sí.
Debe observarse que las condiciones de cultivo descubiertas por los autores de la presente invención permiten el mantenimiento de las PSC humanas tales como iPSC humanas en el estado de PSC naif sin necesidad de una expresión exógena adicional de los factores Oct4, Sox2, Klf4 y/o c-Myc. Esto contrasta fuertemente con todos los intentos anteriores de generar PSC humanas naif que requerían la expresión exógena de los factores Oct4, Sox2, Klf4 y/o c-Myc, y que tras restablecer estos factores las PSC naif se diferenciaban espontáneamente y no se podían mantener en las células madre indiferenciadas y pluripotentes (véase, p. ej., Hanna J, 2010b).
Según algunos aspectos de la descripción, la expresión exógena de los factores de crecimiento se efectúa durante un tiempo limitado, tal como durante no más de 10 días en cultivo, p. ej., durante no más de 1 pase.
Según algunos aspectos de la descripción, una vez que las iPSC naif se generan a partir de las células somáticas, se cultivan más en el medio de cultivo de algunos aspectos de la descripción (p. ej., el medio WIS-NHSM) sin expresión exógena de los factores Oct4, Sox2, Klf4 y/o c-Myc por las iPSC naif, y sin adición de los factores Oct4, Sox2, Klf4 y/o c-Myc aislados al medio de cultivo.
Como se usa en el presente documento, la frase "factores ... aislados" se refiere a factores que se expresan de manera recombinante a partir de un vector de expresión en una célula hospedante (p. ej., una bacteria), se sintetizan bioquímicamente o se aíslan de una muestra biológica (p. ej., suero o células).
El método de algunos aspectos de la descripción se puede usar para mejorar la generación de iPSC a partir de células somáticas en comparación con la generación de iPSC a partir de células somáticas usando la expresión de los factores Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc en células somáticas sin inhibición adicional de la expresión de Mbd3.
Por ejemplo, cuando se usan células somáticas humanas, el método se realiza usando un medio que comprende factor inhibidor de leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFpl) y un inhibidor de MBD3, y opcionalmente también un inhibidor de ROCK. Cuando las células somáticas se someten a desdiferenciación usando transfección de ADN de los factores de crecimiento (p. ej., al menos dos de Oct4, Sox2, Klf4 c-Myc), entonces el método da como resultado al menos aproximadamente 30%, p. ej., al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, p. ej., al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, p. ej., al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, p. ej., al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, p. ej., 100% más iPSC en comparación con el rendimiento de las iPSC obtenidas cuando los Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc se expresan usando transfección de ADN en la célula somática sin inhibición adicional de la expresión de Mbd3.
Por ejemplo, cuando se usan células somáticas humanas, el método se realiza usando un medio que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFpl), y un inhibidor de MBD3, y opcionalmente también un inhibidor de ROCK. Cuando las células somáticas se someten a desdiferenciación usando transfección de ARN de los factores de crecimiento (p. ej., al menos dos de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc), entonces el método da como resultado al menos aproximadamente 5%, p. ej., al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, p. ej., al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, p. ej., al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, p. ej., al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 99%, p. ej., 100% más iPSC en comparación con el rendimiento de las iPSC obtenidas cuando los Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc se expresan usando transfección de ADN en la célula somática sin inhibición adicional de la expresión de Mbd3.
Además, mientras que los métodos de la técnica anterior (sin inhibición de MBD3 y sin el medio de algunos aspectos de la presente descripción) emplean 10-20 rondas de transfección de ARN con el fin de lograr la desdiferenciación de las células somáticas humanas, el método de algunos aspectos de la descripción emplea 1-4 rondas de transfección de ARN con el fin de lograr la desdiferenciación de las células somáticas humanas y, por lo tanto, es mucho más eficiente y requiere más tiempo.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para generar una célula madre pluripotente (PSC) naif, que comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que permiten la generación de las PSC naif a partir de las PSC no naif, comprendiendo la PSC naif:
un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilado, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos del gen XIST no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
y/o
un nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) caracterizado por una relación de la expresión del núcleo al citoplasma que es igual a o mayor que 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.
en donde las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEM, complemento N2 (Gibco), concentrado de lípidos definido (Gibco) o Albumax I (Invitrogen), LIF, bFGF, TG Fpl, inhibidor de ERK1/2, inhibidor de GSK3b, inhibidor de p38, e inhibidor de JNK y un inhibidor de la proteína quinasa C,
generando así la PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además inhibidor de FGFR.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además inhibidor de TGFR.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para generar una célula madre pluripotente naif (PSC), que comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que permiten la generación de la PSC naif a partir de la PSC no naif, comprendiendo la PSC naif:
un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilado, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos del gen XIST no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
y/o
un nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) caracterizado por una relación de la expresión del núcleo al citoplasma que es igual a o mayor que 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.
en donde las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEM, complemento N2 (Gibco), concentrado de lípidos definido (Gibco) o Albumax I (Invitrogen), LIF, bFGF, TGFpl, inhibidor de ERK1/2, inhibidor de GSK3b, inhibidor de p38, e inhibidor de JNK y un inhibidor de la proteína quinasa C,
generando así la PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo comprende además inhibidor de FGFR.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para generar una célula madre pluripotente (PSC) naif, que comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que permiten la generación de la PSC naif a partir de la PSC no naif, comprendiendo la PSC naif:
un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilado, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos del gen XIST no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
y/o
un nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) caracterizado por una relación de la expresión del núcleo al citoplasma que es igual a o mayor que 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.
en donde las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEM, complemento N2 (Gibco), concentrado de lípidos definido (Gibco) o Albumax I (Invitrogen), LIF, bFGF, TG Fpl, inhibidor de ERK1/2, inhibidor de GSK3b, inhibidor de p38, e inhibidor de JNK,
generando así la PSC naif.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para generar una célula madre pluripotente (PSC) naif, que comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que permiten la generación de la PSC naif a partir de la PSC no naif, comprendiendo la PSC naif:
un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilado, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos del gen XIST no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
y/o
un nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) caracterizado por una relación de la expresión del núcleo al citoplasma que es igual a o mayor que 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.
en donde las condiciones comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEM, complemento N2 (Gibco), concentrado de lípidos definido (Gibco), LIF, bFGF, TGFpl, inhibidor de ERK1/2, inhibidor de GSK3b, inhibidor de p38, inhibidor de JNK, y un inhibidor de MBD3,
generando así la PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, el método de generar una célula madre pluripotente (PSC) naif comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEm con complemento N2 (p. ej., aproximadamente 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) con aproximadamente 5 ml de concentrado de lípidos definido por 500 ml de medio, LIF (aproximadamente 20 ng/ml), bFGF (aproximadamente 8 ng/ml), TGFpl (aproximadamente 1 ng/ml), ERK1/2i (aproximadamente 1 |jM de PD0325901), GSK3bi (CHIR99021, aproximadamente 3 jiM), p38i (SB203580, aproximadamente 5 jiM), y JNKi (SP600125, aproximadamente 5-10 jiM), en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos de un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
generando así la PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, el método de generar una célula madre pluripotente (PSC) naif comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEM con complemento N2 (p. ej., aproximadamente 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) con aproximadamente 1-2% de Albumax®II, LIF (aproximadamente 20 ng/ml), bFGF (aproximadamente 8 ng/ml), TGFpl (aproximadamente 1 ng/ml), ERK1/2i (aproximadamente 1 jiM de PD0325901), GSK3bi (CHIR99021, aproximadamente 3 jiM), p38i (SB203580, aproximadamente 5 jiM), y JNKi (SP600125, aproximadamente 5-10 jiM), en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos de un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
generando así la PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, el método de generar una célula madre pluripotente (PSC) naif comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEM con complemento N2 (p. ej., 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) con aproximadamente 15% de KnockOut SR (Gibco), LIF (aproximadamente 20 ng/ml), bFGF (aproximadamente 8 ng/ml), TGFp1 (aproximadamente 1 ng/ml), ERK1/2i (aproximadamente 1 pM de PD0325901), GSK3bi (CHIR99021, aproximadamente 3 pM), p38i (SB203580, aproximadamente 5 pM), JNKi (SP600125, aproximadamente 5-10 pM), en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos de un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
generando así la PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, el método de generar una célula madre pluripotente (PSC) naif comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEm con complemento N2 (p. ej., aproximadamente 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) con aproximadamente 5 ml de concentrado de lípidos definido por 500 ml de medio, LIF (aproximadamente 20 ng/ml), bFGF (aproximadamente 8 ng/ml), TGFp1 (aproximadamente 1 ng/ml), ERK1/2Í (aproximadamente 1 pM de PD0325901), GSK3bi (CHIR99021, aproximadamente 3 pM), p38i (SB203580, aproximadamente 5 pM), JNKi (SP600125, aproximadamente 5-10 pM) y un inhibidor de MBD3, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos de un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
generando así la PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, el método de generar una célula madre pluripotente (PSC) naif comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEM con complemento N2 (p. ej., aproximadamente 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) con aproximadamente 1-2% de Albumax®II, LIF (aproximadamente 20 ng/ml), bFGF (aproximadamente 8 ng/ml), TGFpl (aproximadamente 1 ng/ml), ERK1/2i (aproximadamente 1 pM de PD0325901), GSK3bi (CHIR99021, aproximadamente 3 pM), p38i (SB203580, aproximadamente 5 pM), JNKi (SP600125, aproximadamente 5-10 pM), y un inhibidor de MBD3, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos de un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
generando así la PSC naif.
Según algunos aspectos de la descripción, el método de generar una célula madre pluripotente (PSC) naif comprende incubar una célula PSC no naif en condiciones que comprenden un medio de cultivo que comprende KO-DMEM con complemento N2 (p. ej., aproximadamente 5 ml de N2 por 500 ml de medio de cultivo) con aproximadamente 15% de KnockOut SR (Gibco), LIF (aproximadamente 20 ng/ml), bFGF (aproximadamente 8 ng/ml), TGFp1 (aproximadamente 1 ng/ml), ERK1/2i (aproximadamente 1 pM de PD0325901), GSK3bi (CHIR99021, aproximadamente 3 pM), p38i (SB203580, aproximadamente 5 pM), JNKi (SP600125, aproximadamente 5-10 pM), y un inhibidor de MBD3, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos de un gen de transcrito específico del X inactivo (XIST) no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
generando así la PSC naif.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para mejorar la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de una célula somática, que comprende:
(a) expresar dentro de la célula somática al menos dos factores de crecimiento seleccionados del grupo que consiste en Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc y
(b) inhibir la expresión de Mbd3 en la célula somática y/o inhibir la unión de Mbd3 al complejo de remodelación del nucleosoma y desacetilasa (NuRD) en la célula somática,
mejorando así la generación de iPSC a partir de una célula somática.
Según algunos aspectos de la descripción, la inhibición de la unión de Mbd3 al complejo NuRD se realiza usando un inhibidor de la proteína helicasa con cromodominio de unión a ADN 4 (CHD4).
Según algunos aspectos de la descripción, la inhibición de la unión de Mbd3 al complejo NuRD se realiza usando un dominio superenrollado P66 alfa.
Según algunos aspectos de la descripción, la inhibición de la expresión de Mbd3 se realiza usando un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC).
Como se describe en el Ejemplo 15 de la sección de Ejemplos que sigue, los autores de la presente invención han descubierto que la sobreexpresión de ERAS o la activación de ERAS humano endógeno en células madre pluripotentes se puede usar para inducir un estado naif en células madre pluripotentes.
Según algunos aspectos de la descripción, el método comprende además expresar de manera exógena la secuencia codificante de Ras expresada en células ES (ERAS) (p. ej., SEQ ID NO: 109) o activar la expresión endógena de ERAS en la célula somática.
Según algunos aspectos de la descripción, la activación de la expresión endógena de ERAS se realiza eliminando los sitios de poliadenilación prematura del gen ERAS endógeno (SEQ ID NO: 108), p. ej., en las secuencias recuadradas A-1, A2 o A-3 en la Figura 3 de Kameda et al. Stem Cells 2005; 23: 1535-1540.
Según algunos aspectos de la descripción, la expresión se lleva a cabo durante al menos 48 horas de manera que la inhibición de Mbd3 se realiza hasta 10-30% de un nivel de Mbd3 antes de la expresión.
Según algunos aspectos de la descripción, la expresión se lleva a cabo durante aproximadamente 48 horas y la inhibición se realiza después de aproximadamente 48 horas.
Debe observarse que cuando la inhibición de Mbd3 se lleva a cabo después de 48 horas, la inhibición puede ser de 100% del nivel de expresión de la actividad de MBD3.
Según algunos aspectos de la descripción, en donde cuando la iPSC es una iPSC humana, el método comprende además:
(c) cultivar la iPSC humana en un medio de cultivo que comprende LIF, un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de P38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFpl).
Según algunos aspectos de la descripción, el paso (c) se lleva a cabo después de aproximadamente 48 horas del comienzo de la expresión como se indica en la etapa (a).
Según algunos aspectos de la descripción, el medio comprende además un inhibidor de ROCK.
Según algunos aspectos de la descripción, la expresión se lleva a cabo usando transfección de ADN de los factores de crecimiento.
Según algunos aspectos de la descripción, la expresión se lleva a cabo usando transfección de ARN de los factores de crecimiento.
Según algunos aspectos de la descripción, la expresión se lleva a cabo usando la transfección de proteínas de los factores de crecimiento.
Debe observarse que la transfección de proteínas en células y núcleos celulares se puede llevar a cabo como describen Hongyan Zhou, Shili Wu, et al. "Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins". Cell Stem Cell - 5 de junio de 2009, vol. 4, Número 6, pág. 581; esencialmente conjugando péptidos señal que dirigen los factores recombinantes al interior de la célula o núcleo celular.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona una célula madre pluripotente naif aislada que se puede obtener por el método de algunos aspectos de la descripción.
Según algunos aspectos de la descripción, la célula madre pluripotente naif comprende:
un gen de transcrito específico inactivo de X (XIST) no metilado, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos del gen XIST no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
y/o
un nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) caracterizado por una relación de expresión del núcleo al citoplasma que es igual a o mayor que 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para generar células diferenciadas, que comprende someter las células madre pluripotentes naif generadas según el método de algunos aspectos de la descripción, a condiciones de diferenciación, generando así las células diferenciadas.
Según algunos aspectos de la descripción, las PSC naif de algunos aspectos de la descripción se pueden usar para aislar células específicas de linaje.
Como se usa en el presente documento, la frase "aislar células específicas de linaje" se refiere al enriquecimiento de una población mixta de células en un cultivo con células que presentan predominantemente al menos una característica asociada con un fenotipo de linaje específico. Se apreciará que todos los linajes celulares derivan de las tres capas germinales embrionarias. Por lo tanto, por ejemplo, los hepatocitos y las células pancreáticas derivan del endodermo embrionario, los tejidos conectivos óseos, cartilaginosos, elásticos, fibrosos, fibras, células miocárdicas, células de la médula ósea, células vasculares (en concreto, células endoteliales y del músculo liso) y las células hematopoyéticas se diferencian a partir del mesodermo embrionario y las células neurales, de la retina y epidérmicas derivan del ectodermo embrionario.
Las células específicas de linaje se pueden obtener induciendo directamente las PSC naif indiferenciadas, expandidas, en condiciones de cultivo adecuadas para la diferenciación de linajes celulares específicos.
A continuación se da una descripción no limitante de una serie de procedimientos y enfoques para inducir la diferenciación de EB en células específicas de linaje.
Células precursoras neurales
Para diferenciar los EB de algunos aspectos de la descripción en precursores neurales, se cultivan EB de cuatro días de edad durante 5-12 días en placas de cultivo de tejidos que incluyen medio DMEM/F-12 con insulina 5 mg/ml, transferrina 50 mg/ml, cloruro de selenio 30 nM y fibronectina 5 mg/ml (su medio, Okabe, S. et al., 1996, Mech. Dev.
59: 89-102). Los precursores neurales resultantes se pueden trasplantar más para generar células neurales in vivo (Bristle, O. et al., 1997. "In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 14809-14814). Se apreciará que antes de su trasplante, los precursores neurales se tripsinizan y trituran en suspensiones unicelulares en presencia de DNasa al 0.1%.
Oligodendrocitos y células mielínicas
Los EB de algunos aspectos de la descripción se pueden diferenciar en oligodendrocitos y células mielínicas cultivando las células en medio SATO modificado, es decir, DMEM con albúmina de suero bovino (BSA), piruvato, progesterona, putrescina, tiroxina, triyodotironina, insulina, transferrina, selenito de sodio, aminoácidos, neurotrofina 3, factor neurotrófico ciliar y Hepes (Bottenstein, J. E. y Sato, G. H., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 514-517; Raff, M. C., Miller, R. H. y Noble, M., 1983, Nature 303: 390-396]. Brevemente, los EB se disocian usando tripsina al 0.25%/EDTA (5 min a 37°C) y se trituran en suspensiones de células individuales. Las células suspendidas se siembran en matraces que contienen medio SATO complementado con suero equino al 5% y suero de ternero fetal (FCS) al 5%. Después de 4 días en cultivo, los matraces se agitan suavemente para suspender las células que se adhieren débilmente (principalmente oligodendrocitos), mientras que los astrocitos permanecen adheridos a los matraces y producen más medio acondicionado. Los oligodendrocitos primarios se transfieren a nuevos matraces que contienen medio SATO durante dos días adicionales. Después de un total de 6 días en cultivo, las oligoesferas se disocian parcialmente y se resuspenden en medio SATO para el trasplante celular, o se disocian completamente y se siembran en placas en un medio acondicionado de oligoesferas que se obtiene de la etapa previa de agitación [Liu, S. et al., (2000). "Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6126-6131].
Mastocitos
Para la diferenciación en mastocitos, los EB de dos semanas de edad de algunos aspectos de la descripción se transfieren a placas de cultivo de tejidos que incluyen medio DMEM complementado con FCS al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 mg/ml, medio acondicionado con células WEHI-3 al 20% (v/v) y factor de células madre de rata recombinante 50 ng/ml (rrSCF, Tsai, M. et al., 2000. "In vivo immunological function of mast cells derived from embryonic stem cells: An approach for the rapid analysis of even embryonic lethal mutations in adult mice in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 97: 9186-9190). Los cultivos se expanden semanalmente transfiriendo las células a nuevos matraces y reemplazando la mitad del medio de cultivo.
Células hematolinfoides
Para generar células hematolinfoides a partir de los EB de algunos aspectos de la descripción, se transfieren EB de 2-3 días a placas de cultivo permeables a gases en presencia de 7.5% de CO2 y 5% de O2 usando una incubadora con contenido de oxígeno ajustable.
Después de 15 días de diferenciación, las células se recogen y disocian por digestión suave con colagenasa (0.1 unidades/mg) y dispasa (0.8 unidades/mg), ambas disponibles de F. Hoffman-La Roche Ltd, Basilea, Suiza. Las células positivas para CD45 se aíslan usando el anticuerpo monoclonal anti-CD45 (mAb) M1/9.3.4.HL.2 y microperlas paramagnéticas (Miltenyi) conjugadas con anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina de rata como se describe en Potocnik, A.J. et al., (Immunology Hemato-lymphoid in vivo reconstitution potential of subpopulations derived from in vitro differentiated embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, 94: 10295-10300). Las células positivas para CD45 aisladas se pueden enriquecer más usando un solo pase por una columna MACS (Miltenyi).
Se apreciará que puesto que los EB son estructuras complejas, la diferenciación de EB en células, tejido u órgano diferenciados específicos puede requerir el aislamiento de células específicas de linaje de los EB.
Dicho aislamiento se puede realizar por separación de las células de los EB por un separador de células activado por fluorescencia (FACS) o por la separación mecánica de células, tejidos y/o estructuras similares a tejidos contenidos dentro de los EB.
Los métodos para aislar células diferenciadas derivadas de EB por análisis de FACS son conocidos en la técnica. De acuerdo con un método, los EB se desagregan usando una solución de tripsina y EDTA (al 0.025% y 0.01%, respectivamente), se lavan con suero bovino fetal (FBS) al 5% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incuban durante 30 min en hielo con anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos contra antígenos de la superficie celular característicos de un linaje celular específico. Por ejemplo, las células endoteliales se aíslan uniendo un anticuerpo dirigido contra la molécula de adhesión a células endoteliales y plaquetas 1 (PECAM1) tal como los anticuerpos para PECAM1 marcados con fluorescencia (30884X) disponibles de PharMingen (PharMingen, Becton Dickinson Bio Sciences, San Jose, CA, EE.UU.) como se describe en Levenberg, S. et al., ("Endothelial cells derived from human embryonic stem cells". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99: 4391-4396). Las células hematopoyéticas se aíslan usando anticuerpos marcados con fluorescencia tales como CD34-FITC, CD45-PE, CD31-PE, CD38-PE, CD90-FITC, CD117-PE, CD15-FITC, clase I-FITC, todos los cuales IgG1 están disponibles de PharMingen, CD133/1-PE (IgG1) (disponible de Miltenyi Biotec, Auburn, CA), y glicoforina A-PE (IgG1), disponible de Immunotech (Miami, FL). Las células vivas (es decir, sin fijación) se analizan en un FACScan (Becton Dickinson Bio Sciences) usando yoduro de propidio para excluir las células muertas con el software PC-LYSIS o CELLQUEST. Se apreciará que las células aisladas se pueden enriquecer además usando anticuerpos secundarios marcados de forma magnética y columnas de separación magnética (MACS, Miltenyi) como describen Kaufman, D.S. et al., ("Hematopoietic colonyforming cells derived from human embryonic stem cells". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98: 10716-10721).
Un ejemplo de aislamiento mecánico de cardiomiocitos que laten de los EB se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N° 20030022367 de Xu et al. Brevemente, los EB de cuatro días de edad de algunos aspectos de la descripción se transfieren a placas recubiertas de gelatina o portaobjetos de cámara y se deja que se unan y se diferencien. Las células que se contraen espontáneamente, que se observan desde el día 8 de diferenciación, se separan mecánicamente y se recogen en un tubo de 15 ml que contiene medio con bajo contenido en calcio o PBS. Las células se disocian usando digestión con colagenasa B durante 60-120 minutos a 37°C, dependiendo de la actividad de la colagenasa. Después, las células disociadas se resuspenden en un medio KB de diferenciación (KCl 85 mM, K2HPO4 30 mM, MgSO45 mM, EGTA 1 mM, creatina 5 mM, glucosa 20 mM, Na2ATP 2 mM, piruvato 5 mM y taurina 20 mM, tamponado a pH 7.2, Maltsev et al., Circ. Res. 75: 233, 1994) y se incuban a 37°C durante 15-30 min. Después de la disociación, las células se siembran en portaobjetos de cámara y se cultivan en el medio de diferenciación para generar cardiomiocitos individuales capaces de latir.
Se apreciará que las condiciones de cultivo adecuadas para la diferenciación y expansión de las células específicas de linaje aisladas incluyen varios medios de cultivo de tejidos, factores de crecimiento, antibióticos, aminoácidos y similares y está dentro de la habilidad de un experto en la técnica determinar qué condiciones deben aplicarse para expandir y diferenciar tipos de células y/o linajes celulares particulares [revisado en Fijnvandraat AC, et al., Cardiovasc Res. 2003; 58: 303-12; Sachinidis A, et al., Cardiovasc Res. 2003; 58: 278-91; Stavridis MP y Smith AG, 2003; Biochem Soc Trans. 31(Parte 1): 45-9].
Además de los cultivos primarios específicos del linaje, los EB de la descripción se pueden usar para generar líneas celulares específicas del linaje que son capaces de expansión ilimitada en cultivo.
Las líneas celulares de algunos aspectos de la descripción se pueden producir inmortalizando las células derivadas de EB por métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, expresión de un gen de telomerasa en las células (Wei, W. et al., 2003. Mol Cell Biol. 23: 2859-2870) o cocultivar las células con células productoras retrovirales NIH 3T3 hph-HOX11 (Hawley, R.G. et al., 1994. Oncogene 9: 1-12).
Los siguientes son ejemplos no limitantes de condiciones de cultivo que son adecuadas para diferenciar y/o expandir células específicas de linaje a partir de las PSC naif de algunos aspectos de la descripción. Debe observarse que para inducir diferenciación de las PSC naif en células diferenciadas, el medio que se usó para mantener las células en el estado pluripotente e indiferenciado naif debe reemplazarse por el medio de diferenciación adecuado.
Las células estromales mesenquimales que son CD73-positivas y SSEA-4-negativas se pueden generar a partir de PSC naif aumentando mecánicamente la fracción de células diferenciadas de tipo fibroblasto formadas en cultivos de hPSC naif, esencialmente como se describe en Trivedi P y Hematti P. Exp Hematol .2008, 36(3):350-9. Brevemente, para inducir la diferenciación de hESC, los intervalos entre cambios de medio se aumentan a 3-5 días, y las células en la periferia de las colonias de PSC naif se convierten en células fusiformes con apariencia de fibroblastos. Después de 9-10 días en estas condiciones, cuando aproximadamente el 40-50% de las células en el cultivo adquieren la apariencia de fibroblastos, las porciones indiferenciadas de las colonias de PSC naif se retiran físicamente y las células diferenciadas que quedan se pasan a nuevas placas de cultivo en las mismas condiciones.
Para inducir la diferenciación de hPSC naif en neuronas dopaminérgicas (DA), las células se pueden cocultivar con las líneas de células estromales de ratón PA6 o MS5, o se pueden cultivar con una combinación de factor derivado de células estromales 1 (SDF-1/CXCL12), pleiotrofina (PTN), factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2) y efrina B1 (EFNB1) esencialmente como se describe en Vazin T, et al., PLoS One. 12 de agosto de 2009; 4(8): e6606; y en Elkabetz Y. et al., Genes Dev. 15 de enero de 2008; 22: 152-165.
Para generar neuronas de dopamina mesencefálica (mesDA), las hPSC naif se pueden modificar genéticamente para expresar el factor de transcripción Lmx1a (p. ej., usando un vector lentiviral con el promotor PGK y Lmx1a) esencialmente como se describe en Friling S., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2009, 106: 7613-7618.
Para generar epitelio pulmonar (neumocitos de tipo II) a partir de hPSC naif, los PSC naif se pueden cultivar en presencia de un medio de cultivo celular disponible en el mercado (Small Airway Growth Medium; Cambrex, College Park, MD), o alternativamente, en presencia de un medio acondicionado recogido de una línea celular de neumocitos (p. ej., la línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano A549) como se describe en Rippon HJ., et al., Proc Am Thorac Soc. 2008; 5: 717-722.
Para inducir la diferenciación de células hPSC naif en células neurales, las células madre pluripotentes se pueden cultivar durante aproximadamente 5 días en presencia de un medio de reemplazo de suero complementado con inhibidor de TGF-b (SB431542, Tocris; p. ej., 10 nM) y Noggin (R&D; p. ej., 500 ng/ml), después de lo cual las células se cultivan con cantidades crecientes (p. ej., 25%, 50%, 75%, cambiado cada dos días) de medio N2 (Li XJ., et al., Nat Biotechnol. 2005, 23: 215-21) en presencia de Noggin 500 ng/ml, esencialmente como se describe en Chambers SM., Et al., Nat Biotechnol. 2009, 27: 275-280.
La descripción, según algunos de sus aspectos, contempla el uso de células, tejidos y órganos generados a partir de las células madre pluripotentes naif de la descripción usando cualquier protocolo de diferenciación conocido en la técnica.
Se apreciará que, puesto que las células o líneas celulares específicas de linaje obtenidas de acuerdo con las enseñanzas de algunos aspectos de la descripción se desarrollan por procesos de diferenciación similares a los que ocurren naturalmente en el embrión humano, se pueden usar además para terapia basada en células humanas y regeneración de tejidos.
Por lo tanto, la descripción según algunos de sus aspectos, contempla el uso de células o líneas celulares específicas de linaje expandidas y/o diferenciadas de algunos aspectos de la descripción para tratar un trastorno que requiere terapia de reemplazo celular.
Por ejemplo, las enfermedades que actualmente se espera que se puedan tratar por trasplante terapéutico de PSC o células derivadas de PSC incluyen la enfermedad de Parkinson, infartos cardíacos, diabetes mellitus de inicio juvenil y leucemia (Gearhart J. Science 1998, 282: 1061; Rossant y Nagy, Nature Biotech. 1999, 17:23).
Por ejemplo, los precursores de oligodendrocitos se pueden usar para tratar los trastornos de la mielina ("Repair of myelin disease: Strategies and progress in animal models". Molecular Medicine Today. 1997. pág. 554-561), se pueden usar condrocitos o células mesenquimales en el tratamiento de defectos óseos y cartilaginosos (Patente de EE.UU. N° 4642 120) y las células del linaje epitelial se pueden usar en la regeneración de la piel de una herida o quemadura (Patente de EE.UU. N° 5716411).
Para ciertos trastornos, tales como lo trastornos genéticos en los que falta un producto génico específico [p. ej., falta del producto del gen CFTR en pacientes con fibrosis quística (Davies JC, 2002. "New therapeutic approaches for cystic fibrosis lung disease". J. R. Soc. Med. 95 Supl. 41:58-67)], las células derivadas de PSC se manipulan preferiblemente para sobreexpresar el gen mutado antes de su administración al individuo. Se apreciará que para otros trastornos, las células derivadas de PSC se deben manipular para excluir ciertos genes.
La sobreexpresión o exclusión de genes se puede realizar usando construcciones de inserción y/o inactivación [véase, p. ej., Fukushige, S. e Ikeda, J. E.: "Trapping of mammalian promoters by Cre-lox site-specific recombination". DNA Res 3 (1996) 73-50; Bedell, M. A., Jerkins, N. A. y Copeland, N. G.: "Mouse models of human disease. Part I: Techniques and resources for genetic analysis in mice". Genes and Development 11 (1997) 1-11; Bermingham, J. J., Scherer, S. S., O'Connell, S., Arroyo, E., Kalla, K. A., Poweil, F. L. y Rosenfeld, M. G.: "Tst-1/Oct-6/SCIP regulates a unique step in peripheral myelination and is required for normal respiration". Genes Dev 10 (1996) 1751-62].
Además de la terapia de reemplazo celular, las células específicas de linaje de algunos aspectos de la descripción también se pueden usar para preparar una biblioteca de ADNc. El ARNm se prepara por técnicas convencionales a partir de células específicas de linaje y después se realiza la transcripción inversa para formar ADNc. La preparación de ADNc puede sustraerse con nucleótidos de fibroblastos embrionarios y otras células de especificidad no deseada, para producir una biblioteca de ADNc sustraída por técnicas conocidas en la técnica.
Las células específicas del linaje de algunos aspectos de la descripción se pueden usar para cribar factores (tales como fármacos moléculas pequeñas, péptidos, polinucleótidos y similares) o condiciones (tales como condiciones de cultivo o manipulación) que afectan a la diferenciación del precursor del linaje en células terminalmente diferenciadas. Por ejemplo, las sustancias que afectan el crecimiento, toxinas o factores de diferenciación potenciales pueden ensayar por adición de los mismos al medio de cultivo.
De acuerdo con un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para generar una célula germinal primordial, que comprende cultivar células madre pluripotentes naif de primates en un medio de cultivo seleccionado capaz de inducir células madre pluripotentes naif de primates en célula germinal primordial, en donde el medio de cultivo comprende un inhibidor de la quinasa Rho (ROCK) y la proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), generando así la célula germinal primordial.
Según algunos aspectos de la descripción, la célula madre pluripotente naif de primates comprende:
un gen de transcrito específico del X inactivo no metilado (XIST), en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces la PSC femenina naif tiene dos alelos del gen XIST no metilados; y
(ii) cuando la PSC naif es una PSC masculina, entonces la PSC masculina naif tiene un alelo del gen XIST no metilado,
y/o
un nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) caracterizado por una relación de expresión del núcleo al citoplasma que es igual a o mayor que 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.
Según algunos aspectos de la descripción, la célula germinal primordial se caracteriza por un patrón de expresión positivo para CD61 (intergrina beta 3).
Según algunos aspectos de la descripción, la célula germinal primordial se caracteriza por el patrón de expresión (firma de expresión) CD61+/ SSEA4+.
Según algunos aspectos de la descripción, el medio de cultivo seleccionado capaz de inducir las células madre pluripotentes naif de primates en células germinales primordiales comprende además al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de células madre (SCF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF).
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona una población aislada de células germinales primordiales de primates que comprenden células germinales primordiales de primates generadas de acuerdo con el método de algunos aspectos de la descripción.
Según algunos aspectos de la descripción, la población aislada de células germinales primordiales de primate que comprende al menos aproximadamente 50%, p. ej., al menos aproximadamente 60%, p. ej., al menos aproximadamente 70%, p. ej., al menos aproximadamente 80%, p. ej., en al menos aproximadamente 90%, p. ej., al menos aproximadamente 95%, p. ej., al menos aproximadamente 99%, p. ej., 100% de las células germinales primordiales caracterizadas por el patrón de expresión CD61+/ SSEA4+.
Debe observarse que las células germinales primordiales aisladas (PGC) de algunos aspectos de la descripción se pueden inyectar en testículos u ovarios humanos adultos para completar su maduración y generar espermatozoides u óvulos.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para tratar a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar las células germinales primordiales de algunos aspectos de la descripción a un tejido gonadal del sujeto, tratando así al sujeto que lo necesita.
El término "sujeto" se refiere a un mamífero, p. ej., un primate, preferiblemente un ser humano de cualquier edad que padece la patología.
El término "tratar" se refiere a inhibir, prevenir o detener el desarrollo de una patología (enfermedad, trastorno o afección) y/o producir la reducción, remisión o regresión de una patología. Los expertos en la técnica entenderán que se pueden usar diversas metodologías y ensayos para evaluar el desarrollo de una patología y, de forma similar, se pueden usar diversas metodologías y ensayos para evaluar la reducción, remisión o regresión de una patología.
Según algunos aspectos de la descripción, el sujeto padece infertilidad.
Según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un kit que comprende las células germinales primordiales de primates de algunos aspectos de la descripción y un medicamento para tratar la infertilidad.
El kit también puede incluir tampones y conservantes adecuados para mejorar la vida en anaquel del kit.
El kit puede incluir instrucciones de uso adecuadas y etiquetas que indiquen la aprobación de la FDA para uso en el tratamiento de un sujeto, tal como el tratamiento de la infertilidad en el sujeto.
Como se muestra en las Figuras 26A-C, 108A-C y 109A-E y se describe en el Ejemplo 8 de la sección de Ejemplos que sigue, los autores de la presente invención fueron capaces de usar la PSC naif aislada de algunos aspectos de la descripción para generar un organismo humano-ratón quimérico, y contribuir al desarrollo del embrión de ratón in vivo (Gafni et al. Nature 2013; 12 dic.; 504 (7479): 282-6. doi: 10.1038/nature12745. Epub 30 oct. 2013). Por tanto, 24 horas y más tarde después de la administración de las PSC humanas, las células inyectadas eran viables en los embriones de ratón en desarrollo temprano. Estos resultados indican que las células naif humanas cultivadas en el medio de algunos aspectos de la descripción (p. ej., condiciones WIS-NHSM) pueden contribuir a organismos quiméricos de especies cruzadas.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para generar un animal quimérico. El método comprende introducir la PSC naif de primate (p. ej., humana) aislada de algunos aspectos de la descripción, o las células germinales primordiales de algunos aspectos de la descripción en un embrión de pre-implantación de un animal hospedante, generando así el animal quimérico.
Según algunos aspectos de la descripción, el método comprende además permitir que el animal quimérico crezca in vivo o ex vivo.
Obsérvese que puesto que las células madre pluripotentes naif aisladas o las células germinales primordiales se introducen en el embrión de pre-implantación, es probable que formen un embrión normal.
Como se usa en el presente documento, la frase "animal quimérico" se refiere a un animal que comprende células de al menos dos individuos genéticamente distintos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "embrión pre-implantación" se refiere a un embrión en una etapa de 8 células, embrión en etapa de 16 células, mórula temprana, mórula tardía, blastocisto temprano y/o blastocisto tardío.
Se observa que el animal quimérico puede estar compuesto por células de dos individuos diferentes que pertenecen a dos especies diferentes o a la misma especie.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif aislada o la célula germinal primordial es alogénica para el animal hospedante.
Como se usa en el presente documento, el término "alogénico" se refiere a al menos dos individuos genéticamente diferentes de la misma especie.
Según algunos aspectos de la descripción, la PSC naif aislada o la célula germinal primordial es xenogénica para el animal hospedante.
Como se usa en el presente documento, el término "xenogénico" se refiere a al menos dos individuos de diferentes especies.
Según algunos aspectos de la descripción, el animal hospedante no es humano.
Según algunos aspectos de la descripción, la introducción de las células se lleva a cabo in vivo.
Los métodos de administración de células in vivo en una mórula de un animal son bien conocidos en la técnica, tal como en Gafni O, Weinberger L, Mansour AA, Manor YS, Chomsky E, Ben-Yosef D, Kalma Y, Viukov S, Maza I, Zviran A, Rais Y, Shipony Z, Mukamel Z, Krupalnik V, Zerbib M, Geula S, Caspi I, Schneir D, Shwartz T, Gilad S, Amann-Zalcenstein D, Benjamin S, Amit I, Tanay A, Massarwa R, Novershtern N, Hanna JH. Nature. 12 dic.
2013;504(7479):282-6. doi: 10.1038/nature12745. Epub 30 oct. 2013; y Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cuarta edición. De Richard Behringer; Marina Gertsenstein; Kristina Vintersten Nagy; Andras Nagy.
Según algunos aspectos de la descripción, la introducción de las células se lleva a cabo in vitro o ex vivo mediante inyección directa o agregación con el embrión hospedante en desarrollo.
Según algunos aspectos de la descripción, la mórula comprende al menos 4 células.
Según algunos aspectos de la descripción, la mórula comprende no más de 128 células.
Según algunos aspectos de la descripción, el animal hospedante es un primate, p. ej., un mamífero.
Según algunos aspectos de la descripción, el animal hospedante es ratón.
Según algunos aspectos de la descripción, el animal hospedante es cerdo.
Según algunos aspectos de la descripción, el animal hospedante es mono.
Según algunos aspectos de la descripción, el animal hospedante es chimpancé.
Obsérvese que una vez que se forma el animal quimérico y se deja crecer, las células del animal quimérico se pueden usar para terapia celular. Por ejemplo, las células diferenciadas maduras (p. ej., células madre hematopoyéticas, hepatocitos hepáticos, células beta productoras de insulina) generadas en el animal quimérico basándose en algunos aspectos de la descripción se pueden usar para trasplantes en humanos adultos o para aplicaciones biomédicas.
Por lo tanto, según un aspecto de algunos aspectos de la descripción, se proporciona un método para aislar células diferenciadas, linajes celulares, tejidos u órganos del animal quimérico de algunos aspectos de la descripción.
Los métodos para aislar dichas células diferenciadas, tejidos u órganos son bien conocidos en la técnica y también se describen en lo que antecede.
Por tanto, en caso de que las PSC naif que se usaron para formar el animal quimérico sean células humanas, estas células se pueden aislar además del animal quimérico formado y usar para tratar a un sujeto humano.
De acuerdo con algunos aspectos de la descripción, el método comprende además aislar células o tejidos derivados de ser humano (de origen humano) del animal quimérico.
Los ejemplos no limitantes del uso de dichas células, tejidos u órganos de origen humano incluyen terapia basada en células, reemplazo de tejidos, implantación de órganos o tejidos.
A continuación se da una descripción no limitante de vectores de expresión y modos de administración de los mismos en células que se pueden usar para expresar un polipéptido de interés (p. ej., cualquiera de las proteínas descritas anteriormente, p. ej., OCT4, c-MYC, SOX2, KLF4, LIF, bFGF, TGFpl) en una célula.
Para expresar una proteína exógena en células de mamífero, una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de interés se liga preferiblemente en una construcción de ácido nucleico adecuada para la expresión en células de mamífero. Dicha construcción de ácido nucleico incluye una secuencia promotora para dirigir la transcripción de la secuencia de polinucleótido en la célula de una manera constitutiva o inducible.
La construcción de ácido nucleico (también denominada en el presente documento un "vector de expresión") de algunos aspectos de la descripción incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas, eucariotas o preferiblemente ambos (p. ej., vectores lanzadera). Además, los vectores de clonación típicos también pueden contener una secuencia de inicio de la transcripción y la traducción, terminador de la transcripción y la traducción y una señal de poliadenilación. A modo de ejemplo, dichas construcciones incluirán típicamente una LTR 5', un sitio de unión de ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de síntesis de ADN de segunda cadena y una LTR 3' o una porción de la misma.
La construcción de ácido nucleico de algunos aspectos de la descripción incluye típicamente una secuencia señal para la secreción del péptido de una célula hospedante en la que se pone. Preferiblemente, la secuencia señal para este propósito es una secuencia señal de mamífero o la secuencia señal de las variantes polipeptídicas de algunos aspectos de la descripción.
Los promotores eucariotas contienen típicamente dos tipos de secuencias de reconocimiento, la caja TATA y elementos promotores secuencia arriba. Se cree que la caja TATA, situada 25-30 pares de bases secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción, está implicada en la dirección de la ARN polimerasa para comenzar la síntesis de ARN. Los otros elementos promotores secuencia arriba determinan la velocidad a la que se inicia la transcripción.
Los elementos potenciadores pueden estimular la transcripción hasta 1000 veces a partir de promotores homólogos o heterólogos unidos. Los potenciadores son activos cuando se ponen secuencia abajo o secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción. Muchos elementos potenciadores derivados de virus tienen una amplia gama de hospedantes y son activos en una variedad de tejidos. Por ejemplo, el potenciador del gen temprano de SV40 es adecuado para muchos tipos de células. Otras combinaciones de potenciador/promotor que son adecuadas para algunos aspectos de la descripción incluyen las derivadas del poliomavirus, citomegalovirus humano o murino (CMV), la repetición terminal larga de varios retrovirus tales como el virus de la leucemia murina, el virus del sarcoma de Rous o murino y el VIH. Véase, Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1983.
En la construcción del vector de expresión, el promotor se pone preferiblemente aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción heteróloga a la que está el sitio de inicio de la transcripción en su entorno natural. Sin embargo, como se conoce en la técnica, se puede acomodar alguna variación en esta distancia sin pérdida de la función promotora.
También se pueden añadir secuencias de poliadenilación al vector de expresión con el fin de aumentar la eficacia de la traducción del ARNm. Se requieren dos elementos de secuencia distintos para una poliadenilación precisa y eficaz: secuencias ricas en GU o U situadas secuencia abajo del sitio de poliadenilación y una secuencia altamente conservada de seis nucleótidos, AAUAAA, situada 11-30 nucleótidos secuencia arriba. Las señales de terminación y poliadenilación que son adecuadas para algunos aspectos de la descripción incluyen las derivadas de SV40.
Además de los elementos ya descritos, el vector de expresión de algunos aspectos de la descripción normalmente puede contener otros elementos especializados destinados a aumentar el nivel de expresión de ácidos nucleicos clonados o para facilitar la identificación de células que llevan el ADN recombinante. Por ejemplo, una serie de virus animales contienen secuencias de ADN que promueven la replicación cromosómica adicional del genoma viral en tipos de células permisivas. Los plásmidos que llevan estos replicones virales se replican de forma episomal siempre que los factores adecuados sean proporcionados por genes transportados en el plásmido o con el genoma de la célula hospedante.
El vector puede incluir o no un replicón eucariota. Si está presente un replicón eucariota, entonces el vector es amplificable en células eucariotas usando el marcador seleccionable adecuado. Si el vector no comprende un replicón eucariota, no es posible la amplificación episomal. En cambio, el ADN recombinante se integra en el genoma de la célula modificada, donde el promotor dirige la expresión del ácido nucleico deseado.
El vector de expresión de algunos aspectos de la descripción puede incluir además secuencias de polinucleótidos adicionales que permitan, por ejemplo, la traducción de varias proteínas de un solo ARNm, como un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) y secuencias para la integración genómica del promotor de polipéptido quimérico.
Se apreciará que los elementos individuales comprendidos en el vector de expresión se pueden disponer en una variedad de configuraciones. Por ejemplo, los elementos potenciadores, promotores y similares, e incluso la(s) secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifican una proteína de interés se pueden disponer en una configuración de "cabeza a cola", pueden estar presentes como un complemento invertido, o en configuración complementaria, como una cadena antiparalela. Aunque es más probable que ocurra dicha variedad de configuraciones con elementos no codificantes del vector de expresión, también se prevén configuraciones alternativas de la secuencia codificante dentro del vector de expresión.
Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen, pero no se limitan a pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, que están disponibles en Invitrogen, pCI que está disponible en Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV que están disponibles en Strategene, pTRES que está disponible en Clontech y sus derivados.
También se pueden usar vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas tales como retrovirus. Los vectores SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. Los vectores derivados del virus del papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus Epstein Bar incluyen pHEBO y p2O5. Otros vectores de ejemplo incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, promotor tardío de SV-40, promotor de metalotioneína, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de polihedrina, u otros promotores mostrados eficaces para la expresión en células eucariotas.
Como se ha descrito anteriormente, los virus son agentes infecciosos muy especializados que han evolucionado, en muchos casos, para eludir los mecanismos de defensa del hospedante. Típicamente, los virus infectan y se propagan en tipos de células específicos. La especificidad de dirección de los vectores virales usa su especificidad natural para dirigirse específicamente a tipos de células predeterminados y de ese modo introducir un gen recombinante en la célula infectada. Por tanto, el tipo de vector usado por algunos aspectos de la descripción dependerá del tipo de célula transformada. La capacidad para seleccionar vectores adecuados según el tipo de célula transformada está en la habilidad del experto en la técnica y, por lo tanto, no se proporciona en el presente documento una descripción general de la consideración de selección. Por ejemplo, las células de la médula ósea se pueden dirigir usando el virus de la leucemia de células T humanas tipo I (HTLV-I) y las células renales se pueden dirigir usando el promotor heterólogo presente en el baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) como se describe en Liang CY et al., 2004 (Arch Viro!. 149: 51-60).
Los vectores virales recombinantes son útiles para la expresión de la proteína de interés in vivo, ya que ofrecen ventajas tales como infección lateral y especificidad dirigida. La infección lateral es inherente al ciclo de vida de, por ejemplo, retrovirus y es el proceso por el cual una sola célula infectada produce muchos viriones de progenie que brotan e infectan las células vecinas. El resultado es que se infecta rápidamente una gran área, la mayor parte de la cual no había sido infectada inicialmente por las partículas virales originales. Esto contrasta con la infección de tipo vertical en la que el agente infeccioso se propaga solo a través de la progenie hijas. También se pueden producir vectores virales que no se pueden propagar lateralmente. Esta característica puede ser útil si el propósito deseado es introducir un gen específico en solo un número localizado de células diana.
Se pueden usar varios métodos para introducir el vector de expresión de algunos aspectos de la descripción en células madre. Dichos métodos se describen en general en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véase las patentes de EE.UU. n° 5464764 y 5487992 para métodos de selección positivo-negativo.
La introducción de ácidos nucleicos por infección viral ofrece varias ventajas frente a otros métodos como la lipofección y la electroporación, ya que se puede obtener una mayor eficacia de transfección debido a la naturaleza infecciosa de los virus.
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con construcciones virales o no virales, tales como adenovirus, lentivirus, virus del herpes simple I o virus adenoasociado (AAV) y sistemas basados en lípidos. Los lípidos útiles para la transferencia del gen mediada por lípidos son, por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol [Tonkinson et al., Cáncer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996)]. Las construcciones más preferidas para uso en terapia génica son virus, lo más preferiblemente adenovirus, AAV, lentivirus o retrovirus. Una construcción viral, tal como una construcción retroviral, incluye al menos un promotor/potenciador transcripcional o elemento(s) que definen el locus, u otros elementos que controlan la expresión génica por otros medios, tales como corte y empalme alternativo, exportación de ARN nuclear o modificación postraduccional de mensajero. Dichas construcciones de vectores también incluyen una señal de empaquetamiento, repeticiones terminales largas (LTR) o porciones de las mismas, y sitios de unión del cebador de cadena positiva y negativa adecuados para el virus usado, a menos que ya esté presente en la construcción viral. Además, dicha construcción incluye típicamente una secuencia señal para la secreción del péptido de una célula hospedante en la que se pone. Preferiblemente, la secuencia señal para este propósito es una secuencia señal de mamífero o la secuencia señal de las variantes polipeptídicas de algunos aspectos de la descripción. Opcionalmente, la construcción también puede incluir una señal que dirige la poliadenilación, así como uno o más sitios de restricción y una secuencia de terminación de la traducción. A modo de ejemplo, dichas construcciones incluirán típicamente una LTR 5', un sitio de unión de ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de síntesis de segunda cadena de ADN y una LTR 3' o una porción de la misma. Se pueden usar otros vectores que no sean virales, tales como lípidos catiónicos, polilisina y dendrímeros.
Además de contener los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada, la construcción de expresión de algunos aspectos de la descripción también puede incluir secuencias diseñadas para mejorar la estabilidad, producción, purificación, rendimiento o toxicidad del péptido expresado. Por ejemplo, se puede modificar genéticamente la expresión de una proteína de fusión o una proteína de fusión escindible que comprende el polipéptido de interés de algunos aspectos de la descripción y una proteína heteróloga. Dicha proteína de fusión se puede diseñar de manera que la proteína de fusión se pueda aislar fácilmente por cromatografía de afinidad; p. ej., mediante inmovilización en una columna específica para la proteína heteróloga. Cuando se modifica genéticamente un sitio de escisión entre la proteína de interés y la proteína heteróloga, la proteína de interés se puede liberar de la columna cromatográfica por tratamiento con una enzima o agente adecuado que altere el sitio de escisión [p. ej., ver Booth et al. Alabama. (1988) Immunol. Lett. 19: 65-70; y Gardella et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:15854-15859].
Como se ha mencionado en lo que antecede, se puede usar una variedad de células procariotas o eucariotas como sistemas de expresión en hospedante para expresar los polipéptidos de algunos aspectos de la descripción. Estos incluyen, pero no se limitan a microorganismos, tales como bacterias transformadas con un vector de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o ADN cósmido que contiene la secuencia codificante; levaduras transformada con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen la secuencia codificante; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes, tales como el plásmido Ti, que contienen la secuencia codificante. También se pueden usar sistemas de expresión de mamíferos para expresar los polipéptidos de algunos aspectos de la descripción.
Los ejemplos de construcciones bacterianas incluyen la serie pET de vectores de expresión de E. coli [Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89).
En levaduras, se puede usar una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N°: 5932447. Alternativamente, se pueden usar vectores que promuevan la integración de secuencias de ADN extraño en el cromosoma de levadura.
En los casos en los que se usan vectores de expresión de plantas, la expresión de la secuencia codificante puede ser dirigida por una serie de promotores. Por ejemplo, se pueden usar promotores virales tales como los promotores de ARN 35S y ARN 19S de CaMV [Brisson et al. (1984) Nature 310: 511-514], o el promotor de la proteína de la cubierta del TMV [Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6: 307-311]. Alternativamente, se pueden usar promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO [Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680 y Brogli et al., (1984) Science 224: 838-843] o promotores de choque térmico, p. ej., hsp17.5-E o hsp17.3-B de soja [Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565]. Estas construcciones se pueden introducir en células de plantas usando el plásmido Ti, plásmido Ri, vectores virales de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación y otras técnicas bien conocidas por el experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, págs. 421-463.
Otros sistemas de expresión tales como sistemas de células hospedantes de insectos y de mamíferos que son bien conocidos en la técnica y que se describen con más detalle en lo sucesivo también se pueden usar en algunos aspectos de la descripción.
Las células transformadas se cultivan en condiciones eficaces, que permiten la expresión de grandes cantidades del polipéptido de interés recombinante (p. ej., LIF, TGFpl, bFGF, OCT4, c-myc, SOX2, KLF-4). Después de un tiempo predeterminado en cultivo, se efectúa la recuperación del polipéptido recombinante. La frase "recuperación del polipéptido recombinante" usada en el presente documento se refiere a recoger el medio de fermentación completo que contiene el polipéptido y no implica necesariamente etapas adicionales de separación o purificación.
Por lo tanto, el polipéptido de interés se puede purificar usando una variedad de técnicas convencionales de purificación de proteínas, tales como, pero no limitadas a cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía de concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
El polipéptido de interés se recupera preferiblemente en forma "sustancialmente pura". Como se usa en el presente documento, la frase "sustancialmente pura" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz del polipéptido de interés (p. ej., LIF, TGFpl, bFGF) para mantener las células madre embrionarias humanas en un estado indiferenciado mientras están en cultivo.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%.
Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no se limita a".
La expresión "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".
La expresión "que consiste esencialmente en" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicados.
Como se usa en el presente documento, la forma singular "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo sus mezclas.
A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar varios aspectos de esta descripción en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la descripción. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha descrito específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos específicamente descritos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las frases "intervalo/intervalos entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "en el intervalo de/está en el intervalo de" un primer número indicado "a" un segundo número indicado, se usan indistintamente en el presente documento y pretenden incluir el primer y segundo número indicados y todos los numerales fraccionarios y enteros entre ellos.
Como se usa en el presente documento, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea determinada, que incluye, pero no se limita a aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos que se conocen o se desarrollan fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir el avance de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.
Se aprecia que ciertas características de la descripción, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de aspectos separados, también se pueden proporcionar en combinación en un solo aspecto. A la inversa, varias características de la descripción, que, por brevedad, se describen en el contexto de un solo aspecto, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otro aspecto descrito de la descripción. Ciertas características descritas en el contexto de varios aspectos no deben considerarse características esenciales de esos aspectos, a menos que el aspecto sea inoperante sin esos elementos.
Varios aspectos y aspectos de la presente descripción como se ha indicado en los que antecede y como se reivindica en la sección de reivindicaciones más adelante, encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Se hace ahora referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunos aspectos de la descripción de una manera no limitante.
Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio usados en la presente descripción incluyen técnicas de ADN molecular, bioquímico, microbiológico y recombinante. Dichas técnicas se explican con detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como las expuestas en las patentes de EE.UU. n° 4666828; 4 683202; 4801 531; 5192659 y 5272057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la bibliografía de patentes y científica, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n° 3791 932; 3 839 153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901 654; 3935074; 3984533; 3996345; 4 034074; 4098876; 4879219; 5011 771 y 5281 521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Se proporcionan otras referencias generales a lo largo de este documento. Los procedimientos en el mismo se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan por conveniencia del lector.
Materiales generales y métodos experimentales
Métodos de referencia: líneas de células madre de ratón y cultivo celular - La reprogramación y el mantenimiento de las células pluripotentes naif murinas se llevaron a cabo en un medio basado en N2B27 químicamente definido sin suero: 240 ml de DMEM/F12 (Biological Industries - hecho por encargo), 240 ml de Neurobasal (Invitrogen; 21103), 5 ml de suplemento N2 (Invitrogen; 17502048), 5 ml de suplemento de B27 (Invitrogen; 17504044), reemplazo de suero Knockout al 15% (Invitrogen - 10828), glutamina 1 mM (Invitrogen), aminoácidos no esenciales al 1% (invitrogen), pmercaptoetanol (Sigma) 0.1 mM, penicilina-estreptomicina (Invitrogen), BSA 5 mg/ml (Sigma). Las condiciones naif para las PSC murinas incluían LIF humano recombinante 10 ng/ml (Millipore; LIF1005) (5 pg por 500 ml). Cuando esté indicado inhibidores "2i" se añadieron los siguientes agentes: inhibidores de molécula pequeña CHIR99021 (CH, 3pM - Axon Medchem) y PD0325901 (PD, 1 p M - TOCRIS). El "2i" se añadió 48 horas después de la inducción con Os Km .
Métodos de referencia: El "medio N2B27 cebado" para células murinas (EpiSC) contenía bFGF humano recombinante 8 ng/ml (Peprotech Asia) y activina humana recombinante 20 ng/ml (Peprotech Asia).
Métodos de referencia: Las líneas de células madre y ratones deficientes en Mbd3 y sus líneas de ES derivadas se obtuvieron como se describió previamente (Kaji et al., 2007) (Mbd3flox/flox, Mbd3flox/- y Mbd3+/_) (Kaji et al., 2006). Para el direccionamiento génico adicional de líneas de células madre pluripotentes de ratón (indicador Nanog-GFP, construcciones de rescate pBRY-Mbd3, Rosa26-CreER), se linealizaron 50 pg de ADN de la construcción de direccionamiento y se electroporaron en las líneas celulares pluripotentes indicadas, que después se sometieron a selección con G418 (300 microg/ml) o puromicina (1 microg/ml). Después de 10 días de selección con antibióticos, se analizaron los clones resistentes al fármaco para determinar el direccionamiento correcto por PCR o análisis de transferencia Southern.
Se aparearon machos y hembras Mbd3Utx+/_ para la derivación de ESC en condiciones definidas de 2i/LIF de ratón y se recogieron y explantaron blastocistos E3.5 para la derivación de ESC en condiciones definidas de 2i/LIF de ratón en placas recubiertas con MEF.
NGFP1-Mbd3KD se estableció por infección y subclonación de la línea secundaria de iPSC NGFP1 con un vector de ARNhc pLKO-Tet-On (Addgene) como se ha descrito previamente (Hanna, J. et al. Nature 462, 595-601, 2009). Las ESC de ratón V6.5 que albergan un alelo Oct4 endógeno marcado con Flag (Figura 60C) se generaron por direccionamiento de genes directo como se ha descrito previamente (Tsai, HH, Bourque, G. y Lufkin, T. "In silico tándem affinity purification refines an Oct4 interaction list". Stem cell research Ther. 2: 26, 2011). Los ensayos de detección de micoplasmas se llevan a cabo semanalmente para garantizar la exclusión de cualquier célula contaminada. El genotipado y la validación funcional del agotamiento de Mbd3 se presentan a lo largo del estudio (Ejemplos en las Figuras 1I-J y Figuras 8M-N).
Métodos de referencia: Reversión epigenética de células de epiblasto cebadas de ratón - Se inyectaron células ESC Nanog-GFP V6.5 (Mbd3+/+) naif masculinas (Mansour et al., 2012) mantenidas en condiciones 2i/LIF en blastocistos BDF2 y Epiblasto. Los embriones quiméricos se diseccionaron el día E6.5 y se explantaron en placas recubiertas con gelatina/vitronectina en condiciones de bFGF/activina N2B27 complementadas con 1 pg/ml de puromicina, permitiendo el aislamiento de las EpiSC Nanog-GFP. Para la reversión epigenética de las EpiSC murinas a pluripotencia na'i've, las células se pasaron en condiciones N2B272i/LIF en placas recubiertas con vitronectina (1 pg/ml) y gelatina (0.2%) (sin sobreexpresión de factores de reprogramación exógenos). Cuando el ensayo de reversión epigenética implicaba siembra en placas de células individuales, el medio de crecimiento de EpiSC se complementó con inhibidor de ROCK durante 24 horas antes de tripsinización. Los ARNip (ON-TARGETplus SMARTpools) y el ARNip de control (ON-TARGETplus Non-target pool D-001810-10-05) se adquirieron de Dharmacon. Se usó ARNip 10 nM o control para cada transfección con Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen).
Para los experimentos de derivación de EG (células germinales embrionarias de ratón), se separaron las células Oct4-GFP PGC (células germinales primordiales) de embriones quiméricos diseccionados E8.5 y se cultivaron en placas individuales en medio N2B27 k Sr al 15%, LlF (20 ng/ml)/SCF (10 ng/ml)/bFGF (8 ng/ml) y 2i (complementado 48 horas después). El marcador nuclear mCherry de EpiSC y sus PGC derivadas se usó para permitir calcular la eficacia del cultivo en placa y calcular la eficacia de la reprogramación (% de eficacia de reprogramación = clones Oct4 o Nanog-GFP/clones de mCherry+).
Factores OKSM: Oct4 (SEQ ID NO: proteína 54), Sox2 (SEQ ID NO: proteína 56), c-Myc (SEQ ID NO: proteína 60) y Klf4 (SEQ ID NO: proteína 58).
Métodos de referencia: reprogramación de células somáticas de ratón e infección celular - Los líquidos sobrenadantes que contienen virus de los diferentes virus de reprogramación (vector policistrónico STEMCA-OKSM (SEQ ID NO: 62) (expresión inducible y constitutiva con Dox) (Mansour et al., 2012), vector policistrónico STEMCCA-OKS (expresión inducible y constitutiva con DOX), FUW-tetO-lox-hKLF4, FUW-tetO-lox-hOCT4 y FUW-tetO-lox-hSOX2, FUW-tetO-mKlf4, FUW-tetO-mOct4, FUW-tetO-mSox2, FUW-tetO-c-Myc, FUW-Oct4-2A-Sox2, FUW-Oct4-2A-Klf4, FUW-tetO-lox-SOX2, pMXs-OCT4, pMXs-SOX2, pMXs-KLF4, pMXs-cMYC) se complementaron con el virus FUW-lox-M2rtTA (cuando fuera necesario) y un volumen igual de medio de cultivo de nueva aportación para la infección. Se aislaron fibroblastos de ratón y otros tipos de células somáticas y se separaron células individuales de quimeras reprogramables transgénicas secundarias (Hanna et al., 2009a; Mansour et al., 2012). Se reprogramaron células somáticas de ratón transgénicas secundarias que llevaban el transgén que codifica OSKM inducible con DOX (Hanna et al. Cell 2008, Mansour et al. Nature 2012) aplicando medio de ESC naif de ratón Doxiciclina (DOX) (sin 2i en las primeras 48 horas y luego añadiendo también 2i hasta la finalización del proceso). La reprogramación de iPSC humanas se aplicó por infección lentiviral de células diferenciadas humanas con lentivirus que codificaban OSKM y aplicando condiciones WIS-NHSM empezando 48 horas después de la infección.
Reprogramación de iPSC usando medio de ESC naif de ratón 2i/LIF DOX (1 pg/ml) (sin 2i en las primeras 48 horas) en condiciones de O2 fisiológico al 5%. MEF Mbd3'/' (pero no células pluripotentes) experimentan senescencia acelerada y pérdida de la capacidad de proliferación y, por lo tanto, las células Mbd3'/_ se reprogramaron aplicando tamoxifeno en células Mbd3flox/' después de 48 horas de inducción con OSKM. De manera similar, para la reducción de la expresión aguda de Mbd3 en células somáticas con ARNip de Mbd3 en un intento de reforzar la reprogramación, la transfección se llevó a cabo al menos después de 48 horas de inducción con OSKM. Alternativamente, las células somáticas con expresión hipomórfica (en lugar de ablación completa) de Mbd3 no demuestran defectos de proliferación o senescencia acelerada debido a los niveles de expresión de Mbd3 residuales, pero retienen niveles de Mbd3 suficientemente reducidos que permiten la reprogramación sincronizada determinista por OSKM (Figura 4B). Por lo tanto, los siguientes sistemas se usaron preferible y predominantemente a lo largo de este estudio: contextos genéticos de Mbd3flox/-, NGFP1-Mbd3KD o WIBR3-MBD3flox/flox. En particular, en las condiciones de reprogramación usadas en el presente documento, la siembra en placa de células individuales de MEF produjo aproximadamente 70% de eficacia de supervivencia (con o sin DOX). Por lo tanto, para la obtención de imágenes en vivo, tras sembrar 150 MEF por pocillo, los autores de la presente invención observaron la formación de 100-120 colonias que se siguieron en muestras Mbd3flox/'. Es importante destacar que el mCherry constitutivo permitía controlar la supervivencia después de la siembra en placa para obtener eficacias de reprogramación precisas y no sesgadas (% de eficacia de reprogramación = clones (células) Oct4 o Nanog-GFP/clones (células) mCherry+). Se obtuvieron eficacias de reprogramación equivalentes en células alimentadoras irradiadas de ratón o placas recubiertas de gelatina, matrigel o gelatina/vitronectina. La reprogramación en células MEF DR4 irradiadas se usó preferiblemente para la obtención de imágenes en vivo y experimentos de reprogramación de células individuales con el fin de mejorar la supervivencia y la adherencia celular. La mezcla de ARNip Stealth de Mbd3 que incluye los componentes Ms S-237238, MSS-275658 y MSS-275659 (Invitrogen) y la mezcla de ARNip Stealth de Chd4 que incluye MSS-200894, MSS-200895 y MSS-200896 (Invitrogen) se usaron para la reducción de la expresión eficiente en células de ratón. Las transfecciones se llevaron a cabo con RNAiMAX (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Métodos de referencia: plásmidos de ADN y edición del gen TALEN - Los siguientes vectores de sobreexpresión constitutivos lentivirales y de mamífero se usaron en células somáticas y pluripotentes: pBRY-Mbd3-Ires-Zeocin. Se generaron lentivirus expresados constitutivamente FUW-Mbd2 y FUW-Mbd3 por clonación de insertos en sitios EcoRI del vector FUW para generar expresión constitutiva después de la transducción viral y la integración estable en líneas somáticas o de PSC.
Las mutaciones y deleciones de Flag-Mbd3 se hicieron por PCR con ADN polimerasa Q5 (NEB). Los plásmidos que expresan TALEN se diseñaron con la ayuda de TALEN Targetter 2.0 [talent (punto) cac (punto) cornell (punto) edu /] y se clonaron usando el kit GoldenGate TALEN 2.0 adquirido en Addgene (Bedell, VM, et al. Nature 491: 114 -8, 2012) según el protocolo publicado. Para dirigir G, los autores de la invención han usado repeticiones de tipo NN. La construcción del donante se hizo con fragmentos de ADN amplificados a partir de ADN genómico de ESC humanas WIBR3. Se electroporaron 107 ESC con 30 pg de plásmido donante y 10 pg de cada uno de los plásmidos que expresan TALEN y se cultivaron en presencia de G418 (75 pg/ml) y 0iclovir (1 pM). Se aislaron los clones resistentes y se extrajo el ADN genómico para análisis de transferencia Southern y PCR. Para generar líneas celulares subclonadas de indicador OCT4-GFP, se electroporaron 107 iPSC MBD3+/+ y MBD3flox/- con 30 pg del plásmido donante de inserción OCT4-GFP-2A-PURO previamente descrito (Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 29, 731-734, 2011; amablemente proporcionado por el Prof. Jaenisch a través de Addgene) y 10 pg de cada uno de los plásmidos que expresan TALEN y se cultivaron en presencia de puromicina (0.4 pg/ml). Se aislaron los clones resistentes y se extrajo el ADN genómico para análisis de transferencia Southern y PCR. Se generaron fibroblastos diferenciados in vitro a partir de ESC/iPSC humanas como se ha descrito previamente (Hockemeyer, D. et al. Cell Stem Cell 3, 346-353, 2008).
Reprogramación de células somáticas humanas e infección celular - La reprogramación se llevó a cabo al 5% de pO2 en condiciones complementadas con DOX (1-2 pg/ml): 1) Las primeras 48 horas las células se incubaron en medio de ES humano convencional (hESM - véase más adelante). 2) Después de 48 horas, las células se transfirieron hasta el día 7-8 a condiciones de crecimiento definidas naif denominadas WIS-NHSM (véase más adelante) y se complementaron con ROCKi (concentración final 5 mM). 3) Después de 8 días se retiró DOX y las células se expandieron en condiciones WIS-NHSM. Se usaron ARNip Stealth de MBD3 que incluyen componentes HSS147580, HSS147581 (n° cat. 1299003) para la reducción de la expresión eficaz de MBD3 en células humanas. Las transfecciones se llevaron a cabo con RNAiMAX (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Las condiciones convencionales de ES humanas (hESM) incluyen: 475 ml de KnockOut DMEM (Invitrogen 10829), KSR al 15% (Invitrogen), bFGF recombinante 8 ng/ml (Peprotech) y TGFp1 recombinante 1 ng/ml (Peprotech), glutamina 1 mM (Invitrogen), aminoácidos no esenciales al 1% (Invitrogen), p-mercaptoetanol 0.1 mM (Sigma), penicilina-estreptomicina (Invitrogen).
Se usaron las siguientes condiciones definidas sin suero, denominadas "WIS-NHSM" (medio de células madre humanas naif del Instituto Weizmann de Ciencias) para aislar, generar, derivar y estabilizar células madre pluripotentes humanas naif (PSC y ESC). El medio WIS-Nh Sm se generó incluyendo: 475 ml de KnockOut DMe M (Invitrogen 10829), KSR al 15% (Invitrogen) o 5 g de AlbuMAX (Invitrogen 11020-021), 5 ml de suplemento N2 (Invitrogen 17502048), 10 pg de LIF humano recombinante (Peprotech), bFGF recombinante 8 ng/ml (Peprotech), TGFpl recombinante 1 ng/ml (Peprotech), glutamina 1 mM (Invitrogen), aminoácidos no esenciales al 1% (Invitrogen), pmercaptoetanol 0.1 mM (Sigma), penicilina-estreptomicina (Invitrogen) e inhibidores moléculas pequeñas: PD0325901 (1 pM, ERK1/2i, AXON MEDCHEM); CHIR99021 (3 pM, GSK3pi, AXON MEDCHEM); SB203580 (5 pM, p38i, To CRIS); SP600125 (10 pM, JNKi, TOCRIS). A lo largo del estudio, se cultivaron hESC/hiPSC naif en placas recubiertas con gelatina al 0.2% vitronectina 1 ng/ml durante al menos 1 hora a 37°C. Las células se pasaron por tripsinización de células individuales (Trisina al 0.25% o 0.05% EDTA) cada 3-4 días. Aunque no es esencial, se puede obtener una mayor eficacia de clonación de células individuales con la complementación de WIS-NHSM con el inhibidor de la ruta ROCK Y-27632 (5 pM, ROCKi Axon Medchem) durante 24 horas antes y después del pase celular.
Métodos de referencia: tinción por inmunofluorescencia de embriones pre y post-implantación - Para la preimplantación, se recogieron ovocitos y embriones de una célula de los oviductos de ratones B6D2F1 cebados con hormonas y se cultivaron en KSOM (Millipore) hasta la etapa deseada. La inmunotinción se llevó a cabo como se ha descrito previamente con modificaciones (Silva, J. et al. Cell 138, 722-737, 2009). Brevemente, la zona pelúcida se eliminó usando una solución de Tyrode ácida (Sigma). Los embriones se transfirieron a una placa de vidrio de reloj (Genenet), se fijaron durante 15 minutos en PFA al 4% en tampón de fosfato (PB), se enjuagaron tres veces en PBS que contenía pVp 3 mg/ml, se permeabilizaron en PBS/PVP con tritón X-100 al 1 % durante 30 minutos y se bloquearon en solución de bloqueo (suero de burro normal al 2%, BSA al 0.05%, Tween al 0.01% en PBS) durante 1 hora. Después, los embriones se incubaron durante la noche a 4°C en anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo, se lavaron tres veces en solución de bloqueo durante 15 minutos cada uno, se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente, se contratiñeron con DAPI durante 15 minutos, se lavaron dos veces en PBS y montaron en placas de fondo de vidrio de 96 pocillos para obtener imágenes confocales. Los embriones post­ implantación se fijaron y se insertaron en parafina como se ha descrito anteriormente (Acampora, D., et al. Development. 1997; 124: 3639-50) con modificación. Los embriones de la decidua materna se fijaron en PFA al 4%/PB durante la noche a 4°C, se lavaron 3 veces en PBS durante 30 minutos cada uno, se deshidrataron y se insertaron en parafina usando el procedimiento estándar. Se rehidrataron secciones de parafina embrionarias (5-7 pm), se trataron con recuperación de antígeno, se enjuagaron en PBS, se permeabilizaron en Triton al 0.1%/PBS durante 10 minutos, se enjuagaron en PBT (Tween/PBS al 0.02%) y se bloquearon en solución de bloqueo (suero de burro normal al 5%, BSA al 0.05%, en PBT) durante 1 hora. Después, los portaobjetos se incubaron en los anticuerpos primarios y secundarios adecuados diluidos en solución de bloqueo como se ha descrito anteriormente, y se procesaron como se ha descrito anteriormente (Mansour, AA, et al. Nature 488, 409-413, 2012). Se usaron los siguientes anticuerpos: de ratón anti-Oct4 (1:100, C-10; Santa Cruz SC-5279), de cabra anti-Mbd3 (1:50, C-18; Santa Cruz SC-9402).
Análisis de inmunoprecipitación e inmunotransferencia - Se transfectaron células HEK293T con cada clon de ADNc en un vector de expresión usando jetPEI (transfección Polyplus) y se lisaron 48 horas después en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM a pH 7.4, NaCl 150 mM, Tritón al 1%, NP40 al 0.1% y EDTA 1.5 mM). Se usaron los siguientes plásmidos para transfecciones en diferentes combinaciones: pCaggs-Mbd3, FUW-Oct4, FUW-Klf4, FUW-Sox2, FUW-c-Myc, FUW-Nanog, pCaggs-Flag-Mbd3, pMSCV-Flag-OCT4, pMSCV-Flag-SOX2, pMSCV-Flag-KLF4, pCaggs-Flagc-Myc, pCaggs-Flag-Nanog, pcDNA3.1-Flag-HDAC1 (obtenido a través de Addgene). Se incubaron 30 pl de perlas magnéticas anti-FlagM2 (Sigma) durante 6 horas en fracciones de lisado celular, para el control de IgG se añadieron 6 pg de IgG y 50 pl de Dynabeads de proteína G (Invitrogen) al lisado celular durante 6 horas. Ambas fracciones (antiflag y anti-IgG) se cargaron en un separador magnético Invitrogen y las perlas se lavaron seis veces con tampón de lisis. Las proteínas de unión se eluyeron con 0.5 pg/ml de tampón de péptido X3Flag (Sigma) para las perlas antiflagM2 o hirviéndolas con tampón de muestra y se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS e inmunotransferencia. Los análisis de inmunotransferencia se realizaron usando los siguientes anticuerpos primarios: anti-Flag (clon M2, F3165, Sigma), anti-Mbd3 (A300-258A, Bethyl), anti-Nanog (A300-397A, Bethyl), anti-OcT4 (sc-9081, H134, Santa Cruz), anti-KLF4 (sc20691,H180, Santa Cruz), anti-SOX2 (n° 2748s, Cell Signaling), anti-c-Myc (n° 9402s, Cell Signaling)
Diferenciación del aislamiento de células germinales primordiales (PGC) - Para los experimentos de derivación de EG, se separaron células Oct4-GFP+ de embriones quiméricos diseccionados e 8.5 y se pusieron en placas individualmente en medio N2B272i/LIF/SCF (10 ng/ml)/bFGF (8 ng/ml).
Análisis de RT-PCR - El ARN total se aisló usando el kit RNeasy (Qiagen). Se trataron tres pg de ARN total con DNasa I para eliminar la contaminación potencial del ADN genómico usando un kit de DNA Free RNA (Zymo Research). Se sometió a transcripción inversa 1 pg de ARN tratado con DNasa-I usando un kit de síntesis de primera cadena (Invitrogen) y finalmente se resuspendió en 100 pl de agua. El análisis de PCR cuantitativo se llevó a cabo por triplicado usando 1/50 de la reacción de transcripción inversa en una plataforma Viia7 (Applied Biosystems). Las barras de error indican la desviación estándar de las mediciones por triplicado para cada medición.
Para el análisis de RT-PCR de célula individual, se separaron células individuales de diferentes muestras y se usó el kit Ambion® Single Cell-to-CT™ para el procesamiento de muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron la química basada en la sonda TaqMan y la mezcla maestra de PCR en tiempo real TaqMan en la plataforma Viia7 para la detección de la expresión génica. Se usaron las siguientes sondas TaqMan (Invitrogen): Sall4 Mm00453037_s1, Esrrb Mm00442411_m1, Utf1 Mm00447703_g1; Sox2 (específico de alelo de ratón endógeno) Mm03053810_s1; Nanog Mm02384862_g1; Gapdh Mm99999915_g1. Se usó el punto de corte Ct de 39 ciclos como umbral para definir la detección de la transcripción.
Métodos de referencia: Reducción de la expresión de mbd3 humano por ARNip - Los autores de la presente invención usaron para células humanas el ARNip "Stealth" de Invitrogen, con los siguientes números de catálogo: N° de cat./Lote - 10620318/168750 F02 "MBD3HSS147581" (3_RNAI) para - AGGUCAAGGGCAAGCCCGACCUGAA (SEQ ID NO: 52), y N° de cat./Lote - 10620319/168750 F03 "MBD3HSS147581" (3_RNAI) para -UUCAGGUCGGGCUUGCCCUUGACCU (SEQ ID NO: 53).
Métodos de referencia: Reducción de la expresión de mbd3 de ratón por ARNhc - Para las células de ratón, los autores de la presente invención usaron los sistemas lentiviral pLKO.1 o pLKO-Tet-On con las siguientes secuencias: "TRCN0000039069 F" - CCG GCT AAG TGG ATT GAG TGC CTT TCT CGA GAA AGG CAC TCA ATC CAC TTA GTT TTT G (SEQ ID NO: 63) y la "TRCN0000039069 R" - AAT TCA AAA ACT AAG TGG ATT GAG TGC CTT TCT CGA GAA AGG CAC TCA ATC CAC TTA G (SEQ ID NO: 64); o la "TRCN0000039071 F| - CCG GGC GCT ATG ATT CTT CCA ACC ACT CGA GTG GTT GGA AGA ATC ATA GCG CTT TTT G (SEQ ID NO: 65) y la "TRCN0000039071 R" - AAT TCA AAA AGC GCT ATG ATT CTT CCA ACC ACT CGA GTG GTT GGA AGA ATC ATA GCG C (SEQ ID NO: 66).
Adquisición y análisis de imágenes de microscopía - MEF Mbd3+/+ y Mbd3flox/- inducibles por OKSM secundarios que llevan el indicador de pluripotencia Oct4-GFP y el marcador mCherry nuclear expresado de manera constitutiva, se sembraron en placas de 12 pocillos a bajas densidades (150 células por pocillo) y se generaron imágenes con AxioObserver Z1 (Zeiss) en 5% de O2, 5% de CO2, 37°C en condiciones controladas. Las placas se sacaron los días 3-4 para el reemplazo del medio (pero sin pase/división) y se devolvieron para la etapa automatizada de generación de imágenes en vivo. Se tomaron imágenes en mosaico de pocillos llenos cada 12 horas durante 6 días con un aumento de 5x, que incluye contraste de fase y dos imágenes de longitud de onda fluorescentes. Se desarrolló e implementó un protocolo de segmentación automatizado interno en Matlab para analizar las mediciones de lapso de tiempo en mosaico de pocillos completos con marcadores fluorescentes mCherry y Oct4-GFP.
El desafío en este protocolo era implementar la segmentación rápida de un número desconocido de colonias en imagen en mosaico de 108 píxeles. Las etapas principales del protocolo (como se muestra en las Figuras 40A-E) incluyen: Detección adaptativa: Se borran los bordes de la placa con filtro circular. Se define el umbral de detección usando la mediana con desplazamiento (10% del intervalo_dinámico) y se crea una imagen binaria de los píxeles detectados. Estas etapas se llevaron a cabo por separado para cada punto de tiempo y cada longitud de onda fluorescente.
Reducción de la complejidad: Para esta tarea, los autores de la presente invención aplicaron un filtro morfológico para aislar colonias de mCherry usando un filtro deslizante mediano (60 [pm]*60 [pm]) (Arce, G. R. "Nonlinear Signal Processing: A Statistical Approach" - Gonzalo R. Arce - Google Books, 2005). Este filtro retiene solo colonias densas, borrando el ruido y las células aisladas individuales (un solo núcleo tiene aproximadamente 6 [um]*6[um]), esta etapa es crucial para reducir la dimensión de la tarea de agrupamiento.
Segmentación de colonias: La segmentación se hizo usando el filtro de media móvil (filtro de paso bajo) (60 [um]*60 [um]) (Arce, GR "Nonlinear Signal Processing: A Statistical Approach" - Gonzalo R. Arce - Google Books, 2005) para fusionar fragmentos de colonias adyacentes en colonias conectadas grandes y después aplicar agrupaciones de componentes conectados, marcando objetos conectados usando 8-vecinos conectados.
Extracción de características de colonia: Se extraen las características de cada colonia mCherry, incluyendo el área, la región limitadora y el centroide. Al superponer la segmentación de colonias de mCherry en la imagen binaria de GFP (píxeles detectados), los autores de la presente invención extraen para cada colonia el indicador GFP+ (0/1) y la fracción de píxeles de GFP+ y mCherry+ de todos los píxeles mCherry+.
Este protocolo de segmentación se realizó a lo largo de mosaicos de lapso de tiempo que recogen información sobre la dinámica de formación de colonias, dinámica de colonia GFP+ y proporciones de descendencia de células Oct4-GFP+.
Las características de dinámica de colonias y reprogramación se analizaron estadísticamente usando el programa Matlab, incluyendo la estimación de la distribución acumulativa, la función de densidad y la interpretación gráfica de diagrama de caja (Figs. 42A-E). El análisis de diagrama de caja caracteriza la distribución de la reactivación de Oct4-GFP intracolonia para todas las colonias individuales segmentadas, que representa la distribución de las células iPS descendientes dentro de las colonias segmentadas. Además, se produjeron películas que caracterizan la dinámica del proceso usando un programa de Matlab personalizado. El programa anterior fue validado por una matriz de entrada artificial y por una colección de imágenes en mosaico de ES recogidas. Además, la robustez del umbral de detección y los tamaños de filtros se midieron con diversos parámetros (datos no mostrados).
Preparación de la biblioteca de secuenciación e inmunoprecipitación de cromatina (para los ejemplos 1-4 a continuación) - Se midió la inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación profunda (ChlP-Seq) para las siguientes proteínas: H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac y Mbd3, en 4 puntos de tiempo diferentes durante la reprogramación: 0 (MEF), 4 días, 8 días, iPS. La unión de cada proteína se midió tanto en condiciones Mbd3+/+ y Mbd3flox/', así como en células ES Mbd3'/_. Se midió Oct4 en todas las condiciones anteriores, excluyendo el día 8. Aproximadamente 40*106 células se reticularon en formaldehído (concentración final 1%, 10 minutos a temperatura ambiente (TA)) y después se inactivaron con glicina (5 minutos a TA). Las células fijadas se lisaron en HEPES KOH 50 mM a pH 7.5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10%, NP-40 alternativa al 0.5%, Tritón al 0.25% complementado con inhibidor de proteasa a 4°C (Roche, 04693159001), se centrifugaron a 950xg durante 10 minutos y se resuspendieron en SDS al 0.2%, EDTA 10 mM, NaCl 140 mM y Tris-HCl 10 mM. A continuación, las células se fragmentaron con un Branson Sonifier (modelo S-450D) a -4°C a tamaños en el intervalo entre 200 y 800 pb y se precipitaron por centrifugación. Se preunieron 10 pg de cada anticuerpo incubando con Dynabeads con proteína G (Invitrogen100-07D) en tampón de bloqueo (PBS complementado con TWEEN al 0.5% y BsA al 0.5%) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadieron perlas lavadas al lisado de cromatina y después se incubaron durante la noche. Las muestras se lavaron 5 veces con tampón RIPA, dos veces con tampón RIPA complementado con NaCl 500 mM, dos veces con tampón de LiCl (TE 10 mM, LiCl 250 mM, NP-40 al 0.5%, DOC al 0.5%), una vez con TE (Tris- HCl 10 mM a pH 8.0, EDtA 1 mM) y después se eluyó en SDS al 0.5%, NaCl 300 mM, EDTA 5 mM, Tris Hcl 10 mM a pH 8.0 a 65°C. El eluato se incubó a 65°C durante 8 horas y después se trató secuencialmente con RNasaA (Roche, 11119915001) durante 30 minutos y proteinasa K (NEB, P8102S) durante dos horas. El ADN se purificó con el sistema Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter Genomics, A63881). Se prepararon bibliotecas de muestras de ADN de ChIP invertido cruzado de acuerdo con una versión modificada del protocolo de ADN genómico de Illumina, como se ha descrito anteriormente75 (Blecher-Gonen, R. et al. Nat. Protoc. 2013, 8: 539-54). Brevemente, el ADN de ChIP se ligó a adaptadores de Illumina y se sometió a 14 ciclos de amplificación por PCR. Los productos amplificados entre 200 y 800 pb se purificaron en un gel de agarosa al 2%. Después, se aplicaron aproximadamente 5 picomoles de la biblioteca de ADN a cada carril de la celda de flujo y se secuenciaron en el secuenciador Illumina Hiseq2000 de acuerdo con los protocolos estándar de Illumina. Se usaron los siguientes anticuerpos para los experimentos de cromatina-IP: IgG de control (calidad ChIP, ab46540, Abcam), Anti-Histona H3 tri-metil K4 (calidad ChIP, ab8580, Abcam), Anti-Histona H3 acetil K27 (calidad ChIP, ab4729, Abcam), anti-Histona H3 tri-metil K27 (calidad ChIP, 07­ 449, Millipore), anti-Oct4 (sc5729 (C-10), Santa Cruz), anti-Chd4 (calidad ChIP, ab70469, Abcam). Para la mezcla de anticuerpos 1:1 chip de Mbd3 se usó: anti-Mbd3 (Bethyl Laboratories A302-528\9A) y anti-Mbd3 (ab16057, Abcam).
Alineación y detección de picos - Los autores de la presente invención usaron software Bowtie (Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. y Salzberg, S. L. "Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome". Genome Biol. (2009)) versión 0.12.5 para alinear las lecturas con el genoma de referencia mm9 de ratón (UCSC, julio de 2007). Los autores de la presente invención solo consideraron lecturas que estaban alineadas únicamente con el genoma con hasta un solo apareamiento erróneo, tomando el mejor apareamiento de cada lectura. Los autores de la presente invención identificaron intervalos enriquecidos de H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, Mbd3 y Oct4 usando MACS versión 1.4.1 (Zhang, Y., et al. Genome Biol. 2008, 9(9): R137). Los autores de la presente invención usaron la secuenciación del extracto de células completas como control con el fin de definir un modelo de fondo. Las lecturas duplicadas alineadas con la misma ubicación exacta son excluidas por la configuración predeterminada de MACS. Se hizo el mapeo de genes de intervalos enriquecidos si se superponían con un solo intervalo simétrico de Kb alrededor de sus sitios de inicio de transcripción (tomado de la tabla de genes conocidos de RefSeq en el navegador del genoma UCSC). Los datos de ChIP-seq en muestras de tipo natural eran altamente reproducibles en comparación con publicaciones previas (Sridharan, R., et al. Cell 36 (2): 364-77, 2009; Mikkelsen, T.S. et al. Nature 454, 49-55, 2008) (datos no mostrados).
Detección de motivos (Figura 63) - Los motivos que están enriquecidos en regiones de unión de Mbd3 se detectaron usando la herramienta SeqPos en el paquete Cistrome [cistrome (punto) org/ap/]. Los picos de Mbd3 en MEF, MEF+DOX e iPSC se analizaron frente a la base de datos de motivos curados de Cistrome con un punto de corte del valor p de 0.001.
Perfiles de marcas de histonas (Figuras C-E) - se calcularon usando un script interno. De forma breve, este script genera una matriz de densidades de lectura en intervalos genómicos dados. En este caso, los perfiles de los 29952 genes de Entrez (mm9, tomados de las tablas de genes conocidos de UCSC) se calcularon entre 1 kb secuencia arriba de TSS y TES. Estas densidades de lecturas después se convirtieron en puntuación z normalizando cada posición por
la desviación estándar y media del ruido de muestra
Figure imgf000072_0001
Los parámetros de ruido se estimaron para cada muestra a partir de 6*107 pb aleatorias en todo el genoma. Finalmente, para presentar perfiles alineados, el perfil de puntuación z de cada gen se agrupó (binned) en 20 bins secuencia arriba de TSS y otros 100 cuantiles entre TSS y TES. El valor de cada bin o cuantil se seleccionó para ser el valor máximo dentro de ese intervalo.
En el análisis de distribución de marcas de histonas (Figuras 65A-E y 66A-J) y en la correlación y agrupación de marcas de histonas (Figuras 47A-B y Figuras 48A-C), cada gen y cada marca de histona se representa con la puntuación z máxima medida en el perfil de ese gen, donde los perfiles se calcularon como se ha descrito anteriormente. La agrupación de marcas de histonas se llevó a cabo en vectores concatenados que incluyen todas las marcas para cada gen en tándem.
Análisis de enriquecimiento de anotaciones - Se ensayó en los genes diana de Mbd3 el enriquecimiento de conjuntos de genes funcionales tomados de Gene Ontology [GO, geneontology (punto) org]. Las anotaciones de uniones proteína-ADN se tomaron de diversas publicaciones (Boyer, L. A., et al. Cell. 2005, 122(6): 947-56; Mikkelsen, T. S. et al. Nature 448, 553-560, 2007; Kim, J. et al., Cell 132(6): 1049-61, 2008; Loh, YH. et al. Nat Genet 38, 431-440, 2006). Los valores P de enriquecimiento se calcularon usando la prueba exacta de Fisher (Fisher, S., Genetiker, S., Fisher, RA y Genetician, S. "Statistical methods for research workers", 1970) y se corrigieron para múltiples hipótesis usando el umbral de tasa de descubrimientos falsos (FDR) de 0.0001%.
Adquisición, procesamiento y análisis de datos de expresión genética - Se aisló el ARN total de las líneas celulares indicadas. La concentración de ARN se cuantificó y se sometió a control de calidad en Agilent Bioanalyzer. Se procesaron simultáneamente 250 ng de ARN de cada muestra. El ADNc se fragmentó, marcó e hibridó con Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA), que contiene 35557 sondas. Se usaron matrices de Affymetrix para el análisis de muestras de células humanas. Los niveles de transcritos se procesaron a partir de archivos de imágenes [de los archivos de Affymetrix CEL y el archivo CDF (versión V1.r3, que mapea las sondas en 33 252 conjuntos de sondas)] usando el método RMA (Irizarry, R.A. et al. Biostatistics, 2003, 4: 249-64), que corrige la variación de la muestra no biológica usando la normalización de cuantiles, implementada por el software "Expression Console" de Affymetrix. Los datos se filtraron más para incluir sondas que tienen al menos una detección superior a 64 (= 26), lo que da como resultado 21 811 sondas mapeadas contra 15815 transcritos de RefSeq [ncbi (punto) nlm (punto) nih (punto) gov/RefSeq /]. Los ID de Entrez únicos que usan anotaciones actuales de Affymetrix (archivos de anotaciones de NetAffx versión 33.1) y sitios de NCBI. Las sondas que se dirigen al mismo gen se colapsaron por la mediana, dando como resultado 13894 genes. Los datos de micromatrices están disponibles en la base de datos del Gene Expression Omnibus del Centro Nacional de Información Biotecnológica con los números de acceso de la serie GSE37822, GSE45352 y GSE46872. Datos adicionales de muestras de ESC humanas de matrices Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 previamente descritas que contienen 54675 conjuntos de sondas (GSE21222; (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010) pasaron por el mismo procesamiento descrito previamente, dando como resultado 15571 genes. Después, las dos listas de genes se entrecruzaron en una lista que contenía 12071 genes. El efecto de lote resultante de dos plataformas diferentes se corrigió normalizando cada conjunto de datos respecto a una muestra del mismo genotipo (WIBR3, muestras de referencia excluidas de análisis posteriores), permitiendo que los dos conjuntos de datos se unieran para análisis posteriores. Las muestras se agruparon jerárquicamente usando la unión promedio y la correlación de Spearman o Pearson como una matriz de distancia, como se indicó, con resultados similares. Con el fin de comparar las muestras con células en estadio de masa celular interna (ICM), se incluyeron los datos de preimplantación humanos de Vassena et al. (Vassena, R. et al.
Development 138, 3699-3709, 2011). Estos datos, de las micromatrices de Affymetrix HuGene 1.0 st descritas antes, se pasaron por el mismo procesamiento que el descrito previamente, dando como resultado 16953 genes antes y 12 062 genes después de la intersección con la lista de genes anterior. El efecto de lote se corrigió mediante la normalización de los nuevos datos respecto a los valores medios de sus muestras de ESC. Los genes expresados diferencialmente entre muestras naif y cebadas se encontraron usando la prueba t bilateral para dos muestras, cuyos valores p se corrigieron para hipótesis múltiples usando el umbral de tasa de descubrimientos falsos (FDR) de Benjamini-Hochberg de 0.05, combinado con un umbral de expresión de cambio de dos veces. Se verificó el enriquecimiento funcional de los genes expresados diferencialmente usando la herramienta en línea GOrilla [cbl-gorilla (punto) cs (punto) technion (punto) ac (punto) il/ (Eden, E., et al. BMC Bioinformatics 10, 48, 2009)], con la lista completa de genes usada como contexto. Se usó un umbral de valor p corregido por FDR de 0.05. Para el análisis estadístico de la expresión génica, los autores de la presente invención usaron el software "Cluster" [rana (punto) lbl (punto) gov/EisenSoftware (punto) htm] para analizar agrupaciones jerárquicas en las muestras, usando correlación centrada de uniones completas como métrica de distancia. Los autores de la presente invención usaron Matlab versión R2011a y Versión R2012b y su caja de herramientas de bioinformática para ejecutar el Análisis de componentes principales que detecta los componentes principales con la mayor variación en los datos.
Análisis de expresión de genes - Las sondas se mapearon contra las ID de genes de Entrez y se filtraron adicionalmente para incluir las ID que tienen al menos una detección superior a 32 (= 25), lo que da como resultado 16 620 ID de genes. Para el análisis de la expresión génica, los autores de la presente invención usaron Matlab versión R2011 b. Las firmas de genes expresados diferencialmente entre muestras de MEF (muestras de MEF Mbd3+K, Mbd3f/-, Mbd3'/') y muestras de ES (e S V6.5, ES Mbd3'/', IPS Mbd3f/- e iPS Mbd3+/+) se caracterizaron usando la prueba t para dos muestras y se corrigieron para hipótesis múltiples usando la tasa de descubrimientos falsos (FDR) [Benjamini, Y. y Hochberg, Y. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological), 57: 289-300, 1995]. Las firmas de genes expresados diferencialmente incluyen genes que están por debajo del umbral de FDR de 5%, así como por encima de 4 veces el cambio, dando como resultado 1323 genes. La agrupación de muestras con todos los 16620 genes (Figura 8R y Figuras 45A-B) y con 1323 genes expresados diferencialmente (Figura 7), se hizo de dos formas: (1) Agrupación jerárquica (Sibson, R. SLINK: "An optimally efficient algorithm for the single-link cluster method". The Computer Journal 16, 30-34, 1973) usando la correlación de Spearman como una métrica de distancia y unión promedio. (2) Análisis de componentes principales (PCA) que detecta los componentes principales con la mayor variación en los datos. La progresión de un solo gen en la reprogramación (Figuras 46A-E) se cuantificó usando la siguiente transformación
Figure imgf000073_0001
donde, Xj(t) indica el valor de expresión del gen j en el tiempo t (p. ej. Xj(4d) o Xj(MEF)) y Xj (IPS), Xj (MEF) indica el valor de expresión promedio para las muestras de IPS y MEF, respectivamente. La transformación anterior representa una distancia desde los valores de expresión de MEF (establecidos en 0) hacia los valores de iPS (establecidos en 1), donde los genes cuya expresión cambia hacia (regulando por aumento/disminución) su valor de iPS muestran Xj (t) > 0. La distribución de las veces de cambio de la expresión génica, en relación con MEF, se presenta mediante diagramas de caja (Figuras 36A-J y Figuras 65A-E, 66A-J). La significación de la diferencia de distribución se calculó con la prueba t de muestras emparejadas.
Preparación y análisis de bibliotecas de secuenciación por bisulfito de representación reducida - Se generaron bibliotecas de RRBS como se ha descrito previamente con ligeras modificaciones (Smith, Z. D. et al. Nature 484, 339­ 344, 2012). Brevemente, se aisló el ADN de los sedimentos celulares congelados rápidamente usando el kit QuickgDNA mini prep (Zymo). Después, el ADN aislado se sometió a digestión con MspI (NEB), seguido de reparación del extremo usando mezcla de ADN polimerasa T4 PNK/T4 (NEB), cola A usando el fragmento Klenow (3 '^ 5' exo-) (NEB), selección de tamaño para fragmentos de menos de 500 pb usando perlas SPRI (Beckman Coulter) y ligación en un plásmido usando la a Dn ligasa T4 Quick (NEB). Los plásmidos se trataron con bisulfito de sodio usando el kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo) y el producto se amplificó por PCR usando la ADN polimerasa GoTaq de inicio en caliente (Promega). Se añadió la cola A los productos de la PCR usando el fragmento Klenow, se ligaron a adaptadores Illumina indexados usando ADN ligasa T4 Quick y se amplificaron por PCR usando ADN polimerasa GoTaq. A continuación, las bibliotecas se seleccionaron por tamaño a 200-500 pb por electroforesis en gel extendida usando agarosa NuSieve 3:1 (Lonza) y extracción en gel (Qiagen). Las bibliotecas se combinaron y secuenciaron en un sistema Illumina HiSeq 2500. Las lecturas de secuenciación se alinearon con la construcción de genoma de ratón 37 (mm9) usando Bismark. Los niveles de metilación se calcularon y promediaron solo para los CpG que estaban cubiertos por 5 o más lecturas de secuenciación distintas a lo largo de todas las bibliotecas. El contenido de CpG "experimentado" por cada sitio CpG se definió como el número de dinucleótidos CpG encontrados dentro de una ventana de 500 pb que rodea el sitio dividido por el tamaño de la ventana.
Análisis de modelización numérica
Adquisición de datos para modelización - Los autores de la presente invención midieron las latencias de
reprogramación para múltiples sistemas con el fin de establecer distribuciones acumulativas empíricas para la
dinámica de reprogramación. Las dinámicas de reprogramación de células B (Mbd3+/+) NGFP1 secundarias
monoclonales con o sin alteraciones genéticas adicionales (ARNhc desordenado, sobreexpresión de Nanog
(NanogOE)) se midieron semanalmente usando FACS, como se ha descrito antes (Hanna, J. et al. Nature 462, 595­
601, 2009). Se estableció la línea de iPSC NGFP1-Mbd3KD, y se recogieron células pre-B de animales quiméricos y
se sometieron a reprogramación con DOX. Las mediciones de seguimiento monoclonal se llevaron a cabo mediante
placas de células individuales seguido de detección de Nanog-GFP el día 7 (1 semana). Dado que el seguimiento
monoclonal daba una eficacia de 100% en las células pre-B NGFp1-Mbd3KD, los autores de la presente invención
también llevaron a cabo experimentos de reprogramación policlonal en NGFP1 y NGFP1-Mbd3KD derivados de células
pre-B y midieron Nanog-GFP diariamente por FACS durante los primeros 8-10 días de inducción con OSKM (Figuras
31A-E). Finalmente, las mediciones semanales monoclonales de NGFP1 y las mediciones diarias policlonales de
NGFP1-Mbd3KD establecieron distribuciones de latencia para la dinámica de reprogramación. Estas distribuciones de
latencia se ajustaron a múltiples esquemas de modelización como se indica a continuación.
Implementación del ajuste del modelo- El ajuste para los modelos (detallado a continuación) fue implementado por el
programa Matlab realizando un ajuste de regresión no lineal con el estadístico R2 ajustado. La definición del R2
ajustado es
Figure imgf000074_0001
Aquí, y¡ es el punto de datos de distribución de latencia medido, y¡ es el punto de datos estimado según el modelo
predicho y y es el valor medio de la distribución de latencia medida. Adicionalmente, n indica el número de muestras
tomadas y m indica el número de parámetros del modelo usados para el ajuste del modelo. Algunos de los modelos
también se ajustaron usando un estimador de máxima verosimilitud, como se detallará a continuación.
Ajuste a un modelo de función escalón - En el caso determinista, todas las células se vuelven pluripotentes al mismo
tiempo después de la inducción con DOX. Este comportamiento se aproxima bien por la dinámica de tipo función
escalón. Los autores de la presente invención ajustaron la latencia de reprogramación observada a una función
escalón, donde el tiempo de transición determinista se estimó optimizando el estadístico R2 ajustado. El ajuste se hizo
en Matlab mediante regresión no lineal (Figuras 35A-C).
Ajuste al modelo gaussiano - Con el fin de estimar la variabilidad observada en las medidas de latencia de
reprogramación, se usó el ajuste a la distribución gaussiana y se calculó la media, la varianza y el coeficiente de
variación (CV = std/media) para cada muestra (Mbd3+/+ y Mbd3KD) (Figuras 56A-F, Figuras 57A-D). El ajuste se hizo
en Matlab usando tanto regresión no lineal como estimaciones de máxima verosimilitud.
Ajuste al modelo de movimiento browniano - Los cambios biológicos (p. ej. expresión génica) se puede describir
mediante la ecuación química de Langevin (CLE) [Wilkinson, D.J. "Stochastic modelling for quantitative description of
heterogeneous biological systems". Nat Rev Genet 10, 122-133 (2009).
Figure imgf000074_0002
donde, Xt es la expresión de gen/proteína en función del tiempo, p indica la velocidad de producción, a indica la
velocidad de degradación y Wt es un proceso de Wiener (o movimiento browniano estándar). Sin embargo, la duración
de reprogramación medida es de uno o dos órdenes de magnitud (10d para Mbd3KD y > 100d para WT) mayor que la
escala de tiempo de producción/degradación. Además, el tiempo entre muestras en la latencia de reprogramación
medida es más largo que el tiempo de semivida (T1/2) del proceso de producción/degradación. Por lo tanto, debido a
la separación de escalas de tiempo, los autores de la presente invención suponen que el proceso de
producción/degradación está en un estado cuasi-estacionario, donde el valor de la expresión del estado estacionario
(p/a) cambia lentamente debido a cambios reguladores que afectan a la velocidad de producción p, posiblemente
debido a modificaciones epigenéticas.
Para estos cambios de acumulación lenta, se asume un modelo de difusión lineal más simple
. = . o + V * <7*.
Ahora, X t es la expresión del estado cuasi-estacionario en función del tiempo, v.t representa la dinámica determinista donde v se llama deriva del proceso, y o.W t representa el ruido de la expresión génica donde a es la desviación estándar y Wt es un proceso de Wiener.
Los autores de la presente invención asumen que la dinámica de reprogramación observada está dominada por la transición de algunos reguladores maestros (posiblemente Nanog u Oct4) desde su estado de baja inactividad a su estado de alta expresión. Para esta transición, la latencia de reprogramación se corresponde con la distribución del tiempo del primer pase (véase la ilustración en la Figura 57C), donde el tiempo de reprogramación depende del tiempo del primer pase de algún umbral de expresión fijado. Por lo tanto, para un umbral de expresión fijado (desconocido) a > X o, tenemos87:
Figure imgf000075_0001
donde T es una variable aleatoria que representa el tiempo de reprogramación (o el tiempo del primer pase), IG(:,:)
I
ii r . ' „ . . . . '' (media) y J (parámetro de forma) y fr es la función de densidad. Los autores de la presente invención asumen, sin pérdida de generalidad, que X o es cero, en otro lugar los autores de la presente invención pueden cambiar todo, incluyendo a ' = a - X o > 0.
Por lo tanto, los autores de la presente invención ajustan la latencia de reprogramación observada a la distribución gaussiana inversa usando el estimador de máxima verosimilitud, encontrando los parámetros de mejor ajuste (p, A) para cada muestra. Todavía a es un parámetro de modelo desconocido, pero los autores de la presente invención
p i / y [ l = a ¡v
pueden calcular a partir de los resultados del ajuste, esto define la variabilidad dinámica para cada muestra. Esta variabilidad es la relación de la desviación estándar del movimiento browniano (o) dividida entre el parámetro de deriva del movimiento browniano (v), donde o /v > 1 corresponde a una dinámica de alta variabilidad. Los autores de la presente invención muestran que aunque la variabilidad dinámica en la muestra Mbd3+/+ es o/v > 5, las mediciones de Mbd3KD y del ciclo celular muestran ambas una variación dinámica de o/v ~ 0.5 (Figura 57B).
Propagación del error - El ajuste de distribuciones gaussianas y gaussianas inversas devuelve intervalos de confianza al 95% para los parámetros. Calculando la relación para el coeficiente de variación y la variabilidad dinámica, los autores de la presente invención asumieron que o y p no están correlacionados y usaron la siguiente ecuación para el error:
Figure imgf000075_0002
donde £ cv, y £a indican los errores en el coeficiente de variación, media y desviación estándar, respectivamente.
Modelización de la duración del ciclo celular - Los parámetros de tiempo de duplicación (media y desviación estándar) se midieron como se ha descrito previamente en Hanna, J. et al. 2009 [Nature 462, 595-601] para las líneas celulares Mbd3+/+ y Mbd3KD actuales. Los autores de la presente invención buscaron estimar el número de generaciones de acuerdo con la duración de la reprogramación y ajustar la distribución del tiempo del ciclo celular a la latencia de reprogramación observada. Obsérvese que Hanna, J. et al. 2009 (Nature 462, 595-601) mostraban una dependencia entre la duración del ciclo celular y la distribución de la latencia de reprogramación. Sin estar ligados a ninguna teoría, los autores de la presente invención argumentan que la reducción de las barreras limitadoras de la velocidad puede reducir la variabilidad de la reprogramación a la variabilidad explicada solo por los ciclos celulares. La distribución del tiempo de duplicación se caracterizó previamente (Duffy, K.R. et al. Science 335, 338-344, 2012) para linfocitos B, los autores de la presente invención asumen por simplicidad que la duración del ciclo celular obedece a una distribución gaussiana, esto es apoyado por (Duffy K.R., 2012, Science 335: 338-344, Fig. 3A) y validado aplicando la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk [Shapiro, S. S. y Wilk, M. B. "An analysis of variance test for normality (complete samples)". Biometrika (1965), 52: 591] en los tiempos de duplicación medidos (valor P >0.7). Además, debe definirse un modelo para la distribución del ciclo celular de generación múltiple, y los autores de la presente invención consideraron en el análisis dos modelos opuestos.
Modelo dependiente: la duración del ciclo celular es heredado entre hermanos y generaciones. Por lo tanto, cada población monoclonal (cada pocillo) representa una única muestra de la distribución del ciclo celular (v ~ N(p,a)). Por lo tanto, el tiempo para el pocillo i para conseguir K divisiones se distribuye por
Figure imgf000076_0001
donde N (:,:) indica distribución normal.
Modelo independiente: la duración del ciclo celular es independiente entre hermanos y generaciones. Por lo tanto, para cada población monoclonal (cada pocillo) i el tiempo para lograr K divisiones es un proceso de recorrido aleatorio. Por lo tanto,
Figure imgf000076_0002
donde
son variables aleatorias ¡id (independientes e idénticamente distribuidas).
El proceso biológico real probablemente se encuentra entre esos dos modelos opuestos. Se ha caracterizado la correlación entre hermanos (Duffy K.R, 2012, Science 335: 338-344, Fig. 2F) lo que apoya el modelo de dependencia, sin embargo, la correlación se deteriora con el tiempo, apoyando así el comportamiento independiente de procesos de múltiples generaciones. Por lo tanto, los autores de la presente invención decidieron verificar el ajuste para ambos modelos (dependiente e independiente) con el fin de calcular límites que permitan confiar en los resultados.
El procedimiento de ajuste consiste en: 1) Estimar la media (p) y desviación estándar (a) del tiempo de duplicación en cada muestra (Mbd3+/+y Mbd3KD), como se ha descrito previamente en (Hanna, Nature 2009). 2) Ajustar la latencia
de reprogramación observada a ambos modelos: N(K ■ p,K ■ a) para el dependiente y para el modelo independiente. La media (p) y la desviación estándar (a) se estiman empíricamente a partir de cada muestra. El ajuste se hizo en Matlab usando regresión no lineal. 3) Estimar el número de generaciones (K) necesarias para explicar la duración de reprogramación medida, optimizando el estadístico R2 ajustado (véase antes para detalles de R2 ajustado).
El ajuste del modelo dependiente se da en (Figuras. 57D-E), donde los resultados del modelo independiente son muy similares a los del modelo dependiente, como se ve en la siguiente Tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000076_0003
Por lo tanto, los resultados del ajuste en los modelos dependiente e independiente son equivalentes y deberían ser válidos para el modelo de ciclo celular realista (con correlación dependiente de generación parcial).
Deducción del modelo estructural (modelo de tipo de fase) - Varios artículos han sugerido que el proceso de reprogramación se puede modelizar por etapas limitantes de la velocidad en tándem [Buganim, Y. et al. Cell 150, 1209-1222 (2012); Polo, J. M. et al. Cell 151, 1617-1632 (2012); Hanna, J. et al. Nature 462, 595 - 601 (2009); Smith, Z. D. et al. Nat. Biotechnol 28, 521 -526 (2010)]. Para estudiar cómo cambia este proceso de múltiples etapas después del agotamiento de Mbd3 en la reprogramación, los autores de la presente invención aplicaron una modelización de tipo fase (PH) (Bolch, G., Greiner, S., de Meer, H. y Trivedi, K.S. "Queueing networks and Markov chains: modeling and performance evaluation with computer science applications". WILEY, Segunda Edición, 2006) que es un enfoque novedoso usado para caracterizar la dinámica de los modelos de cadena de Markov en tiempo continuo y espacio finito con una sola fase de absorción (en nuestro caso la fase iPSC). Las latencias de reprogramación observadas de Mbd3KD y Mbd3+/+ se ajustaron al modelo de múltiples pasos en tándem, donde se usó la convergencia de la eficacia de estimación con el fin de seleccionar el modelo de mejor ajuste (Figuras. 55C-D, 58D, 59G). Obsérvese que para este modelo los autores de la presente invención usaron las mediciones de Mbd3KD recogidas por microscopía en vivo, para permitir una alta resolución temporal en el período de transición de reprogramación (muestra cada 12 horas). Esas mediciones muestran dinámica equivalente a las mediciones de Mbd3KD adquiridas por FACS (Figura 55B).
Sin estar limitados por ninguna teoría, los autores de la presente invención describen el proceso de reprogramación como un modelo de cadena de Markov secuencial con M fases, donde la probabilidad de estar en la fase /
en el momento t se indica por Pi(t). En este modelo, la probabilidad de que una célula inducida sea una célula B es P i (t), la probabilidad de ser un iPSC es PM(t), y hay M-2 fases intermedias dentro del camino desde las fases de célula B a iPSC. Se asume que la transición ocurre entre las fases ia y (i+1)a con velocidad de transición j , que significa que el modelo actual ignora las retroalimentaciones entre fases. Además, con el fin de permitir un retraso determinista en el modelo, los autores de la presente invención incorporaron al ajuste un parámetro adicional to que indica un "cambio" determinista en la dinámica del modelo. Por lo tanto, un modelo de M fases se puede caracterizar por las siguientes ecuaciones para todo t> to
Figure imgf000077_0001
Este modelo se puede resolver con las siguientes condiciones iniciales: P i (t)=1, Pi(t)=0 para todo i>1 y para todo t< to. La solución para el modelo de M fases define P(t) para todo t>0 como una función de las velocidades de transición (p¡, i e {1,K,M -1}) y to, en un contexto físico Pi(t) describe la evolución temporal de la proporción de población de células en fase i.
Los autores de la presente invención construyeron un procedimiento de ajuste anidado para el ajuste de la dinámica de Mbd3KD y Mbd3+/+ de control a múltiples modelos con M que varía de 2 a 6. Puesto que los autores de la presente invención midieron solo la distribución de la latencia de reprogramación completa, el ajuste se hizo entre la distribución de latencia medida de cada sistema y la función PM(t) calculada para cada modelo, buscando el modelo de mejor ajuste para cada distribución de latencia medida. Los autores de la presente invención aplicaron ajuste de regresión no lineal para cada modelo con el estadístico R2 ajustado para el rechazo de modelos sobreajustados. Obsérvese que el sobreajuste es rechazado por el R2 ajustado ya que ese mayor número de parámetros del modelo m disminuye el estadístico R2 ajustado siempre que la suma de los cuadrados de los residuos converja (convergencia de la eficacia de la estimación).
El modelo de mejor ajuste define el número de fases que recapitulan la dinámica de cada sistema de reprogramación (Mbd3KD y Mbd3+/+), el procedimiento de ajuste calcula las velocidades de transición optimizadas yi y el retraso determinista to. De acuerdo con informes previos [Buganim, Y. et al. "Single-cell expression analyses during cellular reprogramming reveal an early stochastic and a late hierarchic phase". Cell 150, 1209-1222 (2012); Polo, J. M. et al. "A Molecular Roadmap of Reprogramming Somatic Cells into iPS Cells". Cell 151, 1617-1632 (2012); Hanna, J. et al. "Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration". Nature 462, 595-601 (2009); Smith, Z. D., Nachman, I., Regev, A. y Meissner, A. "Dynamic single-cell imaging of direct reprogramming reveals an early specifying event". Nat Biotechnol 28, 521-526 (2010)], la dinámica de Mbd3+/+ se ajusta a un proceso de múltiples etapas que consiste en 1 o 2, pero no 0, fases intermedias (Figuras 55C-D, 58A-D). Es de destacar que la dinámica medida de Mbd3KD se ajusta de manera óptima a un proceso de una sola etapa sin dase intermedias (Figuras 55C-D
Figure imgf000077_0002
la velocidad promedio del proceso de reprogramación se estimó entonces usando
para cada muestra. Se documentaron los resultados del ajuste y los parámetros estimados del modelo (datos no mostrados). Obsérvese que el ajuste de los modelos se validó usando un segundo procedimiento de ajuste basado en el ajuste no lineal ponderado por minimización de chi2. Los resultados muestran (Figuras 58A-D y Figuras 59A-G) que los dos procedimientos de ajuste daban resultados equivalentes.
Del resultado obtenido para el Mbd3KD se puede inferir una reducción de los estados intermedios y, por tanto, una reducción de las barreras limitantes de la velocidad. No propone directamente por la estocasticidad, pero existe una clara conexión entre las barreras y la variabilidad del proceso. Los resultados obtenidos también tienen muchas observaciones experimentales que los respaldan, tales como fases intermedias establecidas previamente en la reprogramación que se caracterizaron ampliamente en trabajos previos (Mikkelsen, T. S. et al. Nature 454, 49-55, 2008). La predicción del modelo de que el protocolo de Mbd3KD logra una dinámica de reprogramación sin barrera está respaldado por el hecho de que se detectaron intermedios (SSEA1 positivo con Oct4 y Nanog negativos) en la muestra de WT (tipo natural), pero no se observó ninguno en la muestra de Mbd3KD (Figura 8S y Figuras 8F-K). Además, las líneas celulares previamente descritas (Mikkelsen, T. S. et al. Nature 454, 49-55, 2008) parcialmente reprogramadas (pre-iPS intermedias) se convirtieron de manera robusta en iPSC tras el agotamiento de Mbd3 (Figura 50B). En conjunto, esos resultados validan experimentalmente las predicciones del modelo para la eliminación de las barreras limitantes de la velocidad en el protocolo de reprogramación de Mbd3KD.
Notas técnicas adicionales: Primero, obsérvese que las velocidades para Mbd3KD y Mbd3+/+ se adaptan a escala de manera diferente debido a las diferencias en las mediciones de los ensayos policlonales y monoclonales (Figuras 55C-D). Para el sistema monoclonal Mbd3+/+, la detección positiva de células iPS en poblaciones clonales se define por el umbral FACS de FACS de >0.5% de células GFP+ por pocilio, para este sistema las velocidades de transición y
generales deben adaptarse a escala respecto a la velocidad promedio de la población mediante
Figure imgf000078_0001
, de acuerdo con el modelo descrito anteriormente (Hanna, J. et al. Nature 462, 595-601, 2009), la razón detrás de esta adaptación de escala es que cada suceso de activación (pocillo) representa una competición entre muchas variables exponenciales iid (independientes e idénticamente distribuidas). Por otro lado, para el ensayo policlonal de Mbd3KD se midió diariamente la fracción global de células Nanog-GFP+ de toda la población, para esta medición de una sola célula no es necesario adaptar a escala las velocidades de transición respecto al promedio de la población.
En segundo lugar, obsérvese que los efectos no lineales tal como en las funciones de Hill pueden dar como resultado una dinámica similar a la latencia de reprogramación observada, pero debido al esquema de medición monoclonal (población homogénea) de pozos múltiples, los autores de la presente invención pueden descartar dichos efectos. Claramente, cada suceso de activación (cada pocillo) es independiente y está físicamente aislado de todos los demás pozos, por lo que no le pueden influir las activaciones de pocillos cercanos. Además, las líneas celulares reprogramadas eran sistemas secundarios con construcciones estables a la inducción con DOX homogéneas. Por lo tanto, la dinámica de la función S debe corresponder a la distribución de latencia de reprogramación y no a otro efecto no lineal.
Finalmente, los autores de la presente invención señalan que el parámetro t0 usado en el ajuste del modelo no es el inicio del proceso. Al examinar la expresión génica y los resultados de la cromatina, se puede ver que los cambios importantes en la expresión génica y la cromatina ya son evidentes en 4d después de la inducción (para Mbd3KD) y 8d (para WT) (véase las Figuras 45A-B, 47A-B). El parámetro t0 es técnico para permitir que las distribuciones se muevan y se ajusten entre sí, puede representar la duración determinista mínima necesaria para los cambios requeridos en la reprogramación. Obsérvese que para el sistema monoclonal Mbd3+/+, el retardo de detección se debe a un umbral obtenido en FACS que se puede formular por t = Td ■ Log2 (NFACS ■ ThrFACS)“ 4d, donde Td es el tiempo de duplicación (~20 horas), NFACS es igual a 5000 células y Thr igual a 0.05%. El retardo de inducción con DOX es aproximadamente 0.5d. Mientras que el retardo de detección de Mbd3KD es despreciable (ensayo policlonal). La reducción de esos retardos mecanísticos a partir del t0 estimado, los autores de la presente invención consiguen que tanto Mbd3+/+ como Mbd3KD tengan aproximadamente 3 [días] de "duración mínima" necesarios para que se completen los cambios de la reprogramación.
Hipótesis de regresión no lineal - La mayoría de las estimaciones de modelos anteriores usaban regresión no lineal como su procedimiento de ajuste. Para esto los autores de la invención asumen que: 1) Los errores de observación, es decir, los residuos definidos como una diferencia entre los valores observados y los predichos por el modelo, se distribuyen normalmente. 2) Los errores en las observaciones en tiempos sucesivos son independientes. 3) La varianza de los errores de observación (a2) es la misma para todas las variables de estado y tiempos de observación. Los autores de la presente invención verificaron la distribución de los residuos para todos los problemas de estimación previos usando pruebas de normalidad de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk [Shapiro, S. S. y Wilk, M. B. "An analysis of variance test for normality (complete samples)". Biometrika (1965), 52: 591; Smirnov, N. JSTOR: The Annals of Mathematical Statistics, Vol. 19, No.2 (Jun., 1948), pág. 279-281]. Los residuos pasaron las pruebas de normalidad con los valores P dados en la Tabla complementaria 1 en Rais Y, et al. ["Deterministic direct reprogramming of somatic cells to pluripotency", Nature. 3 Oct. 2013;502(7469): 65-70. Epub 18 Sep. 2013].
Análisis evolutivo del complejo NuRD y otras proteínas asociadas - Los autores de la presente invención asignaron ortólogos para 15 proteínas humanas que se sabe que forman parte del complejo NuRD o que están relacionadas con estas proteínas (MBD1; ID de gen: 4152; SEQ ID NO: 5), MBD2 (ID de gen: 8932; SEQ ID NO: 6), MBD3 (ID de gen: 53615; SEQ ID NO: 7), MBD4 (ID de gen: 8930; SEQ ID NO: 8), OCT4 (ID de gen: 5460; SEQ ID NO: 9), SOX2 (ID de gen: 6657; SEQ ID NO: 10), CHD4 (ID de gen: 1108; SEQ ID NO: 11), Nanog (ID de gen: 79923; SEQ ID NO: 12), RBBP4 (ID de gen: 5928; SEQ ID NO: 13), RBBP6 (ID de gen: 5930; SEQ ID NO: 14), RBBP7 (ID de gen: 5931; SEQ ID NO: 15), HDAC1 (ID de gen: 3065; SEQ ID NO: 16), HDAC2 (ID de gen: 3066; SEQ ID NO: 17), MTA1 (ID de gen: 9112; Se Q ID NO: 18), MTA2 (ID de gen: 9219; SEQ iD NO: 19), para 15 especies de metazoos representativas (ratón - M.musculus, ornitorrinco - O.anatinus, diamante cebra - T.guttata, pollo - G.gallus, rana - X. tropicalis, pez cebra -D.rerio, pez globo - T.nigroviridis, lanceta - B.floridae, erizo de mar púrpura - S.purpuratus, mosquito - A.gambiae, mosca de la fruta -D. melanogaster, abeja europea - A.mellifera, escarabajo - T.castaneum, anémona de mar - N. vectensis, placozoos - T. adhaerens) y la levadura S. cerevisiae, como un grupo externo. El último metazoo de esta lista, T. adhaerens, representa un grupo basal de metazoos y se usa para estudiar los orígenes de la multicelularidad animal [Rokas, A. Annual review of genetics, 42: 235-251, 2008; Knoll, A. H. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 39, 217­ 239, 2011]. Es probable que las proteínas que tienen un ortólogo en T. adhaerens estén presentes en los animales multicelulares basales, mientras que las proteínas que aparecen en la levadura preceden a la multicelularidad animal. Los ortólogos se recuperaron usando el componente COG (versión 9.0) de la base de datos STRING (versión 9.0) (Szklarczyk, D. et al. "The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored". Nucleic Acids Res. 39, D561-D568, 2010). Los autores de la presente invención limitaron el análisis a ortólogos que se encuentran en el mismo grupo de ortólogos (COG) que las proteínas humanas (e ignoraron cualquier otra proteína similar, si se asignan a un COG diferente). En casos donde se encontró más de un ortólogo (Altschul, S. F., et al. Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389-402) para una especie, los autores de la presente invención aplicaron Blast a los diversos ortólogos de esa especie frente al ortólogo humano para cuantificar su grados relativos de similitud. Los autores de la presente invención descartaron proteínas que tienen menos de 50 restos o que tienen valores de e superiores a 0.001. Como el homólogo más cercano para la proteína humana, los autores de la presente invención eligieron el ortólogo en la especie comparada con el valor e más bajo de las proteínas restantes. Los autores de la presente invención calcularon una puntuación de similitud normalizada entre los dos ortólogos, dividiendo la puntuación de similitud en la longitud de la proteína más larga de los dos ortólogos (el ortólogo humano y el ortólogo de la especie comparada).
Captura de células pluripotentes humanas naif - Las siguientes condiciones definidas sin suero, denominadas WIS-NHSM (medio de células madre humanas naif del Instituto de Ciencias Weizmann) se usaron para aislar, generar, derivar y estabilizar células madre pluripotentes humanas naif (iPSC y ESC) con las propiedades biológicas únicas descritas en este estudio. El medio WIS-NHSM-(i) se generó incluyendo: 475 ml de DMEM Knockout (Invitrogen 10829), 5 gramos de AlbuMAX (Invitrogen 11020-021), 5 ml de suplemento N2 (Invitrogen 17502048), 10 pg (microgramos) de LIF humano recombinante (factor inhibidor de la leucemia) (Peprotech), bFGF recombinante 8 ng/ml (Peprotech) y TGFpl recombinante 1 ng/ml (Peprotech), glutamina 1 mM (Invitrogen), 1% de aminoácidos no esenciales (Invitrogen), p-mercaptoetanol 0.1 mM (Sigma), penicilina-estreptomicina (Invitrogen) e inhibidores moléculas pequeñas: PD0325901 (1 pM, ERK1/2Í, Axon Medchem); CHIR99021 (3 pM, GsK3pi, Axon Medchem); SP600125 (10 pM, JNKi, TOCRIS), SB203580 (5-10 pM, p38i, TOc R iS). Después de una optimización adicional, los autores de la presente invención usaron alternativamente SB202190 (5 pM, p38i, Axon Medchem) o BIRB796 (2 pM, P38i Axon Medchem) para la mejor inhibición de P38 en lugar de usar SB203580.
A lo largo del estudio, se cultivaron hESC/hiPSC naif en placas recubiertas con gelatina al 0.2% vitronectina 1 ng/ml durante al menos 1 hora a 37°C. En particular, también se puede usar 1 ng/ml de vitronectina o laminina recombinante (Sigma Aldrich L2020, 1 ng/ml durante al menos 1 hora a 37°C) para mantener las células humanas naif en condiciones WIS-NHSM.
Las células se sometieron a pases por tripsinización de células individuales (Trisina al 0.25% o 0.05% EDTA) cada 3-4 días. Aunque no es esencial, se puede obtener mayor eficacia de clonación de células individuales con la complementación de WIS-NHSM con el inhibidor de la ruta de ROCK Y-27632 (5 pM, ROCKi Axon Medchem) durante 24 horas antes y después del pase celular. Los números de pases de -hiPSC/hESC naif indican número de pases contados después de la inducción o estabilización del estado naif (y no incluyen pases previos cuando las células se establecieron y mantuvieron en condiciones de ESC convencionales/cebadas). Para la transfección de iPSC/ESC naif de ratón y humanas, las células se recogieron con solución de tripsina-EDTA al 0.05% (Invitrogen), y las células resuspendidas en PBS se transfectaron con 75 pg de construcciones de ADN (Gene Pulser Xcell System; Bio-Rad; 500 V, 25 pF, cubetas de 0.4 cm).
Aunque las células descritas y analizadas en este estudio se mantuvieron como se ha descrito anteriormente, los autores de la presente invención señalan que las hESC/iPSC naif se pueden expandir en placas recubiertas de gelatina junto con células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) inactivadas con mitomicina C o irradiadas con rayos gamma.
Además, es posible una composición alternativa de WIS-NHSM reemplazando el componente Albumax por reemplazo de suero KnockOut al 15-20% (KSR; Invitrogen 10828-028) o concentrado de lípidos definido químicamente (GIBCO0 Invitrogen 11905-031) o ácido oleico-albúmina (O3008 Sigma Aldrich, 10 p/ml final) o ácido oleico (01257, Sigma Aldrich, concentración final 10 pg/ml) o suplemento linoleico/oleico/albúmina (L9655 Sigma Aldrich, concentración final 10 pg/ml) o ácido oleico [O1008 Sigma Aldrich (disuelto en DMSO), concentración final 10 pg/ml].
En lugar de añadir 5 ml de mezcla N2 lista, se pueden añadir componentes individuales a una botella de medio de 500 ml a la concentración final indicada: 1) Insulina humana recombinante (Sigma 1-1882) - Concentración final 12.5 pg/ml; 2) Apo-Transferrina (Sigma T-1147) - Concentración final 500 pg/ml; 3) Progesterona (Sigma- P8783) - Concentración final 0.02 pg/ml; 4) Putrescina (Sigma- P5780) - Concentración final 16 pg/ml; 5) Selenito de sodio (Sigma - S5261) -añadir 5 pl de solución madre 3 mM por 500 ml de medio WIS-NHSM.
En lugar de SB203580 (p38i), el medio WIS-NHSM puede incluir SB202190 (5 pM, p38i, TOCRIS) o BIRB796 (2 pM, P38i Axon Medchem) sin ningún cambio en la expresión de OCT4-GFP en condiciones WIS-NHSM.
Se ensayaron la complementación de vitamina C (ácido L-ascórbico 2-fosfato, Sigma, A8960, concentración final 50 microg/ml) y/o condiciones de crecimiento de hipoxia (5% PO2), y se encontró que eran adecuadas para expandir las ESC y las iPSC humanas naif de Oct4-GFP+.
En lugar de KO-DMEM, también se pueden usar alternativamente los siguientes medios: DMEM-F12 (Biological Industries o Invitrogen), KO-DMEM/F12 (Invitrogen 12660-012), GMEM (Invitrogen 11710) o DMEM/F12:mezcla neurobasal 1:1 (Invitrogen 21103-049).
A continuación se muestra un ejemplo no limitante de un medio WIS-NHSM alternativo (denominado "WIS-NHSM-ii") que se usó para cultivar las células naif de algunos aspectos de la descripción: 425 ml de Knockout DMEM (Invitrogen 10829), 74 ml de reemplazo de suero KnockOut (Invitrogen 10828-028), 5 ml de suplemento N2 (Invitrogen 17502048), 10 pg de LIF humano recombinante (Millipore, LIF1005), bFGF recombinante 8 ng/ml y TGFpl recombinante 1 ng/ml (Peprotech), glutamina 1 mM (Invitrogen), 1% de aminoácidos no esenciales (Invitrogen), p-mercaptoetanol 0.1 mM (Sigma), penicilina-estreptomicina (Invitrogen) e inhibidores moléculas pequeñas: PD0325901 (1 pM, ERK1/2Í, AXONMEDCHEM); CHIR99021 (3 pM, GSK3bi, AXON MEDCHEM); SB203580 (5 pM, p38i, TOCRIS); SP600125 (5 pM, JNKi, TOCRIS) con o sin Y-27632 (5 pM, ROCKi Axon Medchem).
La composición alternativa del medio WIS-NHSM implicó reemplazar KSR al 15% por albumax al 1%: 500 ml de DMEM KnockOut (Invitrogen 10829), 5 g de AlbuMAX (Invitrogen 11020-021), 5 ml de suplemento N2 (Invitrogen 17502048), 10 pg de LIF humano recombinante (Millipore, LIF1005), bFGF recombinante 8 ng/ml y TGFp1 recombinante 1 ng/ml (Peprotech), glutamina 1 mM (Invitrogen), 1% de aminoácidos no esenciales (Invitrogen), p-mercaptoetanol 0.1 mM (Sigma), penicilina-estreptomicina (Invitrogen) e inhibidores moléculas pequeñas: PD0325901 (1 pM, ERK1/2i, AXONMEDCHEM); CHIR99021 (3 pM, GSK3bi, AXON MEDCHEM); SB203580 (5 pM, p38i, TOCRIS); SP600125 (5 pM, JNKi, TOCRIS) con o sin Y-27632 (5 pM, ROCKi Axon Medchem).
Derivación de iPSC - Para la derivación de iPSC directamente de fibroblastos (y no de líneas de iPSC ya establecidas), fibroblastos BJ o fibroblastos secundarios derivados de C1/2 (Hanna, J., et al. 2010. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227) que albergan vectores lentivirales de doxiciclina (DOX) que codifican los factores de reprogramación Oct4, Sox2 y Klf4 (Hanna, J., et al. 2010. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227) y un lentivirus constitutivamente activo que codifica el transactivador de tetraciclina inverso se cultivaron en presencia de DOX en condiciones WIS-NHSM (como se describe anteriormente) en placas recubiertas con vitronectina/gelatina hasta que se observaron colonias de PSC iniciales y se subclonaron.
Métodos de referencia: Derivación de ESC de blastocistos humanos - El uso de embriones humanos pre-implantación para la derivación de ESC se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por un comité ESCRO del Instituto Weizmann, el comité de revisión institucional del hospital Lis y el Comité Nacional de Ética de Israel (7/04-043) y tras la aceptación de un consentimiento informado por escrito. La participación de las parejas en el estudio fue voluntaria después de firmar formularios de consentimiento informado y no hubo compensación monetaria por la donación de embriones. Las masas de células internas (ICM) se aislaron mecánicamente mediante micromanipulación asistida por láser de embriones de FIV de reserva, el día 6-7 después de la fertilización [Ben-Yosef, D. et al. Sesgo del sexo femenino en líneas de células madre embrionarias humanas. "Female Sex Bias in Human Embryonic Stem Cell Lines". Stem Cells and Development 21, 363-372 (2012)]. Las aglomeraciones de ICM intacta se pusieron en una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón DR4 tratados con irradiación y se cultivaron en medio WIS-NHSM. Los crecimientos iniciales de las ESC en proliferación fueron evidentes el día 6 y se tripsinizaron en células individuales, 6-10 días después de la siembra en placa de ICM. Las líneas celulares recién establecidas se propagaron más con tripsina y luego se congelaron o se usaron para análisis posteriores.
Compuestos de moléculas pequeñas y citoquinas - Se adquirieron moléculas pequeñas y citoquinas de Tocris, Calbiochem, Stemgent, Peprotech o Sigma, y se complementaron como se indica en la siguiente concentración final: inhibidor de JAK (420099 JAKi, 0.6 pM - CAL BIOCHEM), Kenopaullona (KP, 5 pM, Sigma Aldrich), PD0325901 (PD, 1 pM, Axon Medchem); CHIR99021 (CH, 3 pM, AXON MEDCHEM), forskolina (FK, 10 pM, TOCRIS), inhibidores del receptor de FGF4 PD173074 (0.1 pM, TOCRIS) y SU5401 (2 pM, TOCRIS); Inhibidores de TGFp/ALK A83-01 (1 pM, STEMGENT), inhibidor de PKC Go6983 (1 pM, TOCRIS), inhibidor de ALK (ALKi: SB431542, 2 pM, TOCRIS); AICAR (0.5 mM); BixO1294 (1 pM); BayK8644 (1 pM, Stemgent); SB203580 (5-10 pM, p38i, TOCRIS); SBS202190 (5 pM, p38i, TOCRIS), BIRB796 (Axon Medchem 2 pM), SP600125 (10 pM, JNKi, TOCRIS); BMP4 humana recombinante (5-10 ng/ml; Peprotech), SCF humano recombinante (10 ng/ml, Peprotech), IGF1 humano recombinante (10 ng/ml, Peprotech), el medio con inhibidores se reemplazó cada 24-48 horas.
Cultivo de ESC y iPSC humanas de referencia convencional/cebadas - Se usaron las siguientes líneas de ESC e iPSC humanas de referencia convencionales ya establecidas (el número de pase indicado de la línea celular tomada para la conversión en pluripotencia naif se indica entre paréntesis): Líneas de células madre pluripotentes inducidas humanas C1 (P21) y hiPSC C2 (P9) (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 9222-9227, 2010) y las líneas de células madre embrionarias humanas (hESC) BGO1 (P35) (Código de identificación de los Institutos Nacionales de Salud BG01; BresaGen], H1 (P40), H9 (P37), WIBR1 (P13), WIBR2, WIBR3 (P11) hESC (Lengner, CJ et al. Cell 141, 872-883, 2010) se mantuvieron en condiciones de 20% pO2 (a menos que se indique lo contrario) en capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) irradiados o placas recubiertas de gelatina/vitronectina, en medio de hESC: 425 ml Knockout-DMEM - Invitrogen 10829) complementado con 15% de reemplazo de suero Knockout (Invitrogen 10828-028), glutamina 1 mM (Invitrogen), 1% de aminoácidos no esenciales (Invitrogen), pmercaptoetanol 0.1 mM (Sigma), bFGF 8 ng/ml (Peprotech) y TGFp1 humano recombinante 1-8 ng/ml (p. ej., 1-2 ng/ml) (Peprotech). Los cultivos se sometieron a pases cada 5-7 días, ya sea manualmente o por tripsinización (24 horas antes y 24 horas después de la adición de inhibidor de ROCK en una concentración de 5-10 nM). Para la transfección de las líneas de hiPSC y hESC, las células se cultivaron en inhibidor de quinasa Rho (ROCK) (Calbiochem; Y-27632) 24 horas antes de la electroporación. Se recogieron las células ESC e iPSC humanas cebadas/convencionales con solución de tripsina-EDTA al 0.05% (Invitrogen), y las células resuspendidas en PBS se transfectaron con 75 pg de construcciones de ADN (Gene Pulser Xcell System; Bio-Rad; 250 V, 500 pF, cubetas de 0.4 cm). Posteriormente, las células se sembraron placa en capas alimentadoras de MEF (MEF DR4 para la selección con puromicina) en medio de hESC complementado con inhibidor de ROCK durante las primeras 24 horas, y después se aplicó la selección con antibióticos.
Líneas de células madre cebadas y naif de ratón y cultivo - Células pluripotentes ESC V6.5 naif murinas (C57B6/129sJae) se mantuvieron y expandieron en medio basado en N2B27 químicamente definido sin suero: 500 ml de KO-DMEM (Invitrogen), 5 ml de suplemento N2 (Invitrogen; 17502048), 5 ml suplemento B27 (Invitrogen; 17504044), glutamina 1 mM (Invitrogen), 1% de aminoácidos no esenciales (Invitrogen), p-mercaptoetanol 0.1 mM (Sigma), penicilina-estreptomicina (Invitrogen), BSA 5 mg/ml (albúmina de suero bovino; Sigma). Las condiciones de 2i/LIF naif para las PSC murinas incluían 5 pg de LIF humano recombinante (Peprotech). donde se indica "2i" se añadió lo siguiente: inhibidores moléculas pequeñas CHIR99021 (CH, 3 pM - Axon Medchem) y PD0325901 (PD, 1 pM - TOCRIS). Las ESC y las iPSC naif murinas se expandieron en placas recubiertas de gelatina, a menos que se indique lo contrario. Las ESC Eras_/Y previamente descritas fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Shinya Yamanaka [Takahashi, K., Mitsui, K. y Yamanaka, S. Nature 423, 541-545 (2003)]. La línea de EpiSC 129Jae cebadas (derivada de embriones E6.5) o línea de EpiSC C57BL6/129sJae (derivada después de cebado in vitro de ESC de ratón V6.5) se expandieron en N2B27 con bFGF humano recombinante 8 ng/ml (Peprotech Asia) y activina humana recombinante 20 ng/ml (Peprotech Asia) y KSR al 1% (reemplazo de suero Knockout). Las EpiSC murinas se expandieron en placas recubiertas de gelatina/vitronectina o Matrigel sin alimentador. Se comprobaron en las líneas celulares de forma rutinaria cada mes las contaminaciones por Mycoplasma (LONZA - MYCOALERT KIT), y ninguna de las muestras analizadas en este estudio estaba contaminada.
Reprogramación de células somáticas e infección de células - Líquidos sobrenadantes que contienen virus de los diferentes virus reprogramadores: vector policistrónico STEMCA-OKSM (expresión inducible y constitutiva con DOX) [Mansour, A.A. et al. Nature 488, 409-413 (2012)] se complementó con el virus FUW-lox-M2rtTA (cuando fue necesario) y un volumen igual de medio de cultivo de nueva aportación para la infección. Para la derivación de iPSC directamente de fibroblastos (y no de líneas de iPSC ya establecidas), fibroblastos BJ o células fibroblastos secundarios derivados de C1.2 [Hockemeyer, D. et al. Cell Stem Cell 3, 346-353 (2008)] que albergan vectores lentivirales de doxiciclina (DOX) que codifican los factores de reprogramación Oct4, Sox2 y Klf4 y un lentivirus constitutivamente activo que codifica el transactivador de tetraciclina inverso [Hockemeyer, D. et al. Cell Stem Cell 3, 346-353 (2008)], se cultivaron en presencia de DOX en condiciones WIS-NHSM en placas recubiertas de vitronectina/gelatina hasta que se observaron las colonias iniciales de iPSC y se subclonaron. La generación de hiPSC BJ1 a partir de fibroblastos de prepucio humano BJ se llevó a cabo mediante el kit de transfección de ARNm de OSKM y LIN28 (Stemgent) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes, pero en condiciones WIS-NHSM aplicadas a partir del día 2 del proceso de reprogramación. Se obtuvieron fibroblastos específicos de paciente varón con X frágil a través del depósito de Coriell (GM05131 y GM07071). Las iPSC se reprogramaron en condiciones convencionales o naif (WIS-NHSM) como se indica en las Figuras 21A-D y 71A-E. Se usaron cebadores de PCR previamente descritos para la detección del gen FMR1 [Urbach, A., et al. Stem Cell 6, 407-411 (2010)]: cebador directo: 5'-CAGGGCTGAAGAGAAGATGG-3' (SEQ ID NO: 72), cebador inverso: 5'-ACAGGAGGTGGGAATCTGA-3' (SEQ ID NO: 73). El análisis por pirosecuenciación para la metilación en el locus de FMR1 se realizó como se ha descrito previamente [Urbach, A., et al. Stem Cell 6, 407-411 (2010)].
Ensayos de diferenciación de iPSC y ESC humanas - Para la diferenciación inducida por cuerpos embrioides (EB), se tripsinizaron hESC/hiPSC naif y se cultivaron durante 6-8 días en placas de cultivo en suspensión no adherentes (Corning) en DMEM complementado con suero bovino fetal al 15%. Para la formación y el análisis de teratomas, se recogieron hESC e iPSC naif por tripsinización antes de inyección. Las células se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) en ratones NSG macho de 6-8 semanas de edad (laboratorios Jackson). Los tumores se desarrollaron en general en el espacio de 4-6 semanas y los animales se sacrificaron antes de que el tamaño del tumor excediera 1.5 cm de diámetro. Las hiPSC C1 naif se infectaron con un lentivirus que albergaba una construcción indicadora VASA-EGFP, se seleccionaron con neomicina, se subclonaron y posteriormente se usaron para el protocolo de diferenciación de células germinales primordiales (PGC) (Hanna et al., 2010b). Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices y después de la aprobación del Instituto Weizmann IACUC (aprobación n° 00960212-3).
Métodos de referencia: Micromanipulación de embriones de ratón - ESC de ratón pluripotentes o iPSC humanas naif (pretratadas con ROCKi 10 pM durante 12 horas) se tripsinizaron y posteriormente se inyectaron en mórulas o blastocistos de ratón diploides BDF2, recogidos de hembras BDF1 de 6 semanas de edad cebadas con hormonas. La microinyección en mórulas E2.5 o blastocistos E3.5 puestos en medio M16 en aceite mineral se hizo mediante una pipeta de microinyección de punta plana. Se dejó que los embriones inyectados con iPSC humanas se recuperaran en medio KSOM (Invitrogen) complementado con ROCKi (5 pM) durante 3-9 horas antes de que se trasplantaran a ratones pseudopreñadas subrogadas. Se inyectó un número controlado de 10-12 células en la cavidad del blastocisto. Después de inyección, los blastocistos se devolvieron al medio KSOM (Invitrogen) y se pusieron a 37°C hasta que se transfirieron a las hembras receptoras. Se transfirieron de diez a quince blastocistos inyectados a cada cuerno uterino de hembras pseudopreñadas 2.5 días después del coito. El ensayo de complementación tetraploide 4n se realizó fusionando embriones BDF2 en el estadio de 2 células [Stadtfeld, M. et al. Nature 465, 175-181 (2010)], y permitiendo posteriormente que los embriones se desarrollen hasta la etapa de blastocisto en el día 3.5, y después se usaron para microinyección de PSC. Se permitió que los embriones se desarrollaran a término. La determinación de la transmisión de la línea germinal se realizó por apareamiento de animales quiméricos con hembras C57B/6 y comprobación continua de crías de agutí de color. Para la formación y análisis de teratomas, se recogieron hESC y hiPSC naif por tripsinización antes de inyección. Las células se inyectaron por vía subcutánea en ratones NSG (laboratorios Jackson). Los tumores se desarrollaron en general en el espacio de 4-6 semanas y los animales se sacrificaron antes de que el tamaño del tumor excediera 1.5 cm de diámetro. Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices y después de la aprobación del Instituto Weizmann IACUC (aprobación n.° 00960212-3). Los autores de la presente invención no han excluido animales del análisis y no aplicaron la aleatorización por enmascaramiento.
Recombinería de BAC y edición de genes TALEN - Se diseñaron plásmidos que expresan TALEN con la ayuda de TALEN targeter 2.0 y se clonaron usando el kit GoldenGate TALEN 2.0 adquirido en Addgene [Bedell, v M, et al., Nature 491: 114-8. (2012)] según el protocolo publicado. Para el direccionamiento de G, los autores de la presente invención han usado repeticiones de tipo NN. Se electroporaron 107 ESC/iPSC con 30 pg del plásmido donante con inserción de OCT4-GFP-2A-PURO previamente descrito [Hockemeyer, D. et al., Nat Biotechnol 29, 731-734 (2011)] (amablemente proporcionado por R. Jaenisch a través de Addgene) y 10 pg de cada uno de los plásmidos que expresan TALEN y cultivados en presencia de selección con antibióticos. Se aislaron los clones resistentes y se extrajo el ADN genómico para análisis de transferencia Southern y PCR. Las construcciones OCT4-GFP-2A-PURO, APE-OCT4-GFP-2A-PURO, ADE-OCT4-GFP-2APURO se hicieron a partir del clon de BAC que contenía el locus del gen OCT4 humano usando recombinación Red/ET (Gene Bridges). Brevemente, se insertó el casete GFP-2A-puro en el sitio de inicio de la traducción de OCT4, y después se subclonó la región genómica desde 8 kb secuencia arriba hasta 10 kb secuencia abajo de TSS en el vector pBS. Los elementos proximales (PE) y distales (DE) se determinaron por homología con los elementos respectivos de Oct4 de ratón descritos en [Bao, S. et al. Nature 461, 1292-1295 (2009)], y basándose en los resultados obtenidos con el ensayo de prueba de luciferasa (Figura 25A). Las deleciones de APE y ADE se hicieron en la construcción de tipo natural intercambiando estas regiones con un casete de selección de kanamicina que posteriormente se eliminó por restricción. Los vectores de direccionamiento se linealizaron con SspI y se electroporaron en diferentes líneas de células pluripotentes cebadas y naif como se indica. Para hacer el indicador APE-Oct4-GFP de ratón, los autores de la presente invención han modificado la construcción mGOF18APE previamente descrita [Yeom, Y. I. et al. "Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells". Development 1996, 122 (3): 881-94], por recombinación de pRed/ET. El casete pgk-gb2-Neo (GeneBridges) se insertó en el extremo 3' del fragmento genómico de Oct4 clonado (9.7 kb secuencia abajo de Oct4 TSS). El casete neo insertado tiene la misma orientación que el gen Oct4. La construcción se linealizó con SspI y se electroporó en ESC V6.5 de ratón y se usó para experimentos en las Figuras 86A-C y las Figuras 87A-B. Para el direccionamiento génico de locus de OCT4 y COL1A humanos, se implementó el diseño y la estrategia de vectores de direccionamiento como se detalla en las Figuras 71B-C. Los brazos de homología se amplificaron por PCR de ADN genómico derivado de hESC H9. El direccionamiento de genes se introdujo usando vectores isogénicos después de linealización y transducción en hESC H9 naif y cebadas. Los clones dirigidos correctamente se validaron por cribado por transferencia Southern según el direccionamiento correcto mediante sondas externas tanto 5' como 3' (Figuras 21A-D).
Construcciones de ADN y clonación de plásmidos - Los vectores pCAG-IresPuro o pCAG-flox-DsRed-IRES-Puro [Ficz G, et al. Cell Stem Cell. 5 sep. 2013; 13(3):351-9. doi: 10.1016/j.stem.2013.06.004. Epub 11 Jul 2013] codificaban los siguientes insertos (que se clonaron por ligaciones cohesivas o de extremos romos en sitios XhoI-NotI): mutante de Stat3-CA (Addgene 13373) (mutaciones A662C y N664C, sustituyendo A662 y N664 por restos de cisteína en la molécula de Stat3, se pueden formar enlaces disulfuro entre los monómeros de Stat3 y hacer que la molécula sea capaz de dimerizar sin un fosfato en Y705); Stat3-Y705F (alelo dominante negativo - Addgene 8709). Secuencias potenciadoras de OCT4 humano [las construcciones de Oct4DE- y Oct4PE-SV40-luciferasa (Luc)] se clonaron en el vector promotor pGL3 (Promega) con los siguientes cebadores:
5' hOcCT4PE KpnI: 5'-GGTACCGGATACTCAGGCCAGGCCCAGAAA-3' (SEQ ID NO: 74);
3' hOCT4PE XhoI: 5'- CTCGAGTCCACAGACCTCTGGCACT-3' (SEQ ID NO: 75);
5' hOCT4DE KpnI: 5'-GGTACCCATTGAGTCCAAATCCTCTTTACTAGGTG-3' (SEQ ID NO: 76);
3' hOCT4DE XhoI: 5'-CTCGAGCTGAGGCTCATGCTGCTGG-3' (SEQ ID NO: 77).
Se usaron construcciones indicadoras para determinar el patrón de regulación de la expresión de Oct4 y se electroporaron en 0.5-3 x 106 células junto con el vector pRL-TK (Renilla) para la normalización. Los ensayos se realizaron 48 horas después usando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega). La actividad basal del vector de luciferasa vacío se estableció en 1.0. Se produjo vitronectina recombinante y se purificó como se ha descrito previamente [Chen, G. et al. "Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture". Nat. Methods 8, 424-429 (2011)] después de obtener la construcción iónica de expresión a través de Addgene (vector 30225).
Análisis de RT-PCR (descripción para los ejemplos 5-9) - El ARN total se aisló usando Trizol (Invitrogen). 1 pg de ARN tratado con DNasa-I se sometió a transcripción inversa usando un kit de Síntesis de primera cadena (Invitrogen) y finalmente se resuspendió en 100 pl de agua. El análisis de PCR cuantitativo se hizo por triplicado usando 1/50 de la reacción de transcripción inversa en una plataforma Viia7 (Applied Biosystems). Las barras de error indican la desviación estándar de las mediciones por triplicado para cada medición. Los cebadores de RT-PCR usados en el presente documento son:
XIST-Directo: 5'-AGGGAGCAGTTTGCC CTACT-3' (SEQ ID NO: 78);
XIST-inverso: 5'-CACATGCAGCGTGGTATCTT-3' (SEQ ID NO: 79);
OCT4-Directo: 5'-AGTGATTCTCCTGCCTCAGC-3' (SEQ ID NO: 80);
OCT4-Inverso: 5'-CTTCTGCTTCAGGAGCTTGG-3' (SEQ ID NO: 81);
SOX1-Directo: 5'-GGAATGGGAGGACAGGATTT-3' (SEQ ID NO: 82);
SOX1-Inverso: 5'-AACAGCCGGAGCAGAAGATA-3' (SEQ ID NO: 83);
PAX6-Directo: 5'-AAGGATGTTGAACGGGCAGA-3' (SEQ ID NO: 84);
PAX6-Inverso: 5'-TCCGTTGGAACTGATGGA GT-3' (SEQ ID NO: 85);
HPRT-Directo: 5'-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3' (SEQ ID NO: 86);
HPRT-Inverso: 5'-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3' (SEQ ID NO: 87);
EOMES-Directo: 5'-CGCCACCAAACTGAGATGAT-3' (SEQ ID NO: 88);
EOMES-Inverso: 5'-CACATTGTAGTGGGCAGTGG-3' (SEQ ID NO: 89);
CDX2-Directo: 5'-CAGTCGCTACATCACCATCC-3' (SEQ ID NO: 90);
CDX2-Inverso: 5'-TTTCCTCTCCTTTGCTCTGC-3' (SEQ ID NO: 91);
HAND1-Directo: 5'-AACTCAAGAAGGCGGATGG-3' (SEQ ID NO: 92);
HAND1-Inverso: 5'-CGGTGCGTCCTTTAATCCT-3' (SEQ ID NO: 93);
GSC-Directo: 5'-CGCCTCGGCTACAACAACTA-3' (SEQ ID NO: 94);
GSC-Inverso: 5'-CGCCTCGGC TACAACAACTA-3' (SEQ ID NO: 95);
ID1-Directo: AAACGTGCTGCTCTACGACA-3' (SEQ ID NO: 96);
ID1-Inverso: 5'-TAGTCGATGACGTGCTGGAG-3' (SEQ ID NO: 97);
ID3-Directo: 5'-CTACAGCGCGTCATCGACTA-3' (SEQ ID NO: 98);
ID3-Inverso: 5'-TCGTTGGAGATGACAAGTTCC-3' (SEQ ID NO: 99);
ZIC1-Directo: 5'-GCGCTCCGAGAATTTAAAGA-3' (SEQ ID NO: 100);
ZIC1-Inverso: 5'-GTCGCTGCTGTTAGCGAAG-3' (SEQ ID NO: 101);
NANOG-Directo: 5'-GATTTGTGGGCCTGAAGAAA-3' (SEQ ID NO: 102);
NANOG-Inverso: 5'-CAGATCCATGGAGGAAGGAA-3' (SEQ ID NO: 103);
MIXL1 -Directo: 5'-AGCTGCTGGAGCTCGTCTT-3' (SEQ ID NO: 104);
MIXL1-Inverso: 5'-CGCCTGTTCTGGAACCATAC-3' (SEQ ID NO: 105).
Tinción por inmunofluorescencia - Las células se cultivaron durante dos días en cubreobjetos de vidrio (13 mm 1.5 H; Marienfeld, 0117530) fijadas con paraformaldehído/tampón de fosfato al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se permeabilizaron en PBS/Triton al 0.1% durante 10 minutos. Las células se bloquearon con solución de bloqueo (suero de burro normal al 2%, BSA al 0.1% en PBS/Tween al 0.05%) y se incubaron con anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo durante la noche a 4°C (todos los anticuerpos de este estudio se han validado en la bibliografía y por los propios autores de la invención). Después, las células se lavaron tres veces con PBS/Tween al 0.05%, se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron en PBS/Tween al 0.05%, se contratiñeron con dAp I (1 pg/ml), se montaron con Shandon Immu-Mount (Thermo Scientific, 9990412) y obtuvieron imágenes. Para la tinción de H3K27me3 y proteínas nucleares, las células se permeabilizaron en PBS/Triton al 0.5% durante 30 o 10 minutos, respectivamente, y se incluyó Triton al 0.1% en la solución de bloqueo. Todos los experimentos comparativos se hicieron simultáneamente. Para la tinción de MHC de clase I de células humanas, se usó anticuerpo anti-MHC de clase I (BE pharmingen) y las células se analizaron en un analizador y sistema de separación FACS ARIA III. Se usaron los siguientes anticuerpos en las diluciones indicadas:
Tabla 2
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Obtención de imágenes, cuantificaciones y análisis estadístico - Las imágenes se adquirieron con microscopio invertido D1 (Carl Zeiss, Alemania) equipado con cámara DP73 (Olympus, Japón) o con microscopio confocal invertido LSM 700 Zeiss (Carl Zeiss, Alemania) equipado con láseres de estado sólido a 405 nm, 488 nm, 555 nm y 635, usando un objetivo Plan-Apochromat 20x (NA 0.8). Todas las imágenes se adquirieron en modo secuencial. Para el análisis comparativo, todos los parámetros durante la adquisición de imágenes se mantuvieron constantes a lo largo de cada experimento. Las imágenes se procesaron con el software Zen blue 2011 (Carl Zeiss, Alemania) y Adobe Photoshop CS4. La inactivación del cromosoma X se ensayó por la presencia de un foco de tinción de H3K27me3 condensado por núcleo individual y se cuantificó manualmente usando el software ImageJ (NIH) usando.
Análisis de imágenes automatizado y cuantitativo para la localización de TFE3 - La intensidad de la fluorescencia de una sola célula se analizó por función de perfil en el software Zen Blue 2011. Un protocolo de segmentación automatizado desarrollado internamente segmenta el núcleo de la célula contenido en cada imagen. El núcleo se definió por la intersección de la iluminación fluorescente tanto de DAPI como OCT4. Este protocolo se describe en Rais et al (Rais Y., et al. Nature. 3 oct. 2013; 502(7469):65-70. doi:10.1038/nature12587. Epub 18 sep. 2013) y depositado en el sitio web del laboratorio [weizmann (punto) ac (punto) il/molgen/Hanna/Home (punto) html]. A continuación, las células segmentadas se procesan individualmente con el fin de estimar la relación entre la intensidad de TFE3 intranúcleo y la intensidad de TFE3 citoplásmico. Etapas principales en el procesamiento: 1) Definición de un cuadro delimitador que contiene el núcleo segmentado y un margen de 10 píxeles alrededor del núcleo. 2) Estimación de la intensidad media de TFE3 dentro de la máscara del núcleo. 3) Estimación de la intensidad media de TFE3 dentro del cuadro delimitador pero fuera de la máscara del núcleo. Los datos se midieron por muestra de 200 células obtenidas de al menos cuatro campos de imagen independientes. La distribución de las relaciones de intensidad para todas las células se presenta usando un diagrama de caja. Los centros de los diagramas de caja indican el valor mediano y los bordes de las cajas indican los percentiles 25 y 75. Los valores p de las diferencias de distribución indicados en el gráfico se estimaron con la prueba t de muestras emparejadas.
Análisis de inmunotransferencia Western de proteínas - Se aislaron extractos de proteínas de células enteras de células ES humanas. Las transferencias se incubaron con los siguientes anticuerpos en BSA/TBST al 3% o PBST: pSTAT3 (9318; 1:1000; Cell Signalling), STAT3 (C-20; 1:1000; Santa Cruz), pp-Catenina (9561; 1:750; Cell Signalling), p-catenina (610153; 1:2000; BD Biosciences), HSP90a (CA1016; 1:5000; Calbiochem), pJNK (9251; 1:500; Cell Signalling), JNK (SC-571; 1:100; Santa Cruz), pp38 (9215; 1:100; Cell Signalling), p38 (9212; 1:1000; Cell Signalling), pERK (E4; 1:100; Santa Cruz), ERK1.2 (C-14 ; 1:100; Santa Cruz), KLF4 (AF3158; 1:200; R&D), OCT4 (H-134; 1:1000; Santa Cruz), Nanog (397A; 1:1000; Bethyl). Los anticuerpos secundarios eran de cabra anti-ratón ligado a HRP, de cabra anti-conejo y de conejo anti-cabra (1:10000; Jackson). Las transferencias se desarrollaron usando ECL (Thermo).
Análisis de expresión génica de especies cruzadas - Se llevó a cabo en matrices humanas descritas anteriormente y en conjuntos de datos de expresión génica de ESC y EpiSC de ratón previamente descritos en una plataforma de matriz Agilent 4 x 44 k (GSE15603; descrita en [Hanna, J. et al. Cell Stem Cell 4, 513-524 (2009)] que contiene 45018 sondas. Los datos de ratón se procesaron como se ha descrito anteriormente, dando 17885 genes únicos. La ortología humano-ratón se descargó de MGI [informatics (punto) jax (punto) org] que contiene 17772 pares de genes ortólogos. De estos, 9803 se mapearon respecto a los datos de expresión de los autores de la presente invención. Los valores de expresión de ratón y ser humano se transformaron por separado en valores de abundancia relativa [Liao, B. Y. Molecular Biology and Evolution 23, 530-540 (2005)]: para cada gen, el valor de abundancia relativa es el valor de expresión dividido entre la media de los valores de expresión dentro del mismo gen en muestras de la misma especie. La matriz de expresión resultante se sometió a agrupamiento jerárquico (correlación de Spearman, enlace promedio), al igual que la matriz de correlación de Spearman de las muestras. El coeficiente de varianza, una medida para el ruido definida como la desviación estándar dividida entre la media, se calculó por separado para cada una de las dos especies y para los estados naif y cebado. La significación estadística entre las distribuciones del coeficiente de varianza para los dos estados se calculó usando la prueba t unilateral. Los valores atípicos no se mostraron en el gráfico, pero se incluyeron en las pruebas estadísticas.
Inmunoprecipitación de cromatina y preparación de la biblioteca de secuenciación (para los ejemplos 5-9 a continuación) - Se midió la inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación profunda (ChIP-Seq) para las siguientes proteínas - H3K4me3, H3K27me3, H3K4me1, H3K27Ac y H3K9me3 - en células pluripotentes humanas y de ratón (ESC, EpiSC y/o iPSC) expandidas en condiciones de crecimiento naif o cebadas/convencionales sin alimentador y sin suero bovino fetal (expansión sin FBS y alimentador, en placas recubiertas de gelatina/vitronectina). Aproximadamente 40*106 células se entrecruzaron en formaldehído (concentración final al 1%, 10 minutos a temperatura ambiente (TA)) y después se inactivaron con glicina (5 minutos a TA). Las células fijadas se lisaron en HEPES KOH 50 mM a pH 7.5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10%, NP-40 alternativo al 0.5%, Triton al 0.25% complementado con inhibidor de proteasa a 4°C (Roche, 04693159001), se centrifugaron a 950 x g durante 10 minutos y se resuspendieron en SDS al 0.2%, EDTA 10 mM, NaCl 140 mM y Tris-HCl 10 mM. Después, las células se fragmentaron con un Branson Sonifier (modelo S-450D) a -4°C hasta intervalos de tamaño entre 200 y 800 pb y se precipitaron por centrifugación. Se preunieron 10 pg de cada anticuerpo incubando con Dynabeads con proteína G (Invitrogen100-07D) en tampón de bloqueo (PBS complementado con tW e EN al 0.5% y BsA al 0.5%) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadieron perlas lavadas al lisado de cromatina y después se incubaron durante la noche. Las muestras se lavaron 5 veces con tampón RIPA, dos veces con tampón RIPA complementado con NaCl 500 mM, dos veces con tampón de LiCl (TE 10 mM, LiCl 250 mM, NP-40 al 0.5%, DOC al 0.5%), una vez con TE (Tris -HCl 10 mM a pH 8.0, EDTA 1 mM), y después se eluyó en SDS al 0.5%, NaCl 300 mM, EDTA 5 mM, Tris HCl 10 mM a pH 8.0 a 65°C. El eluato se incubó a 65°C durante 8 horas y después se trató secuencialmente con RNasaA (Roche, 11119915001) durante 30 minutos y proteinasa K (NEB, P8102S) durante dos horas. El ADN se purificó con el sistema Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter Genomics, A63881). Se prepararon bibliotecas de muestras de ADN de ChIP invertidas cruzadas de acuerdo con una versión modificada del protocolo de ADN genómico de Illumina, como se ha descrito previamente [Blecher-Gonen, R., et al. Nat Protocol. Marzo 2013; 8 (3):539-54. doi:10.1038/nprot.2013.023. Epub 21 feb. 2013]. Brevemente, el ADN de ChIP se ligó a adaptadores de Illumina y se sometió a 14 ciclos de amplificación por PCR. Los productos amplificados entre 200 y 800 pb se purificaron en un gel de agarosa al 2%. Después se aplicaron aproximadamente 5 picomoles de biblioteca de ADN a cada carril de la celda de flujo y se secuenciaron en el secuenciador Illumina Hiseq2000 de acuerdo con los protocolos estándar de Illumina. Se usaron los siguientes anticuerpos para experimentos de IP de cromatina: IgG de control (calidad ChIP, ab46540, Abcam), Anti-H3K4me3 (ab8580, Abcam), H3K27me3 (07-449, Millipore).
Análisis de datos de secuenciación por IP de cromatina - Los marcadores de cromatina H3K27me3, H3K4me3, H3K4me1, H3K27Ac y H3K9me3 se midieron en 4 líneas celulares pluripotentes humanas diferentes: C1, WIBR3, LIS2 (naif y cebadas), BGO1 y WIBR3-MBD3mut (naif). Además, se midieron H3K27me3, H3K4me3, H3K4me1 y H3K27Ac en EpiSC naif y cebadas V6.5 de ratón. Las mediciones de H3K27me3 y H3K4me3 en ES de ratón naif fueron publicadas previamente por el grupo de los autores de la invención [Mansour, A. A. et al. Nature 488, 409 - 413 (2012)]. Cada muestra era acompañada por un experimento de secuenciación de control de introducción de extracto de células completas. Se usó el software Bowtie [Langmead, B., et al. Genome Biol. 2009; 10(3):R25] versión 1.0.0 para alinear las lecturas humanas respecto al genoma de referencia humano hg19 (UCSC, febrero de 2009) y las lecturas de ratón respecto al genoma de referencia mm9 de ratón (UCSC, julio de 2007). Los autores de la presente invención solo consideraron las lecturas que estaban alineadas de forma única con el genoma con hasta un único apareamiento erróneo, tomando el mejor emparejamiento de cada lectura. Para descartar el sesgo de la secuenciación profunda, las secuencias alineadas se submuestrearon de modo que todas las muestras tuvieran el mismo número de lecturas alineadas. Las muestras humanas de las marcas H3K4me3, H3K27me3, H3K4me1 y H3K27Ac, así como el extracto de células completas, se submuestrearon para incluir 3750000 lecturas alineadas. Las muestras de H3K9me3 se submuestrearon a 5900000 lecturas alineadas. Las muestras de ratón de las marcas H3K4me3, H3K27me3, H3K4mel y H3K27Ac, se submuestrearon a 3420000 lecturas alineadas.
Los perfiles de cromatina (Figs. 70A-F y Figuras 83A-D) se calcularon en todos los genes RefSeq (n = 43463) y en los genes de desarrollo de la siguiente manera: (i) Las densidades de lectura se calcularon entre 3 Kb secuencia arriba respecto a TSS y 3 Kb secuencia abajo respecto a TES. (ii) Cada gen se dividió en bins de tamaño 100, y se calculó la suma de lecturas en cada bin. (iii) Se calculó el perfil promedio para todos los genes, donde el cuerpo del gen, que es de tamaño variable, se representó por 100 cuantiles. Se eliminaron por filtración los genes de tamaño inferior a 1 Kb. (iv) Los perfiles de muestras humanas representan la media y la s.d. (barras de error) de 3 muestras cebadas y 5 muestras naif. Por último, se seleccionaron los genes de desarrollo si tienen una anotación GO que está relacionada con el desarrollo o la diferenciación. Usando este criterio, los autores de la presente invención tenían 5922 genes de desarrollo humano RefSeq y 420 genes de desarrollo de ratón RefSeq. Se procesaron y visualizaron ejemplos concretos de genes (Figs.
71B-D) usando el software IGV versión 2.0 [Robinson, J. T. et al. Nat Biotechnol 29, 24 - 26 (2011)].
La acumulación del marcador H3K9me3 en el cromosoma X (Fig. 76C) también se procesó y visualizó usando IGV69. Aquí, cada cromosoma está representado por 100 genes aleatorios. Para medir la distribución de la acumulación de H3K9me3 en los genes del cromosoma X, se calcularon las RPKM (lecturas por kilobase por 5.9 millones de lecturas) para cada gen (entre 1 Kb secuencia arriba respecto a TSS y TES). Los valores P entre distribuciones se calcularon con la prueba t de muestras emparejadas unilateral.
Los potenciadores se detectaron siguiendo las pautas establecidas por Rada-Iglesias et al. [Rada-Iglesias, A. et al. Nature 470, 279-283 (2011)]. Brevemente, los potenciadores de tipo uno son intervalos genómicos que contienen marcas H3K4me1 y H3K27Ac, no contienen marcas H3K4me3 o H3K27me3 y están al menos a 500 pb de distancia de cualquier TSS. Los potenciadores del tipo dos son intervalos genómicos que contienen las marcas H3K4me1 y H3K27me3, no contienen la marca H3K27Ac y están al menos a 500 pb de distancia de cualquier TSS. Para encontrar esos potenciadores, los autores de la presente invención identificaron en primer lugar intervalos enriquecidos de las marcas anteriores usando MACS versión 1.4.1 [Zhang, Y., Genome Biol. 2008;9(9):R137]. Los autores de la presente invención usaron la secuenciación del extracto de células completas como control para definir un modelo de contexto. Las lecturas duplicadas alineadas con la misma ubicación exacta están excluidas por la configuración predeterminada de MACS. Los intervalos enriquecidos ("picos") que se superponen en al menos 1 pb se consideraron superpuestos, y su unión se definió como el intervalo potenciador, a menos que al menos el 10% del mismo se superpusiera con cualquiera de las marcas excluidas (p. ej. H3K27me3 en el caso de potenciadores de tipo uno) o con TSS. Para calcular el número de potenciadores en muestras humanas (Figuras 84D-E), los autores de la presente invención solo consideraron potenciadores que son comunes a 2 líneas celulares cebadas C1 y WIBR3, o comunes a 4 líneas celulares naif: C1, WIBR3, WIBR3-MBD3mut y BGO1. El nivel de expresión de los genes asociados con potenciadores (Figuras 84G-F) se calculó mapeando cada potenciador respecto al gen más cercano (siempre que esté como máximo a 100 Kb de distancia), convirtiéndolo en Entrez Gene y tomando su valor de expresión del conjunto de datos de expresión génica brutos descrito anteriormente.
Para detectar genes bivalentes, los autores de la presente invención identificaron intervalos enriquecidos de H3K4me3 y H3K27me3 usando MACS. Los intervalos enriquecidos se mapearon respecto a genes si se superponían un intervalo de 3 kb antes de sus sitios de inicio de transcripción y después de su sitio de finalización de transcripción. Los genes se marcaban como bivalentes si tenían tanto H3K27me3 como H3K4me3. En muestras humanas, los autores de la presente invención requerían que los genes fueran bivalentes en al menos 2 líneas celulares. La distribución de la marca H3K27me3 en los componentes genómicos se calculó contando el número de picos de H3K27me3 en cada componente:promotor (intervalo simétrico de 6 Kb alrededor de TSS), cuerpo del gen (entre 3 Kb secuencia abajo respecto a TSS y TES) e intergénico (promotor externo y cuerpo génico). Los picos se dividieron en bins según su altura, calculada como RPKM.
Construcciones de ADN insertadas en células pluripotentes humanas. Los vectores pCAG-IresPuro o pCAG-flox-DsRed-IRES- Puro vectors (7) codificaban los siguiente insertos (que se clonaron con ligaciones cohesivas o de extremos romos en sitios XhoI-NotI): Stat3-C (mutaciones A662C y N664C) (8), Stat3-Y705F (alelo negativo dominante). Las secuencias del potenciador Oct4 humano [las construcciones Oct4DE- y Oct4PE-SV40-luciferasa (Luc)] se clonaron en el vector pGL3-Promotor (Promega) con los siguientes cebadores:
5' hOcCT4PE KpnI: 5'-GGTACCG GATACTCAGGCCAGGCCCAGAAA-3' (SEQ ID NO: 1);
3' hOCT4PE XhoI: 5'- CTCGAGTCCACAGACCTCTGGCACT-3' (SEQ ID NO: 2);
5' hOCT4DE KpnI: 5'-GGTACCCATTGAGTCCAAATCCTCTTTACTAGGTG-3' (SEQ ID NO: 3);
3' hOCT4DE XhoI: 5'-CTCGAGCTGAGGCTCATGCTGCTGG- 3' (SEQ ID NO: 4).
Las construcciones de indicadores se usaron para determinar el patrón de regulación de la expresión de Oct4 y se electroporaron en 0.5-3 x 10-6 junto con el vector pRL-TK para la normalización. Los ensayos se llevaron a cabo usando el Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega). La actividad basal del vector de luciferasa vacío se estableció como 1.0.
Generación de la línea celular NGFP1-Mbd3KD: NGFP1-Mbd3KD se estableció por infección y subclonación de la línea secundaria NGFP1 de iPSC con un vector ShRNA pLKO-Tet-On (Addgene) como se ha descrito anteriormente (Hanna et al. Nature 2009).
Inmunocitoquímica y análisis FACS - Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS y se inmunotiñeron de acuerdo con protocolos estándar usando los siguientes anticuerpos primarios: SSEA1, SSEA4 y SSEA3 (Developmental Studies Hybridoma Bank); Tra-1-60 y Tra-1-81 (Millipore); SOX2 (R&D Systems); OCT3/4 (Biotecnología de Santa Cruz); NANOG humano (policlonal de cabra; R&D Systems), Nanog de ratón (policlonal de conejo; Bethyl). Se usaron anticuerpos secundarios adecuados conjugados con colorante Alexa Fluor (Molecular Probes, Invitrogen). Para la tinción de MHC de clase I de células humanas, los autores de la presente invención usaron anticuerpo anti- MHC de clase I (BE Pharmingen). Para las células de ratón, los autores de la presente invención usaron anti-MHC de clase I de ratón H-2Kb y H-2Kd (eBioscience). Las células humanas se tiñeron con marcadores de superficie celular específicos; APC conjugadas con SSEA4 o PE conjugado con TRA-1-60(R) (R&D). Los datos se recogieron en BD FACS ARIA III y se analizaron con el software Flowjow.
Análisis de metilación del ADN - El ADN se trató con proteinasa K y se extrajo, y 1 pg de ADN se sometió a conversión usando el kit Qiagen EpiTect Bisulfite. Las regiones promotoras de OCT4 y XIST se amplificaron usando cebadores previamente descritos (Hanna et al., 2010b; Lengner CJ, et al. (2010) "Derivation of pre-x inactivation human embryonic stem cell line in physiological oxygen conditions". Cell. 28 de mayo de 2010; 141 (5):872-83; Hockemeyer D et al. (2008) "A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency". Cell Stem Cell 3:346-353; y Soldner F, et al. (2009) "Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors". Cell 136:964-977). Cebador directo de XIST (usado en el ADN tratado con bisulfito): 5'-taa att tta aat taa tta aat tat-3' (SEQ ID NO: 106); cebador inverso de XIST (usado en el ADN tratado con bisulfito): 5'-tgt ttt aga aag aat ttt aag tgt aga ga-3' (SEQ ID NO: 107). Los productos de la PCR se clonaron usando el vector pCR2.1-TOPO y se secuenciaron usando el cebador directo M13. Método para la cuantificación por LC-MS de la metilación relativa de citosina: Se llevó a cabo una medición por espectrometría de masas del contenido de 5-metilcitosina (5mC) (en iPSC/ESC cebadas humanos y iPSC/ESC naif humanas expandidas en condiciones WIS-NHSM modificadas que incluían PKCi y que no incluía las citoquinas FGF2 y TGFB, como se ha descrito previamente [Leitch, H.G. et al. "Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation". Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 311-316 (2013)] con una ligera modificación. Brevemente, se desnaturalizaron 250 ng de ADN genómico de células pluripotentes naif o cebadas expandidas sin células alimentadoras MEF, calentando a 100°C durante 3 minutos. Las muestras se incubaron con 1/10 de volumen de acetato de amonio 0.1 M, pH 5.3 y 2 Unidades (U) de nucleasa P1 durante 2 horas a 45°C. Se añadió un volumen 1/10 de bicarbonato de amonio 1 M y 0.002 unidades de fosfodiesterasa I, seguido de incubación durante 2 horas a 37°C. Finalmente, las muestras se incubaron durante 1 hora a 37°C con 0.5 U de fosfatasa alcalina. Posteriormente, las muestras se diluyeron en formiato de amonio 2 mM, pH 5.5. Los nucleósidos se separaron en una columna Agilent RRHD Eclipse Plus C18 2.1 x 100 mm 1.8u usando el sistema HPLC 1200 (Agilent) y se analizaron usando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 6490. Para calcular las concentraciones de nucleósidos individuales dentro de las muestras analizadas, se generaron curvas de referencia con cantidades conocidas de nucleósidos sintéticos y se usaron para convertir los valores del área del pico en las concentraciones correspondientes.
Bibliotecas de secuenciación por bisulfito de representación reducida (RRBS) para el perfil de secuenciación del genoma completo de la metilación del ADN - Se generaron bibliotecas de RRBS como se ha descrito previamente con ligeras modificaciones [Smith, Z. D. et al. Nature 484, 339-344 (2012)]. Brevemente, se aisló ADN de los sedimentos celulares congelados rápidamente usando el kit Quick-gDNA mini prep (Zymo). A continuación, el ADN aislado se sometió a digestión con MspI (NEB), seguido de reparación del extremo usando mezcla de T4 PNK/polimerasa de ADN T4 (NEB), cola A usando fragmento Klenow (3 ' ^ 5' exo-) (NEB), selección de tamaño fragmentos de menos de 500 pb usando perlas SPRI (Beckman Coulter) y ligación en un plásmido usando ligasa de ADN T4 rápida (NEB). Los plásmidos se trataron con bisulfito de sodio usando el kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo) y el producto se amplificó por PCR usando la ADN polimerasa de inicio en caliente GoTaq (Promega). Se añadió la cola A a los productos de la PCR usando el fragmento Klenow, se ligaron a adaptadores Illumina indexados usando ADN ligasa T4 Quick y se amplificaron por PCR usando ADN polimerasa GoTaq. A continuación, las bibliotecas se seleccionaron por tamaño a 200-500 pb por electroforesis en gel extendida usando agarosa NuSieve 3:1 (Lonza) y extracción en gel (Qiagen). Las bibliotecas se combinaron y secuenciaron en un sistema Illumina HiSeq 2500. Las lecturas de secuenciación se alinearon con la construcción de genoma de ratón 37 (mm9) usando Bismark. Los niveles de metilación se calcularon y promediaron solo para los CpG que estaban cubiertos por 5 o más lecturas de secuenciación distintas a lo largo de todas las bibliotecas. El contenido de CpG "experimentado" por cada sitio CpG se definió como el número de dinucleótidos CpG encontrados dentro de una ventana de 500 pb que rodea el sitio dividido entre el tamaño de la ventana.
Protocolo para inyectar células madre pluripotentes naif humanas y de primate
1. Diseccionar oviductos de hembras B6D2F1 cebadas con hormonas y cruzadas X machos B6D2F1 y extraer cigotos (como se hace habitualmente con micromanipulación de ratón).
2. Cultivar cigotos durante 2 días en gotitas de medio KSOM (Zenith Biotech KSOMaa Evolve n° cat. ZEKS-050) cubiertos con aceite mineral en incubadora a 37°C, 5% de O2, hasta que se desarrollen a la etapa de mórula.
3. Cultivar células naif humanas hasta 70-90% de confluencia en medio NHSM en placas recubiertas con gelatina/MEF irradiados DR4.
4. El día antes de la recolección de células, añadir ROCKi 10 pM a las células (en caso de que no se utilicen continuamente en el medio NHSM).
5. Tripsinizar las células durante ~5 minutos con tripsina al 0.05%, agitar y pipetear completamente para obtener una suspensión celular. Detener la reacción con DMEM FBS al 15% y centrifugar a 1000 RPM durante 3 minutos. Aspirar y descartar el medio.
6. Resuspender las células en 900 pl de medio NHSM, añadir 100 pl de FBS filtrados (para reducir la pegajosidad de las células) y ROCKi 10 pM. Mantener en hielo hasta y durante las inyecciones (muy importante). Es preferible inyectar las células tan pronto como se recojan.
7. Inyectar 15-20 células naif humanas en una mórula de ratón usando Piezo (como se hace habitualmente con las inyecciones de ES de ratón).
8. Después de la inyección, incubar durante 3-4 horas en gotitas de KSOM complementadas con ROCKi 10 pM cubiertas con aceite mineral.
9. Después de 3-4 horas, transferir las mórulas a gotitas de KSOM (sin ROCKi) cubiertas con aceite mineral, incubar durante la noche.
10. Al día siguiente, la mayoría de las mórulas deberían desarrollarse en blastocistos. Transferir 15-20 blastocistos a úteros de ratones hembra B6D2F1 pseudopreñadas.
Ejemplo de referencia 1
Potenciación de la reversión de células madre cebadas a pluripotencia naif
Los autores de la presente invención se propusieron ensayar si manipulaciones genéticas adicionales pueden permitir la reprogramación radicalmente eficaz y homogénea hacia la pluripotencia en estado fundamental. Estudios recientes han señalado la importancia de la desrepresión de la cromatina en la conversión de células somáticas en iPSC (Mansour et al., 2012; Soufi et al., 2012). Además, el estado fundamental de la pluripotencia corresponde a una configuración de cromatina abierta con niveles reducidos de marcas de cromatina represivas (Marks et al., 2012). Por lo tanto, los autores de la presente invención tenían como objetivo realizar un cribado con pérdida de función de factores represores epigenéticos en un intento de potenciar drásticamente la eficacia de la reprogramación a la pluripotencia en estado fundamental. Los autores de la presente invención se centraron inicialmente en revertir las células madre de epiblasto cebadas (EpiSC) (Mansour et al., 2012), que en ausencia de sobreexpresión del factor de transcripción exógeno, pueden convertirse en 7 días en un estado pluripotente naif en condiciones de crecimiento 2i/LIF naif (2i = inhibidor de ERK1/2 PD0325901 e inhibidor de GSK3p CHIR99021). Los autores de la presente invención usaron una línea de EpiSC que lleva un indicador con inserción de Nanog-GFP que está activo solo en el estado fundamental naif (Mansour et al., 2012), y aplicaron el cribado de ARNip con el fin de identificar potenciadores de la reversión de EpiSC en células pluripotentes naif Nanog-GFP+ (Figuras 1A-B y 33A-G). Aunque la inhibición de la metilación del ADN y H3K27me3 por reducción de la expresión de Dnmt1 y EED/Suz12 respectivamente (Mikkelsen et al., 2008), aumentaba la eficacia de la reversión epigenética, todavía solo una minoría de las células de donantes activó el indicador Nanog-GFP (Figura 1A-B). Sorprendentemente, los autores de la presente invención observaron que la inhibición de Mbd3 usando el ARNip de Mbd3 [mBD3HSS147581 (3_RNAI) Invitrogen:
AGGUCAAGGGCAAGCCCGACCUGAA (SEQ ID NO: 52);
MBD3HSS147581 (3_ARNI) Invitrogen-UUCAGGUCGGGCUUGCCCUUGACCU; (SEQ ID NO: 53)] aumentaba notablemente la eficacia de reversión de EpiSC, donde hasta 80% de las células transfectadas activaban Nanog-GFP en condiciones 2i/LIF (Figuras 1A-B) en comparación con <20% en las EpiSC de control (Figuras 1A-B). No se observó un efecto tan notable con ninguno de los otros factores ensayados, incluyendo todos los demás miembros de la familia Mbd ensayados (Figuras 1A-B).
El dominio de unión de metil-CpG 3 (Mbd3; SEQ ID NO: 7) es una proteína componente estructural en el complejo de remodelación y desacetilación de nucleosomas (NuRD), y junto con Mbd 1, 2 y 4, se caracterizó originalmente como una proteína que contiene un región con alta homología con el dominio de unión de metil-CpG (MBD) de MeCP2 (Kaji et al., 2007). Mbd2 y Mbd3 se ensamblan en complejos de NuRD distintos mutuamente excluyentes (Le Guezennec, X. et al. Mol. Cell. Biol. 26, 843-851, 2006), que pueden mediar la represión génica a través de la desacetilación de histonas a través de la histona desacetilasa 1 (HDAC1) y 2, y las actividades de la ATPasa de remodelación de la cromatina a través de sus subunidades de proteína helicasa con cromodominio de unión a ADN 3 (CHD3) (Mi2a) y CHD4 (Mi2b)) (Zhu et al., 2009).
Mbd3/NuRD se une y reprime de forma preferible genes transcritos activamente y algunos de sus componentes (p. ej. Chd4) también se ha implicado en servir como activadores de la transcripción en ciertos locus [Reynolds, N., et al., Cell Stem Cell, 2012, 10:583-594; Günther, K. et al. Nucleic Acids Res. 2013, 41:3010-3021].
Para validar los resultados del cribado de ARNip, los autores de la presente invención usaron ESC Mbd3+/+ y Mbd3flox/-(Kaji et al., 2007) e introdujeron Rosa26-CreER y un alelo con inserción de Nanog-GFP mediante direccionamiento de genes (Figuras 1C y 1H). Las EpiSC se establecieron a partir de las últimas líneas genéticamente modificadas después de microinyección en blastocistos E3.5 y rederivación en E6.5 a partir de epiblasto posterior a implantación (Figuras 33B-G). En comparación con EpiSC Mbd3+/+, las células cebadas Mbd3flox/' revirtieron con mayor eficacia en condiciones de 2i/LIF tamoxifeno (Figuras 1C y 1H), y mostraron una reactivación homogénea de Nanog-GFP, consistente con la reversión a la pluripotencia en estado fundamental36 (Figuras 1D-L). El análisis clonal de una sola célula para la reversión epigenética de las EpiSC (marcadas constitutivamente con mCherry para controlar la eficacia de la siembra en placa) demostró una eficacia de la reversión de una sola célula Nanog-GFP+ de 95% en células agotadas de Mbd3 (Figuras 1C y 1H). Es importante destacar que las EpiSC Mbd3flox/-, que retienen la expresión de la proteína Mbd3 hipomórfica (~20%) (Figuras 1I-J) (Kaji, K. et al. Nat Cell Biol 8, 285-292, 2006), también produjeron ESC revertidas con eficacias >93% (Figuras 1C y 1H). Tanto las células Mbd3'/' (después de inserción transgénica de Mbd3 para rescatar su deficiencia de diferenciación (Kaji, K., et al. Development 134, 1123-1132, 2007; Kaji, K. et al. Nat Cell Biol 8, 285-292, 2006) como las Mbd3flox/- revertidas pueden contribuir a la formación de quimeras adultas (Figuras 1I, J, K, L). La reconstitución de la expresión de Mbd3 en EpiSC Mbd3'/_ y Mbd3flox/' inhibió las eficacias de reversión en 2i/LIF hasta <20% como se observa típicamente en las células de tipo natural (Figuras 1C y 1H). Estos resultados demuestran directamente que la reducción de los niveles de proteína Mbd3 produce una reversión casi completa de las EpiSC murinas a la pluripotencia en estado fundamental.
El hecho de que la falta de Mbd3 promueva la reversión a la pluripotencia es aparentemente contradictorio con estudios previos in vivo que habían sugerido que Mbd3 es esencial para establecer el estado fundamental de pluripotencia después de fertilización (Kaji et al., 2006; 2007). Esta conclusión se basaba en el hecho de que, aunque se podían observar células Oct4+ en la masa celular interna de embriones E3.5 Mbd3'/_, no se podían derivar ESC Mbd3'/_ in vitro después de la explantación en condiciones de derivación de suero/LIF (Kaji et al., 2006; 2007). Sin embargo, las células ES ya establecidas, que pueden tolerar la pérdida de Mbd3 después del direccionamiento génico, muestran una propensión a la diferenciación de trofoblastos en condiciones que contienen suero (Figuras 34A-B) (Zhu et al., 2009), lo cual también puede subyacer a la incapacidad de la técnica anterior para derivar ESC Mbd3'/' en condiciones que contienen suero. Por lo tanto, los autores de la presente invención revisaron la derivación ESC a partir de embriones E3.5 Mbd3'/' en condiciones 2i/LIF sin suero [Ying, Q.-L. et al. "The ground state of embryonic stem cell self-renewal". Nature 453, 519-523 (2008)], y de hecho pudieron aislar ESC Mbd3'/_ que expresaban todos los marcadores de pluripotencia ensayados (Figuras 34A-C, 2A-O). Esto indica que Mbd3 es prescindible para establecer el estado fundamental de pluripotencia y la derivación de ESC de ratón. De acuerdo con esto, la expresión nuclear de la proteína Mbd3 se reduce después de la fertilización a lo largo de todo el desarrollo previo a la implantación y se detecta fácilmente solo en la etapa de blastocisto tardía y de epiblasto post-implantación (Figuras 1O-T y Figuras 35A-C, 36A-J). La expresión de la proteína nuclear Mbd3 se conserva después derivación in vitro en células pluripotentes de ratón tanto naif como cebadas (Figuras 36E-H). Estos resultados indican que la reprogramación y el desarrollo in vivo pre-implantación están acompañados por el agotamiento de la expresión de Mbd3, que se vuelve a expresar una vez que se establece la pluripotencia, de acuerdo con una función crítica para Mbd3 al permitir la diferenciación y salida de la pluripotencia naif [Reynolds, N., Strouboulis, J., Behrens, A., Bertone, P. y Hendrich, B. "NuRD suppresses pluripotency gene expression to promote transcriptional heterogeneity and lineage commitment". Cell Stem Cell, 2012, 10:583-594]. Finalmente, los autores de la presente invención tenían como objetivo ensayar la influencia de la reducción de la expresión de Mbd3 en la reprogramación de células germinales primordiales Oct4+ en células germinales embrionarias (EG) pluripotentes similares a ES. Típicamente, estas células derivan de PGC E8.5 después de explantación en condiciones de crecimiento ES [Durcova-Hills, G., Tang, F., Doody, G., Tooze, R. y Surani, M.A. "Reprogramming primordial germ cells into pluripotent stem cells". PLoS ONE 3, e3531 (2008); Leitch, H. G. et al. "Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state". Development 137, 2279-2287 (2010)]. PGC E8.5 Oct4-GFP+ Mbd3flox/- separadas en células individuales de animales quiméricos, eran competentes en la formación de colonias y líneas de células EG (>95% de eficacia), mientras que las PGC aisladas de quimeras se generan a partir de células Mbd3+/+ o Mbd3flox/- que llevan un transgén que expresa Mbd3 exógeno reprogramado a menos de 10% de eficacia (Figuras 1N-M). En conjunto, estos hallazgos muestran que la neutralización de la expresión de Mbd3 facilita el acceso a la pluripotencia en estado fundamental de las células embrionarias tempranas que expresan Oct4.
Ejemplo de referencia 2
El alivio de la inhibición de mbd3 facilita la reprogramación de células somáticas
En el ejemplo de referencia 2, las células hESC a partir de blastocistos están presentes solo como referencia. Los autores de la presente invención ensayaron si la inhibición de Mbd3 en células somáticas, que carecen de expresión de marcadores de pluripotencia endógenos como Oct4 y están más restringidas en el desarrollo en comparación con las EpiSC y las p Gc , facilita su conversión directa a pluripotencia en estado fundamental con eficacias cercanas a 100%. Los fibroblastos Mbd3+/+, Mbd3flox/' y Mbd3'/_ que llevaban el indicador Oct4-GFP se infectaron directamente con los virus de Moloney que codifican O, K, S, M, y se evaluó la reactivación de Oct4-GFP por citometría de flujo. Aunque las células empobrecidas de Mbd3 se reprogramaron de manera más eficiente en comparación con las células de tipo natural, solo 15% de las células Oct4-GFP se obtuvieron de muestras agotadas en Mbd3flox/' y Mbd3'/_ (Figura 37A). Esto está de acuerdo con un estudio reciente que informa sobre una modesta eficacia de formación de iPSC de hasta 1.5% después de la reducción de la expresión de Mbd3 [Luo, M. et al. "Blocks ReprogAramming of Mouse Somatic Cells into Pluripotent Stem Cells". Stem Cells (2013)]. La infección con el vector policitrónico OKSM [Sommer, C. A. et al. "Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette". Stem Cells 27, 543-549 (2009)] aumentó notablemente la reprogramación de iPSC Mbd3flox/' hacia el 45%, probablemente debido al suministro de transgenes mejorado por célula somática individual (Figura 37B). Dado que las ESC agotadas en Mbd3 requieren condiciones de crecimiento de 2i/LIF sin suero para mantener de manera óptima su pluripotencia (Figuras 34A-B), los autores de la presente invención ensayaron a continuación si la complementación de una variedad de factores exógenos que promueven el crecimiento de células madre naif puede alcanzar la eficacia máxima (Figura 37C). Notablemente, al complementar el medio ES con 2i empezando a las 48 horas posteriores a la inducción del transgén y aplicando condiciones fisiológicas de oxígeno, se obtuvo una mejora notable de la reprogramación. En estas condiciones, 95% de las células Mbd3flox/- y Mbd3'/' eran positivas paraOct4-GFP el día 10, mientras que se observaron solo niveles de hasta 18% en los fibroblastos Mbd3+/+ de control reprogramados en condiciones idénticas de crecimiento y reprogramación (Figura 4A). Para evaluar con precisión la cinética y la eficacia de la reprogramación, los autores de la presente invención establecieron líneas celulares transgénicas Mbd3+/+ y Mbd3flox/' "reprogramables secundarios" (Hanna et al., 2009b; Wernig et al., 2008) que albergan un casete policistrónico OKSM inducible por DOX [Sommer, C. A. et al. "Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette". Stem Cells 27, 543-549 (2009)], un marcador mCherry nuclear constitutivo (para permitir su seguimiento como células individuales y el control de la eficacia de la siembra en placa), y un indicador específico Oct4-GFP (Boiani, M., Kehler, J. y Scholer, H.R. en Methods In Molecular Biology, 2004, 254:001-034) (Figuras 3A-D y 3G). Estas últimas células se inyectaron en el blastocisto del hospedante y se obtuvieron MEF reprogramables secundarios y se usaron para reprogramar cuantificaciones (Hanna et al., 2009b). La separación de células individuales de MEF mCherry+ Mbd3flox/' y posterior reprogramación en condiciones de 2i-LIF+DOX y 5% de O2 produjo de manera reproducible una eficacia de derivación de iPSC de 100% el día 8. En las células de tipo natural reprogramadas en condiciones idénticas, no más de 20% de los clones reactivaron Oct4-GFP, mientras que la mayoría de las células fibroblastos secundarios mCherry no habían reactivado el marcador Oct4-GFP ni adquirido morfología similar a ES (Figura 4B). Las células somáticas agotadas en Mbd3 tenían similares tasas de crecimiento en DOX y niveles de viabilidad de fondo en comparación con las células de control de tipo natural tras la inducción con OSKM, excluyendo así la proliferación celular y la apoptosis como factores potenciales subyacentes a las diferencias observadas en las eficacias de derivación de iPSC (Figuras 5A-F). Se obtuvieron tasas de eficacia de reprogramación de una sola célula radicalmente altas con múltiples líneas secundarias Mbd3flox/' establecidas que albergan diferentes integraciones de OKSM (Figura 4B) y de una variedad de células progenitoras adultas y diferenciadas terminalmente obtenidas de la línea iPSC NGFP1 (Hanna, J. et al. Nature 462, 595-601,2009) que contienen un alelo ARNhp específico de Mbd3 (Mbd3-KD) inducible por DOX y una inserción Nanog-GFP en el indicador (Figuras 31A-E y 38A-B). Todos los clones ensayados aleatoriamente daban tinción positiva para fosfatasa alcalina (AP), marcadores de pluripotencia Oct4 y Nanog (Figuras 4C-G). Se obtuvieron teratomas maduros y quimeras de alta contribución, algunas de las cuales eran competentes en la transmisión de la línea germinal, a partir de múltiples clones de iPSC (Figuras 4C-G y 39A-D), de acuerdo con una reprogramación adecuada a la pluripotencia en estado fundamental.
Los autores de la presente invención analizaron la dinámica de reprogramación de fibroblastos "secundarios" Mbd3flox/" y de control Mbd3+/+ aplicando imágenes de microscopía en vivo (Smith et al., 2010) (Figuras 40A-E). Las mediciones de lapso de tiempo mostraron un aumento notable en la formación de colonias similares a ES en fibroblastos Mbd3fl°x/-(Figuras 4H-I). Se aplicó un algoritmo desarrollado internamente que permite la segmentación de colonias mCherry individuales y el seguimiento de la dinámica de reactivación de Oct4-GFP durante la reprogramación en poblaciones clonales (Figuras 40A-E, 4H-I, 41A-D, 42A-E). El día 6 después de la inducción con d Ox , >98% de las poblaciones clonales Mbd3flox/' reactivaron el marcador de pluripotencia Oct4-GFP, mientras que se detectó solo hasta 15% de eficacia en muestras de control reprogramadas en condiciones de crecimiento idénticas (incluyendo 2i/LIF y 5% pO2) (Figuras 4J-O, 4Q, 4R). El día 6, aproximadamente 85% de las células dentro de cada población clonal Mbd3flox/_ individual se convirtieron en células Oct4-GFP+, mientras que <2% de las células dentro de los clones Mbd3+/+ reprogramado con éxito activaron el marcador Oct4-GFP (Figura 4R). El último análisis cuantitativo no sesgado demostró una reactivación sincronizada intra e interclonal notable de Oct4-GFP que se producía durante una ventana estrecha en poblaciones clonales Mbd3flox/_ los días 4.5-5.5 (Figuras 4Q-R y Figuras 42A-E), y destaca un aumento notable en la sincronía y la eficacia de la reprogramación después de agotamiento de Mbd3 en células somáticas transducidas con OSKM. La detección de Oct4-GFP por citometría de flujo en poblaciones policlonales demostró una cinética similar para la reprogramación de iPSC (Figuras 43A-B). La reinfección con lentivirus que codifican Mbd3, pero no Mbd2, antes del día 5 de reprogramación tenía un efecto inhibidor profundo en la generación de iPSC a partir de MEF Mbd3flox/-, mientras que la reinfección después del día 5 tenía un efecto disminuido (Figuras 44A-B). El análisis cinético anterior sugiere que el Mbd3 puede inhibir la reprogramación cuando se introduce antes de las etapas finales de reprogramación que coinciden con la reactivación endógena de Oct4/Nanog (Silva, J. et al. Cell 138, 722-737, 2009). Sin embargo, una vez que se restablece la pluripotencia, se tolera la presencia de Mbd3 y no compromete el mantenimiento de la pluripotencia en estado fundamental.
Para evaluar la extensión molecular de la reprogramación en células somáticas Mbd3flox/_ y Mbd3+/+ transducidas con OSKM, los autores de la presente invención llevaron a cabo análisis de expresión génica global en MEF del donante y los días 0, 4 y 8 después de la inducción de DOX sin pases de células, y lo compararon con las líneas iPSC y ESC. Solo las células somáticas Mbd3flox/_ se agrupaban por separado de los fibroblastos del donante ya el día 4 después de DOX. Sorprendentemente, el día 8 eran transcripcionalmente indistinguibles de múltiples ESC y líneas iPSC establecidas subclonadas (Figuras 8R, Figuras 45A-B, Figura 7 y Figuras 46A-E). El análisis de RT-PCR de célula individual confirmó que solo en muestras reprogramadas Mbd3flox/_ el 100% (12/12) de las células individuales analizadas expresaban todos los marcadores de pluripotencia que se ha mostrado recientemente que indican células reprogramadas con éxito (Buganim, Y. et al. Cell 150, 1209-1222, 2012) (Sall4, Utf1, Esrrb, Sox2 y Nanog) (Figuras 46D-E). El mapeo de cromatina del genoma completo para H3K27me3 (K27me3), H3K4me3 (K4me3) y H3K27acetil (K27ac) por inmunoprecipitación de cromatina seguido de análisis de secuenciación (Chip-Seq), también confirmó que el día 8, solo los MEF transducidos Mbd3flox/_ habían asumido un perfil de cromatina similar a Es (Figuras 47A-B, 48a -C). El mapeo de la metilación del ADN del genoma completo por secuenciación por bisulfito de representación reducida (RRBS) confirmó que el patrón de metilación similar a iPSC se puede ver en la muestra de población policlonal Mbd3flox/- solo después de 8 días de tratamiento con DOX, pero no en células Mbd3+/+, de acuerdo con los resultados que indican pérdida de metilación de CpG que se produce predominantemente en las últimas etapas de una reprogramación satisfactoria (Polo, J. M. et al. Cell 151, 1617-1632, 2012) (Figuras 49A-B). En conjunto, los resultados anteriores indican que el agotamiento de Mbd3 después de la inducción con OSKM en condiciones 2i/LIF produce un auténtico restablecimiento molecular del estado fundamental de pluripotencia en toda la población de células somáticas del donante y su progenie.
Tras el agotamiento de la expresión de Mbd3, los autores de la presente invención no pudieron aislar células parcialmente reprogramadas estables que no reactivaban Oct4/Nanog-GFP y se podían expandir de manera estable in vitro como normalmente se puede obtener a partir de células somáticas de tipo natural transducidas con OSKM (Figura 8S, 8A-D, 8E) [Sridharan, R., et al., Cell 36 (2):364-77 (2009); Mikkelsen, T. S. et al. Nature 454, 49 - 55 (2008); Costa Y. et al. "NANOG-dependent function of TET1 and TET2 in establishment of pluripotency". Nature 495, 370-374 (21 de marzo de 2013]. El 1-15% de células residuales negativas para Oct4-GFP observadas el día 6 en células Mbd3flox/_ (Figuras 4Q y 4R), se convierten rápidamente en GFP+ en 1-2 días de reprogramación continuada (Figuras 43A-B). Los autores de la presente invención tomaron 3 líneas parcialmente reprogramadas transducidas con OSKM Mbd3+/+ independientes derivadas por diferentes métodos de reprogramación a partir de fibroblastos o células B, e intentaron completar su reprogramación por inhibición de Mbd3. Notablemente, mediante la introducción de ARNip de Mbd3 [mBD3HSS147581 (3_RNAI) Invitrogen: 5'-AGGUCAAGGGCAAGCCCGACCUGAA (SEQ ID NO: 52); MBD3HSS147581 (3_RNAI) Invitrogen- 5'-UCAGGUCGGGCUUGCCCUUGACCU; (SEQ ID NO:53)], los 3 clones activaron notablemente los marcadores de pluripotencia Oct4-GFP o Nanog-GFP tras la expresión continuada de OSKM en 2i/LIF (Figuras 8F-K y 50A-B). Finalmente, la expresión de Mbd3 en epigenoma somático o en células pluripotentes prohibió específicamente la reprogramación de células somáticas murinas a pluripotencia por fusión celular (Figura 51) (Tada, M., et al. Current Biology, 11:1553-1558, 2001). Estos resultados indican que el agotamiento de la expresión de Mbd3 abre una "puerta de acceso" al estado fundamental de pluripotencia.
El análisis filogenético de Mbd3 y otras proteínas del complejo NuRD en 16 metazoos que abarcan todo el clado (desde mamíferos al animal multicelular más simple, T.adhaerens) mostró que Mbd3 y otras proteínas del complejo NuRD tenían un ortólogo en T.adhaerens, pero no en levaduras, lo que podría implicar su aparición en los primeros animales multicelulares junto con Oct4 y pluripotencia del desarrollo (Figura 9).
Para validar funcionalmente un papel inhibidor conservado para MBD3 en la reprogramación de iPSC humanas (Figura 9), los autores de la presente invención generaron hESC MBD3flox/- por edición de genes con efectores de nucleasa TALE (Figura 8L y Figuras 52A-C) (Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 29, 731-734, 2011), y expresión de proteína MBD3 hipomórfica validada en un clon genéticamente modificado correctamente (Figuras 8M-N). Los fibroblastos se diferenciaron in vitro de hESC MBD3+/+y MBD3flox/- y se reprogramaron por transducción de OSKM en condiciones de promoción de pluripotencia humana naif descritas recientemente (condiciones WIS-NHSM - que contienen 2i/LIF+bFGF), y produjeron notablemente >90% de eficacia de iPSC solo a partir de muestras agotadas en MBD3, determinado por tinción de SSEA4 y TRA1- 60 el día 8 (Figura 8O). La eficacia de la reprogramación de célula individual se ensayó después de introducir el indicador con inserción de OCT4-GFP y un mCherry constitutivo en hiPSC MBD3+/+y MBD3fl°x/- que alberga factores OSKM inducibles por DOX. Los fibroblastos secundarios diferenciados in vitro a partir de células Mbd3flox/- se reprogramaron con una eficacia cercana a 100%, mientras que los fibroblastos secundarios diferenciados y reprogramados por los mismos métodos no presentaron eficacias de reprogramación superiores a 2% en condiciones WIS-NHSM (Figura 8O, Figuras 53A-E). Las iPSC MBD3flox/- eran evidentes solo después de la inducción de DOX, y este efecto era inhibido por la sobreexpresión de Mbd3, descartando así la contaminación con iPSC primarias residuales como un fuente de sus altas eficacias de reprogramación observadas (Figura 8O). Además, se obtuvo una formación de iPSC humanas notablemente aumentada aplicando ARNip de MBD3 [mBD3HSS147581 (3_ARNI) Invitrogen: AGGUCAAGGGCAAGCCCGACCUGAA (SEQ ID NO: 52); MBD3HSS147581 (3_RNAI) Invitrogen- UUCAGGUCGGGCUUGCCCUUGACCU; (SEQ ID NO: 53)] los días 2 y 4 después de la inducción con DOX en fibroblastos secundarios transgénicos OSKM MBD3+/+ (Figuras 10A-D). El tratamiento con ARNip de MBD3 permitió la generación reproducible de iPSC humanas a partir de fibroblastos específicos de pacientes humanos adultos solo después de 2-3 ciclos de transfección de ARNm de OSKM LIN28 [Warren, L. et al. "Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA". Cell Stem Cell (2010)] y la posterior detección y aislamiento de colonias el día 8 (Figuras 54A-G). Considerados en conjunto, estos resultados demuestran que la inhibición de MBD3 alivia los obstáculos predominantes para la reprogramación directa de células somáticas humanas a la pluripotencia por OSKM y, por lo tanto, la inhibición de MBD3 se puede usar en una nueva plataforma tecnológica para impulsar la formación de iPSC. Es importante destacar que las células madre pluripotentes humanas agotadas en MBD tienen una morfología similar a ESC de ratón redonda notable y crecen de manera homogénea (Figuras 8P-Q). Estos resultados indican que la inhibición de Mbd3 podría mejorar aún más las condiciones de crecimiento naif WIS-NHSM (descritas en el presente documento).
Ejemplo de referencia 3
Descripción numérica de la reprogramación con OSKM después de agotamiento de MB3
Los autores de la presente invención buscaron a continuación caracterizar cuantitativamente la distribución de latencia de reprogramación para muestras Mbd3+/+ y Mbd3KD y comparar con el comportamiento determinista conocido. Para hacerlo, los autores de la presente invención aplicaron un enfoque descrito previamente para el seguimiento semanal de células Pre-B murinas monoclonales para la reactivación de Nanog-GFP (Figura 31A) (Hanna, J. et al. Nature 462, 595-601,2009). Una línea secundaria NGFP1-iPSC transgénica OSKM se convirtió en transgénica para una reducción de la expresión de Mbd3 inducible por DOX (NGFP1-Mbd3KD) (Figuras 5B, 5C y 5D). De hecho, solo poblaciones de células B monoclonales derivadas de NGFP1-Mbd3KD se convirtieron en iPSC Nanog-GFP+ el día 7 con una eficacia de 100% (Figuras 31B-C). Posteriormente, durante los primeros 10 días de reprogramación, los autores de la presente invención llevaron a cabo la detección diaria de Nanog-GFP en poblaciones de células B NGFP1-Mbd3KD y de control NGFP1 policlonales. Estas últimas células mostraron un aumento notable en la reprogramación y siguieron una cinética similar a la medida en MEF Mbd3flox/_, medida por imágenes de microscopía en vivo (Figuras 55A-B). Los autores de la presente invención después ensayaron si la reprogramación de células Mbd3KD se comporta como una función determinista. En este caso, los autores de la presente invención esperan que todas las células se vuelvan pluripotentes al mismo tiempo después de la inducción con DOX. Dicho comportamiento determinista se aproxima bien mediante una función escalón con 0% de reprogramación antes de un tiempo determinista fijo y 100% de formación de iPS después. El ajuste de la dinámica de reprogramación de las células clonales a dicha función escalón determinista puso de manifiesto un ajuste estrecho (R2>0.9, Chi2=52) de células Mbd3KD, pero no de células Mbd3+/+ de control (R2=0.55, Chi2=405) (Figuras 31D-E). A pesar de la similitud observada con un comportamiento determinista, la variabilidad todavía era evidente en la muestra Mbd3KD en las condiciones optimizadas ideadas en el presente documento. Por tanto, los autores de la presente invención buscaron cuantificar y comparar la variabilidad detectada en las mediciones de latencia de reprogramación tanto en muestras Mbd3+/+ como Mbd3KD y luego comparar con la variabilidad inherente del ciclo celular medida (Hanna, J. et al. Nature 462, 595-601,2009). Para este propósito, los autores de la presente invención usaron dos esquemas de modelización. Primero, los autores de la presente invención ajustaron la latencia de reprogramación observada a la distribución gaussiana: Los autores de la presente invención estimaron el coeficiente de variación (CV = std/media) de cada muestra, y encontraron que mientras que el coeficiente de variación en la muestra Mbd3+/+ es 0.5, el coeficiente de variación de Mbd3KD se redujo a 0.09, muy próximo al coeficiente de variación estimado del ciclo celular (0.08) (Figuras 56A-F y 57A). En segundo lugar, los autores de la presente invención buscaron usar un modelo estocástico dinámico para estimar la variabilidad de la reprogramación. Los autores de la presente invención usaron un modelo de movimiento browniano (BM) (Figura 57C) y encontraron que de hecho Mbd3KD y las mediciones del ciclo celular mostraban la misma variación dinámica, mientras que las muestras Mbd3+/+ mostraban mayor variabilidad (Figura 57B y materiales generales y métodos experimentales anteriores). Para respaldar aún más la reducción de la(s) barrera(s) limitantes de la velocidad tras el agotamiento de Mbd3, los autores de la presente invención modelaron la dinámica del proceso de reprogramación de OSKM usando el modelo de cadena de Markov de múltiples etapas (modelización de tipo de fase (PH) (Bolch, G., Greiner, S., de Meer, H. y Trivedi, K.S. "Queueing networks and Markov chains: modeling and performance evaluation with computer science applications". WILEY, segunda edición, 2006) (Figuras 55C-D, 58A-D, 59A-G). Finalmente, sin estar sujetos a ninguna teoría, los autores de la presente invención plantearon la hipótesis de que la reducción de las barreras limitantes de la velocidad en las muestras Mbd3KD puede reducir la variabilidad de la reprogramación a la variabilidad explicada solo por el ciclo celular. Para este propósito, los autores de la presente invención ajustaron la latencia de reprogramación observada a un modelo de ciclo celular que captura la duración de reprogramación requerida (Materiales generales y métodos experimentales anteriores y datos no mostrados) (Hanna, J. et al. Nature 462, 595-601, 2009; Duffy, K.R. et al. "Activation-Induced B Cell Fates Are Selected by Intracellular Stochastic Competition". Science 335, 338-344, 2012). Específicamente, los autores de la presente invención estimaron el número de generaciones según la duración de la reprogramación y ajustaron la distribución del tiempo del ciclo celular a la latencia de reprogramación observada. Al aplicar este método, los autores de la presente invención obtuvieron un ajuste profundo (R2=0.999) entre el modelo dinámico de Mbd3KD y del ciclo celular, pero no en la dinámica de Mbd3+/+ de control (R2=0.73) (Figuras 57D-E). En conjunto, estos resultados muestran consistentemente una reducción en la variabilidad de la reprogramación y la proximidad al comportamiento dinámico determinista tras el agotamiento de Mbd3, donde la variabilidad restante se puede explicar por la variabilidad inherente del ciclo celular. Es importante destacar que estos hallazgos no excluyen la existencia de rutas alternativas que pueden acelerar o mejorar aún más la dinámica de reprogramación determinista observada en las células agotadas en Mbd3 después de la inducción con OSKM y/o permitir la inducción determinista de pluripotencia sin manipular la expresión o actividad de Mbd3 (Maekawa, M. et al. Nature 474, 225-229, 2011). Además, estos resultados muestran una trayectoria determinista para obtener con éxito iPSC basándose en la medición de la reactivación de genes de pluripotencia endógenos como un resultado final.
Ejemplo de referencia 4
Mecanismos para la inhibición de MBD3 de la reprogramación de iPSC por OSKM
Trabajos recientes han mostrado que el factor de pluripotencia Zfp281 recluta directamente Mbd3/NuRD al promotor Nanog y reprime su expresión (Fidalgo et al., 2012), y que la inhibición de Zfp5281 conduce a un modesto aumento de 2 veces en la eficacia de formación de iPSC (Fidalgo et al., 2012). Dado que la inhibición de Mbd3 realizada aquí conducía a un efecto mucho más pronunciado, en comparación con el agotamiento de Zfp281, esto ha planteado la hipótesis de que Mbd3 puede estar actuando de manera más global en la regulación de la pluripotencia al interaccionar directamente con muchos otros factores promotores de la pluripotencia. Los autores de la presente invención muestran que Oct4, Klf4 y Sox2 marcados con Flag co-inmunoprecipitaban específicamente con Mbd3 después de la sobreexpresión en células 293HEK (Figuras 11A-D y Figuras 11I-L). Es importante destacar que Mbd2 no interaccionaba directamente con todos los demás factores de pluripotencia ensayados (Figuras 11E-H y Figuras 11M-P). Lo anterior podría explicar la clara influencia de Mbd2 y Mbd3 en la reprogramación a pluripotencia en estado fundamental (Figuras 1A-B). En conjunto, estos resultados apoyan una función crítica para el factor de pluripotencia y la interacción directa de Mbd3 en la inhibición de la formación de iPSC por OSKM.
La inhibición de Mbd3 era un contribuyente clave y dominante a la progresión radicalmente eficiente hacia la pluripotencia descrita en el presente documento. Por tanto, los autores de la presente invención tenían como objetivo definir los mecanismos de inhibición de Mbd3 de la reprogramación de iPSC. La inhibición de la expresión de Mbd3 no era suficiente para inducir la formación de iPSC en ausencia de sobreexpresión exógena de OSKM en células somáticas (incluso en NPC que se pueden reprogramar solo con expresión de Oct4) (Kim, J.B. et al. Nature 461 ,649­ 653, 2009) (Figura 38A). Mbd3 no sustituía la expresión de OSK exógena para dar lugar a iPSC (Figura 38B). La presencia de c-Myc exógeno era esencial para obtener iPSC con una eficacia de 100% después de transducción del factor (Figura 38B). El agotamiento de Mbd3 sin la expresión de OSKM no conduce independientemente a la reactivación endógena de genes de pluripotencia bona fide (Figura 38A). Además, el efecto inhibidor de Mbd3 en la pluripotencia no podría atribuirse predominantemente a su capacidad para reprimir Nanog endógeno directa o indirectamente [Luo, M. et al. "NuRD Blocks ReprogAramming of Mouse Somatic Cells into Pluripotent Stem Cells". Stem Cells (2013); Fidalgo, M. et al. "Zfp281 mediates Nanog autorepression through recruitment of the NuRD complex and inhibits somatic cell reprogramming". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16202-16207 (2012)], ya que la sobreexpresión ectópica de Nanog junto con OSKM daba como resultado una mejora modesta en la formación de iPSC y el proceso seguía un curso estocástico (Hanna, J. et al. Nature 462, 595-601, 2009) (Figura 31A y Figura 8E).
Trabajos recientes han mostrado que el factor de pluripotencia Zfp281 recluta directamente Mbd3/NuRD para reprimir la actividad del promotor Nanog, y que la inhibición de Zfp281 conduce a un modesto aumento de 2 veces en la eficacia de formación de iPSC (Fidalgo, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16202-16207, 2012). Dado que, en comparación con el agotamiento de Zfp281 o la sobreexpresión de Nanog (Fidalgo, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16202-16207, 2012), la inhibición de Mbd3 conduce a un efecto radicalmente más pronunciado, se planteó la hipótesis de que Mbd3 puede estar actuando de manera más global en la reprogramación de la regulación al interaccionar directamente con otros factores críticos que promueven la pluripotencia. Los autores de la presente invención establecieron que Oct4, Klf4, Sox2 y c-Myc marcados con Flag co-inmunoprecipitaban específicamente con Mbd3 después de sobreexpresión exógena en células HEK293 (Figuras 32A-B). Los experimentos recíprocos mostraban que Mbd3 marcado con Flag co-inmunoprecipitaba específicamente con Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, pero no con Nanog (Figuras 60A-B). OSKM co-inmunoprecipitaba específicamente con componentes Mbd3/NuRD en células MEF sometidas a reprogramación después de 3 días de inducción con OSKM (Figura 60C). Las ESC Mbd3'/' que expresan el transgén Mbd3 marcado con Flag validaron la interacción directa de Mbd3 con el factor de reprogramación Sall4, que se sabe que se reactiva más adelante en el proceso de reprogramación y coopera con OSKM para finalizar el proceso de reprogramación (Figura 61A) (Buganim, Y. et al. Cell 150, 1209-1222, 2012; Mansour, A.A. et al. Nature 488, 409-413, 2012). Estas interacciones eran mediadas a través del dominio MBD de Mbd3, y las deleciones definidas introducidas en el dominio MBD anularon la co-inmunoprecipitación de Mbd3 con factores de reprogramación OSKM (Figuras 62A-C). Como se ha visto previamente en una variedad de líneas celulares somáticas y de cáncer (Le Guezennec, X. et al. Mol. Cell. Biol. 26, 843-851, 2006), Mbd2 y Mbd3 no se colocalizan en los mismos complejos NuRD validados por experimentos de co-inmunoprecipitación (Figuras 61A-C). Lo anterior explica, al menos en parte, la falta de influencia notable para perturbar la expresión de Mbd2 en la reprogramación a pluripotencia en estado fundamental (Figuras 1A-B, 1A y 44A-B).
De acuerdo con las interacciones de proteínas directas para el complejo Mbd3/NuRD con OSKM descritas antes, el análisis de ChIP-seq del genoma completo de la unión de Mbd3 en m Ef de tipo natural inducidos por DOX, identificó un aumento global en el reclutamiento y unión de Mbd3 después de la inducción con OSKM (1177 regiones de unión en MEF en comparación con 8657 después de la inducción con OSKM). Solo después de la inducción con DOX, los genes unidos a Mbd3 están enriquecido para objetivos de Klf4, Oct4, Sox2 y Esrrb (p <10'22) así como para genes con marca de cromatina activa H3K4me3 en células ES (p <10'38) (Figuras 32C-D). El análisis de búsqueda de motivos en las ubicaciones de unión de Mbd3 identificó 30 motivos (p<0.001), donde los motivos de Klf4, Sox2 y Oct4 están entre los seis primeros (p <10'30) (Figura 63). Es importante destacar que en los MEF somáticos antes de la inducción con OSKM, Mbd3 no se localiza en los genes diana de factores de pluripotencia (Figuras 32C-D). El componente Chd4 de NuRD se reclutó de manera similar a los objetivos secuencia abajo sólo después de la inducción con DOX, lo que indica el reclutamiento de NuRD con Mbd3 después de la inducción con DOX (Figuras 32C-D). La localización de Chd4 respecto a objetivos secuencia abajo de OKSM se redujo en células agotadas en Mbd3 y su reducción de expresión en MEF Mbd3+/+ sometidos a reprogramación mejoró significativamente la formación de iPSC (hasta 50% de células Oct4-GFP+ el día 8 - (Figura 63), lo que respalda la idea de que Mbd3 ejerce su función inhibidora en la reprogramación predominantemente a través de funciones dependientes del complejo NuRD. En particular, la inhibición de Chd4 tenía un efecto relativamente más leve sobre la potenciación de la reprogramación de iPSC, en comparación con el agotamiento de Mbd3, posiblemente porque Chd4 (también conocido como Mi2b) también se encuentra en otros complejos de proteínas cuya influencia en la pluripotencia aún no se ha definido (p. ej. complejo activador de Ep300 (Reynolds, N., Development 140, 505-512, 2013). Sin embargo, sin estar ligados a ninguna teoría, los autores de la presente invención no pueden excluir la inhibición independiente de NuRD adicional para Mbd3 en la reprogramación.
El nivel de transcripción de los genes diana de Mbd3 después de 4 días de DOX se reguló por aumento significativamente después de DOX en muestras agotadas en Mbd3 (Figura 32E), de acuerdo con la función predominante del complejo Mbd3/NuRD como un represor de la red de genes de pluripotencia durante la reprogramación. La cromatina de los objetivos directos de Mbd3 era significativamente más activa y abierta en muestras agotadas en Mbd3 durante la reprogramación, incluyendo niveles más altos estadísticamente significativos de H3K4me3 y H3K27ac, y una marca de cromatina represiva de H3K27me3 reducida (Figura 32F). Además, el agotamiento de Mbd3 permitía una mayor unión de Oct4 exógeno a las dianas de Mbd3 el día 4 después de DOX (p<10-16, Figura 32F). Se encontró que los genes diana de OSKM conocidos que son reactivados durante la formación de iPSC eran regulados por aumento significativamente a los 4 días en células agotadas en Mbd3 y retenían una confirmación de cromatina abierta en comparación con células Mbd3+/+ de control (Figuras 65A-E). Se observó una expresión génica y patrón de cromatina similares con las dianas compartidas de Mbd3 y los factores de reprogramación (OSKM) (Figuras 66A-J). Los mutantes de Mbd3 con capacidad comprometida para interaccionar directamente con factores de reprogramación de OSKM eran deficientes en la reducción de la eficacia de reprogramación de células somáticas Mbd3flox/-, lo que respalda la idea de que las interacciones OSKM-Mbd3 directas son importantes para inhibir la formación de iPSC (Figura 32G). Es importante destacar que los autores de la presente invención observaron que se requería de manera similar una inducción transgénica exógena (DOX) mínima de 5 días para obtener iPSC a partir de células Mbd3+/+y Mbd3flox/' (Figuras 67A-D), y que la expresión de las parejas de interacción con OSK que impulsan positivamente la reprogramación a pluripotencia (como Utx y Wdr5) también es esencial para la formación de iPSC en células empobrecidas en Mbd3 (Figuras 67B-D). En conjunto, estos resultados establecen un paradigma donde los OSKM exógenos interaccionan con múltiples complejos epigenéticos que desreprimen las redes de genes que promueven la pluripotencia (p. ej. complejos que contienen Wdr5 o Utx) (Ang, Y.-S. et al. Cell 145, 183-197, 2011; Mansour, AA et al. Nature 488, 409-413, 2012), también se ensamblan directamente con el complejo represor Mbd3/NuRD. Como resultado, Mbd3/NuRD es reclutado directamente para los genes diana de OSKM secuencia abajo que son esenciales para impulsar el proceso de reprogramación y contrarresta de manera potente su robusta reactivación (Han, J. et al. Nature 463, 1096-1100, 2010; Doege, C.A. et al. Nature 488, 652-655, 2012; Chia, N.-Y. et al. Nature 468, 316-320, 2010). En ausencia del efecto inhibidor de Mbd3, las interacciones de OSKM con reguladores epigenéticos que promueven la pluripotencia predominan funcionalmente y dirigen la progresión ininterrumpida de la reprogramación directa a la pluripotencia.
Análisis y discusión
Mbd3 y reprogramación determinista a pluripotencia naif en estado fundamental
Aquí, los autores de la presente invención identifican el complejo represor específico Mbd3/NuRD como la barrera principal que evita la reversión epigenética de EpiSC, PGC y células somáticas a la pluripotencia en estado fundamental por señalización definida y acceso transcripcional. Este complejo se conserva evolutivamente desde la aparición de la multicelularidad y contrarresta el potencial de reprogramación de una variedad de factores de pluripotencia que establecen cooperativamente el estado fundamental de la pluripotencia. La represión de Mbd3 es tolerada una vez que se establece la pluripotencia, sin embargo, cuando se intenta entrar en este estado, la función inhibidora se vuelve notablemente limitante de la velocidad y evita que la mayoría de las células asuman el estado pluripotente. En conjunto, estos hallazgos muestran que la reprogramación directa a pluripotencia no necesita ser estocástica, y que OSKM y otros métodos de reprogramación aplicados hasta ahora son reduccionistas. Sería interesante investigar si existen rutas alternativas que puedan permitir la inducción determinista de pluripotencia y/o acelerar más la dinámica de reprogramación determinista observada en células agotadas en Mbd3 después de la inducción con OSKM. También será de gran interés determinar si y cómo se neutraliza Mbd3 in vivo durante la pre­ implantación y la reprogramación de la línea germinal.
La capacidad de reprogramar directamente células somáticas en iPSC ha reforzado el interés científico por comprender la dinámica de la reprogramación epigenética a alta resolución y definir con precisión la regulación temporal entre factores de transcripción y remodeladores de cromatina durante todo el proceso de formación de iPSC. A pesar del gran progreso logrado en el campo, los autores de la presente invención todavía están muy limitados en la comprensión de los mecanismos moleculares, la dinámica y la interdependencia entre diferentes capas de regulación de la cromatina, y cómo conducen al establecimiento de distintos estados pluripotentes. Esto último es el resultado directo de la ineficacia y la estocasticidad de los métodos de reprogramación actualmente ideados, junto con la dificultad de aislar prospectivamente las células raras que se reprograman correcta y rápidamente en iPSC. Aunque el estudio de poblaciones intermedias ha proporcionado importantes conocimientos en los mecanismos de reprogramación de pluripotencia, estas células presentan una heterogeneidad molecular excesivamente grande y conservan la aleatoriedad progresiva hacia la pluripotencia. Las estrategias de reprogramación casi deterministas descritas en el presente documento pueden permitir la disección de eventos moleculares auténticos que acompañan a un patrón de progresión más sincronizado y no intermitente hacia las iPSC, que es fundamental para el descifrado molecular de la caja negra de la reprogramación.
Los autores de la presente invención muestran que la trayectoria estocástica y no sincronizada de reprogramación directa por OSKM (Hanna, J. H., et al., Cell, 143, 508-525, 2010) se puede obligar a que se vuelva radicalmente eficiente y determinista con enfoques de reprogramación modificados. Los autores de la presente invención destacan el complejo represor Mbd3/NuRD, que se agota de forma natural durante el desarrollo normal previo a la implantación (Figuras 1O-T), como una barrera predominante que previene la reversión epigenética de EpiSC, PGC y células somáticas a la pluripotencia en estado fundamental por señalización definida y acceso transcripcional. Una variedad de factores críticos de reprogramación interacciona directamente y reclutan el complejo Mbd3/NuRD y, por lo tanto, forman un complejo regulador negativo muy potente que restringe la reactivación del gen de pluripotencia durante todo el proceso. Aliviar esta ruta inhibidora facilita la conversión directa y sincronizada en iPSC por acceso de señalización y transcripcional definido (Figura 32H). Será de gran interés explorar si la reprogramación directa en ausencia de represión de Mbd3 mejora la calidad de las células reprogramadas y reduce la frecuencia de obtención de iPSC reprogramadas de manera aberrante (Zwaka, T. P. Stem cells: Troublesome Memories. Nature. 2010, 467:280-1). Finalmente, la ineficacia y estocasticidad de los métodos de reprogramación actualmente ideados, junto con la dificultad para aislar prospectivamente las células raras que se reprograman correcta y rápidamente en iPSC, han restringido la capacidad para caracterizar la regulación temporal entre factores de transcripción y remodeladores de cromatina a lo largo de todo el proceso de formación de iPSC (Buganim, Y. et al. Cell 150, 1209-1222, 2012). Aunque el estudio de poblaciones intermedias (Hanna, J. et al. Nature 462, 595-601, 2009) ha proporcionado importantes conocimientos sobre los mecanismos de reprogramación de la pluripotencia, dichas células presentan una heterogeneidad molecular excesivamente grande y retienen la aleatoriedad en el progreso hacia la pluripotencia (Polo, J.M. et al., Cell 151, 1617-1632, 2012). La estrategia de reprogramación determinista descrita en el presente documento puede permitir la disección de sucesos moleculares auténticos que acompañan a un patrón de progresión más sincronizado y no intermitente hacia iPSC, que es fundamental para el descifrado bioquímico y funcional de la caja negra de la reprogramación.
Ejemplo 5
Condiciones de crecimiento químicamente definidas para derivar células pluripotentes naif humanas independientes de transgenes e indefinidamente estables
El reciente aislamiento de células madre pluripotentes naif de ratas y cepas de ratones diabéticos no obesos (NOD) (Hanna et al., 2009a), previamente consideradas "no permisivas" para la derivación de ESC, se ha logrado mediante la complementación con moléculas pequeñas o factores de crecimiento que alivian las señales de diferenciación inhibitoria y/o refuerzan las rutas de señalización clave que estabilizan los circuitos transcripcionales centrales de la pluripotencia naif (Hanna et al., 2010b).
Definición de condiciones de crecimiento de pluripotencia naif humana
Para definir las condiciones para expandir células pluripotentes naif humanas que son independientes de la señalización de ERK1/2, los autores de la presente invención usaron en primer lugar una línea de ípSc C1.2 femenina humana "secundaria" descrita previamente, que contiene transgenes lentivirales inducibles por doxiciclina (DOX) que codifican los factores de reprogramación OCT4 (SEQ ID NO: 54 proteína), SOX2 (SEQ ID NO: 56 proteína) y Kl F4 (SEQ ID NO: 58 proteína) (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010; Chia, N.-Y. et al. Nature 468, 316-320 (2010); Lengner, C. J. et al. Cell 141, 872-883 (2010); Tomoda, K. et al. Cell Stem Cell 11, 91-99 (2012); Bernstein, B. E. et al. Cell 125, 315-326 (2006); Guenther, M. G. et al. Cell Stem Cell 7, 249-257 (2010)], y un lentivirus constitutivamente activo que codifica el transactivador de tetraciclina inverso (FUW-M2rtTA) (Figuras 12A-C). Este clon se dirigió con una construcción de indicador con inserción de OCT4-GFP-2A-PURO [Takahashi, K. y Yamanaka, S. Cell 126, 663-676 (2006); Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 29, 731-734 (2011)] para el seguimiento de su mantenimiento de pluripotencia (Figuras 12A-C). Como se estableció previamente [Nichols, J. y Smith, A. Cell Stem Cell 4, 487-492 (2009); Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010], la expresión exógena de los transgenes de factores de reprogramación por complementación con DOX, permite mantener células que son morfológicamente similares a las mESC, a la vez que retiene aproximadamente 60% de la fracción celular OCT4-GFP+ en condiciones 2i/LIF (Figura 12D). En particular, el marcador neural SOX1 era altamente expresado, lo que indica que estas células previamente descritas están estabilizadas de manera aberrante y retienen una propensión a la diferenciación en 2i/LIF DOX (Figura 72A). La línea de hiPSC C1.2 dependiente de DOX se usó para cribar compuestos adicionales y/o factores de crecimiento [Ying, Q.-L. et al. Nature 453, 519-523 (2008); Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107,9222-9227,2010; Tiwari, VK. et al. Nat Genet 2011, 44(1):94-100; De Los Angeles A., et al. Curr. Opin. Genet. Dev. 22, 272-282 (2012); Li, W. et al. Cell Stem Cell 4, 16-19 (2009)] que, tras la retirada de DOX, podría estabilizar las hiPSC C1.2 en 2i/LIF de forma indefinida con expresión de OCT4-GFP homogénea (en casi 100% de las células) (Figuras 12A-C).
Mientras que las células C1.2 se diferenciaba rápidamente solo en condiciones 2i/LIF, la acción combinada de las condiciones de 16 factores (16F- dividido en subgrupos de Grupo 1 y Grupo 2) atenuaba la propensión a la diferenciación y permitía retener 32% de las células OCT4-GFP+ medidas en día 14 después de la retirada de DOX (Figura 12D). Esto indicaba que la combinación 16F contiene factores que promueven cooperativamente el mantenimiento de la pluripotencia humana en condiciones 2i/LIF. Cuando se eliminaron los componentes del Grupo 2 (Figura 12D), la fracción de células OCT4-GFP+ aumentó significativamente en relación con la combinación 16F, lo que sugiere que el Grupo 2 contenía factores que influían negativamente en el mantenimiento de las células GFP+ (Figura 12D). Sin estar ligados a ninguna teoría, los autores de la presente invención plantearon la hipótesis de que la inhibición de las rutas de FGF y TGFp era perjudicial para el crecimiento de células pluripotentes humanas en condiciones 2i/LIF. FGF2 y TGFp tienen una función divergente evolutiva en la promoción de la pluripotencia en seres humanos induciendo la expresión de KLF4 y NANOG en hESC [Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010; De Los Angeles, A., et al. Dev. 22,272-282 (2012); Li, W. et al. Cell Stem Cell 4, 16-19 (2009); Pribluda, A. et al. Nat Biotechnol 30, 247-249 (2012); Nichols, J. y Smith, A. "Pluripotency in the embryo and in culture". Cold Spring Harb Perspect Biol 4, a008128 (2012); Roode, M. et al. Dev. Biol. 361, 358-363 (2012); Rad, R., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011, 108(45):18283-8; Xu, Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8129-8134 (2010); Buecker, C. et al. Cell Stem Cell 6, 535-546 (2010)], pero no en las mEpiSC, donde desempeñan un papel opuesto y promueven el cebado de pluripotencia murina. Además, la aplicación de la inhibición del receptor de FGF en blastocistos en desarrollo humanos no evitó la diferenciación de ICM, lo que sugiere además una función divergente para la señalización de FGF en la influencia en la pluripotencia en seres humanos (Roode, M. et al. Dev. Biol. 361, 358-363 (2012); Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227.2010). De hecho, la eliminación de los inhibidores del receptor de TGFp y FGF recapituló el fenotipo obtenido cuando se eliminaban DOX y los componentes del Grupo 2 (Figura 12D), y sugiere además que los componentes del Grupo 2 no eran necesarios para promover el mantenimiento de las células GFP+ en condiciones que contienen 2i/LIF. Además, los componentes del Grupo 1 complementados con citoquinas exógenas FGF2 y TGFp dieron como resultado OCT4-GFP homogéneo en >95% de células independientes de DOX en condiciones que contienen 2i/LIF (Figura 12D). Después, los autores de la presente invención ensayaron cuáles de los componentes del Grupo 1 eran esenciales para mantener las hiPSC C1.2 OCT4-GFP+ independientes de DOX y encontraron que la complementación con citoquinas 2i/LIF, p38i, JNKi junto con FGF2 y TGFpl era esencial para mantener clones C1.2 GFP+ independientes de transgenes exógenos, en placas recubiertas de gelatina/vitronectina sin alimentadores (Figura 12S). La optimización secundaria identificó quinasas superenrolladas asociadas a Rho (ROCK) (Watanabe, K. et al. "A ROCK inhibidor permits survival of dissociated human embryonic stem cells". Nat Biotechnol 25, 681-686 (2007)) e inhibidores de proteína quinasa C (PKC) (Rajendran, G. et al. "Inhibition of protein kinase C signaling maintains rat embryonic stem cell pluripotency". Journal of Biological Chemistry 288, 24351-24362 (2013)) como refuerzos opcionales de la viabilidad celular, y dieron como resultado condiciones optimizadas químicamente definidas denominadas WIS-NHSM (Instituto de Ciencia Weizmann - Medio de células madre humanas naif) (Figura 12U). Estas condiciones optimizadas químicamente definidas, denominadas "WIS-NHSM" (Figuras 12G, 12T, 72B, 72C y 72D), permitían la expansión de hiPSC C1.2 cariotípicamente normales y GFP+ durante más de 50 pases (Figuras 12J-K, 12V). Notablemente, las células pluripotentes humanas cultivadas en medio WIS-NHSM tienen colonias en forma de cúpula que se asemejan a células murinas naif, por lo que los autores de la presente invención se refieren a las células seleccionadas como iPSC y ESC humanas naif, ya que los autores de la presente invención validan sistemáticamente a continuación la evidencia molecular para esta reivindicación.
Ejemplo de referencia 6
Derivación de ESC humanas naif en estado fundamental
Nuevas ESC naif derivadas de embriones humanos -
En el ejemplo de referencia 6, las células hESC de blastocistos están presentes solo como referencia. Los autores de la presente invención examinaron a continuación si las condiciones WIS-NHSM permiten la derivación de nuevas líneas de hESC a partir de la ICM de blastocistos humanos [Lengner, C. J. et al. Cell 141, 872-883 (2010); Roode, M. et al. Dev. Biol. 361, 358-363 (2012)]. En contraste con la falta de derivación de cualquier línea celular de blastocistos explantados en condiciones 2i/LIF/FGF2 (0% de eficacia, n = 82), los blastocistos humanos sembrados en placas recubiertas con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y medio WIS-NHSM generaron con éxito crecimientos de células en forma de cúpula después de sólo 6-8 días de siembra en placa (Figuras 13N-O). Los crecimientos derivados de ICM después se tripsinizaron y se sometieron a pases, y los autores de la presente invención pudieron establecer y caracterizar 4 líneas de células madre recién derivadas denominadas hESC LIS1, LIS2, WIS1 y WIS2 en condiciones naif con 36% de eficacia (n=11 embriones) frente a 9.5% de eficacia en condiciones convencionales/cebadas como se publicó previamente [Hanna, J. et al. Cell Stem Cell 4, 513-524 (2009); Nichols, J. y Smith, A. Cell Stem Cell 4, 487­ 492 (2009); Ben-Yosef, D. et al. Stem Cells and Development 21, 363-372 (2012)] (Figuras 13N-O 14A-B). También se evaluó el resultado del cultivo de líneas de hESC convencionales ya establecidas en condiciones WIS-NHSM. Múltiples líneas de hESC cebadas/convencionales (H1, H9, BGO1, W iBr 1, WIBR3) y líneas de hiPSC (C1 y C2) se sembraron en placas recubiertas con gelatina/vitronectina en medio WIS-NHSM (Figuras 13A-E). Después de 4-8 días de aplicar este protocolo, las colonias en forma de cúpula con morfología de células redondas empaquetadas, típica de las mESC, se podían aislar fácilmente y expandir más (Figuras 13A-E y 68A-B). Se reprogramaron células fibroblastos BJ humanos a hiPSC en condiciones WIS-NHSM después de transducción lentiviral con factores OKSM inducibles por DOX o por transfección transitoria con ARNm de OSKM y Lin28 (Figuras 13V-W). Las colonias de iPSC en forma de cúpula aparecieron 10 días después de las transducciones de los factores de reprogramación en medio WIS-NHSM (Figura 13V), que posteriormente se recogieron, se tripsinizaron y expandieron para el seguimiento y caracterización adicionales (Figuras 14A-D). Todas las líneas de hESC e iPSC policlonales y subclonadas expandidas en condiciones WIS-NHSM eran uniformemente positivas para marcadores pluripotentes (imágenes representativas en las Figuras 68A-B, 15N-O, 18A-F, 16A-H y 73A-F), adecuadamente diferenciadas in vitro tras el cultivo como cuerpos embrionarios (Figuras 19A-I y 19J-O) y formaban teratomas maduros in vivo (Figuras 68C-H, 20A-L y 20M-T).
Las líneas de hESC y hiPSC naif se expandieron en condiciones de crecimiento definidas independientes de alimentadores o suero bovino fetal en placas recubiertas de vitronectina/gelatina, y se sometieron a pases después de la tripsinización en células individuales. Las líneas pluripotentes naif humanas mantenían el cariotipo normal después de pases extensos (Figuras 15H-M). El tiempo de duplicación promedio para las hESC naif en WIS-NHSM se redujo significativamente de 26 horas para las hESC cebadas a 14 horas para las hESCs/hiPSC naif (Figura 74A). Las iPSC/ESC naif humanas mostraban una eficacia de clonación de células individuales de 35% después de la tripsinización y separación (sin el uso de inhibidores de ROCK), mientras que las hESC y las hiPSC cebadas genéticamente emparejadas convencionales no sobrevivieron a la clonación de células individuales (Figura 74B) (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010). En presencia del inhibidor de ROCK, las hPSC naif tenían una eficacia de clonación de células individuales de hasta 88%, mientras que la clonación de células individuales de células cebadas aumentó sólo hasta 22% (Figura 74B). Sin embargo, la eficacia de clonación de células individuales relativamente reducida en las PSC naif humanas no se atribuye a la limitación de las condiciones WIS-NHSM, sino más bien al hecho de que los seres humanos, a diferencia de los roedores, no expresan la proteína ERAS específica de pluripotencia naif de ratón como resultado de una señal de poliadenilación prematura secuencia arriba que da como resultado un transcrito no codificante truncado [Kameda, T. y Thomson, J. Stem Cells 23, 1535-1540 (2005)]. Notablemente, las mESC Eras_/Y naif tenían niveles de siembra en placa de células individuales cercanas a 45%, de manera similar a los obtenidos en las hESC y las hiPSC naif sin el uso de inhibidor de ROCK (Figura 74C). La reconstitución transgénica de ERAS en condiciones de hESC/hiPSC naif permitía una eficacia de clonación de células individuales comparable a la observada en mESC (Figura 74C). Los autores de la presente invención señalan que la eficacia de derivación de mESC nula para Eras también se reduce en comparación con embriones de tipo natural (WT) en 2i/LIF (Figura 74D). En conjunto, estos resultados indican que las hESC naif tienen propiedades de crecimiento distintas de las hESC cebadas y son comparables a las mESC, particularmente cuando se tiene en cuenta la divergencia en la presencia del gen ERAS funcional entre las dos especies.
El hESC/hiPSC naif descritas en el presente documento son establemente pluripotentes in vitro - Todas las líneas celulares se tiñeron uniformemente de forma positiva para los marcadores de pluripotencia Oct4, Sox2, Nanog, SSEA3, SSEA4, TRA1-60 y TRA1-81 (imágenes representativas en las Figuras. 13F-H, Figuras. 16A-H, Figuras. 17A-H y figuras. 18A-F). Para determinar la capacidad de diferenciación de hiPSC y hESC naif in vitro, los autores de la presente invención usaron cultivo flotante para formar cuerpos embrioides (EB). Después de 6 días en cultivo en suspensión, se formaron fácilmente estructuras en forma de bola a partir de todas las líneas celulares ensayadas (Figuras. 19A-F).
Las hESC/hiPSC naif descritas en el presente documento son establemente pluripotentes in vivo - Para ensayar la pluripotencia in vivo, los autores de la presente invención trasplantaron hESC/hiPSC naif por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes (SCID) y 3-5 semanas después de inyección, se extrajeron teratomas para el examen histológico que mostró que el tumor contenía varios tejidos, incluyendo tejidos epiteliales similares al intestino (endodermo), músculo estriado (mesodermo), cartílago (mesodermo), tejidos neurales (ectodermo) (Figuras. 20A-U).
Juntos, estos resultados indican que las líneas de hESC/hiPSC naif establecidas a partir de hESC/iPSC cebadas previamente aisladas tienen las propiedades funcionales y la potencia de desarrollo de las ESC y las iPSC pluripotentes.
El medio WIS-NHSM se puede usar para generar PSC naif a partir de una masa celular interna humana (ICM) - Los autores de la presente invención examinaron la capacidad para expandir células derivadas de ICM humana (Lengner et al., 2010) en condiciones WIS-NHSM. Se sembró en placa un blastocisto humano sobre células fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en medio WIS-NHSM (Figuras. 13NO). El crecimiento era evidente el día 8, y se tripsinizó y se sometió a pases. Se estableció una línea celular pluripotente y se denominó línea WIS1 hESC (Figura 13O). La línea presentaba un cariotipo normal 46XX, se tiñó positivamente para todos los marcadores pluripotentes ensayados y se diferenciaron in vivo en teratomas (Figuras. 13P-U). Esto indica que WIS-NHSM admite la derivación de líneas ESC humanas directamente a partir de embriones humanos.
Ejemplo 7
Características epigenéticas de la pluripotencia naif humana
Los autores de la presente invención se movieron a continuación para caracterizar las características epigenéticas en hiPSC naif y hESC genéticamente no modificadas establecidas en condiciones WIS-NHSM. Las regiones evolutivamente conservadas potenciadoras distal (DE) y proximal (PE) del gen Oct4 están reguladas recíprocamente en el embrión de ratón antes y después de implantación y, por lo tanto, el potenciador distal de Oct4 se usa predominantemente en mESC naif (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010), mientras que el elemento potenciador proximal es activo con preferencia en las mEpiSC cebadas. Se transfectaron hESC/hiPSC cebadas y naif con una construcción de indicador de luciferasa bajo el control de las secuencias potenciadoras distales o proximales humanas que controlan la expresión del gen OCT4 (Figura 25A). De acuerdo con informes anteriores, las hESC cebadas mostraban una activación preferencial del elemento potenciador de OCT4 proximal como se ve típicamente en las mEpiSC [Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010; Chia, N.-Y. et al. "A genome-wide RNAi screen reveals determinants of human embryonic stem cell identity". Nature 468, 316-320 (2010)]. Notablemente, el uso predominante del potenciador distal de OCT4 se detectó en las hESC y las hiPSC naif, lo que indica que el programa de expresión génica activo en las hESC naif favorece el uso del potenciador distal de OCT4 como se observa típicamente en las mESC (Figura 25A). Para corroborar adicionalmente estos últimos hallazgos, las hESC WIBR3 se transfectaron de manera estable con construcciones indicadoras de BAC genéticamente modificadas OCT4-GFP-2A-PURO, APE-OCT4-GFP-2A-PURO o ADE-OCT4-GFP-2A-PURO de longitud completa (Figura 75A). El indicador OCT4-GFP de tipo natural era específicamente activo en condiciones tanto naif como cebadas, y no se detectó tras la diferenciación (Figura 25A). El indicador APF-OCT4-GFP era predominantemente activo en condiciones de crecimiento naif mientras que el indicador ADE-OCT4-GFP era más activo en células pluripotentes cebadas (Figura 25A y Figuras 75A-I). En conjunto, estos hallazgos indican que las hESC/hiPSC capturadas en condiciones WIS-NHSM usan una regulación epigenética distinta de la expresión de OCT4 de las hESC y las hiPSC convencionales/cebadas.
Puesto que una minoría de líneas de PSC cebadas humanas pueden mantener un estado de pre-inactivación de X [Mekhoubad, S. et al. Cell Stem Cell 10, 595-609 (2012); Papp, B. y Plath, K. Cell 152, 1324-1343 (2013)], el estado epigenético del cromosoma X puede no ser un único marcador fiable para distinguir de manera inequívoca entre estado naif y cebado. Sin embargo, los autores de la presente invención tenían como objetivo analizar la frecuencia y las propiedades del estado de inactivación de X en múltiples líneas de hESC/hiPSC naif.
Las células de la ICM (masa celular interna) humana de blastocistos en etapa tardía presentan un estado de pre­ inactivación de X único en mujeres, donde a pesar de que el gen XIST se transcribe débilmente (incluso en embriones masculinos), ambos cromosomas X se encuentran en un estado de pre-inactivación de X y no demuestran recubrimiento de cromosomas H3K27me3 y XIST hasta la diferenciación [Okamoto, I. et al. Nature. 2011; 472(7343):370-4].
Los autores de la presente invención caracterizaron el estado de inactivación del cromosoma X en hESC/hiPSC naif. Las hESC WIBR3 cebadas/convencionales demuestran inactivación de X como es evidente por la metilación de ~50% del gen XIST, transcripción muy alta del transcrito de XIST de acuerdo con el inicio de la inactivación del cromosoma X (Figuras. 23A-D). Notablemente, todos los clones de hESC e IPSC naif expandidos en WIS-NHSM y ensayados demostraron un estado de pre-inactivación de X único similar al descrito en la ICM humana. Las células presentaban la ausencia casi completa de focos de H3K27me3/polycomb en los alelos del cromosoma X (Figura 23C), que era regulado por aumento tras la diferenciación de EB (Figura 23D).
El seguimiento estrecho de la dinámica del cromosoma X en líneas de hESC femeninas cebadas durante la derivación in vitro en condiciones de bFGF/TGFp solo convencionales, demostró que las células tienen una gran tendencia a sufrir la inactivación del cromosoma X como parte de un proceso de adaptación in vitro [Lengner, C. J. et al. Cell 141, 872-883 (2010); Papp, B. y Plath, K. Cell 152, 1324-1343 (2013); O'Leary, T. et al. Nat Biotechnol 30, 278 - 282 (2012)]. De hecho, las células pluripotentes naif capturadas en WIS-NHSM mantienen uniformemente un cromosoma X preinactivado como es evidente por la falta casi completa de focos nucleares de H3K27me3 y la regulación por disminución de la expresión de XIST (Figuras 68I-K y Figuras 76A-B). La mayoría de las hESC y las hiPSC cebadas/convencionales demuestran inactivación de X, como es evidente por la presencia de focos nucleares de H3K27me3, metilación de uno de los alelos del gen XIST y una transcripción muy alta del transcrito de XIST de acuerdo con el inicio de la inactivación del cromosoma X (Figuras 68I-K y 76A-B). De manera compatible, el mapeo del genoma completo de H3K9me3 por inmunoprecipitación de cromatina seguido de secuenciación profunda (ChIP-Seq) en células pluripotentes humanas cebadas y naif femeninas y masculinas, indicaba un aumento significativo (p <2.1'10) en esta marca en líneas celulares femeninas en el cromosoma X, pero no en el cromosoma 1 autosómico, y solo en células pluripotentes cebadas femeninas (Figura 76C). Es importante destacar que, como se observa en células de la ICM humana, XIST se transcribe en niveles bajos en pluripotencia naif humana, incluso en líneas celulares masculinas (Figura 76B). Los alelos del promotor de XIST están completamente desmetilados en ESC naif masculinas y femeninas (Figura 23A). Tras la diferenciación de EB de hESC/hiPSC naif femeninas, la inactivación de uno de los alelos de los cromosomas X se hace evidente y las células muestran nubes de H3K27me3, regulación por aumento de la transcripción XIST simultáneamente con metilación de una de las regiones promotoras de XIST (Figuras 68I-K, Figuras 76B y Figuras 23A). En conjunto, estos resultados indican que las hESC/hiPSC expandidas en WIS-NHSM mantienen uniformemente un estado de pre-inactivación de X único similar al descrito en las ICM de primates y humanas [Okamoto, I. et al. Nature. 2011, 472(7343):370-4; Masterson, KR. Et al. Dev Biol. 2012, 371 (2):146-55], y puede iniciar adecuadamente la inactivación del cromosoma X tras la diferenciación.
Ejemplo 8
Estado transcripcional y de cromatina de la pluripotencia naif humana
Los autores de la presente invención compararon patrones de expresión génica global entre hESC y hiPSC naif y cebadas, muchos de los cuales estaban emparejados genéticamente. La agrupación sin sesgo de los perfiles de expresión del genoma completo demostró que las hESC y las hiPSC naif poseen un patrón de expresión génica distinto y se agrupaban de forma separada de las hESC y las hiPSC convencionales/cebadas (Figura 69A y Figuras 24A). El análisis de la expresión génica indicaba que mientras que OCT4 y KLF4 se transcribían de manera similar en células naif y cebadas, otros transcritos asociados con la pluripotencia naif eran regulados por aumento significativamente en células naif. Estos últimos incluían genes de miembros de la familia NANOG y DUSP, que se ha mostrado que mantienen la desfosforilación de ERK en las ESC naif de roedores (Figuras 77A-B) [Chappell, J., et al. Genes Dev.
27, 725-733 (2013)]. Es importante destacar que las células pluripotentes naif tenían transcritos profundamente regulados por disminución asociados con genes de compromiso de linaje que incluyen ZIC1, SOX6 y SOX11 que se expresan en niveles bajos, pero apreciables, en hESC cebadas (Figuras 77A-B). El análisis de la anotación funcional de genes expresados diferencialmente con Gene Ontology (GO) reveló que los genes regulados por disminución en pluripotencia naif estaban significativamente enriquecidos para términos de GO vinculados a procesos de desarrollo, en particular especificación del ectodermo y células germinales neurales (Figura 69A y Figura 78). Además, la agrupación jerárquica y el análisis de componentes principales (PCA) mostraron que las muestras de ICM humanas son transcripcionalmente más similares a las hESC naif que a las células cebadas (Figuras 69H-I). También se encontró que casi todos estos términos estaban significativamente regulados por disminución en células pluripotentes naif de ratón, en comparación con mEpiSC (Figura 69A), y están de acuerdo con los cambios transcripcionales asociados con el cebado de pluripotencia descrito en ratones [Marks, H. et al. "The transcriptional and epigenomic foundations of ground state pluripotency". Cell 149, 590-604 (2012)]. Además, aunque se sabe que las células de la ICM experimentan cambios transcripcionales importantes después de la derivación in vitro [Chu, L.-F., et al. Curr. Biol.
21, 1759-1765 (2011)], la agrupación jerárquica y el análisis de componentes principales (PCA) mostraron que las muestras de ICM humanas se agrupan transcripcionalmente más cerca de las hESC naif que de las células cebadas (Figura 79). De manera análoga a las diferencias en el patrón de expresión entre las células madre cebadas y naif de ratón, las hESC cebadas demuestran niveles de expresión intermedios del antígeno de MHC de clase I en comparación con células somáticas, mientras que las hESC/hiPSC naif expresan niveles en trazas del antígeno de superficie de MHC de clase I (Figuras 24B-C). Además, mientras que la E-CADHERINA se expresa en hESC cebadas, el patrón de expresión de superficie se vuelve más prominente y uniformemente distribuido en la membrana de la superficie celular de las colonias de hESC naif (Figuras 81A-D). A continuación, los autores de la presente invención llevaron a cabo un agrupamiento jerárquico de especies cruzadas sin sesgo de transcriptoma medido globalmente para evaluar si las células pluripotentes cebadas/convencionales y naif humanas descritas en el presente documento corresponden globalmente a las establecidas en ratones (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227,2010). Usando un método previamente establecido para el análisis de la expresión génica de especies cruzadas en los 9803 genes ortólogos ratón-humanos encontrados en nuestros conjuntos de datos de expresión génica (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010; Hanna, J. et al. Cell Stem Cell 4, 513-524 (2009)], los autores de la presente invención encontraron que mientras que las hESC y las hiPSC cebadas/convencionales se agrupaban con las mEpiSC, todas las hESC/hiPSC naif se agrupaban con las mESC y miPSC independientemente del contexto genético o las condiciones de crecimiento naif usadas (Figuras 69B y 82A). Además, los patrones de expresión de células pluripotentes humanas y de ratón cebadas eran significativamente más heterogéneos en comparación con sus homólogos naif, como se refleja en la distribución de ruido de los dos grupos en ambas especies (Figuras 69C-D). Estas últimas conclusiones están de acuerdo con los hallazgos descritos en mESC cebadas de suero [Marks, H. et al. Cell 149, 590-604 (2012)] y se aplican cuando se observa la heterogeneidad transcripcional de marcadores previamente destacados [Oakley, D. H., Cell 144, 439-452 (2011)] que se sabe que varían mucho entre las iPSC/ESC humanas (Figura 82B). Finalmente, recientemente se demostró que la localización nuclear del factor de transcripción TFE3 es mejorada en las mESC naif y se está comprometida tras el cebado de pluripotencia [Betschinger, J. et al. Cell 153, 335-347 (2013)]. Notablemente, un patrón de enriquecimiento nuclear similar para TFE3 era evidente en las hESC naif, y el enriquecimiento relativo estaba comprometido en las hESC cebadas/convencionales (Figuras 69E, 69F y 69G, y Figuras 80A-D). En conjunto, estos datos demuestran que WIS-NHSM confiere a las células pluripotentes humanas características definitorias de los patrones de expresión génica de pluripotencia que se observan típicamente en las mESC naif en estado fundamental [Marks, H. et al. Cell 149, 590-604 (2012)].
Los autores de la presente invención ensayaron a continuación si una diferencia entre las células humanas naif y cebadas también es evidente a nivel de la cromatina, ya que el cebado de las ESC naif murinas inducidas por la retirada de 2i y el suministro de suero se asocia con la acumulación de la marca H3K27me3 y la formación de dominios bivalentes (promotor genético marcado por H3K27me3 y H3K4me3) en genes reguladores del desarrollo [Marks, H. et al. Cell 149, 590-604 (2012)]. Los autores de la presente invención mapearon las marcas de cromatina H3K4me3 y H3K27me3 usando ChIP-Seq en ESC naif y EpiSC cebadas de ratón y humanas (ambas expandidas en condiciones exentas de suero). De hecho, mientras que la distribución de ambos marcadores epigenéticos en todos los genes mostraba una disminución significativa (p <2e_37) en H3K27me3 (Figuras 83A-D), se observó una disminución aún más notable de ambas marcas en los genes de desarrollo en mESC en condiciones 2i/LIF en comparación con mEpiSC (p <2.5e'50, Figura 70B). Notablemente, aunque los niveles totales de H3K27me3 no se alteraban, había una notable (p <8.6e'61) redistribución y reducción de H3K27me3 en el promotor y la región del cuerpo génico frente a los genes de desarrollo (n = 5922) en células naif humanas en comparación con cebadas (Figuras 70A-B y 70E-F), equivalente a la observada en células de roedores. En particular, junto con la reducción de H3K27me3 en células naif, hay una leve (p <1.4e_9) reducción de H3K4me3 en los promotores de genes de desarrollo en células naif (Figuras 70A-B). La reducción de la marca H3K27me3 a niveles casi de fondo en células naif humanas también se refleja en el número de genes bivalentes, que es más de 13 veces mayor en las células cebadas (3013) en comparación con las células naif (226). Los genes pluripotentes (p. ej. OCT4, SOX2, SALL4) mostraban cromatina activa consistente en condiciones tanto naif como cebadas en seres humanos y ratones, mientras que el regulador de pluripotencia TBX3 adquirió marcas represivas H3K27me3 en muestras cebadas humanas y ratones (Figuras 70C-D).
Los autores de la presente invención ensayaron si las condiciones humanas naif WIS-NHSM tienen un efecto también en otros componentes genómicos tales como potenciadores. Para ello, los autores de la presente invención midieron en primer lugar la distribución de H3K27me3 en tres componentes genómicos: promotores, cuerpos génicos y regiones intergénicas. De acuerdo con lo observado en células de ratón [Marks, H. et al. Cell 149, 590-604 (2012)], los autores de la presente invención encontraron que en estado de células naif, los picos de H3K27me3 se reducen más de los promotores y cuerpos génicos que de las regiones intergénicas (Figuras 84A-B). Los autores de la presente invención entonces mapearon globalmente potenciadores de clase I y clase II en los dos estados de pluripotencia. Los potenciadores de clase I [Rada-Iglesias, A. et al. Nature 470, 279-283 (2011)] se caracterizan por la presencia de marcas H3K4mel y H3K27ac, y la ausencia de H3K4me3 y H3K27me3, y están asociadas con la expresión activa de genes cercanos. Los potenciadores de clase II, por otro lado, se caracterizan por la presencia de H3K4me1 y H3K27me3, y la ausencia de la marca H3K27ac, y están asociados con estar preparados para la activación [Rada-Iglesias, A. et al. Nature 470, 279-283 (2011)]. De acuerdo con la reducción de las características moleculares de cebado de linaje en la pluripotencia naif, los autores de la presente invención observaron (Figuras 84D-E) una reducción importante en los potenciadores de Clase II anotados en estado de células naif, tanto en seres humanos (5.8 veces) como en ratones (62.5 veces). Aunque los genes asociados a la Clase II pierden su marca H3K27me3 en estado naif, no son transcritos de manera más activa (Figuras 84F-G) (como se observó previamente en ratones [Marks, H. et al. Cell 149, 590-604 (2012)]. En conjunto, estos hallazgos indican que el estado fundamental naif de la pluripotencia carece en gran medida de las características asociadas con el premarcaje de genes de desarrollo reprimidos y hace que estén preparados para la activación.
La pluripotencia naif en estado fundamental de los roedores se asocia con la hipometilación global del ADN, mientras se mantienen firmas de impronta epigenética. Este efecto es mediado por la regulación por disminución mediada por 2i de las nuevas enzimas metiltransferasas y el mantenimiento de la expresión de las hidroxilasas TET y la enzima Dnmt1. Notablemente, las ESC y las IPSC naif humanas expandidas en condiciones WIS-NHSM demostraron una notable regulación por disminución de las enzimas metiltransferasas DNMT3a, DNMT3b y DNMT3L, pero no de las enzimas DNMT1 y TET1/2 (Figura 71D). Los autores de la presente invención analizaron después en las células pluripotentes cebadas y naif humanas los niveles globales de 5-metilcitosina (5mC) por LC-MS) [Leitch, H. G. et al. "Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state". Development 137, 2279-2287 (2010); Meissner, A. et al. "Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells". Nature 454, 766-770 (2008)]. Se observó una caída sorprendente en el contenido global de 5mC en condiciones WIS-NHSM, equivalente a las medidas en mESC naif en condiciones 2i/LIF o ICM de ratón (Figura 71E). En conjunto, estos resultados destacan que las células pluripotentes naif humanas capturadas en el presente documento, recapitulan las características epigenéticas definitorias de la pluripotencia naif de roedores: reducción global de la metilación del ADN y modificación de H3K27me3 en promotores y potenciadores de genes asociados al compromiso de linaje.
Estado de pre-inactivación de X similar a ICM en PSC humanas naif
Las regiones potenciadoras distales y proximales altamente conservadas de los genes Oct4 son reguladas recíprocamente en el embrión de ratón antes y después de la implantación y, por lo tanto, el potenciador distal de Oct4 se usa predominantemente en ESC naif de ratón (Hanna et al., 2010b). Se transfectaron hESC/hiPSC cebadas y naif con una construcción de indicador de luciferasa bajo el control de las secuencias potenciadoras distales o proximales humanas que controlan la expresión del gen Oct4 (Figura 25A). El uso predominante del potenciador distal de Oct4 se observó en rev-hESC y las iPSC humanas, lo que indica que el programa de expresión génica activo en rev-hESC favorece el uso del potenciador de Oct4 distal como se observa típicamente en las ESC de ratón (Figura 25A). Para corroborar aún más estos últimos hallazgos, las hESC WIBR3 se dirigieron con Oct4-GFP-2A-PURO o deltaPE-Oct4-GFP-2A-PURO (Figuras 25B-M). El indicador Oct4 GFP completo era específicamente activo en condiciones tanto naif como cebadas (y se perdía tras la diferenciación). El indicador DeltaPE-Oct4-GFp-2A-PURO era específicamente activo en condiciones de crecimiento pluripotente naif, pero no convencionales/cebadas (Figuras 25B-M). En conjunto, estos hallazgos indican que las ESC/iPSC expandidas en condiciones WIS-NHSM tienen un estado molecular y epigenético distinto.
Las iPSC humanas naif pueden contribuir al desarrollo del ratón in vivo - Las iPSC C2 naif humanas se marcaron constitutivamente con el vector de sobreexpresión de GFP y BCL-2. Las células se agregaron con mórulas de embrión de ratón en desarrollo, y las células GFP de 24 horas eran viables en el desarrollo de embriones de ratón tempranos (Figuras. 26A-C). Estos resultados indican que las células naif humanas cultivadas en condiciones WIS-NHSM pueden contribuir a organismos quiméricos de especies cruzadas.
Ejemplo de referencia 9
Propiedades funcionales y de señalización de PSC naif humanas
En el ejemplo de referencia 9, las células hESC de blastocistos están presentes solo como referencia. Los resultados anteriores indican que aunque tanto en las condiciones de crecimiento naif como cebadas humanas que contienen citoquinas bFGF y TGFp, la complementación de las condiciones naif con inhibidores de 2i/LIF, p38 y JNK reconfigura las propiedades moleculares y epigenéticas de las células pluripotentes humanas. Por tanto, los autores de la presente invención caracterizaron a continuación la dependencia de la señalización y los patrones de respuesta de células pluripotentes humanas naif y cebadas a diferentes estimuladores o inhibidores de señalización, en comparación con sus homólogos de roedores. La pluripotencia de las mESC se estabiliza tras la inhibición de la ruta RAF-ERK1/2, mientras que en las hESC y las mEpiSC (Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010), la inhibición de ERK y RAF con una cualquiera de las cuatro moléculas pequeñas diferentes conduce a su diferenciación (Figuras 21A-F y Figuras 15A-M). Sin embargo, como se observó de manera similar con las mESC naif, la estabilidad de las hESC/iPSC naif dependía de la presencia continua de inhibición de ERK1/2 (Figuras 12S, 86A-C, 87A). La complementación de TGFp es necesaria para inhibir el efecto de diferenciación pro-neural de la inhibición de ERK en condiciones WIS-NHSM naif (Figura 86B). Cuando se ensayan los requisitos de señalización de las rutas de p38 y JNK, las hESC y mEpiSC cebadas tienden a diferenciarse tras la inhibición de estas rutas (Figuras 21A-D, 15A-M y 86C). Los ESC murinos mantienen su identidad de estado pluripotente naif medido por la expresión de APE-Oct4-GFP y la capacidad de formación de ratón "todo-ESC" mediante el ensayo de complementación de embriones tetraploides, tras la inhibición de una cualquiera de las rutas de p38, JNK o ERK (Figuras 88A-J y 89A-D). En células naif humanas, se requiere esencialmente la inhibición simultánea de estas rutas para mantener la pluripotencia naif, y su retirada daba como resultado la diferenciación y regulación por aumento de los genes de compromiso de linaje (Figuras 21A-L, 15A-M, 86A-C y 87A-B). La complementación de TGFp es necesaria para inhibir el efecto de diferenciación proneural de la inhibición de ERK en condiciones WIS-NHSM naif. Las hESC naif transfectadas de manera estable con transgenes que codifican un Stat3 dominante negativo se diferenciaban rápidamente y no podían mantenerse in vitro con las condiciones WIS-NHSM, mientras que las células transgénicas para un mutante de Stat3 constitutivamente activo (Stat3-CA) se podían propagar in vitro en ausencia de LIF exógeno (Figura 108B). Estos hallazgos destacan que varias rutas de señalización regulan claramente los dos estados pluripotentes humanos, de una manera similar a la observada en ratones (Marks, H. et al. "The transcriptional and epigenomic foundation of ground state pluripotency". Cell 149, 590-604 (2012); Hanna, J. et al. "Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227 (2010)].
La señalización LIF/Stat3 es una ruta importante para promover el estado fundamental de pluripotencia naif en roedores, y en condiciones 2i/LIF, las mESC dependen de la señalización de LIF y se diferencian fácilmente cuando se exponen al inhibidor de JAK (JAKi) que bloquea la fosforilación de Stat3 (Figuras 21A- D) [Niwa, H., et al. Nature 460, 118-122 (2009)]. Las hESC tradicionales mantenían niveles bajos de STAT3 fosforilado (pSTAT3), que aumentaba en respuesta a la adición de LIF, sin embargo, las células eran resistentes a la adición del inhibidor de JAK1 (Figuras 15A-M y 90). Alternativamente, las hESC/hiPSC naif tenían niveles altos de pSTAT3 (Figuras 15A-M) y se diferenciaban tras la inhibición farmacológica de JAK/STAT3, como se observaba de manera similar con las mESC (Figuras 21A-D). Las hESC naif transfectadas de manera estable con transgenes que codifican un Stat3 dominante negativo se diferenciaban rápidamente y no se podían mantener in vitro con las condiciones WIS-NHSM, mientras que las células transgénicas para un mutante de Stat3 constitutivamente activo (Stat3-CA) se podían propagar in vitro en ausencia de LIF recombinante exógeno y teratomas generados (Figura 71A, Figuras 22G-L). Finalmente, la citoquina BMP4 y la forskolina, un agonista de PKA, conducían a la diferenciación de células pluripotentes humanas o de ratón cebadas pero no naif (Figuras 21A-D, Figuras 22A-F y Figuras 91A-C), lo que indica que varias rutas son reguladas de forma diferencial entre los dos estados de células pluripotentes humanas de una manera similar a la observada entre mESC y mEpiSC.
Los autores de la presente invención caracterizaron a continuación la diferencia funcional entre células pluripotentes cebadas y naif humanas. Las células pluripotentes humanas naif eran reproduciblemente más susceptibles al direccionamiento génico por recombinación homóloga con vectores de direccionamiento isogénicos dirigidos a los locus OCT4 y COL1A endógenos, en comparación con sus células cebadas genéticamente emparejadas (Figuras 71B, C). Además, dado que se ha demostrado que las condiciones promotoras de pluripotencia naif son importantes para la inducción determinista de pluripotencia por OSKM tras el agotamiento de Mbd3 en ratones, las WIS-NHSM son análogamente críticas para obtener niveles de formación de iPSC en estado fundamental naif cercano a 100% a partir de fibroblastos humanos agotados en Mbd3 después de Inducción con OSKM (Figura 71D). De acuerdo con la reducción global de los niveles de metilación del ADN en condiciones de pluripotencia humana naif, las iPSC a partir de fibroblastos específicos de paciente con X frágil [Urbach, A., Bar-Nur, O., Daley, G. Q. y Benvenisty, N. Brief Report. Stem Cell 6, 407-411 (2010)] son capaces de experimentar la reactivación y desmetilación del gen FMR1 después de la reprogramación en condiciones de pluripotencia naif, pero no cebadas (Figuras 71E-G). Finalmente, de acuerdo con la expresión robusta de E-cadherina y la supervivencia de células individuales mejorada, la microinyección de iPSC naif humanas en mórulas de ratón muestra una integración robusta en la ICM de ratón en E3.5 (Figuras 26D-K) y la microinyección de iPSC naif marcadas con GFP humana en mórulas E2.5 de ratón mostraba una integración robusta en ICM desarrolladas in vitro de ratones en E3.5, y mayor que la de las células pluripotentes cebadas (Figuras 109A-C). Los últimos resultados (con respecto a las iPSC cebadas en la Figura 109B) están de acuerdo con la casi ausencia de integración y quimerismo previamente descrita después de la microinyección embrionaria de ESC cebadas de primates (James, D., Noggle, S. A., Swigut, T. y Brivanlou, A. H. "Contribution of human embryonic stem cells to mouse blastocysts". Dev. Biol. 295, 90-102 (2006); Tachibana, M., Sparman, M., Ramsey, C., Ma, H. y Lee, H. S. "Generation of Chimeric Rhesus Monkeys". Cell 148, 285-295 (2012)]. Los blastocistos de ratón obtenidos después de microinyección con iPSC naif humanas se implantaron en ratones hembra pseudopreñadas y se dejaron desarrollar durante 7 días adicionales in vivo, después de lo cual se diseccionaron y se generaron imágenes en su totalidad con microscopía confocal para la detección de células GFP+. Notablemente, los autores de la presente invención pudieron obtener múltiples embriones de ratón (n = 4), correspondientes a las etapas de desarrollo E8.5-E10.5, que mostraron quimerismo con células GFP+ derivadas de iPSC humanas naif integradas en diferentes ubicaciones, incluyendo tejidos craneofaciales y pliegues neurales embrionarios (Figura 108C; Figura 109D). El análisis profundo funcional y de desarrollo de la integración in vivo de células derivadas de iPSC naif humanas es de gran interés científico para el futuro. En conjunto, lo anterior indica que las características biológicas alteradas de las PSC naif humanas las dota directamente de propiedades funcionales únicas.
Sin embargo, en particular, las ESC/iPSC humanas naif generadas en el presente documento son distintas de las células naif murinas, en el sentido de que todavía dependen de la señalización de bFGF y TGF, y la inhibición de estas rutas conduce a la diferenciación y pérdida de su estado de células naif.
En conjunto, estos hallazgos indican que el estado fundamental naif de pluripotencia requiere una combinación única de factores de crecimiento y citoquinas. Las células humanas son más estrictas que las de ratón, por lo que necesitan la inhibición simultánea de diferentes rutas de MAPK (inhibición simultánea de ERK y JNK y p38) junto con estimulación de LIF y WNT (por CHIR99021). Además, bFGF y TGF divergen entre ratones y seres humanos, y en seres humanos también son esenciales para promover la pluripotencia naif y contribuir a la configuración molecular y epigenética única de la pluripotencia naif descrita en el presente documento.
Estos hallazgos corroboran el concepto de estado fundamental naif en células pluripotentes humanas e indican que su mantenimiento requiere una combinación única de factores de crecimiento y citoquinas. Las células pluripotentes humanas son más estrictas con respecto a sus homólogas de ratón, ya que necesitan la inhibición simultánea de diferentes rutas de MAPK (inhibición simultánea de MAPK ERK, JNK y P38) junto con estimulación de LIF y WNT (por CHIR99021). La señalización de FGF2 y TGFp diverge entre ratones y seres humanos [Greber, B. et al. Cell Stem Cell 6, 215-226 (2010); Roode, M. et al. Dev. Biol. 361, 358-363 (2012)], ya que en seres humanos también son esenciales para promover la pluripotencia naif y contribuir a la configuración molecular y epigenética única de la pluripotencia naif descrita en el presente documento. Estos resultados sugieren que el cebado epigenético de células pluripotentes humanas está causado predominantemente por la retirada de LIF y los inhibidores de la señalización de MAPK [Pribluda, A. & Hanna, J. H. Nat Biotechnol 30, 247-249 (2012)]. Estos hallazgos están de acuerdo con la noción de que diferentes contextos genéticos asumen distintos estados de pluripotencia in vitro, cuya estabilidad es regulada por determinantes genéticos endógenos y puede ser modificada por factores exógenos definidos que apoyan el estado fundamental naif de la pluripotencia. La rigurosidad del requisito de estos factores parece ser diferente entre especies distintas, como se ilustra por el requisito de la inhibición simultánea de múltiples rutas de quinasas MAPK en células humanas naif [Hanna, J. et al. Cell Stem Cell 4, 513-524 (2009); Hanna, J. H. et al., Cell 143, 508-525 (2010); Hanna, J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9222-9227, 2010]. Sería interesante explorar si el estado fundamental naif de pluripotencia en seres humanos se podría capturar simplemente por la inhibición de la ruta de señalización [Ying, Q.-L. et al. Nature 453, 519-523 (2008)]. Los cambios epigenéticos inducidos por las condiciones de pluripotencia naif indican que las condiciones naif podrían influir en los fenotipos de memoria epigenética previamente descritos y en la reprogramación aberrante en las iPSC humanas.
Sin estar ligados por ninguna teoría, estos datos no afirman que los estados pluripotentes naif y cebados sean idénticos entre seres humanos y ratones, y de hecho, todavía pueden existir diferencias entre las mESC naif y las células pluripotentes humanas naif descritas en este trabajo. Sin estar ligados por ninguna teoría, los autores de la presente invención no pueden excluir que se puedan idear condiciones de crecimiento alternativas para capturar células pluripotentes naif humanas con características similares a las descritas en el presente documento, o que las condiciones WIS-NHSM se puedan modificar para mejorar la extensión de las características naif en células pluripotentes humanas. Una mayor caracterización molecular de las células de ICM humanas ayudará a mejorar y comprender la relevancia de las características de la pluripotencia naif in vitro descritas en el presente documento [Smith, Z. D. et al. Nature 484, 339-344 (2012); Okamoto, I. et al. Nature. 2011, 472(7343):370-4; Niakan KK et al. Dev. Biol. 375, 54-64 (2013)]. Finalmente, definir un nuevo estado pluripotente naif en seres humanos que sea estable y no requiera ninguna modificación genética podría ser relevante para el estudio molecular del compromiso de linaje temprano in vitro, y para ampliar las capacidades para usar hESC y hiPSC en la investigación de la medicina regenerativa y modelización de enfermedades in vitro e in vivo [Dimos JT, et al. Science 321, 1218-1221 (2008); Sandoe, J. et al. Nature Publishing Group 16, 780-789 (2013)].
Los resultados descritos en el presente documento demuestran que las hESC/iPSC naif cultivadas en WIS-NHSM son distintas de las hESC/hiPSC previamente aisladas y recapitulan ampliamente las características de crecimiento, dependencia de señalización, propiedades epigenéticas y transcripcionales que definen las ESC de ratón naif, en lugar del epiblasto y las EpiSCs post-implantación del ratón. Además, capturan características moleculares de la ICM humana que no están presentes en la ICM de roedor/ratón. Estos hallazgos apoyan la noción de que diferentes contextos genéticos asumen distintos estados de pluripotencia in vitro, cuya estabilidad es regulada por determinantes genéticos endógenos y puede ser modificada por factores exógenos definidos que apoyan el estado pluripotente naif. El umbral y requisito de estos factores es diferente entre las diferentes especies donde en la cepa de ratón "permisiva" 129 la señalización LIF/Stat3 puede estabilizar las ESC de ratón, mientras que en el contexto genético de NOD la promoción de la señalización de Wnt y la inhibición de ERK1 o proporcionar pequeñas moléculas que promueven la expresión de Klf2/4 (KP o FK) estabiliza las ESC de NOD. El contexto genético humano parece además que es no permisivo, ya que requería la modulación de rutas de señalización adicionales para estabilizar el estado naif in vitro. La divergencia evolutiva ha contribuido a los hallazgos de que, en seres humanos, y posiblemente en otras especies, la señalización de bFGF y TGF contribuye al mantenimiento de la pluripotencia naif humana. Finalmente, definir un nuevo estado pluripotente naif en seres humanos que sea indefinidamente estable y no requiera modificaciones genéticas podría ser relevante para el estudio molecular del compromiso de linaje temprano in vitro y para ampliar las capacidades para usar ESC y iPSC humanas en la investigación de la medicina regenerativa y la modelización de enfermedades in vitro e in vivo.
Formular estos desafíos por las condiciones WIS-NHSM y/o la inhibición de Mbd3, puede resultar clave no solo para comprender el desarrollo humano temprano, sino también para diseccionar los circuitos transcripcionales centrales en células pluripotentes humanas naif en ausencia de transgenes exógenos, ya que permite un análisis más auténtico de este estado. Lo más importante es que las ESC cebadas humanas presentan un gran nivel de heterogeneidad en la expresión génica, incluyendo la expresión diferencial de genes de compromiso de linaje y el estado de activación del cromosoma X. Además, las diferencias sustanciales entre las líneas celulares en la expresión génica no son evidentes en el estado indiferenciado, pero aparecen cuando las células se diferencian en las mismas condiciones de crecimiento. Un análisis comparativo cuidadoso para la diferenciación dirigida en linajes específicos puso de manifiesto una heterogeneidad notable que era evidente por las marcadas diferencias en la propensión a la diferenciación entre línea de células madre embrionarias humanas. Es posible que estas propiedades sean resultado directo de que las células usadas corresponden a la etapa EpiSC, donde las células se vuelven altamente sensibles a señales de diferenciación exógenas e inician el compromiso del linaje. Las ESC/iPSC humanas naif son homogéneas funcional y molecularmente cuando se expanden en condiciones WIS-NHSM. Sin estar ligado a ninguna teoría, parece que las células pluripotentes naif son inherentemente resistentes a las señales de diferenciación por la presencia que promueven la pluripotencia naif y, por lo tanto, pueden demostrar que presentan menor heterogeneidad tras la diferenciación.
Además de la heterogeneidad en la propensión a la diferenciación, el estado pluripotente humano naif podría facilitar la adaptación de protocolos de diferenciación que solo han tenido éxito con las ESC de ratón naif. Un ejemplo destacado es la generación de progenitores hematopoyéticos competentes para el injerto con ESC de ratón capaces de repoblación e injerto secundario in vivo, mientras que el éxito con la ESC humana convencional ha sido rudimentario. Queda por ver si las células pluripotentes naif humanas serán más útiles y más eficientes en la generación de fenotipos relevantes para la enfermedad con quimeras humana-animal (como se muestra aquí en las Figuras.26A-C). Por último, lograr la recombinación homóloga ha sido muy ineficaz en células madre embrionarias humanas cebadas/convencionales. El uso de la exonucleasa de dedos de zinc ha tenido mucho éxito, sin embargo, este método es complejo, caro y podría introducir alteraciones genéticas no específicas en las células manipuladas que son difíciles de identificar. El análisis comparativo de la susceptibilidad a la recombinación homóloga entre los estados pluripotentes naif y cebados de WIS-NHSM en ratones y seres humanos podría proporcionar una respuesta concluyente sobre si las células naif son significativamente más susceptibles a la recombinación homóloga.
Ejemplo de referencia 10
Dominios superenrollados P66 alfa como un inhibidor negativo dominante de Mbd3/NuRD y como facilitador para la reprogramación de iSPC determinista
Siguiendo los estudios descritos en lo que antecede relativos al efecto de Mbd3 sobre el proceso de reprogramación, los autores de la presente invención se propusieron cribar un inhibidor de Mbd3, con el fin de neutralizar la función del complejo MBD3\NuRD.
Puesto que el efecto inhibidor de Mbd3 probablemente es mediado por el reclutamiento del complejo NuRD, uno de los enfoques que adoptaron los autores de la presente invención fue intentar y prevenir la unión de MBD3 al complejo.
Gnanapragasam et al. (Gnanapragasam et al. 2011. "p66a-MBD2 coiled-coil interaction and recruitment of Mi-2 are critical for globin gene silencing by the MBD2-NuRD complex". Proc. Natl. Acad. Sci. 108:7487-7492) describen una interacción superenrollada única entre MBD2 y p66a, otro componente del complejo NuRD, mediada por dos regiones superenrolladas en estas proteínas.
La región superenrollada de MBD2 está altamente conservada entre los homólogos de MBD2 (incluyendo MBD3) y entre especies.
Gnanapragasam et al. 2011 (véase antes) muestran que la sobreexpresión de la región superenrollada de p66a compite con la p66a de tipo natural e inhibe la unión de MBD2 a Mi-2 (a o p). Además, muestran que el p66a-CC también se une a MBD3 en la misma región y crea una estructura similar [La estructura de resonancia magnética nuclear (RMN) de la unión de MBD2 al p66a-CC se encuentra en el Protein Data Bank (PDB) ID - 2L2L; Un portal de información sobre estructuras macromoleculares biológicas. Esta interacción entre p66a-CC y MBD2 inhibe la capacidad de MBD2 para reprimir su expresión génica diana secuencia abajo, probablemente mediada por la unión a c HD4 (proteína helicasa con cromodominio de unión a ADN 4).
Otro artículo que se ha publicado recientemente por Walavalkar et al. (Walavalkar et al. 2013."Unique features of the anti-parallel, heterodimeric coiled-coil interaction entre methyl-cytosine-binding domain 2 (MBD2) homologues and GATA zinc finger domain containing 2A (GATAD2A\P66a)". J. Biol. Chem. 288:3419-3427) muestra que el dominio superenrollado p66a interacciona con Mbd3, mbd311, mbd312 con diferente eficacia; MBD2 y MBD3 se unen aproximadamente con la misma eficacia a p66a. Por lo tanto, sin estar ligados a ninguna teoría, los autores de la presente invención prevén que el dominio superenrollado p66a puede interferir con el ensamblaje del complejo NuRD e inhibir el reclutamiento de Chd4, un componente crítico.
Como se ha mencionado, p66a es un componente del complejo NuRD. Se ha mostrado que los ratones con P66a nulo (pérdida de función) mueren durante el desarrollo temprano (día 10) y que no se requiere p66 para la formación de blastocistos (Marino et al. 2007. "Mutants in the mouse NuRD/Mi2 component p66 are embryonic lethal". PLoS ONE 2(6): e519. doi:10.1371/journal.pone.0000519).
Como prueba de concepto, los autores de la presente invención clonaron el dominio superenrollado p66a en el vector pCAG-HA, con el fin de comprobar su efecto sobre el ensamblaje del complejo NuRD.
Los autores de la presente invención sobreexpresaron MBD3-WT (SEQ ID NO: 112) y p66a-CC marcado con HA en células 293T, y además mostraron en una co-inmunoprecipitación para la disminución de anti-Mbd3, que la presencia de p66a inhibe la unión y el reclutamiento de MBD3 a CHD4 (Figura 93).
Además, las Figuras 92A-C muestran que la reducción de la expresión de Mbd3 o Chd4 aumenta la eficacia de la eficacia de la reprogramación de MEF (Figuras 92A-D).
Los siguientes son los ARNip de MBD3 y CHD4 usados por los autores de la presente invención:
Para ratón:
Mezcla de ARNip de Mbd3 Stealth que incluye los componentes MSS-237238, MSS-275658 y MSS-275659 (Invitrogen);
Mezcla de ARNip de Chd4 Stealth que incluye MSS-200894, MSS-200895 y MSS-200896 (Invitrogen), se usó para la reducción de expresión eficiente en células de ratón.
Para seres humanos:
Se usaron ARNip de MBD3 Stealth que incluyen los componentes HSS147580 y HSS147581 (número de catálogo 1299003) para la reducción de la expresión de MBD3 eficiente en células humanas.
ARNip Stealth de CHD4 humano - se usó HSS101850 de Life Technologies para la reducción de la expresión de CHD4 eficazmente en seres humanos.
Dado que los autores de la presente invención han demostrado en experimentos previos que el efecto inhibidor de MBD3 probablemente es mediado principalmente por Chd4, sin estar ligados a ninguna teoría, se supone que un péptido que puede inhibir la unión de Chd4 a Mbd3 puede servir como un potente inhibidor para MBD3.
Se están realizando más investigaciones bioquímicas de la pérdida de función de MBD3 como resultado de la sobreexpresión de P66aCC (examinando las interacciones con OSKM y el complejo NuRD con otros miembros Mta2, Hdac1, 2). La secuencia codificante del dominio superenrollado de P66 alfa se amplificó usando los cebadores representados en las SEQ ID NO: 115 y 116. La secuencia codificante del dominio superenrollado de P66 alfa resultante se expone en la SEQ ID NO: 113, y la secuencia de aminoácidos del dominio superenrollado de P66 alfa codificada se expone en la SEQ ID NO: 114. El dominio superenrollado de P66 alfa (SEQ ID NO: 114) se puede usar como inhibidor de MBD3.
Los ensayos funcionales, que incluyen reprogramación (después de Chip-seq con y sin tratamiento con p66aCC) están en marcha.
El análisis estructural profundo de la RMN prevista con el fin de encontrar o diseñar compuestos que puedan unirse a esta región de MBD3 está en marcha.
La síntesis de un péptido de la región de p66alfa CC (con señal TAT-NLS-) para prueba funcional está en marcha.
Ejemplo de referencia 11
Reprogramación de iPSC a partir de células somáticas adultas humanas a través de la sobreexpresión OKSM y ERAS, junto con el agotamiento MBD3
Se infectaron fibroblastos BJ humanos con lentivirus de ARNhc TRIPZ MBD3 (3.1, 3.2, 3.3 indican tres construcciones de horquilla diferentes que se dirigen a MBD3). Se llevó a cabo la PCR en tiempo real para la expresión de MBD3 después de 72 horas con o sin inducción con DOX. Los resultados presentados en la Figura 99A validan la regulación por disminución de MBD3 en fibroblastos humanos de una manera dependiente de DOX. Se usaron las horquillas de ARNhc números 1 y 3 para análisis adicionales como combinación.
Las líneas celulares de fibroblastos primarios humanos n° 13 y n° 14 (obtenidas de biopsia dérmica de adulto sano) se infectaron con lentivirus que codificaban OKSM, RtTa, ERAS (SEQ ID NO: 109) (para la sobreexpresión de OKSM, RtTa y ERAS) y con un lentivirus que codificaba los ARNhc de MBD3 (para la regulación por disminución de MBD3).
RtTa (también conocido como M2rtTA) es el elemento que permite responder a la Doxiciclina. Cualquier sistema inducible por DOX requiere la introducción del elemento RtTA, por lo que los autores de la presente invención usaron un plásmido lentiviral que expresa el transactivador de tetraciclina inverso (M2rtTA) [vector de Addgene, número de catálogo: 20342; SEQ ID NO: 110).
Se usaron los siguientes clones lentivirales de reducción de la expresión de MBD3 inducibles por DOX: ID de clon de ARNhc de TRIPZ MBD3 humano: V3THS_392206 (n° 1) y V3THS_392210 (n° 3) - Thermo Scientific). Las poblaciones clonales con morfología similar a ES aparecieron 6-10 días después de la inducción con DOX (Figuras 99B-C). La fluorescencia de la proteína roja fluorescente (RFP) es dirigida por el promotor TetO (sensible a DOX) de las construcciones de ARNhc TRIPZ-MBD3. En las Figuras 99D-G se muestran más ejemplos de colonias observadas en el día 5 u 11.
Las Figuras 100A-I muestran la tinción para marcadores de pluripotencia OCT4 y SSEA4 en células reprogramadas en condiciones NHSM después de 10 días de inducción con OKSM, RtTa, ERAS y MBD3-ARNhc DOX. Se observa que el indicador de inducción MBD3-ARNhc (actividad del vector ShMBD3 marcada por activación del indicador de fluorescencia roja que también es codificado en el vector TRIPZ-MBD3 bajo el promotor TetO inducible por DOX, Figura 100I) se localiza conjuntamente con los marcadores de expresión de OCT4 y pluripotencia SSEA4.
Las Figuras 100J-N muestran la tinción para marcadores de pluripotencia de tinción OCT4 y TRA1-60 en células que se reprograman en condiciones NHSM después de 10 días de inducción de OKSM, RtTa, e Ra S y MBD3 ARNhc d Ox . Se observa que el indicador de inducción de MBD3-ARNhc (ShMBD3, Figura 100I) se localiza conjuntamente con los marcadores de expresión de OCT4 y pluripotencia TRA1-60.
Las Figuras 100O-S muestran la tinción para marcadores de pluripotencia de tinción OCT4 y TRA1-81 en células que se reprograman en condiciones NHSM después de 10 días de inducción de OKSM, RtTa, ERAS y MBD3-ARNhc d Ox . Se observa que el indicador de inducción de MBD3-ARNhc (ShMBD3, Figura 100I) se localiza conjuntamente con los marcadores de expresión de OCT4 y pluripotencia TRA1-81.
Se transdujeron células fibroblastos dérmicos adultos femeninos primarios (línea n° 13) con vectores RtTa, OSKM y ERAS en condiciones WIS-NHSM, con o sin mezcla de ARNhc TRIPZ-MBD3 1 3 (para reducir la expresión de MBd 3 humano). El número de colonias de iPSC se contó el día 10 por tinción para los marcadores NANOG y TRA1-60 (Figura 100T). Obsérvese el aumento notable en la formación de iPSC a partir de células somáticas humanas primarias cuando se introduce la inhibición de MBD3.
Ejemplo 12
IPSC y ESC humanas naif se pueden diferenciar en precursores de células germinales primordiales
Células similares a células germinales primordiales (PGC) (PGCLC) derivadas de iPSC/ESC naif humanas se pueden inyectar en testículos de ser humano/primate o ratón y dar lugar a espermatozoides funcionales. Alternativamente, se pueden usar para la generación de ovocitos.
Materiales y medios:
Medio N2-KSR - 250 ml de medio neurobasal (Invitrogen - n° 21103-049), 250 ml de DMEM-F12, complemento N2 (Invitrogen, n° 17502-048), medio KSR (reemplazo de suero KnockOut, Invitrogen, n° 10828028) al 1%] con bFGF 8 ng/ml (Peprotech), TGF-p1 1 ng/ml (Peprotech) y ROCKi (10 pM).
El medio PGC está compuesto de GMEM (Invitrogen, n° 21710082), KSR al 15%, NNEA al 1% (Biological industries, 01-340-1B), penicilina-estreptomicina, L-glutamina 1 mM, ROCKi 5 pM (Y-27632, Axon Medchem) y las siguientes citoquinas: BMP4 500 ng/ml (proteína morfogenética ósea 4; R&D Systems Inc.), LIF 20 ng/ml (factor inhibidor de leucemia; PeproTech), SCF 100 ng/ml (factor de células madre; PeproTech), EGF 50 ng/ml (factor de crecimiento epidérmico; Peprotech).
Métodos experimentales:
Generación de alelo indicador de inserción de mCherry en el locus NANOS3 - Con el fin de crear la expresión del indicador mCherry dirigida por el locus NANOS3 humano endógeno, los autores de la presente invención han optado por insertar la secuencia que codifica p2a-mCherry en el marco con el último exón del gen NANOS3. Los autores de la presente invención han generado plásmidos que codifican moléculas de TALEN específicas para la región que cubre el codón de terminación NANOS3. Las construcciones de TALEN se generaron usando GoldenGate TALEN kit 2.0 (Addgene cat n° 1000000024).
Se diseñó la construcción de direccionamiento para la inserción de 2A-mCherry como se muestra en la Figura 94A. Se electroporaron ESC humanas naif WIS1 (que llevan también el indicador deltaPE-OCT4-GFP) con un par de plásmidos que codifican TALEN y un constructo de direccionamiento del donante. Después de selección con G418 (150 pg/ml) y ganciclovir (2 pM), los autores de la presente invención usaron PCR para analizar 96 de los clones individuales supervivientes. Uno de los clones dirigidos correctamente (basado en PCR y análisis de transferencia Southern) se transfectó con un plásmido que codifica la enzima flipasa con subclonación posterior. La deleción del casete Neo se confirmó por PCR. Además de esto, se secuenció locus objetivo completo y se realizó el análisis del cariotipo para uno de los clones correctamente dirigidos. Tanto la secuenciación como el cariotipado no pusieron de manifiesto ninguna anomalía, y por lo tanto las células se usaron para la validación funcional posterior.
Inducción del estado de epiblasto - Se cultivaron ESC humanas naif, ya sea células modificadas genéticamente con la construcción NANOS3-mCherry o células no modificadas, en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) irradiados o placas recubiertas de gelatina al 0.2% o vitronectina\gelatina, en medio WIS-NHSM complementado con ROCKi 5 pM (Y-27632, Axon Medchem). Las células se tripsinizaron con tripsina al 0.05% EDTA, y se sembraron 50000 células/6 pocillos en placas cubiertas con fibronectina 1 ng/ml (F1141, Sigma) en medio N2-KSR, que induce un estado similar a epiblasto (EpiLC).
Después de dos días en el medio N2-KSR, las células EpiLC se tripsinizaron y se trasladaron a placas de 96 pocillos de baja unión celular (145399, NUNC), con una densidad de 2500 células/pocillo, en 120 pl de medio PGC.
Se añadieron cincuenta microlitros (50 pl) de medio PGC de nueva aportación a cada pocillo después de dos días. Cuatro o seis días después de que las células se trasladaran al medio PGC, se separaron usando TripLE select (10x) (Invitrogen) para citometría de flujo o análisis molecular.
Resultados experimentales
Generación de alelo indicador de inserción de mCherry en el locus Nanos3 - Como se muestra en las Figuras 94A-B, las células humanas naif (WIS1) se dirigieron a un proceso de modificación genética a través de los TALEN con el fin de preparar células en las que la expresión de NANOS3 es visible por la expresión del gen indicador mCherry. NANOS3 es un gen expresado específicamente en PGC ya desde las primeras etapas de su desarrollo (Julaton et al. Hum Mol Genet. 1 de junio 2011; 20 (11):2238-50).
Se indujeron ESC naif al estado de epiblastos sembrando las células en placas cubiertas con fibronectina e incubando en presencia de medio N2-KSR durante 2 días. A continuación, las células se retiraron de las placas por tripsinización y se transfirieron a placas de baja unión celular en presencia del medio PGC. De cuatro a seis días después, las células se separaron de las placas usando el agente TripLE select y se sometieron a citometría de flujo y análisis molecular. La Figura 95 muestra imágenes representativas de las células durante el proceso de diferenciación.
BMP4 induce la expresión del gen indicador NANOS3-mCherry - Las células que se sometieron al proceso de diferenciación descrito en el presente documento, usando los medios N2-KSR y PGC, se examinaron por FACS para determinar la expresión del gen indicador NANOS3-mCherry, que indica que las células están en el estado similar a PGC. Por lo tanto, como se muestra en las Figuras 96A y 96B, aunque las células ESC naif (Figura 96BA) y EpiLC cebadas (Figura 96C) no expresaron el indicador NANOS3-mCherry, después de 4 días en el medio PGC (después de estar durante 2 días en el medio N2-KSR), y en presencia de BMP4 en el medio PGC, una fracción significativa de las células expresó el gen indicador mCherry, lo que indica la expresión de NANOS3 (17.7%; Figura 96E). Por otro lado, en las mismas condiciones, pero sin BMP4 en el medio PGC, solo se observó una expresión mínima del indicador mCherry (0.45% de las células; Figura 96H), lo que sugiere que BMP4 es importante para la diferenciación de las células humanas naif en células similares a PGC (PGCLC).
La evaluación de los marcadores de PGC en las células de PGCLC inducidas a partir de las ESC naif demuestra la generación de PGC a partir de células madre pluripotentes naif - Las células PGCLC generadas por el método descrito en el presente documento se evaluaron adicionalmente para determinar la expresión de marcadores de PGC. Por lo tanto, como se muestra en las Figuras 97A-H, los marcadores de PGCLC se inducen en el protocolo aplicado en ESC naif humanas, incluyendo STELLA (Figura 97D), INTEGRINB3 (Figura 97G), BLIMP 1 (Figura 97B) y VASA (Figura 97H).
Las ESC cebadas, que se modificaron genéticamente con el vector de inserción de NANOS3-mCherry, se sometieron al mismo protocolo de diferenciación descrito en el presente documento. Sin embargo, no pudieron formar PGCLC. Por lo tanto, como se muestra en las Figuras 98A-B, los análisis de FACS de ESC humanas convencionales/cebadas que se sometieron a incubación en el medio PGC solo (Figura 98A) o en el medio de EpiLC seguido por el medio de PGC (Figura 98B) no dieron como resultado en la expresión del gen indicador NANOS3-mCherry, demostrando así la falta de diferenciación en las células germinales primordiales. Estos resultados muestran que las ESC humanas convencionales/cebadas sometidas a protocolo de inducción de PGCLC que incluyen BMP4, no activan satisfactoriamente el indicador NANOS3mCherry.
Análisis adicionales de FACS (Figuras 106A-D) muestran que las células NANOS3 mcherry+ regulan por aumento específicamente el marcador de superficie CD61 (IntergrinaB3). Las células NANOS3-mCherry+ también expresan marcadores de superficie SSEA4 (Figuras 107A-B). Este análisis indica que el marcador de células CD61+ o la combinación de superficie celular CD61+/SSEA4+ se puede usar para separar y aislar PGCLC humanas derivadas de células pluripotentes naif humanas (sin la necesidad de modificación genética del indicador de inserción de NANOs3). Los resultados indican la importancia de usar células pluripotentes naif humanas como material de partida para la inducción de PGCLC humana.
Ejemplo de referencia 13
La inhibición de la proteína quinasa C da como resultado niveles reducidos de proteína MBD3 de células madre embrionarias
Los autores de la presente invención ensayaron varios factores, moléculas pequeñas y agentes para determinar la capacidad de reducir los niveles de expresión de la proteína MBD3 en células madre embrionarias.
Se expandieron células ES de ratón V6.5 durante 4 días en diversas condiciones con el fin de identificar la combinación de factores que da como resultado niveles reducidos de proteína MBD3. Como se muestra en las Figuras 101A-B, aunque el tratamiento con las condiciones "2i/LIF" con o sin DMSO, o la adición de un inhibidor de TGFp no afectaba a los niveles de MBD3, el uso de las condiciones "2i/LIF" con un inhibidor de PKC daba como resultado una reducción significativa de los niveles de proteína MBD3. Los resultados muestran que la inhibición de PKC conduce a una regulación por disminución de la expresión de MBD3 en células madre embrionarias de ratón. Estos resultados sugieren el uso de inhibidores de PKC como agentes que agotan o regulan por disminución la expresión de MBD3 y como reforzadores de la reprogramación determinista de iPSC.
Ejemplo 14
Ajuste de los medios WIS-NHSM
Los autores de la presente invención han ideado varias modificaciones del medio WIS-NHSM básico con el fin de ensayar el efecto de los inhibidores y factores de crecimiento en células madre pluripotentes naif. La Tabla 3 a continuación y las Figuras 102-105 describen el efecto de varios factores e inhibidores en el mantenimiento del estado pluripotente naif.
Tabla 3
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Las Figuras 102-105 muestran el efecto de las diversas modificaciones del medio WIS-NHSM en la metilación del ADN (% de los niveles de citosina metilada total (5 mdC) normalizados respecto a dG; Figura 102), expresión relativa de ARNm de DNMT3L (normalizada respecto a células cebadas; Figura 103), expresión relativa de ARNm de DNMT3B (normalizada respecto a células cebadas; Figura 104) y porcentaje (%) de células WIBR3 OCT4+ después de 9 pases en placas de gelatina al 0.2% (Figura 105). Estos experimentos muestran que la inclusión de p38i es esencial para mantener características de pluripotencia naif asociadas con la regulación por disminución de los genes de ADN metiltransferasa de novo DNMT3b y DNMT3L y conduce a la pérdida de los niveles globales de metilación del ADN. La omisión de p38i y adición de b Mpí en su lugar (combinación 6, Tabla 3 anterior), no daba como resultado dicho efecto que es el sello distintivo de la pluripotencia humana naif. BMPi se puede añadir junto con p38i, y no compromete la pluripotencia naif cuando se usa en combinación (combinaciones 4 o 5, Tabla 3 anterior).
De manera similar, las Tablas 4 y 5 siguientes y las Figuras 85A-C muestran el efecto de las diversas composiciones del medio en el estado naif de las células madre pluripotentes. Las hESC WIBR3 se cultivaron en las condiciones 1 y 7-17 de WIS-NHSM y se analizaron las células para determinar el porcentaje de células madre pluripotentes (por las células positivas para OCT4; Figura 85B) y el porcentaje de citosina metilada total (5mdC; Figura 85C).
Tabla 4
Tabla 4: Se proporcionan los agentes (factores, inhibidores) incluidos en el medio WIS-NHSM. LIF - factor inhibidor de la leucemia; FGF2 = factor de crecimiento de fibroblastos 2 (también denominado "FGF básico"); TGFpl = factor de crecimiento transformante beta 1; SCF = factor de células madre; BMPi = inhibidor de la proteína morfogenética ósea; IGFII = factor de crecimiento similar a insulina 2 (somatomedina A). NOTCHi = inhibidor de NOTCH; SHHi = inhibidor de la ruta Sonic Hedgehog (SHH); TGFRi = inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante; FGFRi = inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos.
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Tabla 5
Tabla 5: Se proporcionan los agentes (factores, inhibidores) incluidos en el medio WIS-NHSM. LIF - factor inhibidor de la leucemia; FGF2 = factor de crecimiento de fibroblastos 2 (también denominado "FGF básico"); TGFpl = factor de crecimiento transformante beta 1; SCF = factor de células madre; BMPi = inhibidor de la proteína morfogenética ósea; IGFII = factor de crecimiento similar a insulina 2 (somatomedina A). NOTCHi = inhibidor de NOTCH; SHHi = inhibidor de la ruta Sonic Hedgehog (SHH); TGFRi = inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante; FGFRi = inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos.
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Como se muestra en las Figuras 85A-C, todas las condiciones 1 y 7-17 eran capaces de mantener el estado naif de las células madre pluripotentes, con el porcentaje reducido notable de citosina metilada total.
Se observa que en las condiciones 12 y 15 (Tabla 5 anterior), cuando se usa NOTCHi, entonces se puede usar TGFRi (y se puede omitir TGFB1 recombinante) para mantener la pluripotencia naif con niveles reducidos de metilación del ADN. Además, en las condiciones 16, cuando se usa NOTCHi, se puede usar entonces FGFRi (y se puede omitir el FGF2 recombinante) para mantener la pluripotencia naif con niveles reducidos de metilación del ADN. Se usan IGFII y SCF recombinantes en estas condiciones para reforzar la proliferación de células naif humanas en ausencia de señalización de FGF2.
Además, en las condiciones 14 y 17, cuando se usa NOTCHi, se pueden usar entonces FGFRi y TGRFi (y se pueden omitir FGF2 y TGFB1 recombinantes) para mantener la pluripotencia naif con niveles reducidos de metilación del ADN. Se usan IGFII y SCF recombinantes en estas condiciones para reforzar la proliferación de células naif humanas en ausencia de señalización de FGF2.
Hay que indicar que el medio 15 de condiciones WIS-NHSM (Tabla 5 anterior) es excelente para el cultivo de células madre pluripotentes humanas en estado naif, como lo demuestra la morfología de la colonia en forma de cúpula y la falta de bordes definidos entre las células individuales en cada colonia (datos no mostrados).
Hay que indicar que las condiciones de WIS-NHSM anteriores se pueden usar para mantener el estado naif de las células madre pluripotentes de primates no humanos.
En resumen, se pueden usar las siguientes modificaciones del medio para establecer un estado pluripotente naif: P38i: los inhibidores para P38 incluyen bloqueadores secuencia arriba para las rutas que activan la señalización de p38: incluyendo inhibidores de señalización de BMP/
Activación de STAT3: Los activadores para la señalización de STAT3 se pueden usar para reemplazar LIF, incluyendo IL-6.
TGFB1 - Los activadores de la ruta de TGF/ACTIVINA que incluyen ACTIVINA A (también conocida como inhibina beta A, ID del gen: 3624 se pueden usar para reemplazar TGFB1).
BMPi: Los inhibidores de proteínas de la ruta de BMP, como la proteína NOGGIN recombinante, se pueden usar para reemplazar inhibidores moléculas pequeñas de la señalización de BMP.
Un ejemplo no limitante de un medio de cultivo que se puede usar para mantener (e inducir a un estado naif) células madre pluripotentes en un estado naif incluye: Un medio de cultivo que comprende factor inhibidor de la leucemia (LIF), un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3b, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFpl), y uno o más de los siguientes componentes:
a) IGFII (intervalo de concentración final 0.1-100 ng/ml);
b) IGF1 [factor de crecimiento similar a insulina 1 (somatomedina C)] (intervalo de concentración final 0.1-100 ng/ml); c) SCF (intervalo de concentración final 0.1-100 ng/ml);
d) Inhibidor de señalización de BMP [los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: LDN193189 (AXON 1509 -concentración final 0.01-20 microM), K02288 (Axon 2189; concentración final 0.1-20 microM), hidrocloruro de dorsomorfina (AXON 2150 concentración final 0.1-20 microM);
e) Inhibidores de señalización NOTCH [los ejemplos incluyen, pero no se limitan a los siguientes inhibidores de gamma secretasa: DAPT (Axon Medchem 1484 - concentración final 0.05-50 microM), hidrocloruro de LY2886721 (Axon Medchem 1964 - concentración final 0.05-50 microM)], DBZ (Axon Medchem - Axon 1488 - concentración final 0.05-50 microM).
f) Inhibidores de la ruta Sonic Hedgehog (SHH) [los ejemplos incluyen, pero no se limitan a los siguientes: GANT61 (SigmaAldrich - concentración final 0.05-50 microM), RU-SKI 43 (Axon Medchem - Axon 2035 - concentración final 0.05-50 microM))].
g) Inhibidores de ERK5 (BIX02189 Axon 1809; intervalo de concentración final de 0.1-100 microM)
h) Inhibidor de ROCK [Y27632 (AXON 1683) - final 0.05-100 microM].
i) Inhibidor de la señalización de FGF: los ejemplos no limitantes de inhibidores de FGFR incluyen PD173074 y SU5401.
j) Inhibidor de la ruta de TGF: los ejemplos no limitantes de inhibidores de TGFR incluyen SB431542 y un compuesto molécula pequeña A 83-01 (como se usa en el presente documento, la expresión "inhibidor de TGFR (o TGFRi)" se refiere a una molécula capaz de inhibir la expresión y/o nivel de actividad de TGFR determinado por ALK4, 5 y 7 fosforilada).
Ejemplo 15
Activación de ERAS para inducción y mantenimiento de estado pluripotente naif
El gen ES Ras (ERAS) humano (ID de gen: 3266) tiene una señal de poliadenilación prematura secuencia arriba que da como resultado una transcripción truncada, no codificante (Kameda T y Thomson JA, Stem Cells 2005, 23:1535-40). Los autores de la presente invención han previsto además que la sobreexpresión de ERas o activación de ERas humano endógeno en células madre pluripotentes se puede usar para inducir un estado naif en células madre pluripotentes. Por lo tanto, las células madre pluripotentes modificadas genéticamente en las que ERas es sobreexpresado o activado endógenamente presentan un estado naif de las células madre pluripotentes.
Sobreexpresión de ERas en células madre pluripotentes - Las células madre pluripotentes humanas se transforman con una construcción de ácido nucleico diseñada para la expresión constitutiva o transitoria de ERas (SEQ ID NO: 109). Activación de la expresión de ERAS endógeno en células madre pluripotentes humanas - En las células humanas, el gen ERAS no se expresa debido a la presencia de secuencias virales que se integran en el genoma humano y bloquean la expresión de ERAS. La activación de la expresión de ERAS humano endógeno se logra eliminando las combinaciones de sitios de poliadenilación (marcados como "sitios de poliadenilación prematuros" en SEQ ID NO: 108 en la lista de secuencias; también definido como "señal poli-A" en las secuencias encuadradas A-1, A2 o A-3 en la Figura 3 de Kameda et al. Stem Cells 2005; 23:1535-1540). Esta última modificación se puede lograr con recombinación homóloga, CRISPR [como se describe en Ryan M. Walsh y Konrad Hochedlinger, Proc Natl Acad Sci U S A. 24 de septiembre de 2013; 110 (39):15514-5; y Yang Hui et al., Cell 154:1370-1379, 12 de septiembre de 2013], o TALENs [Hockemeyer D, et al., Nat Biotechnol. 2011 7 de julio; 29 (8):731-4], ya sea solo o en combinación.
La expresión/reactivación del gen ERAS humano se puede usar en combinación con cualquiera de los medios descritos en el presente documento para células madre pluripotentes naif para reforzar la proliferación de células pluripotentes naif humanas.
Referencias
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una célula madre pluripotente (PSC) naif humana aislada, que comprende:
un gen de transcrito específico de X inactivo (XIST) no metilado, en donde:
(i) cuando la PSC naif es una PSC femenina, entonces dicha PSC femenina naif tiene dos alelos no metilados de dicho gen XIST que tienen menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST; y
(ii) cuando dicha PSC naif es una PSC masculina, entonces dicha PSC masculina naif tiene un alelo no metilado de dicho gen XIST que tiene menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST;
y
el nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) se caracteriza por una relación de expresión de núcleo a citoplasma que es igual o superior a 1 determinado por un ensayo de inmunotinción.
2. La PSC naif humana aislada de la reivindicación 1, en donde cuando la PSC naif aislada se incuba en presencia de un agente seleccionado del grupo que consiste en proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), inhibidor de JNK e inhibidor de P38, la PSC naif mantiene un fenotipo pluripotente.
3. La PSC naif humana aislada de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha PSC naif humana se caracteriza por una metilación reducida de islas de CpG en comparación con un nivel de metilación de dichas islas de CpG en una PSC cebada humana.
4. Una población aislada de PSC naif que comprende al menos 10% de las células PSC naif humanas aisladas de la reivindicación 1, 2 o 3.
5. Un cultivo celular que comprende la PSC naif aislada de la reivindicación 1, 2 o 3, o la población aislada de PSC naif de la reivindicación 4 y un medio de cultivo.
6. Un medio de cultivo seleccionado del grupo que consiste en:
(i) Un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3p, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un activador de STAT3 y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFpl), un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC), un inhibidor de ROCK y un inhibidor de NOTCH, y
(ii) Un medio de cultivo que comprende un inhibidor de ERK1/2, un inhibidor de GSK3p, un inhibidor de p38, un inhibidor de JNK, un activador de STAT3 y al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante (TGFR), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), un inhibidor de la proteína quinasa C (PKC), un inhibidor de ROCK y un inhibidor de NOTCH,
en donde el medio de cultivo es capaz de mantener la célula madre pluripotente naif aislada de la reivindicación 1 en un estado indiferenciado durante al menos 2 pases.
7. El medio de cultivo de la reivindicación 6, en donde dicho activador de STAT3 se selecciona del grupo que consiste en factor inhibidor de la leucemia (LIF) e interleuquina 6 (IL6).
8. El medio de cultivo de la reivindicación 6 o 7, que además comprende al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), un inhibidor de la señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP), un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH), un inhibidor de ERK5, forskolina, Kenpaulona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
9. El medio de cultivo de la reivindicación 6 o 7, que además comprende al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en: factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), factor de crecimiento similar a la insulina II (IGFII), proteína morfogenética ósea 4 (BMP4), un inhibidor de la ruta de Sonic Hedgehog (SHH), un inhibidor de e Rk 5, forskolina, kenpaulona, BayK8644, Bix1294 y factor de células madre (SCF).
10. El medio de cultivo de la reivindicación 6, 7, 8 o 9, en donde dicho activador de STAT3 comprende dicho LIF, y en donde dicho al menos un agente comprende dicho inhibidor de PKC.
11. El medio de cultivo de la reivindicación 10, que además comprende inhibidor de FGFR.
12. El medio de cultivo de la reivindicación 10 u 11, que además comprende inhibidor de TGFR.
13. Un cultivo celular que comprende células y el medio de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 6-12.
14. Un método para generar una célula madre pluripotente (PSC) naif, que comprende:
incubar una célula PSC no naif en condiciones que permitan la generación de la PSC naif a partir de dicha PSC no naif, en donde dichas condiciones comprenden cultivar en el medio de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, y en donde:
(i) cuando dicha PSC naif es una PSC femenina, entonces dicha PSC femenina naif tiene dos alelos no metilados de un gen de transcrito específico de X inactivo (XIST) que tiene menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST; y
(ii) cuando dicha PSC naif es una PSC masculina, entonces dicha PSC masculina naif tiene un alelo no metilado de dicho gen XIST que tiene menos de aproximadamente 20% de lecturas metiladas de CpG secuenciadas en el promotor de XIST,
y
el nivel de expresión del factor de transcripción E3 (TFE3) en dicha PSC naif se caracteriza por una relación de expresión en núcleo a citoplasma que es igual o superior a 1 determinado por un ensayo de inmunotinción, generando así la PSC naif.
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