CN102321542A - 一株耐旱地衣共生藻及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐旱地衣共生藻及其应用。该耐旱地衣共生藻为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC No.3892。本发明提供的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892具有耐旱性强、生长周期短的特点,在进行人工防沙固沙、治理荒漠和改善生态环境等方面将有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株耐旱地衣共生藻及其应用。
背景技术
地衣(lichen)是由真菌与藻类或蓝细菌整合共生形成的,在形态上全然不同于真菌和藻类或蓝细菌的生命形式,是自然界中互惠共生的典范。地衣的主要成分是参与共生的真菌,地衣的形态特征几乎完全由其共生菌所决定,因此地衣共生菌的分类地位即为地衣的分类地位,即地衣共生菌的学名就是其地衣体的物种学名。地衣具有极强的生命力,号称“拓荒者”和“先锋生物”,广泛分布于包括裸露的岩石、荒漠的地表、固化的火山岩浆、极地冰洞介质的内部或表面的各种生境中。
地衣与人类的关系十分密切。主要可以概括为两大类:一是直接利用:如作为草药入药,魏江春等(中国药用地衣,北京:科学出版社.1982)描述了与医药卫生有关的71种地衣;地衣次生代谢产物可作为抗生素、抗癌物质,譬如有抗菌活性的松萝酸、地衣酚类,有抗癌活性的地衣多糖、石耳多糖等;二是间接利用:如地衣监测、评定大气质量。另外,一些种属的地衣因适应了荒漠生境,它们能几个月甚至几年耐受超过50℃的高温和干燥,在荒漠生态系统中发挥着不可替代的生态功能。
如上所述,地衣不仅有药用价值,在荒漠生境中还具有稳定生态系统的重要作用。但是,地衣生长缓慢,需要几年、几十年甚至上百年的生长期才能达到人们所需要的生物量,进而限制了对地衣的利用及其优势作用的发挥。幸运的是可以通过分离培养的方法,获得大量的地衣共生菌及其地衣共生藻,直接或通过人工合成地衣的方式加以利用。因此,对地衣共生菌及其地衣共生藻进行分离培养具有重要意义。
Ahmadjian V.和H.,曾对采集自美国爱荷华州韦弗利地区的石果衣标本进行分离培养,并得到石果衣Endocarpon pusillum Hewdig的共生菌与共生藻(1970,The culture and synthesis of Endocarpon pusillum and Staurothele clopima.Lichenologist,4:259-267.),但其地衣共生菌生长缓慢,需要一年之久。在国内,苏敏、魏江春(Su Min,Wei Jiangchun,2008.Research on liquid culture ofmycobiont and photobiont isolated from cladonia pyxidata.Journal of fungalresearch,6:57-62.)报道,分离得到喇叭石蕊Cladonia pyxidata(L.)Hofm的共生菌与共生藻,但该分离标本采集地年均降雨量在500mm。随后曹叔楠、魏江春(2009,荒漠地衣糙聚盘衣共生菌耐旱生物学研究及液体优化培养.菌物学报28:790-796.)报道对采集自年均降雨量不足100mm甘肃文殊沟的Glypholecia scabra进行分离培养,但是只得到了共生菌,无相应的共生藻。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐旱地衣共生藻及其应用。
本发明所提供的地衣共生藻为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020,已于2010年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC No.3892。
石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892具有以下特征:
1)细胞椭圆形至钝圆柱形,椭圆形细胞大小为3.8×4.8μm,圆柱形细胞长5.8-8.6μm,宽3.8-4.8μm;叶绿体片状、侧生;细胞外侧有水质胶壳包裹。
2)nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)基因序列长度为744bp,其核苷酸序列如序列表序列1所示。
3)生长周期短,在22℃,12h光照/12h黑暗条件下培养10天达到对数生长期,生长曲线见图2。
4)耐旱性强,在干燥条件下(相对湿度<10%)可以存活30天之久(图3,b)。
本发明提供了石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的培养方法,该方法包括将所述石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892在如下条件下进行培养获得所述石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No.3892藻体的步骤:温度20-24℃如22℃、每天24小时中12小时光照(光照强度2000lux)/12小时黑暗。
本发明所提供的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的分离标本采集自腾格里沙漠东南缘的沙坡头地区,该采集地干旱多风,年均降雨量不足200mm,是沙漠生物资源“储存库”;该石果衣共生藻Diplosphaera chodatiiA07020 CGMCC No.3892具有可培养、生长周期短、耐旱性强的特点,在干旱条件下具有很强的生命力,单独使用即可与沙粒形成结皮,预示了该共生藻在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生态环境将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892在不同温度下培养的生长量。
图2为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的生长曲线。
图3为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的耐旱性实验。其中a为对照,未进行干燥胁迫;b为干燥胁迫30天后,转接于PDA培养基。
图4为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892形成的结皮。
图5为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892形成结皮的微观照。
图6为为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893在不同温度下培养的生长量。
图7为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的生长曲线。
图8为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893干旱胁迫实验结果。其中,a为对照;h为干燥胁迫210天后,转接于PDA培养基。
图9为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893形成的结皮。
图10为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893形成结皮的微观照。
图11为实验室条件下石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892形成的结皮。
图12为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892在室内共培养形成结皮的纵剖面电镜扫描图。
图13为喷洒样方的制作。其中,左图为示意图,右图为实际的草障方格。
图14为野外固沙实验形成人工地衣结皮。其中,左上图结皮已初具规模,右上图结皮厚度已达到0.4-0.6cm,左下图对照未形成结皮,右下图已出现Endocarpon sp.。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本实施例中所使用的培养基成分如下:
琼脂(1.5%WA)培养基:琼脂粉15g,蒸馏水1L。
大豆蛋白胨(DBD)液体培养基:蛋白胨10g,酵母膏5g,葡萄糖1g,蒸馏水1L。
土豆浸汁(PDA)培养基:葡萄糖20g,琼脂粉15g,土豆浸汁1L,不加琼脂粉即为液体PDA培养基。
实施例1、石果衣共生藻Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3892的分离、鉴定及特性
1、地衣标本的采集与鉴定
从腾格里沙漠东南缘的沙坡头地区(干旱多风,年均降雨量不足200mm)采集获得新鲜地衣标本,采用形态解剖学方法对该标本进行鉴定。选取成熟、发育良好的地衣体,放于盛有蒸馏水的培养皿中,使地衣体浸透变软,随后用干净滤纸吸去地衣体上的多余水分,冷冻切片,在解剖镜下选取较薄的切片置于载玻片水滴中,加盖玻片,在显微镜下观察,结果如下:
地衣体鳞片叶状,鳞片叶聚集,紧密贴生于基物,宽约2-5mm,圆形至不规则形状,边缘完整至锯齿状,上表面深棕色至浅棕色,平坦至微下凹,下表面黑色具有菌丝和假根,假根黑色,5-7mm长,单一少分枝,每个鳞片叶单个或多个假根。子囊壳球形,直径0.1-0.2mm每个鳞片叶1-6个,埋生于地衣体中,孔口周围深棕色。
地衣体厚140-200μm,上皮层厚25-50μm,透明无色,为假薄壁组织;藻层厚75-100μm,藻细胞直径5-10μm;髓层厚10-25μm;下皮层厚30-50μm,下部浅黑色,菌丝细胞壁加厚。
子囊壳通常圆形,内腔高220-400μm,宽200-380μm,果壳棕色,厚25-37μm,侧丝25-65μm长,子实层藻直径4-7μm,子囊棒状,50-65×15-22μm,子囊内含2个子囊孢子,砖壁型,长椭圆形,25-50×12-17μm。
基物为沙土。
通过以上观察结果,鉴定该荒漠地衣标本为石果衣Endocarpon pusillum Hedwig,Descript.Adumbr.Musc.Frondos.:56(1789)。
2、地衣共生藻的分离、培养
利用孢子释放方法从步骤1获得的石果衣地衣标本中分离地衣共生藻,具体方法为:将新鲜地衣标本的成熟子囊器,用水浸湿后吸去表面多余水分,用凡士林将子囊器倒置在培养皿盖内侧,培养皿下部为1.5%WA培养基,为获得单一孢子萌发形成的藻落,每12h转动培养皿盖一次(因共生菌与共生藻孢子同时喷射,所以可以通过上述孢子释放方法同时得到共生菌与共生藻),当观察到有藻生长后,转入PDA斜面培养基,22℃,12h光照/12h黑暗,光照强度2000lux条件下培养地衣共生藻,大量生长后转入DBD液体培养基,150rpm同样条件下振荡培养。
以上操作均在无菌条件下进行,通过上述方法获得一株地衣共生藻,将其命名为A07020。
3、地衣共生藻A07020的鉴定
1)形态特征
将地衣共生藻藻株A07020接种于PDA斜面培养基,在22℃,12h光照12h黑暗,光强2000lux条件下培养10天,观察藻细胞形态。观察结果为:细胞椭圆形至钝圆柱形;椭圆形细胞大小为3.8×4.8μm,圆柱形细胞长5.8-8.6μm,宽3.8-4.8μm;叶绿体片状、侧生;细胞外侧有水质胶壳包裹。
2)nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列的PCR扩增和序列测定
A)DNA提取
分别取10-20mg步骤1获得的石果衣标本及其地衣共生藻A07020;液氮研磨;加入300μl 2×CTAB,轻轻混匀,90℃水浴2min;加入300μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),振荡混匀,12000r/min离心5min去除蛋白质;取上清加入等体积的DNA结合液(4.0mol/L异硫氰酸胍,0.5mol/L,pH5.0乙酸钾,终体积浓度为30%异丙醇)颠倒混匀,随即移入吸附柱静置2min,12000r/mim离心15s,弃残液;加入300μl洗涤液(10mmol/L,pH5.0乙酸钾,终体积浓度为80%乙醇),12000r/min离心15s,去残液,重复一次;12000r/min离心干燥1min;将吸附柱移入新无菌离心管,加入30μl TE洗脱液静置5min,12000r/min离心15s,重复洗涤一次,去除吸附柱,离心管内即为DNA模板。
B)nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)基因的PCR扩增及序列测序
用于石果衣标本及其地衣共生藻A07020 PCR扩增的正向引物为5’-CTGCGGAAGGATCATTGATTC-3’(SSU nt1780-1800),反向引物为5’-AGTTCAGCGGGTGGTCTTG-3’(LSU nt0012-0030)。PCR扩增体系(50μl):10×buffer5μl;25mmol/L MgCl2 3μl;2.5mmol/L dNTPs 4μl;10μmol/L引物各1μl;ddH2O34μl;Taq DNA酶1μl;模板1μl。PCR扩增条件为95℃180s,94℃30s,52℃30s,72℃90s,37个循环;72℃600s,4℃保存。
PCR扩增产物经北京标凯生物技术有限公司测序,测序结果经DNAman5.2.2进行双序列比对分析。
测序结果表明,石果衣及其共生藻A07020的nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列长度均为744bp,其核苷酸序列完全相同(如序列表序列1所示),表明该荒漠地衣共生藻由其相应标本分离得到。将荒漠地衣共生藻A07020的nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列在Genbank中进行同源比对分析,其序列与Stichococcus diplosphaera Chodat=Diplosphaera chodatii Bialosuknia的nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列相似度为100%。根据形态特征以及nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列在Genbank中同源序列的比对结果,将石果衣共生藻A07020鉴定为Diplosphaera chodatii Bialosuknia。
石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020已于2010年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC No.3892。
4、石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的生长特性
1)培养温度的筛选:挑取定量石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCCNo.3892,转接于DBD液体培养基中,12h光照12h黑暗,光照强度为2000lux分别在10℃,16℃,22℃,28℃,34℃150rpm振荡培养30天,每个温度3个重复,取平均值筛选地衣共生藻最适培养温度。以培养温度为横坐标,藻细胞叶绿素在665nm处的吸光值为纵坐标绘制柱形图。
2)生长曲线的绘制:挑取定量石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCCNo.3892,转接于DBD液体培养基中,22℃,150rpm 12h光照12h黑暗,光照强度为2000lux培养,通过叶绿素在665nm处的吸光值测定共生藻的生长量,每3天测定一次,每次3个重复,以培养时间为横坐标,665nm处吸光值为纵坐标绘制生长曲线。
图1中,对不同温度下培养的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCCNo.3892的吸光值进行多重比较(α=0.05),以标记字母法(a、b、c)表示比较的结果。结果显示,该衣共生藻在10℃到34℃之间都可以生长,在培养温度为22℃时具有最大生长量。从图2可以看出,在22℃,150rpm 12h光照12h黑暗,光照强度为2000lux条件下培养10天后石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892达到对数生长期。
5、石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的耐旱性
1)活化:将对数生长期的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892转接入液体PDA培养基中,22℃、150rpm,12h光照/12h黑暗培养10天。
2)干燥胁迫:无菌条件下,将1)得到的藻液转入不含培养基的培养皿(直径35mm)中,将培养皿放入含变水硅胶的干燥器中(相对空气湿度≤10%,环境温度为20~27℃,自然光照条件),以造成干燥胁迫。
每月将胁迫处理的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020转接到固体PDA培养基中,环境温度20~27℃,黑暗培养,并观察共生藻的生长情况(图3)。
对照:初始未胁迫石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892(图3,a)。
上述石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892在干燥胁迫30天后仍未死亡,转接于PDA培养基培养后,证明其仍有活性(图3,b)。
实施例2、石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的固沙实验
活化:将石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892接入土豆浸汁(PDA)液体培养基中,22℃、12h光照(2000lux)/12h黑暗150rpm培养10天。
将活化后的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892藻悬液在无菌条件下撒播于铺有无菌沙粒培养皿中(沙粒厚约5mm,以无菌水刚刚润湿沙粒为准),使该共生藻的撒播量为0.42×106个细胞/平方厘米,12h光照(2000lux)/12h黑暗条件下,20℃培养,60天后观察到该共生藻与沙粒形成的藻结皮,绿色藻层厚约2mm(图4,图5)。
以上实施例表明石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892具有可培养、生长周期短、耐旱性强的特点,并且在人工培养条件下可与沙粒形成结皮,预示利用该石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892进行人工生物结皮固沙、防沙的巨大潜力,在人工防沙固沙、治理荒漠、改善生态环境方面具有广阔的应用前景。
实施例3、石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892与石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893形成地衣共同固沙
一、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的分离鉴定
1、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的分离鉴定
1)分离培养
利用孢子释放方法从实施例1获得的石果衣标本中分离地衣共生菌,具体方法为:将新鲜地衣标本的成熟子囊器,用水浸湿后吸去表面多余水分,用凡士林将子囊器倒置在培养皿盖内侧,培养皿下部为1.5%WA培养基,每12h转动培养皿盖一次(因共生菌与共生藻孢子同时喷射,所以可以通过上述孢子释放方法同时得到共生菌与共生藻),以获得单一孢子形成的菌落。当观察到孢子萌发后,将含有萌发子囊孢子的琼脂块转入PDA斜面培养基,22℃黑暗培养地衣共生菌,生长后转入DBD液体培养基,150rpm黑暗培养。
以上操作均在无菌条件下进行。通过上述方法获得一株地衣共生菌,将其命名为F07020。
2)地衣共生菌F07020的鉴定
A)形态特征
将地衣共生菌F07020接种于PDA斜面培养基上,22℃黑暗培养30天,观察菌落形态。观察结果为:菌落直径0.8-0.9cm,呈不规则圆形,表面粗糙,边缘整齐或否,暗褐色至浅灰色。
B)nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列的PCR扩增和序列测定
DNA提取:分别取实施例1获得的石果衣及其共生菌F07020 10-20mg;液氮研磨后加入300μl 2×CTAB,轻轻混匀,90℃水浴2min;加入300μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),振荡混匀,12000r/min离心5min去除蛋白质;取上清加入等体积的DNA结合液(结合液成分:4.0mol/L异硫氰酸胍,0.5mol/L、pH5.0乙酸钾,终体积浓度为30%的异丙醇)颠倒混匀,随即移入吸附柱静置2min,12000r/mim离心15s,弃残液;加入300μl洗涤液(洗涤液成分:10mmol/L,终体积浓度为80%的乙醇),12000r/min离心15s,去残液,重复一次;12000r/min离心干燥1min;将吸附柱移入新无菌离心管,加入30μl TE洗脱液静置5min,12000r/min离心15s,重复洗涤一次,去除吸附柱,离心管内即为DNA模板。
nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)基因的PCR扩增及序列测序:用实施例1获得的石果衣及其共生菌F07020 PCR扩增的正向引物为ITS15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SSU nt1769-1787),反向引物为ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(LSU nt60-79);PCR扩增体系(50μl):10×buffer5μl;25mmol/L MgCl2 3μl;2.5mmol/L dNTPs 4μl;10μmol/L引物各1μl;ddH2O34μl;Taq DNA酶1μl(0.25U);模板1μl(50ug)。PCR扩增条件为95℃180s,94℃30s,52℃30s,72℃90s,37个循环;72℃600s,4℃保存。
PCR扩增产物经北京标凯生物技术有限公司测序,测序结果经DNAman5.2.2进行双序列比对分析。
测序结果表明,石果衣及其共生菌F07020的nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列长度均为557bp,其核苷酸序列完全相同(如序列表序列2所示),表明该荒漠地衣共生菌由其相应标本分离得到。根据地衣共生菌的学名就是其地衣物种的学名,以及荒漠地衣共生菌F07020与荒漠地衣标本nrDNA-ITS(ITS1-5.8S-ITS2)同源序列的比对结果,将荒漠地衣共生菌F07020鉴定为石果衣共生菌Endocarpon pusillum Hedwig。
石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020已于2010年05月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC No.3893。
2、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的生长特性
1)培养温度的筛选:定量挑取石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCCNo.3893,转接于DBD液体培养基中,黑暗条件,分别在10℃,16℃,22℃,28℃,34℃150rpm振荡培养45天,每个温度3个重复,取平均值筛选地衣共生菌最适培养温度。以培养温度为横坐标,菌丝干重为纵坐标绘制柱形图(图6)。
2)生长曲线的绘制:挑取定量石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCCNo.3893,转接于DBD液体培养基中,22℃,黑暗条件,150rpm振荡培养,每15天测定一次菌丝干重,每次3个重复,取平均值,以培养时间为横坐标,菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线(图7)。
图6中对不同培养温度下石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的生长量进行多重比较(α=0.05),以标记字母法(a、b、c)表示比较的结果,结果显示,该共生菌在10℃到28℃均可生长,在22℃培养时明显具有最大生长量;从图7可以看出,该菌在22℃培养30天后到达对数生长期,与Ahmadjian V.andH.(1970)报道的地衣共生菌(The culture and synthesis of Endocarponpusillum and Staurothele clopima.Lichenologist,4:259-267.)需培养1年相比,差异显著。
3、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的耐旱性
1)活化:将对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893转接入PDA液体培养基中,150rpm黑暗培养30天。
2)干燥胁迫:在无菌条件下,将步骤1)得到的菌液转入不含培养基的培养皿(直径35mm)中,将培养皿放入含变水硅胶的干燥器中(相对空气湿度≤10%,环境温度为20~27℃,自然光照条件),以造成干燥胁迫。
每月将胁迫处理的石果衣共生菌转接到含固体PDA培养基中,环境温度20~27℃,黑暗培养,并观察石果衣共生菌的生长情况。
对照:初始未胁迫的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893(图8,a)。
上述石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893在干燥胁迫210天后仍未死亡,转接于PDA培养基培养后,证明其仍有活性(图8,h)。
4、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的固沙实验
活化:将对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893转接入液体PDA培养基中,150rpm黑暗培养30天。
将活化后的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌丝球在无菌条件下研碎,用无菌水稀释至浓度为1.57g/ml(以菌丝球湿重计)后撒播于铺有无菌沙粒培养皿中(培养皿直径10cm,沙粒厚5mm,以无菌水刚刚润湿沙粒为准),每皿喷施5mL,使该共生菌的撒播量为0.1g/cm2(以菌丝球湿重计),12h光照/12h黑暗,20℃培养30天后观察。
石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893在30天后有新鲜菌丝长出,同时可以见到新形成的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌丝与沙粒形成的结皮,厚2mm(图9,图10)。
二、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892共培养制备地衣与固沙
1、室内共培养制备地衣与固沙实验
将石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892分别接种于PDA斜面培养基上,活化15天后,当观察到培养基上有上述地衣共生菌和共生藻生长后,将地衣共生菌和共生藻分别转接入PDA液体培养基中150rpm大量培养,培养周期分别为30天和20天,培养条件分别为:共生菌22℃暗培养;共生藻22℃、12h光照(光照强度2000lux)/12h暗培养。
将培养至对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892混匀,使共生菌与共生藻的浓度分别为0.785g/ml(以菌丝球湿重计)和3.25×106个细胞/ml。将得到的混合液均匀喷洒于无菌沙土表面,沙土颗粒大小均一,盛于直径10cm的无菌平皿中,厚约0.5cm。每皿喷施5mL混合液,做3皿重复,平皿密封后置于光照培养箱中,22℃、12h光照(2000lux)/12h黑暗条件下培养,定期观察。
培养12个月后,三个重复均观察到石果衣地衣共生菌与共生藻形成结皮,并且固着在沙土颗粒之上,覆盖了平皿的80%(图11)。
同时,对结皮进行纵切,通过扫描电镜观察发现石果衣共生菌Endocarponpusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892发生接触,并且菌丝将藻细胞包裹在内(图12),说明二者已经共生形成地衣的初始阶段,并且起到固着沙粒的作用。
2、野外固沙实验
在平整固定沙丘上清理3个约0.5m2的沙面,然后用麦草将每个沙面分成两部分,形成草障方格,即0.4×0.5m区作为喷洒清水对照方,0.6×0.5m区作为喷洒悬浮液实验方(图13)。
将处于对数生长期的地衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892及野外收集的地衣碎片(经鉴定,该地衣为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892共生形成的石果衣)与水混合,混合后得到浓度分别为0.5g/ml(以菌丝球湿重计)、0.21×107个细胞/ml、5×10-3g/ml的悬浮液,然后按每平方米1L悬浮液均匀撒播于实验方沙土表面,每3天用清水浇灌一次,观察。对照样方喷洒清水,用量与悬浮液体积相同,其他管理均相同。
以上处理均辅以保水剂(Super Absorbent Polymers,简称SAP,购自北京金元易生态工程技术中心),将保水剂以250g/m2的用量撒播于草方格之上保持水分。
上述地衣碎片的制备方法如下:将地衣(经鉴定,该地衣为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和共生藻Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No.3892共生形成的石果衣)及其下4mm-12mm的土壤同时取下,碾碎经直径0.5cm的筛网过滤,获得均一大小的地衣碎片。
结果:在12个月后的地衣结皮在自然条件下均已初具规模(图14,左上),结皮厚度均已达0.4-0.6cm(图14,右上),与对照方的差异明显(图14,左下),且有地衣着生(图14,右下)。
以上结果表明,该地衣及其共生藻与共生菌可以直接促进地衣结皮的形成,缩短了微型生物结皮成熟的时间,操作简便,可以有效持久固沙,提高荒漠生态系统的营养元素及生物多样性,同时其形成的生态景观不仅可以为荒漠地区旅游业带来经济价值,而且可以为干旱半干旱地区城镇绿化提供材料。
Claims (6)
1.Diplosphaera chodatii A07020,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC No.3892。
2.权利要求1所述Diplosphaera chodatii A07020的培养方法,包括将权利要求1所述Diplosphaera chodatii A07020在如下温度和光照条件下进行培养获得所述Diplosphaera chodatii A07020的藻体的步骤:20-24℃,每天24小时中12小时光照12小时黑暗,光照强度2000lux。
3.权利要求1所述Diplosphaera chodatii A07020在人工防沙固沙中的应用。
4.权利要求1所述Diplosphaera chodatii A07020在治理荒漠中的应用。
5.权利要求1所述Diplosphaera chodatii A07020在改善生态环境中的应用。
6.权利要求1所述Diplosphaera chodatii A07020在制备地衣中的应用。
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