CN108546683A - 一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，其特征在于：具体步骤包括水牛卵母细胞体外培养；体外受精；单层共培养系统的制备；胚胎体外培养；腺病毒载体的包装及腺病毒扩增；腺病毒滴度稀释；腺病毒感染水牛颗粒细胞；腺病毒感染水牛胚胎，获得腺病毒介导的水牛转基因胚胎。本发明具有的优点是：采用本发明的技术方案将腺病毒介导感染水牛转基因胚胎，水牛胚胎卵裂率、桑囊率、转染囊胚率均有明显的提高，能够大大的提高转染的效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法。
背景技术
动物转基因技术自诞生之日起，就广泛运用于畜禽生产性状的改良、提高畜禽抗病力、非常规畜牧产品(如人药用蛋白和工业用酶)的生产、人类疾病模型、生物反应器和生产人类器官等方面。然而，转基因动物的低效率是制约该项技术发展的关键。传统的转基因胚胎生产方法一般为原核注射法、ICSI-Tr法、体细胞克隆法和腺病毒载体法。由于水牛受精卵内分布的脂肪滴较多，在显微镜下无法清晰地看到原核，且外源基因整合效率随机不定，整体效率较低，因此不适宜采用原核注射技术生产转基因水牛胚胎。相比较原核注射而言，ICSI-Tr注射针口径较大，虽然对染色体的损伤较小，但是会损失较多的细胞质，且需要用到显微操作系统，过程较繁琐，效率较低。体细胞克隆转基因法采用细胞导入法，虽然能较稳定将外源基因导入，但该法除了操作繁琐效率低以外还需克服外源基因重组所带来的异常表观遗传修饰模式。
本发明人在《中国畜牧兽医》2016,43(10)：2661-2665中的《腺病毒载体转染水牛不同原代体细胞的效果比较》疑问中就有关于腺病毒载体转染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞的研究；但是该项技术并没有披露有关于用腺病毒载体转染水牛胚胎的任何技术披露；传统的腺病毒载体法只是笼统地将腺病毒感染受精卵，而未考虑到受精卵自身的特点和生长环境因素，因水牛胚胎体外生长需要颗粒细胞共培养，而且水牛受精卵内脂滴较多，透明带较厚，一般的病毒难以携带外源基因高效通过，转基因生产的效率较低；其次，在腺病毒感染水牛胚胎过程中将透明带消化，降低了透明带对外源物质进入胚胎的阻滞，本发明从共培养体系中的水牛颗粒细胞腺病毒感染着手，在不破坏水牛胚胎体外生产环境的前提下，对水牛胚胎进行腺病毒感染，以生产出转基因胚胎为最终目标，提高转基因胚胎的生产效率。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，具体包括以下具体步骤：
(1)水牛卵母细胞体外培养：将屠宰场收集的水牛卵巢保存在39℃生理盐水中于1～2小时内送到实验室，去除卵巢系膜和输卵管多余组织，接着使用含双抗的生理盐水清洗，清洗后抽取直径为2～6mm的卵泡中的卵母细胞，然后选取胞质均匀、胞外有3层以上的颗粒细胞的水牛卵母细胞，洗涤后置于成熟培养液中于39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱中培养；
(2)体外受精：将水牛冻精解冻后在爬高液内培养30min，
将于成熟培养液中培养22～24h后的水牛卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞吹打掉后，置于受精盘微滴中，每微滴加入10～15枚卵子，孵育30min；
将爬高培养后的精子经过洗涤后加入上述受精盘微滴中，控制精子浓度1×106个/mL～1.5×106个/mL，将受精盘置于39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱内培养；
(3)单层共培养系统的制备
将吹打掉的卵丘颗粒细胞吹打均匀后制成30μL/滴的微滴盘单层共培养系统，覆盖石蜡油，于39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱内培养；
(4)胚胎体外培养：受精培养18h后将附着于受精卵表面的精子吹打掉，在胚胎培养液中清洗2～3遍后置于单层共培养系统中，于39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱内培养，记录胚胎各个阶段发育情况，将发育后待感染胚胎的透明带部分消化后置于微滴盘单层共培养系统中继续培养；
(5)腺病毒载体的包装及腺病毒扩增：
A、收集腺病毒上清：
将293细胞计数后按照70％的细胞密度接种于60mm培养皿，按转染试剂LipofectamineR3000说明书进行转染，其中质粒按pBHGloxdelE13cre：pDC316-eGFP＝2:1比例加入；期间添加培养液，转染后第10天，90％的细胞变圆而且其中60％细胞脱离培养皿底部后，用细胞刮刀收集细胞，细胞经液氮、37℃水浴反复冻融约4～5次后，离心并收集腺病毒上清；
B、腺病毒扩增：
准备密度为70％的100mm培养皿的293细胞，加入以上收集的病毒上清，扩增腺病毒，再次重复步骤A的方法收集腺病毒上清，用于后续试验或冻存于～80℃冰箱备用；
(6)腺病毒滴度稀释：
取腺病毒扩增后的腺病毒上清滴度为1GFU/mL的腺病毒液，分别用胚胎培养液(TCM199+10％FBS)进行10倍连续稀释，获得滴度分别为1GFU/mL、1×10-1GFU/mL、1×10- 2GFU/mL、1×10-3GFU/mL、1×10-4GFU/mL、1×10-5GFU/mL的病毒液，置于-80℃冰箱备用；
(7)腺病毒感染水牛颗粒细胞：
a、取1GFU/mL、1×10-1GFU/mL、1×10-2GFU/mL、1×10-3GFU/mL、1×10-4GFU/mL、1×10-5GFU/mL、0GFU/mL浓度的腺病毒液分别感染水牛颗粒细胞单层，分别感染24h、48h、72h后用倒置荧光显微镜观察试验结果，选择最佳感染水牛颗粒细胞的浓度；
b、取最佳感染水牛颗粒细胞浓度的腺病毒液分别感染水牛颗粒细胞单层，分别感染24h、48h、72h、96h后用倒置荧光显微镜观察试验结果，选择最佳感染水牛颗粒细胞的时间；
所述水牛颗粒细胞单层为在步骤(3)中单层共培养系统中培养成功的单层细胞；
(8)腺病毒感染水牛胚胎：
选择步骤(7)中最佳浓度的腺病毒液与于步骤(4)的微滴盘单层共培养系统中培养的待感染胚胎于胚胎培养液感染获得腺病毒介导的水牛转基因胚胎，感染的时间长为步骤(7)中的最佳感染时间。
在本发明中，进一步的说明，所述腺病毒为含有EGFP基因的重组腺病毒颗粒。
在本发明中，进一步的说明，步骤(4)中，所述待感染胚胎的透明带部分消化的操作方法如下：
将受精卵置于含3.3mg/mL Pronase的CM液滴中，在显微镜下观察胚胎消化全过程，并记录视野范围内第一个胚胎透明带开始变形的时间，将这个时间定义为First time，然后继续消化反应，并记录该胚胎透明带消失的时间，将这个时间定义为End time，经过5次重复试验后计算出First time和End time的平均时间；利用平均时间，将受精卵放入含有3.3mg/mLPronase的CM液滴中开始消化，First time后开始观察受精卵透明带变形情况，当透明带开始变形时立即把受精卵移到含10％FBS的CM培养液中终止消化，但仍然要继续观察受精卵的消化情况，直至透明带变到最薄又不破的时候，转移到含10％FBS的CM培养液中完全终止消化，在含10％FBS的CM培养液中洗2～3次后放入含10％FBS的CM培养液滴中，并在39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱中培养备下一步试验用；其中整个消化处理时间不超过End time的平均时间。
在本发明中，进一步的说明，所述胚胎培养液为TCM199+10％FBS。
在本发明中，进一步的说明，所述步骤A中的培养液为DMEM+10％FBS。
在本发明中，进一步的说明，所述胚胎培养液为TCM199+10％FBS+0.1％～0.5％灰树花多糖+0.01％～0.05％螺旋藻多糖。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明的方法大大的促进外源基因高效的转入水牛胚胎，且通过本申请的方法能够实现目标基因在水牛胚胎中高效的表达，从而提高转基因水牛胚胎生产的效率；通过本申请人的研究发现，受精卵内脂滴含量高，透明带厚20μm，使得外源基因不能顺利转入水牛受精卵中，通过本申请的技术手段将透明带消化至最薄但又未完全消化状态，既能保证了受精卵具有原始的生长环境，又能够在透明带很薄的状态下被腺病毒进行转染，提高转染效率。
2、本申请通过不断的探索发现了腺病毒介导转染水牛受精卵生产水牛转基因胚胎的条件，在不破坏胚胎生产环境的前提下，感染水牛颗粒细胞病毒浓度为1×10-2GFU/mL染效率达到80％以上、细胞凋亡率小于2％；腺病毒感染水牛颗粒细胞的最佳时间为48h，病毒感染效率可达100％，且对细胞形态和凋亡影响最小；在最佳的感染浓度和时间下，发现病毒感染2cell和4cell期无透明带胚胎后胚胎发绿光，而感染非完整透明带胚胎后不发光，2cell时期感染胚胎后胚胎停止发育，4cell开始感染胚胎后胚胎继续发育。
附图说明
图1是待感染胚胎的透明带部分消化前后对比图，图中左图为消化透明带前胚胎的细胞图，右图为部分处理消化带后的胚胎的细胞图；
图2是不同浓度腺病毒感染水牛颗粒细胞的绿色荧光效果表达图；
图3是腺病毒感染水牛颗粒细胞的不同感染时间的绿色荧光效果表达图；
图4是最佳浓度1×10-2GFU/mL腺病毒感染不同时期(2cell、4cell期)水牛胚胎的绿色荧光效果表达图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
1.实验方法
1.1试验动物
试验用的水牛来源于广西壮族自治区南宁市西乡塘区鲁班路屠宰场。
1.2试验试剂
转染试剂LipofectamineR 3000购自Invi trigon公司、胎牛血清(FBS)购自Sigma公司、低代次293细胞、293T细胞均购自申国科学院细胞库、腺病毒包装系统质粒pBHGloxdelE13cre、pDC316-eGFP均由申国农业科学院广西水牛研究所水牛遗传繁育重点实验室保存、Hoechest33342购买于德国Hoechst AG公司。
1.3试验仪器
倒置显微镜(日本Nikon公司)、培养箱(德国Bindey公司)、冰箱。
2.实验操作
2.1水牛卵母细胞体外培养
从屠宰场收集水牛卵巢，置于内含39℃生理盐水的保温壶中保温，1～2h以内送到实验室，确保到达实验室后保温壶中的温度仍在30～33℃最好。倒出卵巢，去除卵巢系膜和输卵管等多余组织，再用含双抗的生理盐水清洗2～3遍。清洗干净后用10mL注射器抽取直径为2～6mm的卵泡中的卵母细胞，缓慢注入平皿中，在体视显微镜下迅速选取胞质均匀、胞外有3层以上颗粒细胞的卵母细胞，洗涤2～3次。采用平皿培养，置于成熟培养液中于39℃、5％CO2饱和空气湿度培养箱中培养。
2.2体外受精和颗粒细胞单层共培养系统的准备
将水牛冻精解冻后置于爬高液爬高约30min，在此期间将成熟22～24h的水牛卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞轻轻吹打掉后，置于受精液中，每微滴10～15枚卵子，孵育约30min，将爬高、洗涤后的精子加入受精液微滴中，控制精子浓度(1～1.5)×106个/mL，将受精盘置于39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱中孵育。与此同时，将上述吹打下来的卵丘颗粒细胞吹打均匀后制成30μL/滴的微滴盘单层共培养系统，覆盖石蜡油，于39℃、5％CO2饱和空气湿度培养箱中培养备用。
2.3胚胎体外培养
受精18h后将附着在受精卵表面的精子吹打掉，在胚胎培养液中清洗2～3遍后转移到事先准备好的单层共培养系统中，于39℃、5％CO2饱和空气湿度培养箱中培养，记录胚胎各阶段发育发育情况。将待感染胚胎的透明带部分消化后置于微滴盘单层共培养系统中备用。
2.4腺病毒载体的包装及腺病毒扩增
将293细胞计数后按照70％的细胞密度接种于60mm培养皿，按转染试剂LipofectamineR3000说明书进行转染，其中质粒按pBHGloxdelE13cre：pDC316-eGFP＝2:1比例加入。期间添加培养液(DMEM+10％FBS)，转染后大约第10天左右，90％的细胞变圆而且其中60％细胞脱离培养皿底部后，用细胞刮刀收集细胞，细胞经液氮、37℃水浴反复冻融约4-5次后，离心并收集腺病毒上清。准备密度为70％的100mm培养皿的293细胞，加入以上收集的腺病毒上清，扩增腺病毒。再次收集腺病毒，方法同上，用于后续试验或冻存于-80℃冰箱备用。
2.5腺病毒滴度测定和稀释
将293T细胞计数，按5×103密度接种于96孔板。取100μL腺病毒用293T培养液进行10倍连续稀释，获得101～1010稀释倍数腺病毒液，每个稀释倍数接种3孔，每孔添加100μL腺病毒稀释液，同时设置3个孔为对照组。在37℃、5％CO2培养箱培养48h后，Hoechest33342染核后用倒置荧光显微镜观察试验结果。在200倍镜下，以每个视野内荧光细胞数为10～100个为佳。测得腺病毒滴度以绿色荧光形成单位/毫升(GFU/mL)表示，每个荧光细胞对应一个绿色荧光形成单位。依据公式:titer(GFU/mL)＝[(Green Fluorescent cells/field)×(fields/well)]/[volume virus(mL)×(dilution factor)]计算腺病毒滴度。
取滴度为1GFU/mL的腺病毒液，分别用胚胎培养液(TCM199+10％FBS)进行10倍连续稀释，获得滴度分别为1GFU/mL、1×10-1GFU/mL、1×10-2GFU/mL、1×10-3GFU/mL、1×10- 4GFU/mL、1×10-5GFU/mL的腺病毒液，置于-80℃冰箱备用。
2.6腺病毒感染水牛颗粒细胞条件摸索
因为颗粒细胞本身对腺病毒的耐受性比胚胎高，本发明首先对共培养体系(TCM199+10％FBS)中的水牛颗粒细胞感染条件进行摸索，在不破坏胚胎生产环境的前提下就腺病毒浓度进行首轮的摸索。设计如下两个试验：
(1)分别用1GFU/mL、1×10-1GFU/mL、1×10-2GFU/mL、1×10-3GFU/mL、1×10-4GFU/mL、1×10-5GFU/mL、0GFU/mL浓度的腺病毒分别感染水牛颗粒细胞单层，水牛颗粒细胞单层为上述微滴盘单层共培养系统中已准备好的单层细胞，将稀释成不同浓度梯度的腺病毒轻轻加入共培养系统微滴中，轻轻混匀，分别于感染24h、48h、72h后用倒置荧光显微镜观察试验结果。
(2)在上述最佳浓度条件下，继续摸索最佳感染时间(24h、48h、72h、96h)，方法步骤同上，用倒置荧光显微镜观察试验结果。
2.7腺病毒感染水牛胚胎条件摸索
选择上述颗粒细胞的最佳感染浓度和时间，就胚胎感染最佳时期进行摸索，在感染水牛胚胎前，将水牛受精卵置于含3.3mg/mL Pronase的CM液滴中，并在显微镜下观察胚胎消化全过程，并且记录视野范围内第一个胚胎透明带开始变形的时间，将这个时间定义为First time，然后继续消化反应，并记录该胚胎透明带消失的时间，将这个时间定义为End time，经过5次重复试验后计算出First time和End time的平均时间。利用平均时间进行如下试验，将受精卵放入含有3.3mg/mLPronase的CM液滴中开始消化，First time后开始观察受精卵透明带变形情况，当透明带开始变形时立即把受精卵移到含10％FBS的CM培养液中终止消化，但仍然要继续观察受精卵的消化情况，直至透明到变到最薄又不破的时候，转移到含10％FBS的CM培养液中完全终止消化，在含10％FBS的CM培养液中洗2-3次后放入培养液滴中，并在5％CO2、37℃培养箱中培养备下一步试验用(注意整个消化处理时间不能超过End time的平均时间)。
与现有的技术相比较，能够更加精准的保证胚胎的消化透明带于同一个状态下，而非采用对透明带的消化统一固定的时间区域的限定，使得每一个胚胎透明带的消化的程度不可预计，导致后期步骤腺病毒进行转染的效率不高；
消化透明带的技术相比现有技术也是不同的，针对水牛的胚胎的特性和透明带的组成，在透明带开始变形的时候就需要立即终止消化，整个过程需要持续的观察，才能提高后期腺病毒介导入水牛胚胎，提高生产水牛转基因胚胎的效率；
针对不同物种的胚胎的特点采用了不同的消化酶浓度，
因为透明带由透明带蛋白构成，对于脊椎动物的精卵识别、多精受精的防控以及对胚胎的保护起着关键性的调节作用。透明带蛋白家族由透明带蛋白1(Zona pellucida1,ZP1)、透明带蛋白2(Zona pellucida 2,ZP2)、透明带蛋白3(Zona pellucida 3,ZP3)和透明带蛋白4(Zona pellucida 4,ZP4)组成。小鼠透明带由ZP1～ZP3组成，其中ZP3蛋白是小鼠主要的精子受体，能诱发小鼠精子的顶体反应。水牛的透明带由ZP2、ZP3和ZP4组成，其中ZP3与ZP4形成异源二聚体后与精子结合；
因此本申请的技术是针对水牛的胚胎特点、透明带组成而研究设计的。将上述培养待用的非完整透明带胚胎(见图1)和用胚胎培养液稀释好的腺病毒加入到共培养系统微滴中，避免腺病毒直接加到胚胎上，而是加到培养液中，轻轻混匀，用倒置荧光显微镜观察24h、48h、72h、96h后胚胎感染情况。
3.结果与分析
3.1感染水牛颗粒细胞病毒浓度摸
从感染效果分析(见图2)，随着感染病毒浓度的增加和感染时间的延长，转基因效率得到有效提高，然而细胞凋亡率也随之提高。从病毒感染效率和细胞凋亡率上看，1×10- 2GFU/mL浓度组为最佳感染浓度。
3.2感染水牛颗粒细胞时间摸索
以1×10-2GFU/mL为感染浓度，摸索腺病毒感染水牛颗粒细胞的最佳时间，依图3看48h感染时间较好，该时间下病毒感染效率可达100％，且对细胞形态和凋亡影响最小。
3.3感染水牛胚胎条件摸索
利用腺病毒感染水牛颗粒细胞的最佳浓度和时间，对水牛胚胎的最佳感染条件进行摸索，从图4看出结果发现病毒感染2cell和4cell期无透明带胚胎后胚胎发绿光，而感染非完整透明带胚胎后不发光，2cell时期感染胚胎后胚胎停止发育，4cell开始感染胚胎后胚胎继续发育。用倒置荧光显微镜观察腺病毒感染24h、48h、72h、96h后的胚胎发育和感染情况。
实施例2：
与实施例1的操作步骤基本相同，不同点为胚胎培养液为TCM199+10％FBS+0.1％灰树花多糖+0.01％螺旋藻多糖；
其中，灰树花多糖、螺旋藻多糖的制备方法：取灰树花菌盖，洗净后于38℃下晾晒24小时，然后放入烘干箱中烘干至含水率为5％，一共分三段烘干，第一段烘干采用50℃烘5分钟，接着第二段烘干采用60℃烘干3分钟，接着第三阶段烘干采用40℃烘干至含水率至5％为止，然后凉冷密闭包装后冰冻12小时，接着将干品使用常温水浸泡20分钟，按照水：干品的重量比为5:1中火煎煮40分钟后停火，立即采用超声波功率为500赫兹进行辅助提取直至温度降至38℃，然后使用Sevag法去除蛋白物质，过滤取滤液，将滤液与质量分数为85％的乙醇溶液按照1:2的体积比混合振荡后静置过夜，抽滤后真空沉淀即可得到灰树花多糖
螺旋藻多糖的制备方法与上同，采用的提取部位为螺旋藻整株。
同样的用倒置荧光显微镜观察腺病毒感染24h、48h、72h、96h后的胚胎发育和感染情况。
实施例3：
与实施例2的操作步骤基本相同，不同点为胚胎培养液为TCM199+10％FBS+0.5％灰树花多糖+0.05％螺旋藻多糖。同样的用倒置荧光显微镜观察腺病毒感染24h、48h、72h、96h后的胚胎发育和感染情况。
实施例4：
与实施例2的操作步骤基本相同，不同点为胚胎培养液为TCM199+10％FBS+0.3％灰树花多糖+0.03％螺旋藻多糖。同样的用倒置荧光显微镜观察腺病毒感染24h、48h、72h、96h后的胚胎发育和感染情况。
对比例1：
与实施例1不同的是对胚胎进行透明带完全消化处理后，和用胚胎培养液稀释好的腺病毒加入到共培养系统微滴中，轻轻混匀，用倒置荧光显微镜观察腺病毒感染24h、48h、72h、96h后的胚胎发育和感染情况。
对比例2：
与实施例1不同的是对胚胎不进行透明带消化处理后，和用胚胎培养液稀释好的腺病毒加入到共培养系统微滴中，轻轻混匀，用倒置荧光显微镜观察腺病毒感染24h、48h、72h、96h后的胚胎发育和感染情况。
对比例3：
与实施例1不同的是将胚胎加入到胚胎培养液中，轻轻混匀，用倒置荧光显微镜观察腺病毒感染24h、48h、72h、96h后的胚胎发育和感染情况。
对比例4：
与实施例2的操作步骤基本相同，不同点为胚胎培养液为TCM199+10％FBS+0.09％灰树花多糖+0.009％螺旋藻多糖。同样的用倒置荧光显微镜观察腺病毒感染24h、48h、72h、96h后的胚胎发育和感染情况。对比例5：
与实施例2的操作步骤基本相同，不同点为胚胎培养液为TCM199+10％FBS+0.6％灰树花多糖+0.06％螺旋藻多糖。同样的用倒置荧光显微镜观察腺病毒感染24h、48h、72h、96h后的胚胎发育和感染情况。表1对实施例1-4和对比例1-5培养各个时间后胚胎的感染情况表
备注：每一个数据进行5次重复，每次重复35枚胚胎，胚胎数据的平均数±SEM；消化时间平均数±SD在同一列中的上标字母，相同表示差异不显著，不相同表示差异显著(P＝0.05)。
其中，转染囊胚率(％)＝荧光胚胎数/本组所培养的胚胎数；卵裂率(％)＝大于2-细胞胚胎数/本组所培养的胚胎数；桑囊率(％)是指发育到桑葚胚和囊胚的数量/本组所培养的胚胎数。
由上表可以看出：
从实施例1-4看，实施例2-4的转染囊胚率、桑囊率均比实施例1的处理方式更高，从卵裂率来看差别不大；
从实施例2-4与对比例4-5相比较，转染囊胚率、桑囊率分别在24h、48h、72h、96h时候差别不大，但实施例1相比较对比例4(多糖组合所占比重低)在同一水平时间上转染囊胚率、桑囊率略有提高，实施例4与对比例5(多糖组合所占比重高)在同一水平时间上转染囊胚率、桑囊率略有提高；
从实施例1与对比例4-5相比较，在同一水平时间下对比例4-5在转染囊胚率、桑囊率上略有提高，并随时间的增长降低的幅度小；胚胎培养液中的螺旋藻多糖中含有多种维生素、矿物质，调整了胚胎培养液中的微量元素比例，并且含有大量γ-亚麻酸能够在胚胎发育期间分解降低发育过程中不断分裂产生的有害物质，使得腺病毒感染胚胎的成功率提高，且腺病毒在扩增期间使用胚胎培养液进行扩增能够获取得到更有活力的腺病毒，进而也能提高转染的能力，提高转染的效率；灰树花多糖中含有的蛋白多糖能进一步的提供不断分裂形成的胚胎动力源素，而螺旋藻多糖中由多糖和单糖组成，单糖很容易被吸收在受精卵不断的分裂中容易被吸收利用，多糖需要受精卵多次分裂形成胚胎后分解利用多糖，但是多糖仅仅为一种动力素，另需要大量的蛋白质动力源素支撑，能够在徐徐渐进的分裂过程中提供更多的动力源素，促进腺病毒更有活力能快速的转染质量很好的胚胎，且为了满足分裂生长的需求，有活力的胚胎会快速的将环境中的动力素吸收利用，在多糖和单糖存在的条件下，单糖动力素不足后，会促进胚胎分解多糖成为单糖吸收利用，这就使得在腺病毒转染胚胎成功后的转染胚胎相比较生长的胚胎具有更好的活力与抵抗力，从而能提高在更长的时间段上不凋亡；
从实施例1、2、对比例1、2、3相比较，卵裂率在同一水平时间的培养上差异不大，桑囊率在同一水平时间上，实施例1、2的桑囊率相比较对比例1-3有所提高，在同一时间水平上，实施例1-2与对比例1相比较转染囊胚率也大大的提高。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
Claims (6)
1.腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，其特征在于：具体包括以下具体步骤：
(1)水牛卵母细胞体外培养：将屠宰场收集的水牛卵巢保存在39℃生理盐水中于1～2小时内送到实验室，去除卵巢系膜和输卵管多余组织，接着使用含双抗的生理盐水清洗，清洗后抽取直径为2～6mm的卵泡中的卵母细胞，然后选取胞质均匀、胞外有3层以上的颗粒细胞的水牛卵母细胞，洗涤后置于成熟培养液中于39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱中培养；
(2)体外受精：
将水牛冻精解冻后在爬高液内培养30min，
将于成熟培养液中培养22～24h后的水牛卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞吹打掉后，置于受精盘微滴中，每微滴加入10～15枚卵子，孵育30min；
将爬高培养后的精子经过洗涤后加入上述受精盘微滴中，控制精子浓度1×106个/mL～1.5×106个/mL，将受精盘置于39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱内培养；
(3)单层共培养系统的制备：
将吹打掉的卵丘颗粒细胞吹打均匀后制成30μL/滴的微滴盘单层共培养系统，覆盖石蜡油，于39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱内培养；
(4)胚胎体外培养：受精培养18h后将附着于受精卵表面的精子吹打掉，在胚胎培养液中清洗2～3遍后置于单层共培养系统中，于39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱内培养，记录胚胎各个阶段发育情况，将发育后待感染胚胎的透明带部分消化后置于微滴盘单层共培养系统中继续培养；
(5)腺病毒载体的包装及腺病毒扩增：
A、收集腺病毒上清：
将293细胞计数后按照70％的细胞密度接种于60mm培养皿，按转染试剂LipofectamineR3000说明书进行转染，其中质粒按pBHGloxdelE13cre：pDC316-eGFP＝2:1比例加入；期间添加培养液，转染后第10天，90％的细胞变圆而且其中60％细胞脱离培养皿底部后，用细胞刮刀收集细胞，细胞经液氮、37℃水浴反复冻融约4～5次后，离心并收集腺病毒上清；
B、腺病毒扩增：
准备密度为70％的100mm培养皿的293细胞，加入以上收集的病毒上清，扩增腺病毒，再次重复步骤A的方法收集腺病毒上清，用于后续试验或冻存于～80℃冰箱备用；
(6)腺病毒滴度稀释：
取腺病毒扩增后的腺病毒上清滴度为1GFU/mL的腺病毒液，分别用胚胎培养液(TCM199+10％FBS)进行10倍连续稀释，获得滴度分别为1GFU/mL、1×10-1GFU/mL、1×10-2GFU/mL、1×10-3GFU/mL、1×10-4GFU/mL、1×10-5GFU/mL的病毒液，置于-80℃冰箱备用；
(7)腺病毒感染水牛颗粒细胞：
a、取1GFU/mL、1×10-1GFU/mL、1×10-2GFU/mL、1×10-3GFU/mL、1×10-4GFU/mL、1×10- 5GFU/mL、0GFU/mL浓度的腺病毒液分别感染水牛颗粒细胞单层，分别感染24h、48h、72h后用倒置荧光显微镜观察试验结果，选择最佳感染水牛颗粒细胞的浓度；
b、取最佳感染水牛颗粒细胞浓度的腺病毒液分别感染水牛颗粒细胞单层，分别感染24h、48h、72h、96h后用倒置荧光显微镜观察试验结果，选择最佳感染水牛颗粒细胞的时间；
所述水牛颗粒细胞单层为在步骤(3)中单层共培养系统中培养成功的单层细胞；
(8)腺病毒感染水牛胚胎：
选择步骤(7)中最佳浓度的腺病毒液与于步骤(4)的微滴盘单层共培养系统中培养的待感染胚胎于胚胎培养液感染获得腺病毒介导的水牛转基因胚胎，感染的时间长为步骤(7)中的最佳感染时间。
2.根据权利要求1所述的腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，其特征在于：所述腺病毒为含有EGFP基因的重组腺病毒颗粒。
3.根据权利要求1所述的腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述待感染胚胎的透明带部分消化的操作方法如下：
将受精卵置于含3.3mg/mL Pronase的CM液滴中，在显微镜下观察胚胎消化全过程，并记录视野范围内第一个胚胎透明带开始变形的时间，将这个时间定义为First time，然后继续消化反应，并记录该胚胎透明带消失的时间，将这个时间定义为End time，经过5次重复试验后计算出First time和End time的平均时间；利用平均时间，将受精卵放入含有3.3mg/mLPronase的CM液滴中开始消化，First time后开始观察受精卵透明带变形情况，当透明带开始变形时立即把受精卵移到含10％FBS的CM培养液中终止消化，但仍然要继续观察受精卵的消化情况，直至透明带变到最薄又不破的时候，转移到含10％FBS的CM培养液中完全终止消化，在含10％FBS的CM培养液中洗2～3次后放入含10％FBS的CM培养液滴中，并在39℃、5％CO2、饱和空气湿度的培养箱中培养备下一步试验用；其中整个消化处理时间不超过End time的平均时间。
4.根据权利要求1所述的腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，其特征在于：所述胚胎培养液为TCM199+10％FBS。
5.根据权利要求1所述的腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，其特征在于：所述步骤A中的培养液为DMEM+10％FBS。
6.根据权利要求1所述的腺病毒介导的高效生产水牛转基因胚胎的方法，其特征在于：所述胚胎培养液为TCM199+10％FBS+0.1％～0.5％灰树花多糖+0.01％～0.05％螺旋藻多糖。
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