CN102318562A

CN102318562A - 一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣

Info

Publication number: CN102318562A
Application number: CN2011102620128A
Authority: CN
Inventors: 魏江春; 杨军; 张涛; 周启明; 曹叔楠
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2010-09-29
Filing date: 2011-09-06
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2031-09-06
Also published as: CN102318562B; CN102308753B; CN102321542B; CN102308753A; CN102321542A

Abstract

本发明公开了一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣。本发明提供了一种用于制备地衣的成套产品，由独立包装的菌和藻组成，所述菌为Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893，所述藻为Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892。本发明所提供的专用地衣为Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892形成的地衣。按照本发明的方法将专用地衣和/或该地衣的共生菌和共生藻撒播于沙土表面，一年即可形成结皮，每平方米的结皮覆盖率可达80％，该方法可直接促进地衣结皮的形成，缩短了微型生物结皮成熟的时间，操作简便，可以有效持久固沙，提高荒漠生态系统的营养元素及生物多样性，同时其形成的生态景观不仅可以为荒漠地区旅游业带来经济价值，而且可以为干旱半干旱地区城镇绿化提供材料。

Description

一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣

技术领域

本发明涉及一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣。

背景技术

中国是世界上荒漠化范围最广、危害程度最深的地区之一。截止2009年底，我国荒漠化土地面积为262.37万平方公里，沙化土地面积为173.11万平方公里，分别占国土总面积的27.33％和18.03％。并且还在继续扩大蔓延，危害着农田、牧场、交通及人民生活，给国家和社会经济带来了巨大的损失。以我国现有沙化土地为例，可治理面积有53万平方公里，按每年所见1717平方公里(国家林业局2011)的速度计算，将可治理沙地变成非沙化土地大约需要300年的时间。因此荒漠治理是国家在生态建设和环境保护方面的迫切需求。

机械方法、化学方法及生物方法等多种方法均已被陆续采用，但机械固沙工程量繁重，效果不佳，化学方法则存在固定剂老化，土地无法再利用等问题。生物方法成为荒漠治理的首选方法，而人工植树，建造防风林耗时长，需要数年至十几年，流沙在相当一段时间内仍是流动的，利用微型生物结皮固沙耗时相对较短，可同时固沙并改善荒漠生态环境。

微型生物结皮是由蓝藻、地衣、苔藓、细菌、真菌等微型生物及其缠绕附着的地表沙土形成的一层特殊结构，是荒漠地区所特有的景观。微型生物结皮的形成历经蓝藻结皮、地衣结皮及苔藓结皮等阶段，最终各种高等植物入驻，整个荒漠生态系统得以恢复。杨军(中国北方荒漠地衣及其生态学意义.中国科学院博士论文，2009，p53)通过对宁夏沙坡头地区不同恢复时间的微型生物结皮组成成分研究发现，随着恢复时间的延长，最先出现的蓝细菌(蓝藻)结皮的盖度呈现逐年减少的趋势，而地衣的盖度逐年稳步增加，成熟的结皮以地衣和苔藓为主。

地衣被称为“拓荒者”，是由真菌与藻类或者蓝细菌形成的，具有独特形态结构的互惠共生生物体。真菌为藻类积蓄水分，提供无机盐，并保护藻类免受过强的阳光辐射；藻类或者蓝细菌通过光合作用为真菌提供营养物质，二者互惠，因此地衣具有更强的生命力。地衣能够吸收水分而迅速膨胀，此后水分缓慢的释放而被利用，对于保持土壤水分具有重要的意义；其所进行的光合与固氮作用会增加裸露荒漠地表的有机物含量，是荒漠生态系统中碳、氮元素的重要来源，改善了荒漠生态的微环境；其具有的根状结构(假根)可穿透土壤，提高了沙表的稳定性，起到了显著地防止风蚀、雨蚀的固沙作用；其自身分泌的地衣酸类可以侵蚀岩石表面，同时和其他有机化合物一起粘结土壤颗粒促进土壤的形成，为苔藓植物及高等植物的入驻、生长提供良好的条件，提高生态环境的多样性和稳定性。因此荒漠地衣及地衣结皮在荒漠治理，流沙固定过程中具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工生物结皮治理荒漠的方法及专用地衣。

本发明提供一种用于制备地衣的成套产品，由独立包装的菌和藻组成，所述菌为Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893，所述藻为Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892。

本发明所提供的地衣是由Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892形成的。

本发明还提供一种制备所述地衣的方法，包括将Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892均接入固体基质进行共培养得到地衣的步骤。

所述固体基质为沙土、PDA固体培养基或其它固体基质；

所述Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的接种量以菌丝球的湿重计为0.03-0.07克/平方厘米，如0.05克/平方厘米；

所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的接种量为0.18×10⁶个细胞/ml-0.24×10⁶个细胞/ml，如0.21×10⁶个细胞/ml。

所述共培养的温度、光照条件如下：室温、每天24小时中12小时光照12小时黑暗、光照强度2000lux；所述室温为18-25℃。

本发明所提供的地衣以及Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892可应用于人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生态环境。

本发明还提供一种固沙的方法，包括将Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892混匀后撒播于沙土表面形成结皮的步骤；

所述Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的撒播量以菌丝球的湿重计为0.03-0.07克/平方厘米，如0.05克/平方厘米；

所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的撒播量为0.18×10⁶个细胞/ml-0.24×10⁶个细胞/ml，如0.21×10⁶个细胞/ml。

所述固沙的方法中，所述形成结皮的步骤中还包括辅以保水剂的步骤。

所述固沙的方法中还可以同时撒播荒漠蓝藻、真菌、细菌、苔藓等微型生物。

本发明所提供的将所述地衣和/或所述Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892撒播于沙土表面形成人工结皮治理荒漠的方法，一年即可形成结皮，每平方米的结皮覆盖率可达80％，该方法可直接促进地衣结皮的形成，缩短了微型生物结皮成熟的时间，操作简便，可以有效持久固沙，提高荒漠生态系统的营养元素及生物多样性，同时其形成的生态景观不仅可以为荒漠地区旅游业带来经济价值，而且可以为干旱半干旱地区城镇绿化提供材料，在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生态环境中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实验室条件下石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892形成的结皮。

图2为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892在室内共培养形成结皮的纵剖面电镜扫描图。

图3为喷洒样方的制作。其中，左图为示意图，右图为实际的草障方格。

图4为野外固沙实验形成人工地衣结皮。其中，左上图结皮已初具规模，右上图结皮厚度已达到0.4-0.6cm，左下图对照未形成结皮，右下图已出现Endocarpon sp.。

图5为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的生长曲线。

图6为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的耐旱性实验。其中，a为对照，未进行干燥胁迫；h为干燥胁迫210天后，转接于PDA培养基。

图7为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893形成的结皮。

图8为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893形成结皮的微观照。

图9为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的生长曲线。

图10为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的耐旱性验证。其中，a为对照，未进行干燥胁迫；b为干燥胁迫30天后，转接于PDA培养基。

图11为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892形成的结皮。

图12为石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892形成结皮的微观照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用培养基的配方如下：

琼脂(1.5％WA)培养基：琼脂粉15g，蒸馏水1L。

大豆蛋白胨(DBD)液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖1g，蒸馏水1L。

土豆浸汁(PDA)斜面培养基：葡萄糖20g，琼脂粉15g，土豆浸汁1L。

实施例1、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892室内共培养制备地衣与固沙实验

将石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892分别接种于PDA斜面培养基上，活化15天后，当观察到培养基上有上述地衣共生菌和共生藻生长后，将地衣共生菌和共生藻分别转接入PDA液体培养基中150rpm大量培养，培养周期分别为30天和20天，培养条件分别为：共生菌22℃暗培养；共生藻22℃、12h光照(光照强度2000lux)/12h暗培养。

将培养至对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892混匀，使共生菌与共生藻的浓度分别为0.785g/ml(以菌丝球湿重计)和3.25×10⁶个细胞/ml。将得到的混合液均匀喷洒于无菌沙土表面，沙土颗粒大小均一，盛于直径10cm的无菌平皿中，厚约0.5cm。每皿喷施5mL混合液，做3皿重复，平皿密封后置于光照培养箱中，22℃、12h光照(2000lux)/12h黑暗条件下培养，定期观察。

培养12个月后，三个重复均观察到地衣共生菌与共生藻形成结皮，并且固着在沙土颗粒之上，覆盖了平皿的80％(图1)。

同时，对结皮进行纵切，通过扫描电镜观察发现石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892发生接触，并且菌丝将藻细胞包裹在内(图2)，说明二者已经共生形成地衣的初始阶段，并且起到固着沙粒的作用。

实施例2、野外固沙实验

在平整固定沙丘上清理3个约0.5m²的沙面，然后用麦草将每个沙面分成两部分，形成草障方格，0.4×0.5m区作为喷洒清水对照方，0.6×0.5m区作为喷洒悬浮液实验方(图3)。

将处于对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892及野外收集的地衣碎片(经鉴定，该地衣为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892共生形成的石果衣)与水混合，混合后得到浓度分别为0.5g/ml(以菌丝球湿重计)、0.21×10⁷个细胞/ml、5×10^-3g/ml的悬浮液，然后按每平方米1L悬浮液均匀撒播于实验方沙土表面，每3天用清水浇灌一次，观察。对照样方喷洒清水，用量与悬浮液体积相同，其他管理均相同。

以上处理辅以保水剂(Super Absorbent Polymers，简称SAP，购自北京金元易生态工程技术中心)，将保水剂以250g/m²的用量撒播于草方格之上保持水分。

上述地衣碎片的制备方法如下：将地衣(经鉴定该地衣为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892共生形成的石果衣)及其下4mm-12mm的土壤同时取下，碾碎经直径0.5cm的筛网过滤，获得均一大小的地衣碎片。

结果：在12个月后的地衣结皮在自然条件下均已初具规模(图4，左上)，结皮厚度均已达0.4-0.6cm(图4，右上)，与对照方的差异明显(图4，左下)，且有地衣着生(图4，右下)。

以上结果表明，该地衣及其共生藻与共生菌可以直接促进地衣结皮的形成，缩短了微型生物结皮成熟的时间，操作简便，可以有效持久固沙，提高荒漠生态系统的营养元素及生物多样性，同时其形成的生态景观不仅可以为荒漠地区旅游业带来经济价值，而且可以为干旱半干旱地区城镇绿化提供材料。

上述石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893与共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的分离培养与鉴定实验如下：

一、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的分离培养与鉴定

1、地衣标本的采集与鉴定

从腾格里沙漠东南缘的沙坡头地区(干旱多风，年均降雨量不足200mm)采集获得新鲜地衣标本，采用形态解剖学方法对该标本进行鉴定。选取成熟、发育良好的地衣体，放于盛有蒸馏水的培养皿中，使地衣体浸透变软，随后用干净滤纸吸去地衣体上的多余水分，冷冻切片，在解剖镜下选取较薄的切片置于载玻片水滴中，加盖玻片，在显微镜下观察，结果如下：

地衣体鳞片叶状，鳞片叶聚集，紧密贴生于基物，宽约2-5mm，圆形至不规则形状，边缘完整至锯齿状，上表面深棕色至浅棕色，平坦至微下凹，下表面黑色具有菌丝和假根，假根黑色，5-7mm长，单一少分枝，每个鳞片叶单个或多个假根。子囊壳球形，直径0.1-0.2mm每个鳞片叶1-6个，埋生于地衣体中，孔口周围深棕色。

地衣体厚140-200μm，上皮层厚25-50μm，透明无色，为假薄壁组织；藻层厚75-100μm，藻细胞直径5-10μm；髓层厚10-25μm；下皮层厚30-50μm，下部浅黑色，菌丝细胞壁加厚。

子囊壳通常圆形，内腔高220-400μm，宽200-380μm，果壳棕色，厚25-37μm，侧丝25-65μm长，子实层藻直径4-7μm，子囊棒状，50-65×15-22μm，子囊内含2 个子囊孢子，砖壁型，长椭圆形，25-50×12-17μm。

基物为沙土。

通过以上观察结果，鉴定该荒漠地衣标本为石果衣Endocarpon pusillum Hedwig，Descript.Adumbr.Musc.Frondos.：56(1789)。

2、地衣共生菌的分离、培养

利用孢子释放方法从石果衣标本中分离地衣共生菌，具体方法为：将新鲜地衣标本的成熟子囊器，用水浸湿后吸去表面多余水分，用凡士林将子囊器倒置在培养皿盖内侧，培养皿下部为1.5％WA培养基，每12h转动培养皿盖一次(因共生菌与共生藻孢子同时喷射，所以可以通过上述孢子释放方法同时得到共生菌与共生藻)，以获得单一孢子形成的菌落。当观察到孢子萌发后，将含有萌发子囊孢子的琼脂块转入PDA斜面培养基，22℃黑暗培养地衣共生菌，生长后转入DBD液体培养基，150rpm黑暗培养。

以上操作均在无菌条件下进行。通过上述方法获得一株地衣共生菌，将其命名为F07020。

3、地衣共生菌F07020的鉴定

1)、形态特征

将地衣共生菌F07020接种于PDA斜面培养基上，22℃黑暗培养30天，观察菌落形态。观察结果为：菌落直径0.8-0.9cm，呈不规则圆形，表面粗糙，边缘整齐或否，暗褐色至浅灰色。

2)、nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)序列的PCR扩增和序列测定

A)DNA提取：

分别取地衣体及其共生菌F07020 10-20mg；液氮研磨后加入300μl 2×CTAB，轻轻混匀，90℃水浴2min；加入300μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，振荡混匀，12000r/min离心5min去除蛋白质；取上清加入等体积的DNA结合液(结合液成分：4.0mol/L异硫氰酸胍，0.5mol/L、pH5.0乙酸钾，终体积浓度为30％的异丙醇)颠倒混匀，随即移入吸附柱静置2min，12000r/mim离心15s，弃残液；加入300μl洗涤液(洗涤液成分：10mmol/L，终体积浓度为80％的乙醇)，12000r/min离心15s，去残液，重复一次；12000r/min离心干燥1min；将吸附柱移入新无菌离心管，加入30μlTE洗脱液静置5min，12000r/min离心15s，重复洗涤一次，去除吸附柱，离心管内即为DNA模板。

B)nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)基因的PCR扩增及序列测序

用于地衣体及其共生菌F07020 PCR扩增的正向引物为ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SSU nt1769-1787)，反向引物为ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(LSU nt60-79)；PCR扩增体系(50μl)：10×buffer 5μl；25mmol/L MgCl₂ 3μl；2.5mmol/L dNTPs 4μl；10μmol/L引物各1μl；ddH₂O 34μl；Taq DNA酶1μl(0.25U)；模板1μl(50ug)。PCR扩增条件为95℃180s，94℃30s，52℃30s，72℃90s，37个循环；72℃600s，4℃保存。

PCR扩增产物经北京标凯生物技术有限公司测序，测序结果经DNAman5.2.2进行双序列比对分析。

测序结果表明，荒漠地衣及其共生菌F07020的nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)序列长度均为557bp，其核苷酸序列完全相同(如序列表序列1所示)，表明该荒漠地衣共生菌由其相应标本分离得到。根据地衣共生菌的学名就是其地衣物种的学名，以及荒漠地衣共生菌F07020与荒漠地衣标本nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)同源序列的比对结果，将荒漠地衣共生菌F07020鉴定为石果衣共生菌Endocarpon pusillum Hedwig。

石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020已于2010年05月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.3893。

4、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的生长特性

挑取定量石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893，转接于DBD液体培养基中，22℃，黑暗条件，150rpm振荡培养，每15天测定一次菌丝干重，每次3个重复，取平均值，以培养时间为横坐标，菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线(如图5所示)，结果表明，石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893在培养30天后到达对数生长期，与Ahmadjian V.and

H.(1970)报道的地衣共生菌(The culture and synthesis of Endocarpon pusillum and Staurothele clopima.Lichenologist，4：259-267.)需培养1年相比，差异显著。

5、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的耐旱性

1)活化：将对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893转接入PDA液体培养基中，150rpm黑暗培养30天。

2)干燥胁迫：在无菌条件下，将步骤1)得到的菌液转入不含培养基的培养皿(直径35mm)中，将培养皿放入含变色硅胶的干燥器中(相对空气湿度≤10％，环境温度为20～27℃，自然光照条件)，以造成干燥胁迫。

每月将胁迫处理的石果衣共生菌转接到含固体PDA培养基中，环境温度20～27℃，黑暗培养，并观察石果衣共生菌的生长情况。

对照：初始未胁迫的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893。

上述石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893在干燥胁迫210天后仍未死亡，转接于PDA培养基培养后，证明其仍有活性(图6，h)。

6、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的固沙实验

活化：将对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893转接入液体PDA培养基中，150rpm黑暗培养30天。

将活化后的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌丝球在无菌条件下研碎，用无菌水稀释至浓度为1.57g/ml(以菌丝球湿重计)后撒播于铺有无菌沙粒培养皿中(培养皿直径10cm，沙粒厚5mm，以无菌水刚刚润湿沙粒为准)，每皿喷施5mL，使该共生菌的撒播量为0.1g/cm²(以菌丝球湿重计)，12h光照/12h黑暗，20℃培养30天后观察。

石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893在30天后有新鲜菌丝长出，同时可以见到新形成的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌丝与沙粒形成的结皮，厚约2mm(图7，图8)

二、石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的分离培养与鉴定

1、地衣共生藻的分离培养

利用孢子释放方法从“一’’中的步骤1获得的石果衣标本中分离地衣共生藻，具体方法为：将新鲜地衣标本的成熟子囊器，用水浸湿后吸去表面多余水分，用凡士林将子囊器倒置在培养皿盖内侧，培养皿下部为1.5％WA培养基，为获得单一孢子萌发形成的藻落，每12h转动培养皿盖一次(因共生菌与共生藻孢子同时喷射，所以可以通过上述孢子释放方法同时得到共生菌与共生藻)，当观察到有藻生长后，转入PDA斜面培养基，22℃，12h光照/12h黑暗，光照强度2000lux条件下培养地衣共生藻，大量生长后转入DBD液体培养基，150rpm同样条件下振荡培养。

以上操作均在无菌条件下进行，通过上述方法获得一株地衣共生藻，将其命名为A07020。

2、地衣共生藻A07020的鉴定

1)、形态特征

将地衣共生藻藻株A07020接种于PDA斜面培养基，在22℃，12h光照12h黑暗，光强2000lux条件下培养10天，观察藻细胞形态。观察结果为：细胞椭圆形至钝圆柱形；椭圆形细胞大小为3.8×4.8μm，圆柱形细胞长5.8-8.6μm，宽3.8-4.8μm；叶绿体片状、侧生；细胞外侧有水质胶壳包裹。

2)、nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)序列的PCR扩增和序列测定

A)DNA提取

分别取10-20mg石果衣标本及其地衣共生藻A07020；液氮研磨；加入300μl 2×CTAB，轻轻混匀，90℃水浴2min；加入300μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，振荡混匀，12000r/min离心5min去除蛋白质；取上清加入等体积的DNA结合液 (4.0mol/L异硫氰酸胍，0.5mol/L，pH5.0乙酸钾，终体积浓度为30％异丙醇)颠倒混匀，随即移入吸附柱静置2min，12000r/mim离心15s，弃残液；加入300μl洗涤液(10mmol/L，pH5.0乙酸钾，终体积浓度为80％乙醇)，12000r/min离心15s，去残液，重复一次；12000r/min离心干燥1min；将吸附柱移入新无菌离心管，加入30μlTE洗脱液静置5min，12000r/min离心15s，重复洗涤一次，去除吸附柱，离心管内即为DNA模板。

B)nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)基因的PCR扩增及序列测序

用于石果衣标本及其地衣共生藻A07020 PCR扩增的正向引物为5’-CTGCGGAAGGATCATTGATTC-3’(18S nt1780-1800)，反向引物为5’-AGTTCAGCGGGTGGTCTTG-3’(28S nt0012-0030)。PCR扩增体系(50μl)：10×buffer 5μl；25mmol/L MgCl₂ 3μl；2.5mmol/L dNTPs 4μl；10μmol/L引物各1μl；ddH₂O 34μl；Taq DNA酶1μl；模板1μl。PCR扩增条件为95℃180s，94℃30s，52℃30s，72℃90s，37个循环；72℃600s，4℃保存。

测序结果表明，石果衣及其共生藻A07020的nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)序列长度均为744bp，其核苷酸序列完全相同(如序列表序列2所示)，表明该石果衣共生藻由其相应标本分离得到。将石果衣共生藻A07020的nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)序列在Genbank中进行同源比对分析，其序列与Stichococcus diplosphaera Chodat＝Diplosphaera chodatii Bialosuknia的nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)序列相似度为100％。根据形态特征以及nrDNA-ITS(ITS₁-5.8S-ITS₂)序列在Genbank中同源序列的比对结果，将荒漠地衣共生藻A07020鉴定为Diplosphaera chodatii Bialosuknia。

石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020已于2010年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.3892。

3、石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的生长特性

挑取定量石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892，转接于DBD液体培养基中，22℃，150rpm 12h光照12h黑暗，光照强度为2000lux培养，通过叶绿素在665nm处的吸光值测定共生藻的生长量，每3天测定一次，每次3个重复，以培养时间为横坐标，665nm处吸光值为纵坐标绘制生长曲线(图9)，培养10天后石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892达到对数生长期。

4、石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的耐旱性验证

1)活化：将对数生长期的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892转接入液体PDA培养基中，150rpm黑暗培养10天。

2)干燥胁迫：无菌条件下，将1)得到的藻液转入不含培养基的培养皿(直径35mm)中，将培养皿放入含变色硅胶的干燥器中(相对空气湿度≤10％，环境温度为20～27℃，自然光照条件)，以造成干燥胁迫。

每月将胁迫处理的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892转接到固体PDA培养基中，环境温度20～27℃，黑暗培养，并观察共生藻的生长情况(图10)。

对照：初始未胁迫石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892(图10，a)。

上述石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892在干燥胁迫30天后仍未死亡，转接于PDA培养基培养后，证明其仍有活性(图10，b)。

5、石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的固沙实验

活化：将石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892接入土豆浸汁(PDA)液体培养基中，22℃、12h光照/12h黑暗150rpm培养10天。

将活化后的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892藻悬液在无菌条件下撒播于铺有无菌沙粒培养皿中(沙粒厚约5mm，以无菌水刚刚润湿沙粒为准)，使该共生藻的撒播量为0.42×10⁶个细胞/平方厘米，光照条件下，20℃培养，60天后观察到该共生藻与沙粒形成的藻结皮，绿色藻层厚约2mm(图11，图12) 。

Claims

1.用于制备地衣的成套产品，由独立包装的菌和藻组成，所述菌为Endocarponpusillum F07020 CGMCC No.3893，所述藻为Diplosphaera chodatii A07020 CGMCCNo.3892。

2.由Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatiiA07020 CGMCC No.3892形成的地衣。

3.制备权利要求2所述地衣的方法，包括将Endocarpon pusillum F07020 CGMCCNo.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892均接入固体基质进行共培养得到地衣的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述Endocarpon pusillum F07020CGMCC No.3893的接种量以菌丝球的湿重计为0.03-0.07克/平方厘米；

所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的接种量为0.18×10⁶个细胞/平方厘米-0.24×10⁶个细胞/平方厘米。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述Endocarpon pusillumF07020 CGMCC No.3893的接种量以菌丝球的湿重计为0.05克/平方厘米；

所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的接种量为0.21×10⁶个细胞/平方厘米。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：所述共培养的温度、光照条件如下：室温、每天24小时中12小时光照12小时黑暗、光照强度2000lux。

7.权利要求2所述的地衣在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生态环境中的应用。

8.权利要求1或2所述的Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生态环境中的应用。

9.一种固沙的方法，包括将Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893和Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892混匀后撒播于沙土表面形成结皮的步骤；

所述Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893的撒播量以菌丝球的湿重计为0.03-0.07克/平方厘米；

所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的撒播量为0.18×10⁶个细胞/平方厘米-0.24×10⁶个细胞/平方厘米。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述Endocarpon pusillum F07020CGMCC No.3893的撒播量以菌丝球的湿重计为0.05克/平方厘米；

所述Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No.3892的撒播量为0.21×10⁶个细胞/平方厘米。