CN103695366A

CN103695366A - 金鱼肾脏细胞系及其应用

Info

Publication number: CN103695366A
Application number: CN201310713551.8A
Authority: CN
Inventors: 高隆英; 景宏丽; 李维; 张旻; 王娜; 张利峰; 林祥梅; 吴绍强; 江育林
Original assignee: SHEKOU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA; Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Shekou Customs Of People's Republic Of China; Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: CN103695366B

Abstract

本发明公开了一种金鱼肾脏细胞系及其应用。该金鱼肾脏细胞系已于2013年12月4日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），并证明存活，其保藏登记编号为CGMCC No.8557。本发明所述的金鱼肾脏细胞系特性稳定、成分均一，是研究水产动物病毒的良好材料。

Description

金鱼肾脏细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及一种金鱼肾脏细胞系及其应用，属于医学生物技术领域。

背景技术

关于鱼类细胞系的研究，国内外取得了很大的研究进展。在我国鱼类细胞培养研究始于20世纪70年代，细胞系主要来自鲤科鱼类。1981年张念慈等人建立的草鱼吻端组织细胞系ZC-7901。后来草鱼尾鳍细胞系GCCF-2、草鱼肾脏组织细胞系CIK和团头鲂尾鳍细胞系TQ-8801等多种鱼类细胞系相继建立，为鱼类病毒的研究奠定了坚实的基础。鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系是存着很大的偶然性，所以建立一株需要鱼类细胞系有效的办法是以数量对质量，即制备大批量的原代细胞株，从而筛选出敏感的细胞系。

世界卫生组织（OIE）检测水产动物病毒的“黄金标准”是通过细胞来分离病毒。为了能够更好有效的分离到水产动物的病毒，及早的检测出病毒，预防疾病的爆发，许多国内外的学者仍然在进行鱼类细胞系的研究。目前尚无关于建立金鱼肾脏细胞系的相关报道。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种特性稳定、成分均一的金鱼肾脏细胞系（GK），是一些水产动物病毒的敏感细胞系，是进一步研究未知病毒的良好材料。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种金鱼肾脏细胞系的制备方法。

本发明要解决的第三个技术问题是提供所述的金鱼肾脏细胞系在对水产动物病毒分离方面的初步应用。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：

经过筛选，本发明获得了特性稳定、成分均一的金鱼肾脏细胞系，该金鱼肾脏细胞系（GK）已于2013年12月4日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），并证明存活，其保藏登记编号为CGMCC No.8557，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，其分类命名为金鱼肾脏细胞系。

进一步地，所述细胞系具有以下生物学特性：

（1）细胞呈现典型的上皮细胞形态，连续传代培养50代仍保持该形态特点；

（2）细胞具有较强的增殖能力，连续培养50代仍保持该增殖和生长特性。

本发明还提供了一种上述金鱼肾脏细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：

（1）取金鱼一条，用医用酒精浸泡1-5min，于无菌条件下剪取金鱼的肾脏，放于浓度为1000u/ml的青霉素-链霉素双抗溶液中，放置10-15min；

（2）胰酶消化液消化10min，然后用剪刀剪成小块，用培养基重悬，离心，弃掉上清液，再用培养基进行重悬，离心，弃掉上清，最后加入培养基，重悬混匀；

（3）将步骤（2）制备的重悬混匀液加入到细胞培养瓶中，25℃培养箱中培养；

（4）待细胞铺板到1/3的时候，更换新鲜的培养基一次；

（5）待细胞铺满板子，用胰酶消化液进行初步消化后，加入新的培养基进行培养；

（6）传代3次后，冻存，复苏后能够继续稳定增殖生长，该细胞系命名为GK。

进一步地，所述培养基为含有浓度为100u/ml青霉素-链霉素双抗溶液和10﹪特级胎牛血清的M199培养基。

进一步地，所述胰酶消化液的配制：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，EDTA0.2g，胰酶0.6g，水1000ml。

进一步地，本发明所述的金鱼肾脏细胞系GK可以作为研究水产动物病毒宿主细胞使用，用于水产动物病毒的分离。

本发明的有益效果如下：

实验中使用的是鱼类细胞培养的最常用的培养基、且在简单的条件进行原代细胞筛选培养，保证最终获得的细胞无需特殊试剂和条件就能增殖，为其今后的应用提供更好的空间。该金鱼肾脏细胞系是首次成功在体外培养。该细胞在培养7天，明显出现延伸生长；15天后铺满板子，进行消化后，具有较强的繁殖能力，呈现典型的上皮细胞形态。细胞连续传代培养16个月已传至50代，仍然保持上述形态特点、生长和增殖特性。因此，该细胞是一种特性稳定、成分均一的金鱼肾脏细胞系，是研究水产动物病毒的良好材料。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明；

图1相差显微镜下的金鱼肾脏细胞系的形态；

图2金鱼肾脏细胞系悬浮特性分析

图3金鱼肾脏细胞系的最佳血清浓度的确定；

图4金鱼肾脏细胞系的最佳培养温度的确定；

图5金鱼肾脏细胞系的倍增曲线分析；

图6病鱼组织进行PCR检测结果；M：DL2000DNA Marker；N：空白对照（水）；P：阳性对照。

图7金鱼肾脏细胞系的增殖病毒的初步应用。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的方案，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。

实施例1金鱼肾脏细胞的分离和原代培养

实验材料和试剂

实验动物：10g-30g的金鱼（经过反复分子方法验证未感染水产动物病毒的健康金鱼）。

实验器具：解剖刀、眼科剪刀、眼科镊子和纱布等。

培养基和相关试剂：

青霉素-链霉素双抗溶液浓度为10000u/ml；

培养基：含有浓度为100u/ml青霉素-链霉素双抗溶液和10﹪特级胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）的M199培养基（gibco公司）；

胰酶消化液：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，EDTA0.2g，胰酶0.6g，水1000ml；

医用酒精；

0.01M的PBS缓冲液（NaCl80g，Na₂HPO₄·12H₂O29g，KH₂PO₄2g，KCl2g，水1000ml）。

实验方法

经过检测的健康金鱼，在实验室内暂养15天，无其他疾病，开始实验。具体方法：

（1）取一条金鱼在医用酒精中浸泡5min，无菌条件下，取金鱼的肾脏，放于浓度为1000u/ml的青霉素-链霉素双抗溶液中，放置15min；

（2）胰酶消化液消化10min，用解剖刀切割成小块（约1mm）。加入培养基，重悬。离心1000rmp，10min。弃掉上清液，再次加入培养基，进行重悬，离心，弃掉上清液，最后加入培养基，重悬混匀。

（3）铺瓶，放入到25℃培养箱中培养。

（4）待培养2天后观察细胞贴壁情况，适当加入培养基（保证培养基的pH）。待细胞铺板到1/3的时候（约7天），更换新鲜的培养基一次。

（5）待细胞铺满板子（约15天），用胰酶消化液进行初步消化后，加入新的培养基进行培养；

（6）传代3次后，冻存，复苏后能够继续稳定增殖生长，该细胞系命名为GK;

（7）每隔7天传代1次。

实验结果：

图1为相差显微镜下的金鱼肾脏细胞系的形态；图2是金鱼肾脏细胞系悬浮特性分析，结果表明细胞均一性比较好，集中在直径12-18微米。

实施例2金鱼肾脏细胞系的传代培养和冻存保种

试剂

胰酶消化液：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，EDTA0.2g，胰酶0.6g，水1000ml。

冻存液：含10﹪DMSO、25﹪的特级胎牛血清的M199培养基。

实验方法

待细胞生长至90﹪时，弃掉旧的培养基，加入2.5ml胰酶消化液进行消化；

待细胞呈现“白雾”状的时候，加入2ml的冻存液，以终止胰酶的作用，轻轻幌动，使细胞混匀，计数。

收集细胞到冻存管中，于冻存管上注明细胞的名称、细胞数和冻存日期。

一个月后，按照常规细胞复苏的方法，进行细胞复苏，细胞增殖能力仍然很强，状态良好。

获得的金鱼肾脏细胞系（GK）已于2013年12月4日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），并证明存活，其保藏登记编号为CGMCC No.8557。

实施例3金鱼肾脏细胞系的最适条件确定

一、试剂

培养基：不同浓度的特级胎牛血清的M199培养基。

二、实验方法

1、最适血清的确定

分别配制特级胎牛血清浓度为10%、15%、20%的培养液，调整细胞密度为2.8×10⁵mL^-1，三种血清浓度培养基各按1mL/孔的量接种于24孔板，于25℃，培养箱中培养。每2d从每个实验组里取出3孔细胞，消化收集细胞并计数，共培养12d，连续计数6次，绘制其生长曲线。

2、最适温度的确定

选择15℃、20℃、25℃、30℃四个不同培养温度，使用添加10%特级胎牛血清的M199培养液，调整细胞密度为2.8×10⁵mL^-1，细胞悬液按1mL/孔的量接种于24孔板并置于四个不同培养温度培养箱里。每2d从每个实验组里取出3孔细胞，收集细胞并计数，共培养12d，连续计数6次，绘制其生长曲线。

三、实验结果

最适血清的确定（图3），金鱼肾脏细胞系在特级胎牛血清10%的M199培养基中，增长繁殖最好。

最适温度的确定（图4），金鱼肾脏细胞系在25℃生长，繁殖最好。

实施例4金鱼肾脏细胞系的生长曲线

一、试剂

培养基：10%的特级胎牛血清（FBS）的M199培养基。

二、实验方法

取对数生长期的细胞，收集计数细胞，使用含10%FBS的M199培养，调整细胞浓度为8.38×10⁴mL^-1，按1mL/孔的量接种至24孔板中，置培养箱中25℃培养。每天取3个孔细胞，胰酶消化消化制成细胞悬液，混匀后用细胞计数仪进行计数，实验重复3次，连续进行9d，以培养时间(d)为横坐标，细胞浓度(细胞/mL)为纵坐标，绘制生长曲线；根据公式T=t×lg2/lg(N_t/N₀)计算细胞的群体倍增时间，其中，N₀为接种细胞数，N_t为时间t后的细胞数。

三、实验结果

金鱼肾脏细胞系在传代24h内为迟缓期，对数生长期在第24-120h，当120h时进入到平稳期(图5)

实施例5金鱼肾脏细胞系的初步应用

一、试剂

培养基：10%的特级胎牛血清（FBS）的M199培养基。

发病鱼的组织样品是由本实验室人员去异育银鲫的养殖场获得的。

二、实验方法

（1）发病鱼的组织样品的病原检测，根据典型症状初步判断为有金鱼造血器官坏死病毒引起的，对于典型症状的病鱼组织进行PCR方法确诊。具体步骤如下：

设计引物：

F2：5‘-CCC-AGC-AAC-ATG-TGC-GAC-GG-3’

R2：5’-CCG-TAR-TGA-GAG-TTG-GCG-CA-3’

扩增362bp片段，

反应条件：95℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；72℃，10min；反应35个循环。

（2）PCR检测阳性的组织接种于金鱼肾脏细胞系（GK）：对金鱼肾脏细胞系用胰酶消化液进行消化，含有10%的特级胎牛血清（FBS）的M199培养基重悬，滴入96空板中，25℃培养箱中培养。细胞增殖在24h内接入已稀释好的阳性病鱼组织，置于20℃培养箱中，每天观察变化。

三、实验结果

（1）PCR检测电泳结果：在病鱼的脾脏、肾脏、脑、鳃和肝脏中明显检测出阳性，结果表明病鱼组织中确实含有金鱼造血器官坏死病毒。

（2）病鱼组织接入金鱼肾脏细胞系中，经过7天观察出现了细胞病变（CPE），图7。目前针对金鱼造血器官坏死病毒缺乏敏感细胞系，本次试验结果说明金鱼肾脏细胞系能够增殖病毒金鱼造血器官坏死病毒，为其的研究提供了有力的材料。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种金鱼肾脏细胞系GK，其保藏号为CGMCC No.8557。

2.根据权利要求1所述的金鱼肾脏细胞系GK，其特征在于，所述细胞系具有以下生物学特性：

3.一种权利要求1所述的金鱼肾脏细胞系GK的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）取金鱼一条，用医用酒精浸泡1-2min，于无菌条件下剪取金鱼的肾脏，放于浓度为1000u/ml的青霉素-链霉素双抗溶液中；

（2）胰酶消化液消化10min，然后剪成小块，用培养基重悬，离心，弃掉上清液，再用培养基进行重悬，离心，弃掉上清，最后加入培养基，重悬混匀；

（4）待细胞铺板到1/3的时候，更换新鲜的培养基一次；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为含有浓度为100u/ml青霉素-链霉素双抗溶液和10﹪特级胎牛血清的M199培养基。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述胰酶消化液的配制：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，EDTA0.2g，胰酶0.6g，水1000ml。

6.权利要求1所述的金鱼肾脏细胞系GK作为研究水产动物病毒宿主细胞的应用。

7.权利要求1所述的金鱼肾脏细胞系GK在水产动物病毒分离中的应用。