CN104974939B

CN104974939B - 一种防治杨树溃疡病的木贼镰孢菌株及其应用

Info

Publication number: CN104974939B
Application number: CN201410132396.5A
Authority: CN
Inventors: 梁军; 杨蕾; 倪杨; 张星耀
Original assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2017-12-26
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: CN104974939A

Abstract

本发明公开了一种防治杨树溃疡病的生防菌菌株及其应用方法。所述的菌株为木贼镰孢(Fusarium equiseti)，菌株编号为CGMCC8795。该菌株发酵液与麦麸和玉米粉混合，发酵7d后自然风干并碾碎制成原粉；添加42wt％原粉，36wt％高岭土，12wt％吐温20，8wt％拉开粉，2wt％抗坏血酸制成菌剂；将菌剂稀释后以喷洒和灌根的方式用于防治杨树溃疡病。该菌株具有对病原菌的作用方式多种多样、繁殖速度快、作用效果稳定等优点，对杨树溃疡病病原菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidia)抑制作用强，对杨树溃疡病的防治具有重要意义，具有良好的开发应用前景。

Description

一种防治杨树溃疡病的木贼镰孢菌株及其应用

技术领域：

本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种防治杨树溃疡病的生防菌菌株及其应用，具体地说涉及一种高效防治杨树溃疡病生防菌株木贼镰孢CGMCC8795及应用。

技术背景：

杨树及其杂交品种在世界范围内都有广泛的分布，它不仅可作为人造板及纤维用材的重要加工原料，而且对植树造林、生态恢复、风景绿化和防风固沙都有着重要的作用。杨树溃疡病(有性型病原菌Botryosphaeria dothidia，无性型聚生小穴壳菌Dothiorellagrearia)是中国杨树干部病害中的主要类型，在中国华北、西北及南方杨树栽培区均有分布，在杨树幼林上发生较多，危害严重，一般在感病品种上发病率高达80％～100％，死亡率达30％～50％。杨树溃疡病是中国杨树人工林重大生物灾害之一，严重制约了杨树人工林的发展。

目前对杨树溃疡病的防治主要通过调整杨树林生态系统空间结构及物理和化学方法来完成。但生态系统空间结构调控是一个相对较长的过程，而化学防治对于环境的污染和破坏已成为不容忽视的问题。在人们愈来愈关注环境安全的情况下，对杨树溃疡病的防治也提出了越来越高的安全要求。随着社会经济的发展和人们环境保护意识的增强以及生物防治技术的愈加成熟，用生物防治的方法来可持续治理杨树溃疡病变得更加可行。

从杨树林土壤中分离筛选获得对杨树溃疡病病菌具有拮抗作用的生防菌株，并研制菌株相关活菌剂，对杨树溃疡病的防治具有重要的意义。

发明内容：

本发明的目的是提供一种高效防治杨树溃疡病的木贼镰孢，该菌株于2014年3月4日保存在北京市朝阳区北辰西路1号院3中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为CGMCC8795。木贼镰孢CGMCC8795是一种从杨树林土壤中分离筛选获得对杨树溃疡病病菌具有拮抗作用的生防菌株，对杨树溃疡病的防治具有重要的意义。

本发明另一个目的是提供所述高效防治杨树溃疡病的木贼镰孢CGMCC8795在防治杨树溃疡病方面的多种应用。

本发明的技术方案是提供一种高效防治杨树溃疡病的木贼镰孢CGMCC8795，在PDA培养基上，CGMCC8795菌株菌落呈圆形或椭圆形，气生菌丝初期为白色，绒毛絮状，质地较为疏松，和培养基结合不是很紧密，易挑取，生长率为6.89mm/d，培养后期表面具有浅橙黄色孢子堆。菌丝有隔，少分支。分生孢子梗分枝或在菌丝上直接形成产孢细胞，小型分生孢子极少。大型分生孢子略弯，顶细胞延长成钩状，多为3～6个分隔，大小约为(21.57～44.62)μm×(3.21～5.04)μm，但孢子堆内的大型分生孢子多为5～7个分隔，大小为(52.38～62.15)μm×(3.85～5.43)μm。对菌株CGMCC8795的ITS基因序列进行PCR扩增，产物纯化后测序。测得菌株CGMCC8795的序列长度为563bp。通过分析发现CGMCC8795菌株与编号为AB425996.1的木贼镰孢相似度高达100％，亲缘关系最近，同源性很高。综合菌株的形态学特征以及分子鉴定结果，确定CGMCC8795菌株为木贼镰孢(Fusarium equiseti)。本发明所述高效防治杨树溃疡病的木贼镰孢CGMCC8795通过平板对峙试验、发酵液复筛及离体组织试验筛选获得。

本发明还提供了所述高效防治杨树溃疡病的木贼镰孢CGMCC8795在防治杨树溃疡病上的应用，并且可以用于制备防治植物病害的制剂。

所述的防治杨树溃疡病的制剂的制备过程如下：

(1)先将菌株液体发酵：发酵条件为：接种量为4％，装液量100mL/250mL，初始pH值7.0，温度32℃，转速180r/min，发酵时间96h；发酵培养基为：土豆浸汁200g/1000mL，果糖1％，牛肉浸粉1.4％，KCl0.1％。

(2)固体发酵：选用50％玉米粉与50％麦麸混合作为固体发酵基质，发酵条件为10％接种量，50％的含水量，培养温度为30℃。

(3)菌剂制备：将固体发酵物自然风干后碾碎制成原粉；添加42wt％原粉，36wt％高岭土，12wt％吐温20，8wt％拉开粉，2wt％抗坏血酸制成菌剂。

所述的菌剂还可以经过稀释后，直接以喷洒和灌根的方式用于防治杨树溃疡病。所述的菌剂稀释100-1000倍。

本发明的有益效果是：

(1)木贼镰孢CGMCC8795对杨树溃疡病病原菌具有拮抗作用，而且具有对病原菌的作用方式多种多样、繁殖速度快、作用效果稳定等优点，在杨树溃疡病生物防治中所起到的作用非常重要；

(2)该种菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明：

图1为木贼镰孢CGMCC8795菌株菌落形态图

图2为木贼镰孢CGMCC8795菌株菌丝形态及分生孢子形态图

图3为木贼镰孢CGMCC8795菌株对杨树溃疡病病原菌葡萄座腔菌的平板对峙拮抗作用图

具体实施方式：

本发明提供木贼镰孢CGMCC8795新菌株，其展现出对杨树溃疡病病原菌具有较强的拮抗活性。

本发明的新菌株分离自杨树林土壤中。

本发明的木贼镰孢CGMCC8795在PDA培养基上，CGMCC8795菌株菌落呈圆形或椭圆形，气生菌丝初期为白色，绒毛絮状，质地较为疏松，和培养基结合不是很紧密，易挑取，生长率为6.89mm/d，培养后期表面具有浅橙黄色孢子堆。菌丝有隔，少分支。分生孢子梗分枝或在菌丝上直接形成产孢细胞，小型分生孢子极少。大型分生孢子略弯，顶细胞延长成钩状，多为3～6个分隔，大小约为(21.57～44.62)μm×(3.21～5.04)μm，但孢子堆内的大型分生孢子多为5～7个分隔，大小为(52.38～62.15)μm×(3.85～5.43)μm。对菌株CGMCC8795的ITS基因序列进行PCR扩增，产物纯化后测序。测得菌株CGMCC8795的序列长度为563bp。通过分析发现CGMCC8795菌株与编号为AB425996.1的木贼镰孢相似度高达100％，亲缘关系最近，同源性很高。综合菌株的形态学特征以及分子鉴定结果，确定CGMCC8795菌株为木贼镰孢(Fusarium equiseti)。下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，而不会限制本发明。

实施例1土壤中杨树溃疡病生防菌的分离、筛选及鉴定

采用稀释平板涂布法分离土壤微生物。将1g土壤置于装有100mL无菌水的250mL三角瓶中制成土壤悬浮液母液。将母液置于28℃摇床中震荡1h。无菌条件下对土壤母液进行10倍梯度稀释，稀释倍数为10^-2～10^-7，细菌选用10-5～10-7稀释梯度的土壤悬浊液进行分离，放线菌选用10-3～10-5稀释梯度的土壤悬浊液进行分离，真菌选用10-2～10-4稀释梯度的土壤悬浊液进行分离。通过培养特性和菌落特征，判定从上中下层土壤中中共分离微生物菌株122株，通过平板对峙实验，从122株菌中共分离得到有抑菌效果的菌株69株，其中细菌和放线菌36株，真菌33株。综合“三明治”法和改良琼脂扩散法对初筛菌株的发酵液进行复筛，筛选出的拮抗菌株有8株，分别为细菌TYZ1B3和YX5B1，真菌LS10F1、LX5F1、LZ10F1、LS6F1、CGMCC8795和TLZ2F2。进行离体组织复筛后最终确定生防菌株CGMCC8795的拮抗作用最强。

筛选到的菌株经过形态学观察，生理生化实验以及分子生物学鉴定，最终确定该菌为木贼镰孢。

本发明木贼镰孢CGMCC8795菌株菌落和菌丝形态图见图1和图2。

实施例2木贼镰孢CGMCC8795菌株发酵工艺优化及稳定性

经单因素实验、正交设计以及响应面分析，最终确定CGMCC8795的最优发酵培养基和条件为：土豆浸汁200g/1000mL，果糖1％，牛肉浸粉1.4％，KCl0.1％，起始pH值7.0，温度32℃，转速180r/min，接种量4％，装液量100mL/250mL。优化后菌株CGMCC8795的抑菌率可达75.88％，提高了生防菌株的抑菌活性，为菌株的后续开发利用提供了保障。

木贼镰孢CGMCC8795对酸碱处理有一定的耐受性，在pH为1的条件下，抑菌率为47.28％，在pH为12条件下，仍可保41.57％的抑菌率，由此证明，木贼镰孢CGMCC8795在酸碱条件下均有一定稳定性，而对高温条件的稳定性较弱。实验证明，该菌株对紫外线不具稳定性。经传代10次后，该菌株的抑菌活性仍可达68.62％，说明其遗传稳定。

实施例3木贼镰孢CGMCC8795生防菌剂原粉的制备

采用固体发酵方式制备菌剂原粉。设置3种不同固体发酵基质配方：I.固料400g，其中碎米50％，麦麸50％，且固料与水的比例为1∶1(W/V)，II.固料400g，其中碎米50％，玉米粉50％，且固料与水的比例为1∶1(W/V)，III.固料400g，其中麦麸50％，玉米面50％，且固料与水的比例为1∶1(W/V)。结果表明选用50％玉米粉与50％麦麸混合作为固体发酵基质最为适宜，抑菌率为90.59％，活孢子数达4.69×10¹¹cfu/g。

固体发酵条件的筛选采用三因素三水平的正交设计，共设置9组实验。最终获得CGMCC8795菌株适宜的固体发酵条件为10％接种量，50％的含水量，培养温度为30℃。在这种条件下，抑菌率达89.79％，活菌数为7.28×10⁹。

将固体发酵物自然风干后碾碎制成原粉。

实施例4木贼镰孢CGMCC8795生防菌剂的研制

添加42wt％原粉，36wt％高岭土，12wt％吐温20，8wt％拉开粉，2wt％抗坏血酸为菌剂最优配方。此配方下菌剂的润湿性、分散性、悬浮性都可达最佳水平，对紫外的稳定性也最强。菌剂成品中活菌数为2.26×10¹⁰cfu/g，抑菌率达87.21％。经测定，菌剂的货架保存期较长，保存6个月后抑菌率仍可达68.93％。

实施例5木贼镰孢CGMCC8795生防菌剂的林间使用方法及效果

(一)最佳施用方法

将配置好的菌剂用清水稀释500倍，混合均匀后施用在杨树扦插幼苗上。设置5种不同施用方法：A：仅喷洒CGMCC8795菌剂(LP)：用小型喷雾器将菌剂稀释液均匀喷洒在扦插苗组织表面，以润湿体表，但无明显液滴滴下为宜；B：仅用CGMCC8795菌剂灌根：采用灌根器将稀释菌液灌于扦插苗根部，50～100mL/株，以润湿根际土壤为宜(LG)；C：同时喷洒CGMCC8795菌剂和灌根CGMCC8795菌剂(LP+LG)；D：以同时喷洒和灌根清水为阴性对照；E：以同时喷洒和灌根500稀释倍的多菌灵为阳性对照。每个处理各选用10株长势相同，健康茁壮的杨树扦插苗为实验材料。

用直径为4mm的打孔器打取树皮圆片，置于盛有蒸馏水的三角瓶中，湿热灭菌，冷却后，将树皮圆片放置在长满杨树溃疡病菌的培养基平板上，25℃培养15d后，树皮圆片上长出孢子器，以此树皮圆片为接种体。

分别测定不同施用方式下生防菌剂对杨树溃疡病的预防效果和治疗效果：

(1)预防效果的测定：施用生防菌剂72h后，将溃疡病接种体接种到扦插苗上，用湿脱脂棉保湿，外围用保鲜膜扎紧。

(2)治疗效果的测定：先将溃疡病接种体接种到扦插苗上，用湿脱脂棉保湿，外围用保鲜膜扎紧。72h后施用生防菌剂。

在施用菌剂20d后观察统计各组幼苗溃疡病的发病率及病情指数。如下表，按接种点病斑扩展直径将病斑分为5级。

表1盆栽接种病斑分级标准

病情指数＝∑(病级株数×代表数值)/总株数×发病最重级代表值×100

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

表2CGMCC8795菌剂不同施用方式对杨树溃疡病防治效果的影响

CGMCC8795生防菌剂的盆栽实验结果表明，菌剂对杨树溃疡病有较好的防治效果。当施用方式为喷洒和灌根相结合的时候，其预防效果和对发病后的控制效果均达到最佳，并且使杨树溃疡病的病情指数大幅降低。CGMCC8795生防菌剂对杨树溃疡病的治疗效果和预防效果均较好，可达50％左右。菌剂500倍稀释液的防治效果和化学农药多菌灵相当。

(二)最佳施用浓度

按以下方式设置施用浓度：

试验处理A(空白对照)：喷洒清水、清水灌根处理；

试验处理B(防效测定)：用清水稀释100倍的上述拮抗菌CGMCC8795的生防菌剂喷洒、灌根处理。

试验处理C(防效测定)：用清水稀释500倍的上述拮抗菌CGMCC8795的生防菌剂喷洒、灌根处理。

试验处理D(防效测定)：用清水稀释1000倍的上述拮抗菌CGMCC8795的生防菌剂喷洒、灌根处理。

试验处理E(化学农药防效测定)：用75％500倍的多菌灵喷洒、灌根处理。

每个处理选择9株长势相同的盆栽扦插苗进行。每15天施用菌剂一次，合计共施用3次。病原菌接种方式同前。在最后一次处理后10d进行一次调查。记载病情指数，最终计算防治效果。在调查中同时测定生防菌剂对植株生长的影响，主要测定各株杨树扦插苗的高度、茎粗、分枝数等。

表3CGMCC8795菌剂不同施用浓度对杨树溃疡病防治效果的影响

由结果可以看出，将菌剂稀释100倍、500倍、1000倍的的预防效果可达到65％以上。与对照多菌灵相比，CGMCC8795菌剂对杨树溃疡病的防治效果则呈现明显优势。经过对各实验组幼苗的生长情况调查发现，CGMCC8795菌剂对杨树扦插苗的生长起到促进作用。经过近60d的生长后，施用100倍和500倍稀释菌剂组的幼苗在平均茎高增长量、茎粗增加量等方面与对照组差异不大，说明菌剂不影响杨树的生长。

(三)最佳施用浓度

杨树溃疡病的发病规律为：4月开始发病，5月下旬至6月形成第一个发病高峰，7～8月气温增高时病势减缓，9月出现第二个发病高峰，此病菌来源于当年春季病斑形成的分生孢子，10月以后停止。试验选择在河北廊坊试验基地进行。分别在3月、5月、7月、9月、11月施用生防菌剂，每月按间隔15天施用两次。幼林地试验采用随机区组设计，共设5个小区，每小区15株，每株的间距为2.5m×3m，小区间设保护行。分别在4月10日、6月10日、8月10日、10月10日、12月10日调查样树的发病率、病斑数量及病害发生程度。

病害发生程度采用树干感病面积比(Infected Area Ratio of Trunk)描述，用来描述树木个体病害发生严重程度的指标，用单株树木树干高度0.8～1.8m范围内病斑总面积占树干总表面积的百分比表示。

树干感病面积比(％)＝0.8～1.8m树干上病斑总面积/该段树干总表面积×100％

表4CGMCC8795菌剂不同施用时间对杨树溃疡病防治效果的影响

通过发病率、病斑数、病害发生程度3个指标可以看出，在3月份施用菌剂对溃疡病的防治效果最佳，其次是在7月份施用的效果也较好。虽然在11月份杨树溃疡病的发病率、病斑数、病害发生程度均最低，但这和当时的天气寒冷、空气湿度低等自然条件相关，这样的自然条件不适宜病原菌生长，不能完全体现生防菌剂的效果。

综合结果，CGMCC8795菌剂最适宜的施用方法为：将CGMCC8795生防菌剂用清水稀释500倍，采用灌根和喷洒相结合的方式将稀释后的菌剂悬液施用于杨树根部和干部。施用剂量为每株200mL左右，以润湿根际20cm范围土壤及无明显液滴滴下为宜。施用时间为每年3m、7m，在这些月份中每15d施用一次。

Claims

1.一种防治杨树溃疡病的生防菌菌株，其特征在于，所述的菌株为木贼镰孢(Fusariumequiseti)，菌株保藏编号为CGMCC No.8795。

2.权利要求1所述的生防菌菌株在防治杨树溃疡病中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生防菌菌株用于制备防治杨树溃疡病的制剂。