CN102140435A

CN102140435A - 一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法

Info

Publication number: CN102140435A
Application number: CN 201010553266
Authority: CN
Inventors: 张明; 陈焕华; 付强; 黄怡
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2010-11-22
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2011-08-03

Abstract

一种提高水牛胚胎体外生产效率的方法，在卵母细胞成熟液和培养液中分别添加10μL/mL和20μL/mL胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)进行体外成熟、体外培养。本发明表明，在成熟液中添加10μL/mL的ITS有效地提高了水牛卵母细胞的体外成熟率，第一极体的排出率高达65.61％。在胚胎培养液中添加20μL/mL ITS有利于受精后水牛早期胚胎的发育，囊胚发育率高达29.93％。本发明的优点是提高了水牛卵母细胞的体外成熟率和囊胚发育率，从而提高了水牛胚胎的体外生产效率，为胚胎移植提供了大量优质的胚胎。

Description

一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法

技术领域

本发明属生物工程技术领域，特别涉及哺乳动物体外胚胎生产的方法。

背景技术

胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin，transferrin and selenium，ITS)主要由胰岛素、转铁蛋白和硒组成。胰岛素能刺激DNA、RNA、蛋白质和脂质的合成，促进对葡萄糖和氨基酸的利用，并通过对质膜，细胞骨架，细胞内酶和细胞核的作用来调节细胞功能。同时，胰岛素还有促进细胞有丝分裂的作用。转铁蛋白是一种血清球蛋白，与铁的转运有关，当细胞表面的受体与转铁蛋白结合后，可将铁转入细胞内；而细胞内参与O₂和CO₂的代谢和细胞呼吸过程的肌红蛋白和血红蛋白的合成主要依赖于蛋白质和铁。另外，转铁蛋白还可作为分解培养液中有毒金属物质的解毒蛋白。硒是胚胎发育过程中的一种必需微量元素，可通过调节谷胱甘肽过氧化物酶的活性起着抗氧化作用；同时，还有消除自由基，维持核酸、质膜和蛋白质的正常结构与功能的作用。研究证明这三种物质的联合对卵母细胞和胚胎的发育起着协同作用。ITS具有增强游离氨基酸的作用，而一些特殊氨基酸载体，内源性氨基酸池存在于早期胚胎中；ITS具有催化游离氨基酸的作用，而氨基酸又有助于早期胚胎克服发育阻滞现象。因此在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中添加ITS有利于早期胚胎的发育。

水牛是我国南方特有的品种，水牛奶具有很高的营养价值。但就目前我国奶水牛的现状来看，其数量和奶产量，还远远满足不了市场的需求。通过体外培养，生产大量优质的胚胎用于移植，产下更多的后代，既可以降低繁育成本，也可以在短期内迅速扩充水牛种群，从而推动水牛产业化的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法。在体外条件下，于成熟培养液和胚胎培养液中分别添加10μL/ml ITS(各物质的终浓度分别为：胰岛素10μg/mL，转铁蛋白5.5μg/mL，硒5μg/mL)和20μL/mL ITS(各物质的终浓度分别为：胰岛素20μg/mL，转铁蛋白11μg/mL，硒10μg/mL)，可以显著提高水牛卵母细胞体外成熟率及囊胚发育率。通过该方法能显著地增加胚胎移植的数量及质量，从而能加速良种水牛的繁育速度，促进水牛产业的发展。

本发明的工艺步骤包括以下几步：

(1)从屠宰场回收水牛卵巢，置于无菌生理盐水中，用保温瓶带回实验室。从清洗干净的卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下挑选出包裹有三层或三层以上致密卵丘细胞、外形明亮、且细胞质均匀的卵母细胞，用收集液洗涤2～3次。

(2)将收集到的卵母细胞用成熟培养液洗3次后移入含10μL/mL ITS的成熟培养液中，放入培养箱中成熟培养22～24小时，培养箱内条件为39℃，5％CO₂及最大饱和湿度；成熟培养结束后统计卵母细胞的成熟率。

(3)将体外培养成熟后的卵母细胞从成熟培养液中拣出，用移液枪轻轻抽打去掉大部分卵丘细胞，用受精液洗涤2次后转入受精滴中。将经上浮、离心处理后的精子加入到含有卵母细胞的受精滴中，放入培养箱中进行体外受精培养，培养箱内条件为39℃，5％CO₂及最大饱和湿度。

(4)体外受精培养18～20小时后，将假定的受精卵洗涤干净，然后置于含有10％胎牛血清和20μL/mL ITS的黄牛颗粒细胞单层中进行共培养，培养箱内条件为39℃，5％CO₂及最大饱和湿度；体外培养时间为8天。受精后第2天统计卵裂率，第8天统计囊胚率。

与目前的体外胚胎生产技术相比，本发明的优点在于：

(1)目前尚未发现有关ITS对水牛卵母细胞体外胚胎生产方面的报道。因此，本发明将有望提高水牛体外胚胎的生产效率。

(2)成熟培养液中添加10μL/mL ITS有利于卵母细胞的体外成熟和受精后早期胚胎的发育。成熟液中添加10μL/mLITS成熟率高达65.61％。卵母细胞体外成熟是胚胎体外生产技术中的关键环节，直接影响到卵母细胞体外成熟率和受精率的高低及受精卵早期发育的状况。在本试验体系下，成熟液中添加10μL/mL ITS显著地提高了卵母细胞的成熟率，其不仅为体外受精提供了更多优质的卵母细胞，也是囊胚发育率及囊胚的质量得以提高的先决条件。

(3)胚胎培养液中添加20μL/mL ITS有利于受精后水牛早期胚胎的发育。胚胎培养液中添加20μL/mL ITS的囊胚发育率高达29.93％，高于国内外报道的平均囊胚率。这说明，在本试验体系下，培养液中添加20μL/mL ITS可以显著提高水牛囊胚发育率，从而提高了体外胚胎的生产效率。

附图说明

图1本发明中水牛卵母细胞成熟后排出第一极体样图

图2本发明中第7天的水牛胚胎发育情况样图

具体实施方式

从屠宰场采集水牛卵巢，置于30～35℃生理盐水的保温瓶带内于4小时内送回实验室。卵巢送回实验室后，用灭菌的生理盐水清洗卵巢3～4次。然后用装有18号针头的一次性10mL注射器，从卵巢表面直径为2～8mm卵泡中抽取卵母细胞。在体视显微镜下挑选出包裹有三层或三层以上致密卵丘细胞，外形明亮，且细胞质均匀的卵母细胞，用收集液清洗卵母细胞2～3次，再用成熟液洗2次，然后放入含有1mL成熟培养液的玻璃培养皿(20×10mm)中，在38.5℃、5％CO₂和最大饱和湿度的培养箱中进行体外成熟培养22～24小时。

卵母细胞收集液的成分为：

TCM-199缓冲液+20mmol/L Hepes+5mmol/L NaHCO₃+3％胎牛血清+0.05mg/L硫酸庆大霉素，PH值为7.2～7.4。

成熟培养液的成分为：

TCM-199缓冲液+5mmol/L Hepes+26.2mmol/L NaHCO₃+10％发青牛血清+3％牛卵泡液+0.5μg/mL促卵泡素+5μg/mL促黄体素+10μL/mLITS，PH值为7.2～7.4。

本发明所用精液为水牛细管冷冻精液，精子洗涤采用上浮法。将活力良好的解冻精液注入到预先平衡好的装有2mL受精液的离心管中，于培养箱内倾斜45℃放置约30分钟，使离心管底部活力强的精子尽可能上浮至上层受精液中。取出离心管，吸取离心管上层含有精子的受精液，注入另一无菌离心管中，再加入2mL受精液，1500xg离心5分钟，弃掉上清液。

当卵母细胞成熟培养结束后，用移液枪在成熟液中轻轻抽打卵母细胞以去掉大部分卵丘细胞，用收集液洗涤2次后在体视显微镜下检查第一极体的排出率(即成熟率)。统计成熟率后，挑选胞质均匀、排出第一极体的质量较好的卵母细胞，经受精液洗涤3次后，移入受精滴中。受精滴为45～50μL，每滴放入约20枚卵母细胞。将精子加到受精滴中，使其终浓度达1～2×10⁶/mL，在39℃、5％CO₂，最大饱和湿度条件下孵育18～20小时。

受精液的成分为：

改良的Tyrodes培养液+0.6％牛血清白蛋白+2.0mmoL/L咖啡因+20μg/mL的肝素，PH值为7.5～7.8。

受精18～20小时后，在受精滴中用吸管反复吹打假定的受精卵，去掉卵丘细胞和附着的精子。将假定的受精卵从受精滴中吸出，用培养液洗涤3遍后，移入预先制备好的黄牛颗粒细胞单层培养滴中进行共培养培养。每滴放入15～20枚受精卵，培养期间每两天换液一次，每次换掉1/2液，培养条件为39℃、5％CO₂，最大饱和湿度。第2天统计卵裂率，第8天统计囊胚率。

胚胎培养液的成分为：

TCM-199缓冲液+10％胎牛血清+20μL/mL ITS，PH值为7.2～7.4。

上述所有的培养液均添加60mg/L青霉素和100mg/L链霉素。所有试剂均用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤消毒。

采用上述方法，在水牛体外胚胎生产的过程中，卵母细胞的体外成熟率为65％以上，卵母细胞体外受精后的卵裂率为60％左右，囊胚的发育率为30％左右。

实施例子：

2009年11月1日，从当地屠宰场获得卵巢后，置于保温瓶中4小时内送回实验室。按照本发明提供的方法将收集到的150个卵母细胞置于含10μL/mL ITS的成熟培养液中进行体外成熟培养22～24h。11月2日，将成熟后的卵母细胞用移液枪轻轻抽打，去除大部分卵丘细胞，挑选成熟质量较好(排出第一极体，胞质均匀)的105个卵母细胞进行体外受精。11月3日，将受精18～20小时的假定受精卵用胚胎培养液洗3遍后，移入20μL体积的黄牛颗粒细胞单层中进行共培养，培养液含20μL/mL ITS。11月4日早上统计分裂率，分裂了65个，分裂率约为61.9％。培养期间每隔一天换掉1/2培养液。11月9日开始观察囊胚发育情况。最后，于11月11日统计囊胚率，这次培养共出囊胚34个，囊胚率为32.38％。按照此方法进行10次重复，最终的囊胚率为这10次重复的平均数。经试验证明：成熟培养液中添加10μL/mLITS、胚胎培养液中添加20μL/mLITS可使水牛平均囊胚发育率约为30％。

Claims

1.一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征包括下列步骤：

(1)从屠宰场回收水牛卵巢，置于30～35℃无菌生理盐水中，用保温瓶带回实验室；从清洗干净的卵巢表面抽取卵母细胞，将卵母细胞置于收集液中，在体视显微镜下挑选出包裹有三层或三层以上致密卵丘细胞、外形明亮、细胞质均匀的卵母细胞，用收集液洗涤2～3次。

(2)将卵母细胞转入添加有血清、激素、卵泡液、胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin，transferrin and selenium，ITS)及含N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(Hepes)的TCM199成熟培养液中洗2次，然后移入含有1.0mL成熟培养液的玻璃培养皿中，放入培养箱中进行体外成熟培养；成熟培养结束后统计卵母细胞成熟率。

(3)体外受精使用细管冻精，37℃水浴解冻后采用上浮法分离精子；将体外培养成熟后的卵母细胞从成熟培养液中拣出，用受精液洗涤2次后移入用受精液制成的受精滴中；将离心后的精子加入到含有卵母细胞的受精滴中，放入培养箱中进行体外受精培养。

(4)体外受精培养18～20小时后，将假定的受精卵洗涤干净，然后置于预先制备好的、含有胎牛血清及ITS的黄牛颗粒细胞单层中进行共培养，体外培养时间为8天；受精后第2天统计卵裂率，第8天统计囊胚率。

2.根据权利要求1所述的提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征是步骤(1)中的收集液为TCM-199缓冲液，并添加有20mmol/L Hepes、5mmol/L NaHCO₃、3％胎牛血清和0.05mg/L的硫酸庆大霉素。

3.根据权利要求1所述的提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征是步骤(2)中成熟培养液为TCM199+5mmol/L Hepes+26.2mmol/L NaHCO₃+10％发情牛血清+0.5μg/mL促卵泡素+5μg/mL促黄体素+3％牛卵泡液+10μL/mL ITS(各物质的终浓度分别为：胰岛素10μg/mL，转铁蛋白5.5μg/mL，硒5μg/mL)，培养时间为22～24小时，培养箱内条件为39℃，5％CO₂及最大饱和湿度。

4.根据权利要求1所述的提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征是步骤(3)受精液为改进的Tyrodes培养液，添加有0.6％牛血清白蛋白、2.0mmoL/L咖啡因、20μg/mL的肝素，将活力良好的解冻精液注入到预先平衡好的装有2mL受精液的离心管中，于培养箱内倾斜45℃放置约30分钟，使离心管底部活力强的精子尽可能上浮至上层受精液中；取出离心管，吸取离心管上层含有精子的受精液，注入另一无菌离心管中，再加入2mL受精液，1500g离心5分钟，弃掉上清液；受精滴大小为45～50μL，每滴放入卵母细胞约20枚，将精子加到受精滴中，使精子浓度达到1～2×10⁶/mL，培养条件39℃，5％CO₂及最大饱和湿度，培养时间为18～20小时。

5.根据权利要求1所述的提高水牛体外胚胎生产效率的方法，其特征是步骤(4)中的胚胎培养液为TCM199缓冲液+10％胎牛血清+20μL/mL ITS(各物质的终浓度分别为：胰岛素20μg/mL，转铁蛋白11μg/mL，硒10μg/mL)，并用黄牛颗粒细胞作为单层与水牛胚胎进行共培养，培养条件39℃，5％CO₂及最大饱和湿度，体外培养时间为8天，培养期间每两天换液一次，每次换掉1/2液。