CN112048467A - Ksom-aa培养液在体外培养nod背景鼠胚胎中的应用 - Google Patents

Ksom-aa培养液在体外培养nod背景鼠胚胎中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了KSOM‑AA培养液在体外培养NOD背景鼠胚胎中的应用，本发明比较不同培养液培养NOD背景鼠胚胎的效果，发现KSOM‑AA培养液适合于体外培养NOD背景鼠胚胎、尤其是NCG背景鼠胚胎和NSG背景鼠胚胎，配合35～38℃恒温条件，降低了卵裂率，提高了囊胚形成率，2细胞发育率可达97.30％，囊胚发育率可达18.92％；使用KSOM‑AA培养液培养NOD、NCG、NSG背景鼠胚胎，提高了胚胎的着床能力，进而提高了出生率，在NOD、NCG、NSG背景鼠的胚胎体外培养方面具有重要意义。

Description

KSOM-AA培养液在体外培养NOD背景鼠胚胎中的应用
技术领域
本发明属于小鼠受精卵培养技术领域，涉及KSOM-AA培养液在体外培养NOD背景鼠胚胎中的应用，尤其涉及KSOM-AA培养液在体外培养NOD、NCG、NSG背景鼠胚胎中的应用。
背景技术
哺乳动物的早期胚胎体外培养是将受精卵在人为控制的环境中形成早期胚胎的技术，该技术被广泛地应用于胚胎早期发育研究、转基因动物的构建及辅助生殖等相关领域。
胚胎体外培养技术在科学研究及种质资源保存方面具有重要的意义，胚胎发育的质量与科研成果密切相关，影响胚胎发育率的主要因素为培养基组分及培养方式的选择。目前常用的胚胎培养液包括M16、M2、CZB、MTF及KSOM等；传统的培养方法为“微滴覆盖法”，即用矿物质油覆盖培养基微滴，隔绝了外部环境，有利于pH值及渗透压等理化条件的维持。科研人员不断改良胚胎培养的方式及使用的培养基组分，以期实现较高的胚胎发育率。
CN101798567A公开了一种促进小鼠克隆胚胎发育的培养方法，重构胚胎经激活后，在不含乙二胺四乙酸和谷氨酰胺的M16或CZB培养基中培养至所述胚胎发育至二细胞时期，更换成KSOM培养基进行培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。使用该方法，克隆胚胎的囊胚形成率得到了一定提高，但仍有可以继续改进的空间。
CN106947733A提供了一种提高小鼠克隆胚胎发育率的体外培养方法，将重组胚胎置于激活液(每升所述激活液中含有265-270mg的CaCl2、0.1mg的FeNO3、400mg的KCl、95-100mg的MgSO4·7H2O、5-6g的NaCl、100mg的NaH2PO4、1.5g葡萄糖，余量为四蒸水)中激活2-3h后，置于初期培养液(DMEM中添加乳酸，乳酸与DMEM的质量比例为1-2:1000)中培养至二细胞时期后，交替置于第一后期培养液(KSOM培养液)和第二后期培养液(不含谷氨酰胺、乙二胺四乙酸二钠和牛血清蛋白的M16培养基)中进行培养，可以提高胚胎发育率。该方法大幅提高了囊胚形成率，但操作过程繁琐，实际操作中限制较多。
《小鼠胚胎体外培养方法的改良》(孙芳园等，解剖学报，2015，46(1))提出了一种毛细管培养的方法，将吸有胚胎的毛细管浸入盛有蒸馏水的烧杯中，再放置在磁力搅拌架上，使得胚胎在微小空间内随水流旋转而摆动，该方法模拟了胚胎在输卵管中的运动环境。与传统方法相比，使用毛细管培养的胚胎的囊胚率、胚胎细胞数及接种后的内细胞团集落明显增多，但该方法要求操作技术水平高，且需要借助昂贵的操作仪器。若将该技术与改进的培养基结合使用，必定会达到更好的培养效果。
近年来，人源化的高度及重度免疫缺陷小鼠品系被应用于免疫学、肿瘤研究等多个方面。在研究操作中，科研人员发现常规的胚胎体外培养技术对免疫缺陷小鼠与常规品系小鼠的培养效率差异显著，说明现有培养体系并不适合NOD和NCG这类高度及重度免疫缺陷的小鼠品系。如何调整培养基的相关组分，改进现有的培养技术，以提高高度及重度免疫缺陷小鼠的体外培养效率，已成为目前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了KSOM-AA培养液在体外培养NOD背景鼠胚胎中的应用，采用KSOM-AA培养液在35～38℃下体外培养NOD背景鼠胚胎、尤其是NCG背景鼠胚胎、NSG背景鼠胚胎，降低了卵裂率，提高了囊胚形成率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了KSOM-AA培养液在体外培养NOD背景鼠胚胎中的应用；
其中，所述KSOM-AA培养液包括0.5～2mg/mL牛血清白蛋白、(1～5)×10-3mg/mL乙二胺四乙酸二钠盐、5～8mg/mL氯化钠、0.1～0.2mg/mL氯化钾、(4～5)×10-2mg/mL磷酸二氢钾、(4～5)×10-2mg/mL硫酸镁·7H2O、(1～2)×10-3mg/mL乳酸钠盐溶液、(3～5)×10-2mg/mL葡萄糖、1～3mg/mL碳酸氢钠、0.1～0.2mg/mL L-谷氨酰胺、(2～3)×10-2mg/mL丙酮酸钠、(6～8)×10-2mg/mL青霉素、(4～6)×10-2mg/mL链霉素、(1～2)×10-2mg/mL必需氨基酸和(3～5)×10-3mg/mL非必需氨基酸；
所述牛血清白蛋白在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL或2mg/mL；
所述乙二胺四乙酸二钠盐在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是1×10-3mg/mL、2×10-3mg/mL、3×10-3mg/mL、3.8×10-3mg/mL、4×10-3mg/mL或5×10-3mg/mL；
所述氯化钠在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是5mg/mL、5.555mg/mL、6mg/mL、7mg/mL或8mg/mL；
所述氯化钾在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.186mg/mL或0.2mg/mL；
所述磷酸二氢钾在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是4×10-2mg/mL、4.5×10-2mg/mL、4.76×10-2mg/mL或5×10-2mg/mL；
所述硫酸镁·7H2O在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是4×10-2mg/mL、4.5×10-2mg/mL、4.93×10-2mg/mL或5×10-2mg/mL；
所述乳酸钠盐溶液在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是1×10-3mg/mL、1.5×10-3mg/mL、1.64×10-3mg/mL或2×10-3mg/mL；
所述葡萄糖在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是3×10-2mg/mL、3.6×10- 2mg/mL、4×10-2mg/mL或5×10-2mg/mL；
所述碳酸氢钠在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是1mg/mL、2mg/mL、2.1mg/mL或3mg/mL；
所述L-谷氨酰胺在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是0.1mg/mL、0.146mg/mL、0.15mg/mL或0.2mg/mL；
所述丙酮酸钠在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是2×10-2mg/mL、2.2×10-2mg/mL、2.5×10-2mg/mL或3×10-2mg/mL；
所述青霉素在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是6×10-2mg/mL、6.3×10- 2mg/mL、7×10-2mg/mL或8×10-2mg/mL；
所述链霉素在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是4×10-2mg/mL、5×10-2mg/mL或6×10-2mg/mL；
所述必需氨基酸包括L-胱氨酸、L-盐酸精氨酸、L-水合氨酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙胺酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-缬氨酸中的任意一种或至少两种的组合，所述必须氨基酸在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是1×10-2mg/mL、1.5×10-2mg/mL或2×10-2mg/mL；
所述非必需氨基酸包括L-盐酸丙氨酸、L-水合天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸或甘氨酸中的任意一种或至少两种的组合，所述非必需氨基酸在所述KSOM-AA培养液中的浓度例如可以是3×10-3mg/mL、4×10-3mg/mL或5×10-3mg/mL。
本发明中，在NOD背景鼠胚胎的受精卵阶段采用KSOM-AA培养液进行培养，给予了NOD背景鼠胚胎适宜的生长条件，有利于提高胚胎在后期孕鼠体内的着床比例，提高出生率。
优选地，所述KSOM-AA培养液包括1mg/mL牛血清白蛋白、3.8×10-3mg/mL乙二胺四乙酸二钠盐、5.555mg/mL氯化钠、0.186mg/mL氯化钾、4.76×10-2mg/mL磷酸二氢钾、4.93×10-2mg/mL硫酸镁·7H2O、1.64×10-3mg/mL乳酸钠盐溶液、3.6×10-2mg/mL葡萄糖、2.1mg/mL碳酸氢钠、0.146mg/mL L-谷氨酰胺、2.2×10-2mg/mL丙酮酸钠、6.3×10-2mg/mL青霉素、0.05mg/mL链霉素、0.01mg/mL必需氨基酸和0.005mg/mL非必需氨基酸。
优选地，所述NOD背景鼠包括NCG背景鼠和/或NSG背景鼠。
根据本发明，NOD背景鼠、NCG背景鼠或NSG背景鼠作为人源化的高度及重度免疫缺陷鼠，由于自身免疫系统的原因，抵抗力较差，不同于常规小鼠品系(比如B6J/Gpt)，需要特定的饲养环境和营养条件；另一方面，这类品系背景小鼠的超排条件、胚胎质量等因素与常规小鼠品系(比如B6J/Gpt)差异较大。采用常规的培养体系培养NOD背景鼠、NCG背景鼠或NSG背景鼠胚胎，进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)后发现，后代的出生率明显降低，胚胎的发育率较差，故针对这类背景品系进行了超排条件、IVF体系和培养条件等一系列的探索。
本发明中，采用KSOM-AA培养液体外培养NOD背景鼠、NCG背景鼠或NSG背景鼠胚胎，KSOM-AA培养液中的氨基酸提高了囊胚形成率和囊胚孵化率，同时促进了囊胚合成几种蛋白的mRNA，并达到体内水平。
第二方面，本发明提供了一种NOD背景鼠胚胎体外培养方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备受精皿、获能皿和胚胎培养皿，所述受精皿中滴加有HTF受精培养液，所述获能皿中滴加有HTF受精培养液，所述胚胎培养皿中滴加有KSOM-AA培养液；
(2)将体外受精的受精卵转移至步骤(1)的胚胎培养皿中，进行体外培养。
优选地，步骤(1)所述受精皿的制备方法包括：
用移液器向培养皿中滴入HTF微滴，并覆盖矿物油，得到受精皿。
优选地，所述HTF微滴的个数为1～2个。
优选地，所述HTF微滴的体积为150～200μL，例如可以是150μL、160μL、170μL、180μL、190μL或200μL。
优选地，步骤(1)所述获能皿的制备方法包括：
用移液器向培养皿中滴入HTF微滴，并覆盖矿物油，得到获能皿。
优选地，所述HTF微滴的个数为1～2个。
优选地，所述HTF微滴的体积为100～150μL，例如可以是100μL、110μL、120μL、130μL、140μL或150μL。
优选地，步骤(1)所述胚胎培养皿的制备方法包括：
用移液器向培养皿中滴入KSOM-AA微滴，并覆盖矿物油，得到胚胎培养皿。
优选地，所述KSOM-AA微滴的个数为4～6个，例如可以是4个、5个或6个。
优选地，所述KSOM-AA微滴的体积为30～50μL，例如可以是30μL、40μL或50μL。
优选地，在步骤(1)之后还包括将所述受精皿、获能皿或胚胎培养皿在35～38℃、3％～8％CO2环境中平衡至少6h的步骤。
优选地，步骤(2)所述体外受精的受精卵由获能的精子和卵母细胞在受精皿中形成。
优选地，所述精子来源于10～30周龄的雄鼠。
优选地，所述精子在获能皿中的孵育时间为0.5～2h，例如可以是0.5h、1h、1.5h或2h。
优选地，所述卵母细胞来源于8～10周龄的NOD雌鼠。
优选地，所述卵母细胞在受精皿中的孵育时间为0.5～1h，例如可以是0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h或1h。
优选地，步骤(2)所述体外培养的温度为35～38℃，例如可以是35℃、36℃、37℃或38℃。
本发明中，35～38℃的体外培养温度由热台提供，保证了体外培养过程中温度的稳定性，避免了温度波动而引起的胚胎畸形，提高了胚胎发育率。
优选地，步骤(2)所述体外培养的条件为3％～8％CO2环境，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％。
优选地，步骤(2)所述体外培养的时间为6～8h，例如可以是6h、7h或8h。
优选地，在步骤(2)之后还包括在受精卵阶段、2细胞阶段、8细胞阶段和囊胚阶段对受精卵进行观察计数的步骤。
作为优选技术方案，本发明提供了一种NOD背景鼠胚胎体外培养方法，所述方法包括以下步骤：
(1)受精皿、获能皿和胚胎培养皿的制备：
用移液器向培养皿中滴入1～2个体积为150～200μL的HTF微滴，并覆盖矿物油，得到受精皿；
用移液器向培养皿中滴入1～2个体积为100～150μL的HTF微滴，并覆盖矿物油，得到获能皿；
用移液器向培养皿中滴入4～6个体积为30～50μL的KSOM-AA微滴，并覆盖矿物油，得到胚胎培养皿；
在35～38℃、3％～8％CO2环境中平衡所述受精皿、所述获能皿和所述胚胎培养皿至少6h；
(2)受精卵的形成：
将来源于10～30周龄的雄鼠的精子在获能皿中孵育0.5～2h，随后转移至含有卵母细胞的受精皿中，所述卵母细胞来源于8～10周龄的NOD雌鼠，并在受精皿中孵育0.5～1h进行体外成熟；
(3)胚胎培养：
待受精卵在受精皿中形成后，转移至胚胎培养皿中，35～38℃、3％～8％CO2环境下进行体外培养6～8h；
(4)观察计数：
在受精卵阶段、2细胞阶段、8细胞阶段和囊胚阶段对所述受精卵进行观察计数。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明比较不同培养液培养NOD背景鼠胚胎的效果，发现KSOM-AA培养液适合于体外培养NOD背景鼠、尤其是NCG背景鼠或NSG背景鼠胚胎，配合35～38℃恒温条件，降低了卵裂率，提高了囊胚形成率，2细胞发育率可达97.30％，囊胚发育率可达18.92％；
(2)本发明使用KSOM-AA培养液培养NOD/NCG背景小鼠胚胎，提高了胚胎的着床能力，进而提高了出生率，在NOD/NCG的胚胎体外培养方面具有重要意义。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
制备例1受精皿和获能皿的制备
受精皿：在无菌的超净台中，用200μL移液器吸取200μL HTF受精培养液(江苏集萃药康生物科技有限公司)，向3.5cm培养皿内滴入1个200μL HTF微滴，并覆盖矿物油，转移至37℃、5％二氧化碳培养箱中平衡至少6h，备用；
获能皿：在无菌的超净台中，用200μL移液器吸取200μL HTF受精培养液(江苏集萃药康生物科技有限公司)，向3.5cm培养皿内滴入2个100μL HTF微滴，并覆盖矿物油，转移至37℃、5％二氧化碳培养箱中平衡至少6h，备用。
制备例2胚胎培养皿的制备
在无菌的超净台中，用200μL移液器吸取200μL KSOM-AA培养液，向3.5cm培养皿内滴入5个40μL KSOM-AA微滴，并覆盖矿物油，转移至37℃、5％二氧化碳培养箱中平衡6h，备用；
其中，KSOM-AA培养液的配方如表1所示，必需氨基酸为L-胱氨酸、L-盐酸精氨酸、L-水合氨酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙胺酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，非必需氨基酸为L-盐酸丙氨酸、L-水合天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸；培养液配好后用0.22μm Millipore过滤器过滤除菌，分装到棕色安瓿瓶内，并冲入氮气，4℃冰箱保存。
表1
Figure BDA0002678634010000101
Figure BDA0002678634010000111
制备例3胚胎培养皿的制备
在无菌的超净台中，用200μL移液器吸取200μL KSOM-AA培养液，向3.5cm培养皿内滴入4个40μL KSOM-AA微滴，并覆盖矿物油，转移至37℃、5％二氧化碳培养箱中平衡6h，备用；
其中，KSOM-AA培养液的配方如表2所示，必需氨基酸为L-胱氨酸、L-盐酸精氨酸、L-水合氨酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙胺酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，非必需氨基酸为L-盐酸丙氨酸、L-水合天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸；培养液配好后用0.22μm Millipore过滤器过滤除菌，分装到棕色安瓿瓶内，并冲入氮气，4℃冰箱保存。
表2
Figure BDA0002678634010000112
Figure BDA0002678634010000121
制备例4胚胎培养皿的制备
在无菌的超净台中，用200μL移液器吸取200μL KSOM-AA培养液，向3.5cm培养皿内滴入6个40μL KSOM-AA微滴，并覆盖矿物油，转移至37℃、5％二氧化碳培养箱中平衡6h，备用；
其中，KSOM-AA培养液的配方如表3所示，必需氨基酸为L-胱氨酸、L-盐酸精氨酸、L-水合氨酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙胺酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，非必需氨基酸为L-盐酸丙氨酸、L-水合天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸；培养液配好后用0.22μm Millipore过滤器过滤除菌，分装到棕色安瓿瓶内，并冲入氮气，4℃冰箱保存。
表3
成分 浓度
牛血清白蛋白 200mg/100mL
乙二胺四乙酸二钠盐 0.1mg/100mL
氯化钠 800mg/100mL
氯化钾 10mg/100mL
磷酸二氢钾 5mg/100mL
硫酸镁·7H<sub>2</sub>O 4mg/100mL
乳酸钠盐溶液 0.2mL/100mL
葡萄糖 3mg/100mL
碳酸氢钠 300mg/100mL
L-谷氨酰胺 10mg/100mL
丙酮酸钠 3mg/100mL
青霉素 6mg/100mL
链霉素 6mg/100mL
必需氨基酸 1mL/100mL
非必需氨基酸 0.5mL/100mL
对比例1
与制备例2相比，对比例1的胚胎培养皿中滴加有M16微滴，其他条件与制备例2相同。
对比例2
与制备例2相比，对比例2的胚胎培养皿中滴加有KSOM微滴，其他条件与制备例2相同。
实施例1
(1)供体小鼠的超数排卵
选取健康未孕、8周龄的NOD雌性小鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG，每只小鼠的注射量为0.2mL(10IU)，48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素HCG。
(2)精子的采集与获能
选取10周龄的雄鼠，试配后单放5天，用于体外受精；
实验当天脱颈椎处死雄鼠，采集左右两侧的附睾尾，去掉血液和脂肪后，指尖捏紧附睾尾，用一次性注射针针扎5～6次，显微镊下将精液液滴挑出，转移至获能皿中，37℃、5％培养箱内孵育1小时，备用。
(3)卵母细胞的采集与体外培养
超数排卵的供体小鼠注射HCG 15小时后，脱颈椎处死供体小鼠，面朝下置于无菌纸上，背部喷洒75％酒精至毛发湿润；
剪开背部皮肤和肌肉层，找到并摘除输卵管，将输卵管置于无菌滤纸上去除多余的血液或油脂，随后立即转移到受精皿中的矿物油中，用显微镊撕开膨大部将卵团转移至提前准备好的HTF受精培养液滴内，培养0.5h。
(4)体外受精和受精卵培养
倒置显微镜观察精子质量，根据精子活力情况，用20μL移液器吸取5μL精液加入到受精皿中，随后转移至制备例2的胚胎培养皿中，37℃、5％二氧化碳培养箱内培养7h。
(5)去除异裂和未受精胚胎后，在受精卵阶段、2细胞阶段、8细胞阶段和囊胚阶段对受精卵进行观察计数。
实施例2
(1)供体小鼠的超数排卵
选取健康未孕、9周龄的NOD雌性小鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG，每只小鼠的注射量为0.2mL(10IU)，48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素HCG。
(2)精子的采集与获能
选取20周龄的雄鼠，试配后单放5天，用于体外受精；
实验当天脱颈椎处死雄鼠，采集左右两侧的附睾尾，去掉血液和脂肪后，指尖捏紧附睾尾，用一次性注射针针扎5～6次，显微镊下将精液液滴挑出，转移至获能皿中，38℃、8％培养箱内孵育0.5小时，备用。
(3)卵母细胞的采集与体外培养
超数排卵的供体小鼠注射HCG 15小时后，脱颈椎处死供体小鼠，面朝下置于无菌纸上，背部喷洒75％酒精至毛发湿润；
剪开背部皮肤和肌肉层，找到并摘除输卵管，将输卵管置于无菌滤纸上去除多余的血液或油脂，随后立即转移到受精皿中的矿物油中，用显微镊撕开膨大部将卵团转移至提前准备好的HTF受精培养液滴内，培养0.5h。
(4)体外受精和受精卵培养
倒置显微镜观察精子质量，根据精子活力情况，用20μL移液器吸取5μL精液加入到受精皿中，随后转移至制备例3的胚胎培养皿中，38℃、8％二氧化碳培养箱内培养6h。
(5)去除异裂和未受精胚胎后，在受精卵阶段、2细胞阶段、8细胞阶段和囊胚阶段对受精卵进行观察计数。
实施例3
(1)供体小鼠的超数排卵
选取健康未孕、10周龄的NOD雌性小鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG，每只小鼠的注射量为0.2mL(10IU)，48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素HCG。
(2)精子的采集与获能
选取30周龄的雄鼠，试配后单放5天，用于体外受精；
实验当天脱颈椎处死雄鼠，采集左右两侧的附睾尾，去掉血液和脂肪后，指尖捏紧附睾尾，用一次性注射针针扎5～6次，显微镊下将精液液滴挑出，转移至获能皿中，35℃、3％培养箱内孵育2小时，备用。
(3)卵母细胞的采集与体外培养
超数排卵的供体小鼠注射HCG 15小时后，脱颈椎处死供体小鼠，面朝下置于无菌纸上，背部喷洒75％酒精至毛发湿润；
剪开背部皮肤和肌肉层，找到并摘除输卵管，将输卵管置于无菌滤纸上去除多余的血液或油脂，随后立即转移到受精皿中的矿物油中，用显微镊撕开膨大部将卵团转移至提前准备好的HTF受精培养液滴内，培养1h。
(4)体外受精和受精卵培养
倒置显微镜观察精子质量，根据精子活力情况，用20μL移液器吸取5μL精液加入到受精皿中，随后转移至制备例4的胚胎培养皿中，35℃、3％二氧化碳培养箱内培养8h。
(5)去除异裂和未受精胚胎后，在受精卵阶段、2细胞阶段、8细胞阶段和囊胚阶段对受精卵进行观察计数。
实施例4
与实施例1相比，实施例4的受精卵体外培养于对比例1的胚胎培养皿中，其他条件与实施例1相同。
实施例5
与实施例1相比，实施例5的受精卵体外培养于对比例2的胚胎培养皿中，其他条件与实施例1相同。
胚胎发育率检测
实施例1～5的胚胎发育率结果如表4所示，采用M16培养液可以获得较好的2细胞发育率，但是囊胚发育率仅6.38％；采用KSOM培养液同样可以获得较好的2细胞发育率，但是囊胚发育率也仅10.53％；而采用KSOM-AA培养液可以同时获得较高的2细胞发育率和囊胚发育率。
表4
编号 培养液名称 胚胎数量(枚) 2细胞发育率(％) 囊胚发育率(％)
实施例1 KSOM-AA 37.00 97.30％ 18.92％
实施例2 KSOM-AA 45.00 98.50％ 20.2％
实施例3 KSOM-AA 42.00 97％ 18.77％
实施例4 M16 47.00 100.00％ 6.38％
实施例5 KSOM 19.00 94.74％ 10.53％
体外操作时间的优化
NOD背景鼠胚胎在体外培养的过程中，异常胚胎的比例相较于B6J/Gpt小鼠胚胎(发育异常比例一般为5～20％)偏高很多，因此针对该类胚胎的体外培养时间进行了优化。
结果如表5所示，NOD背景鼠胚胎随着体外培养时间的延长，2细胞发育率正常，但是囊胚发育率差异较大，说明该品系不适合长时间的体外培养，比较适合在体外短时间操作和培养后，尽快转移至小鼠体内，也可以采用恒温台维持温度的稳定性，降低温度波动对胚胎造成的影响，避免引起胚胎畸形的发生。
表5
Figure BDA0002678634010000181
胚胎出生率检测
将实施例1培养的胚胎原核注射入雌鼠内，检测胚胎出生率，并与M16培养液培养的B6J/Gpt鼠胚胎的出生率进行比较。
结果如表6所示，采用KSOM-AA体系培养的NOD背景鼠胚胎的平均出生率可达24％，而采用M16体系培养的B6J/Gpt鼠胚胎的平均出生率仅11％，
说明NOD/NCG背景的小鼠胚胎在受精卵阶段使用KSOM-AA培养液培养可以显著提高胚胎发育程度，从而提高胚胎在后期孕鼠体内的着床比例，提高出生率。
表6
品系背景 注射方式 移植枚数 出生小仔只数 平均出生率
KSOM-AA培养的NOD 原核注射 12380 2955 23.87％
M16培养的B6J/Gpt 原核注射 33670 3690 10.96％
综上所述，本发明采用KSOM-AA培养液体外培养NOD背景鼠、NCG背景鼠或NSG背景鼠胚胎，配合35～38℃恒温条件，降低了卵裂率，提高了囊胚形成率，提高了胚胎的着床能力，进而提高了出生率，在NOD、NCG和NSG背景鼠的胚胎体外培养方面具有重要意义。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.KSOM-AA培养液在体外培养NOD背景鼠胚胎中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述KSOM-AA培养液包括0.5～2mg/mL牛血清白蛋白、(1～5)×10-3mg/mL乙二胺四乙酸二钠盐、5～8mg/mL氯化钠、0.1～0.2mg/mL氯化钾、(4～5)×10-2mg/mL磷酸二氢钾、(4～5)×10-2mg/mL硫酸镁·7H2O、(1～2)×10-3mg/mL乳酸钠盐溶液、(3～5)×10-2mg/mL葡萄糖、1～3mg/mL碳酸氢钠、0.1～0.2mg/mL L-谷氨酰胺、(2～3)×10-2mg/mL丙酮酸钠、(6～8)×10-2mg/mL青霉素、(4～6)×10-2mg/mL链霉素、(1～2)×10-2mg/mL必需氨基酸和(3～5)×10-3mg/mL非必需氨基酸；
优选地，所述KSOM-AA培养液包括1mg/mL牛血清白蛋白、3.8×10-3mg/mL乙二胺四乙酸二钠盐、5.555mg/mL氯化钠、0.186mg/mL氯化钾、4.76×10-2mg/mL磷酸二氢钾、4.93×10- 2mg/mL硫酸镁·7H2O、1.64×10-3mg/mL乳酸钠盐溶液、3.6×10-2mg/mL葡萄糖、2.1mg/mL碳酸氢钠、0.146mg/mL L-谷氨酰胺、2.2×10-2mg/mL丙酮酸钠、6.3×10-2mg/mL青霉素、0.05mg/mL链霉素、0.01mg/mL必需氨基酸和0.005mg/mL非必需氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述NOD背景鼠包括NCG背景鼠和/或NSG背景鼠。
4.一种NOD背景鼠胚胎体外培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备受精皿、获能皿和胚胎培养皿，所述受精皿中滴加有HTF受精培养液，所述获能皿中滴加有HTF受精培养液，所述胚胎培养皿中滴加有KSOM-AA培养液；
(2)将体外受精的受精卵转移至步骤(1)的胚胎培养皿中，进行体外培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述受精皿的制备方法包括：
用移液器向培养皿中滴入HTF微滴，并覆盖矿物油，得到受精皿；
优选地，所述HTF微滴的个数为1～2个；
优选地，所述HTF微滴的体积为150～200μL；
优选地，步骤(1)所述获能皿的制备方法包括：
用移液器向培养皿中滴入HTF微滴，并覆盖矿物油，得到获能皿；
优选地，所述HTF微滴的个数为1～2个；
优选地，所述HTF微滴的体积为100～150μL；
优选地，步骤(1)所述胚胎培养皿的制备方法包括：
用移液器向培养皿中滴入KSOM-AA微滴，并覆盖矿物油，得到胚胎培养皿；
优选地，所述KSOM-AA微滴的个数为4～6个；
优选地，所述KSOM-AA微滴的体积为30～50μL。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之后还包括将所述受精皿、获能皿或胚胎培养皿在35～38℃、3％～8％CO2环境中平衡至少6h的步骤。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述体外受精的受精卵由获能的精子和卵母细胞在受精皿中形成；
优选地，所述精子来源于10～30周龄的雄鼠；
优选地，所述精子在获能皿中的孵育时间为0.5～2h；
优选地，所述卵母细胞来源于8～10周龄的NOD雌鼠；
优选地，所述卵母细胞在受精皿中的孵育时间为0.5～1h。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述体外培养在热台、3％～8％CO2环境中进行；
优选地，步骤(2)所述体外培养的温度为35～38℃；
优选地，步骤(2)所述体外培养的时间为6～8h。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之后还包括在受精卵阶段、2细胞阶段、8细胞阶段和囊胚阶段对受精卵进行观察计数的步骤。
10.根据权利要求4-9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)受精皿、获能皿和胚胎培养皿的制备：
用移液器向培养皿中滴入1～2个体积为150～200μL的HTF微滴，并覆盖矿物油，得到受精皿；
用移液器向培养皿中滴入1～2个体积为100～150μL的HTF微滴，并覆盖矿物油，得到获能皿；
用移液器向培养皿中滴入4～6个体积为30～50μL的KSOM-AA微滴，并覆盖矿物油，得到胚胎培养皿；
在35～38℃、3％～8％CO2环境中平衡所述受精皿、所述获能皿和所述胚胎培养皿至少6h；
(2)受精卵的形成：
将来源于10～30周龄的雄鼠的精子在获能皿中孵育0.5～2h，随后转移至含有卵母细胞的受精皿中，所述卵母细胞来源于8～10周龄的NOD雌鼠，并在受精皿中孵育0.5～1h进行体外成熟；
(3)胚胎培养：
待受精卵在受精皿中形成后，转移至胚胎培养皿中，35～38℃、3％～8％CO2环境下进行体外培养6～8h；
(4)观察计数：
在受精卵阶段、2细胞阶段、8细胞阶段和囊胚阶段对所述受精卵进行观察计数。
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