CN110305844A - 一种鲫鱼脊髓组织细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鲫鱼脊髓组织细胞系，该细胞系被命名为异育银鲫脊髓组织细胞系C8C37，于2018年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2018204。该细胞系可以在37℃快速繁殖，并能使病毒稳定传代。本发明还提供了选育具有类似特性的基于脊髓组织细胞系的选育方法。本发明的细胞系可以很好地应用于鲤疱疹病毒2型的研究和相关疫苗的生产中，具有成本低、耗时少、效果好的优点。

Description

一种鲫鱼脊髓组织细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，特别涉及适用于鲤疱疹病毒2型培养的一种 鲫鱼脊髓组织细胞系。

背景技术

1992年，在日本西部养殖的金鱼稚鱼出现大量死亡，死亡率几乎达到了 100％，病原鉴定为疱疹病毒性造血器官坏死病病毒(Herpesviral haemato poietic necrosisvirus，HVHNV)，因其是第二个从鲤科鱼体内分离得到的疱疹病 毒，故命名为鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2)。2007-2008年， 我国江苏盐城地区部分养殖场发现养殖鲫鱼以体表出血、鳃出血等为主要症 状的疾病，死亡率高达90％以上，经检验，病原为鲤疱疹病毒2型。2009年以 后，该疾病在该鲫鱼主产区呈现连年大面积暴发的趋势。并以江苏盐城为辐 射点，传播至江西、湖北、安徽、浙江、广东、宁夏、河北、天津、辽宁等 地。2011年，我国出口的马来西亚的金鱼被通报检出CyHV-2病原。该病毒传 染速度快、致死率高，给我国鲫鱼及金鱼的养殖行业造成了巨大损失，严重 遏制了水产养殖行业的健康发展。

病毒学研究离不开细胞培养分离技术的支持。但目前仍未分离出适合 CyHV-2持续繁殖超过10代的细胞。Jung等发现鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papillosum cyprinid，EPC)、胖头鲤细胞(Athead minnow cellS，FHM)和罗非 鱼卵巢细胞(Tilapia ovary，TO-2)能分离出CyHV-II，但CyHV-II在以上3种细 胞中的增殖均不能超过4代。Jeffrey研究结果表明，鲤疱疹病毒在锦鲤鳍细胞 (koifin 1，KF-1)培养能出现典型的CPE(细胞病变效应)，但随着增殖代数的增 加，细胞病变范围逐渐减小，第3代病毒接种后则完全无CPE出现。

CyHV-2无法持续在细胞内繁殖，导致研究CyHV-2的人员必须重复对细胞进 行接毒，耗时耗力。

另外，现有常用的鱼类细胞系的培养温度不能超过30℃，其生长速度很 慢：传代比例1∶2的情况下每代次培养时间通常为10～14日，加重了时间成本。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种鲫鱼脊髓组织细胞系，该细胞系 被命名为异育银鲫脊髓组织细胞系C8C37，于2018年11月15日保藏于中国 典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉的武汉大学，保藏号为 CCTCC NO：C2018204。

本发明还提供了一种能在37℃快速繁殖的鲫鱼脊髓组织细胞系的选育 方法，其特征在于，包含如下步骤：

1)传代培养：将鲫鱼脊髓组织细胞系CSC置于L15细胞培养基中，24℃ 传代至F50代；所述CSC保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为： CCTCC NO：C2018194；

2)37℃驯化：将2)中冻存细胞在24℃复苏，培养3日，移入37℃环 境培养，每2日更换培养基并倒掉漂浮死细胞，直至细胞长满单层；每次更 换培养基前，培养基必须37℃预热；

3)快速生长细胞筛选：在37℃传代培养，传至F60代，筛选生长最快 的一瓶细胞；

4)血清驯化：前述筛选后，F61-F62代用1号L15完全培养基培养，F63-F67 代用2号L15完全培养基培养，F68-F79代细胞用3号L15完全培养基培养； 所述1号L15完全培养基含有5％胎牛血清和5％新生牛血清，所述2号L15 完全培养基含有10％新生牛血清，3号L15完全培养基含有5％新生牛血清。

进一步地，步骤1)得到的F50代细胞经过冻存、24℃复苏后，再进入 步骤2)。

更进一步地，所述复苏为：在24℃培养3天。

本发明还提供了能在37℃快速繁殖的鲫鱼脊髓组织细胞系在鲤疱疹病 毒2型培养中的用途，其特征在于，所述细胞系是通过如下方法得到的：

1)传代培养：将鲫鱼脊髓组织细胞系CSC置于L15细胞培养基中，24℃ 传代至F50代；所述CSC保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C2018194；

2)37℃驯化：将2)中冻存细胞在24℃复苏，培养3日，移入37℃环 境培养，每2日更换培养基并倒掉漂浮死细胞，直至细胞长满单层；每次更 换培养基前，培养基必须37℃预热；

3)快速生长细胞筛选：在37℃传代培养，传至F60代，筛选生长最快 的一瓶细胞；

4)血清驯化：前述筛选后，F61-F62代用1号L15完全培养基培养，F63-F67 代用2号L15完全培养基培养，F68-F79代细胞用3号L15完全培养基培养； 所述1号L15完全培养基含有5％胎牛血清和5％新生牛血清，所述2号L15 完全培养基含有10％新生牛血清，3号L15完全培养基含有5％新生牛血清。

进一步地，步骤1)得到的F50代细胞经过冻存、24℃复苏后，再进入 步骤2)。

更进一步地，所述复苏为：在24℃培养3天。

本发明还提供了该细胞系在鲤疱疹病毒2型培养中的用途。

本发明还提供了一种鲤疱疹病毒2型的培养方法，其特征在于：它包括 如下步骤：

(1)将鲤疱疹病毒2型悬液接种于权利要求1所述C8C37细胞；

(2)吸附；

(3)继续培养，细胞病变后收获病毒。

如前述的方法，步骤(2)所述吸附的温度为24℃。

如前述的方法，步骤(2)所述吸附时间为1h。

如前述的方法，步骤(3)所述培养液为含新生牛血清含量为2％(体积 比)的L15维持液。

如前述的方法，步骤(3)的培养温度是24℃。

如前述的方法，步骤(3)的细胞病变率达到70％～80％时收获病毒。

本发明创造了一种在37℃快速繁育的鱼细胞，相比于以往常用的鱼类细 胞系，将鱼类细胞系培养的温度不能超过30℃稳定提升到37℃，将每代次 的培养时间从10～14日缩短至2～3日，传代扩增比例从1∶2扩大到了1∶3， 细胞状态良好时能将接种比例扩大到1∶4。

本发明还将培养基从进口胎牛血清替换为国产新生牛血清，血清用量从 10％降低到5％，使企业生成成本大幅降低。

本发明的细胞系可使CyHV-2病毒在细胞中持续稳定传代，传至第十代后 病毒的毒力仍然稳定。避免了CyHV-2相关研究开发及相关生产中反复对细胞 接毒，而产生的较大的时间、物力及人力成本。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。

附图说明

图1：鲫鱼脑组织细胞系分离驯化结果。

图2：37℃驯化的鲫鱼脊髓组织细胞系C8C37 F70代次染色体组成。

图3：C8C37细胞系培育的CyHV-2F10代病变图。

图4：C8C37收获的CBV F9、F10；1、CBV F9；2、CBV F10；M、2000bp maker；Y、阳性组织毒样本；N、阴性对照。

具体实施方式

以下通过实施例的方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但 不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明前 述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

1.实施例中用到的细胞

鲫鱼脊髓组织细胞系CSC(CCTCC NO：C2018194)。

2.试剂耗材

L15细胞培养基、胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清(FBS)购自Gibico公司； 青霉素链霉素双抗购自Hyclone公司；新生牛血清购自金源康公司；二甲基 亚砜(DMSO)购自SIGMA公司。PCR用2×Mi×buffer购自天根生化科技公 司，引物CyHV-2/F3与CyHV-2/R3由生工生物工程公司合成。

3.主要仪器设备

II级生物安全柜(苏净安泰BSC-1000A2)，倒置显微镜(重庆光电XDS-1B)， 冷冻离心机(Thermo)，恒温培养箱(科恒SPX-150)，液氮罐。

实施例1鲫鱼脊髓组织细胞系C8C37的选育

(1)CSC细胞系的传代培养：传代培养的鲫鱼脊髓组织细胞系在T25方瓶 长成单层后，倒掉原培养液，加入0.5m10.25％(w/v)的胰蛋白酶消化液 润洗一遍，再加入1ml的胰蛋白酶消化液室温静置消化1min左右待其行程 云雾状细胞层，倒掉胰蛋白酶消化液，显微镜下观察，当80％的贴壁细胞均 变圆时，加入5ml L15完全培养液，反复吹打，吹散悬浮消化的细胞，弃去 一半的细胞悬液，剩下细胞加入10ml L15完全培养基，置于24℃继续培养。

(2)37℃驯化：将24℃稳定传代至F50代次的CSC细胞消化后用冻存液 (10％的DMSO+90％胎牛血清)重悬，用冻存盒在-80℃冰箱冷冻24h以上，将 细胞转移至液氮罐冻存。冻存一月后取5支细胞复苏到T25细胞瓶后在24℃ 培养，检测细胞活性。培养3日后，待细胞生长至70％左右，将其直接转移 在37℃培养，每日镜检观察细胞生长状态。2日后将细胞培养瓶中漂浮死细 胞的培养液倒掉，换37℃预热的L15完全培养液。此后每2日更换一半细胞 培养液，直至细胞在37℃长满单层。

(3)37℃快速生长细胞筛选：复苏的5个F51代T25培养细胞中，待其在 37℃增殖形成单层时，均进行原瓶消化传代，50％细胞悬液接种，获得10个 T25瓶F52代细胞，继续37℃培养。每日镜检，筛选增殖最快形成细胞单层 的细胞培养瓶，进行继续传代培养。筛选至F60代，留下生长速度最快的一 瓶细胞进行37℃驯化的CSC细胞系继续繁育，命名为C8C37。

(4)血清驯化：配置①号L15完全培养基(5％胎牛血清+5％新生牛血清 +100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素)、②号L15完全培养基(10％新生牛血 清+100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素)及③号L15完全培养基(5％新生牛 血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素)。将F60代C8C37细胞扩繁，从F61 代开始用①号L15完全培养基传代培育，筛选生长最快的细胞从F63代开始 用②号L15完全培养基传代培育，至F65代C8C37细胞转用②号L15完全培养基进行新生牛血清驯化，从F68代在③号L15完全培养基传至F70代。经 筛选后的37℃驯化的鲫鱼脊髓组织细胞系C8C37细胞扩繁至T75细胞培养 瓶，长满单层后多生长一日，消化计数，细胞总数大于10⁶时，1∶3传代比 例在③号L15完全培养基内培养，可于3日内长满T75细胞培养瓶。如图1 所示，A为原代CSC F35代次鲫鱼脊髓组织细胞系，B为37℃驯化的C8C37F70 代次鲫鱼脊髓组织细胞系。

实施例2鉴定

将上述C8C37 F70代次鲫鱼脊髓组织细胞系进一步观察以及鉴定(鉴定 项目包括冻存复苏实验、染色体分析)，发现该细胞系具有如下的生物学特性：

(1)形态学：细胞类型为成纤维样细胞，多短小突触，据其分离部位判 断为胶质细胞。

(2)生长特性：传代的C8C37细胞在传代20min后开始贴壁，5h左右健 活细胞已贴壁完全。群体增倍速度约为36h。细胞生长为致密多层细胞，密 度效应明显，细胞接种密度越大增殖速度越快。

(3)稳定性：截止申请日前，细胞已传代至F75代次，增殖速度稳定， 细胞形态一致。

(4)冻存与复苏：胰酶消化后存活率96.9％的细胞液氮冻存，复苏后贴壁 迅速，生长速率、细胞形态未发生变化，无明显差别。液氮冻存1月后复苏 用台盼蓝染色，进Counstar细胞计数仪统计，仍有85％的细胞不着色，具有 细胞活性。

(5)染色体分析：取生长旺盛的快长满的细胞2瓶，加入秋水仙素，使 终浓度为0.4μg/ml，作用3～4小时后，倒掉培养基，用胰蛋白酶-EDTA消化， 然后1200rpm离心8min，去上清，沉淀用0.075mol KCl 8ml充分悬浮后37℃ 低渗25min；低渗后加入2ml新配的固定液(甲醇：冰乙酸为3∶1)，充分吹 打后1200rpm离心8min，去上清，留沉淀。再加入固定液将沉淀分散，冰 浴固定10分钟，重复二次；最后一次离心后视沉淀多少加入适量的固定液， 在温度25℃，湿度为50％的环境下，滴片。滴完片后玻片在65℃干燥箱中烤 30分钟；Giemsa染色，油镜观察，计数染色体数，根据多个分裂相细胞观 察计数，37℃培养的鲫鱼脊髓组织细胞系染色体数为156，与袁剑(袁剑等， 野鲫、异育银鲫和复合四倍体银鲫的倍性鉴别，上海海洋大学学报，2009，18： 667-672)研究结果相吻合(图2)。

鉴定后，将C8C37细胞送至中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏 号为CCTCC NO：C2018204。

实施例3病毒实验

CyHV-2敏感的鲫鱼脊髓组织细胞系系的应用，其步骤如下：

(1)组织毒样本收集：将经浙江淡水水产研究所提供的CyHV-2感染发病 致死的组织毒悬液经0.22μm滤膜过滤制备成无菌组织毒悬液，分装后保存 在-80℃。

(2)CyHV-2在C8C37细胞上的增殖：C8C37细胞T75培养至80％左右单 层，弃去培养基，用预热的③号L15完全培养基润洗一遍，将上述制备的无 菌组织毒悬液0.5ml接种至T75细胞瓶，24℃吸附1h，期间晃动3次以便病 毒吸附均匀。吸附结束后加入新生牛血清浓度为2％的L15维持液15ml继续 24℃培养，逐日镜检观察细胞有无病变，至病变达到70％～80％即可收获病毒。

(3)收获的CyHV-2核酸提取：将出现明显病变的C8C37细胞冻融1次后， 取少量悬液加入到离心管内，沸水浴5min后置于冷冻冰箱冰冻降温，此后 再次沸水浴5min后置于冷冻冰箱冰冻降温。经10000r/min离心5min，上清 即为CyHV-2的核酸模板。

(4)收获的CyHV-2PCR检测：

对提取的CyHV-2病毒核酸模板进行PCR扩增检测，引物：

CyHV-2/F3：TCATCGTCATCGTCATCATCAG(SEQ ID NO.1)；

CyHV-2/R3：GGTTGTATAGGCGGTTGGTATC(SEQ ID NO.2)。

反应体系为：2×PCR mixtrue buffer 12.5μl，水10.5μl，引物各0.5μl，模 板1μl。

扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变形30s，54℃退火30s，72℃延 伸40s，35个循环后，72℃延伸5min，结束反应。

结果：

CyHV-2接种C8C37细胞单层后，24℃培养5日后出现细胞变圆、回缩、 间隙变大等反应，8日后细胞单层脱落产生拉网现象，有明显的细胞病变效 应，并且传代至第F10代次的CyHV-2毒种仍然有明显的细胞病变效应，毒力 未见明显衰弱(图3)。

收获经C8C37培养的不同代次CyHV-2毒种，经PCR检测，均得到704bp 大小的片段，与阳性对照的扩增条带大小一致，结果判定为阳性(图4)。扩 增产物经测序，其序列均鉴定为CyHV-2，无碱基突变。

综上，本发明的细胞系具有在37℃下稳定快繁的能力，将其用作CyHV-2 病毒培养的载体，可使病毒稳定传代。本发明的细胞系具有十分良好的应用 前景。

序列表

<110> 成都天邦生物制品有限公司

浙江省淡水水产研究所

马鞍山史记动物健康管理有限公司

<120> 一种鲫鱼脊髓组织细胞系及其应用

<130> GY768-2019P016847CCZ

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

tcatcgtcat cgtcatcatc ag 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

ggttgtatag gcggttggta tc 22

Claims (8)

1.一种鲫鱼脊髓组织细胞系，其特征是，该细胞系被命名为异育银鲫脊髓组织细胞系C8C37，于2018年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：C2018204。

2.权利要求1所述细胞系在鲤疱疹病毒2型培养中的用途。

3.一种鲤疱疹病毒2型的培养方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)将鲤疱疹病毒2型悬液接种于权利要求1所述C8C37细胞；

(2)吸附；

(3)继续培养，细胞病变后收获病毒。

4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于：步骤(2)所述吸附的温度为24℃。

5.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于：步骤(2)所述吸附时间为1h。

6.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于：步骤(3)所述培养液为含新生牛血清含量为2％(体积比)的L15维持液。

7.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于：步骤(3)的培养温度是24℃。

8.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于：步骤(3)的细胞病变率达到70％～80％时收获病毒。