CN113122457A - 一株果生炭疽菌f11及其制剂与水葫芦治理的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.21933的果生炭疽菌F11及其制剂和在治理水葫芦方面的应用。上述技术方案至少包括以下有益效果：提供了一种新的保藏于CGMCC，保藏号为CGMCCNo.21933的果生炭疽菌F11及其抑菌剂。所述果生炭疽菌F11可针对性的高效抑制水葫芦的繁殖，对水体中的其他植物以及水体并无不良影响。

Description

一株果生炭疽菌F11及其制剂与水葫芦治理的应用

技术领域

本发明涉及到生物医药领域，特别涉及到一株果生炭疽菌F11及其制剂与水葫芦治理的应用。

背景技术

水葫芦：学名凤眼莲[Eichhornia crassipes(Martius)]，是雨久花科凤眼蓝属的漂浮性水生植物，原产于南美洲亚马逊河流域，被列入世界百大外来入侵物种之一。水葫芦根系发达，吸收能力非常强，适量的水葫芦具有净化水质的作用，根须有利于吸收和分解水中的氮、磷营养盐、有机物、等污染物。水葫芦繁殖快、产量高，如果不能有效控制水葫芦的生物量,将引发一系列的环境生态问题。在水葫芦泛滥地区,水葫芦的疯狂生长会影响水利运输；或是遮掩阳光,减少溶氧给水体自净带来负面压力,破坏生态平衡；水葫芦也易腐烂,释放出其所吸收的有害物质,造成水体的二次污染。水葫芦的大量繁殖对自然环境是有害的，但它也是水体中不可缺少的一类物种，它吸附氮、磷、钾等富营养化的物质，有利于水质的净化。

在水葫芦的生态治理上，要趋利避害，既要利用水葫芦对污染水体的强吸附能力，又要合理控制水葫芦的恶性蔓延。因此，水葫芦的治理综合治理策略上并不是完全的消灭水葫芦，而是在时间和空间上合理控制水葫芦的群体数量，并在水质净化上保持一定的功能，从而在“水—水葫芦”生态的生态系统中，建立一种动态的生态平衡，将是水葫芦的生态治理中的重点也是难点。

现有水葫芦治理多以机械、人工打捞为主，然而人工打捞劳动强度大，成本高。而且水葫芦繁殖快，易扩散，既有性繁殖，又有无性繁殖。人工打捞无法清除种子。打捞出的水葫芦需要外运、堆放、填埋数量越来越多，将造成堆放、填埋场地的严重不足，容易引发二次生态灾害，再次造成水体污染。

目前治理水葫芦的方法主要是靠人工打捞，既费时、又费力，且没有从根本上解决问题。生物防控技术将是未来水葫芦治理的主攻方向，生物防治就是在水葫芦的传入地,引进原产地的水葫芦天敌,建立群体,使天敌与水葫芦之间形成相互制约的动态平衡,从而将水葫芦的、种群密度长期控制在生态平衡和经济危害水平之下。

发明内容

本发明提供了一株新的果生炭疽菌F11产品及其制剂，其可抑制水葫芦的生长繁殖，且不会抑制其他水生植物的生长，不会污染水体环境，为一种生物防控技术方案。果生炭疽菌F11寄生于水葫芦生长，通过与水葫芦宿主竞争营养物，分泌毒素等方式来破坏水葫芦的组织和细胞。利用果生炭疽菌 F11感染水葫芦的叶片、茎、根部位，促使水葫芦植株枯萎腐烂，有效造成水葫芦绝育达到控制繁殖蔓延的治理效果。

为达到本发明的第一个发明目的，本发明提供了保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No.21933，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的果生炭疽菌F11。保藏日期为：2021 年3月18日，分类命名：果生炭疽菌；拉丁名称：Coletotrichum fructicola。

为达到本发明的第二个发明目的，本发明提供了保藏于CGMCC，保藏号为保藏号为CGMCC No.21933的果生炭疽菌F11在抑制水葫芦生长方面的应用。

水葫芦发生炭疽病时，除根以外的所有部位都可能被侵染。发病开始时叶面上有黑色的斑点，斑点数量和面积逐渐增大，叶出现病斑后，光合作用受抑制，幼苗瘦弱，抑制无性繁殖。后期水葫芦茎的膨胀处出现大面积疮疤，可造成腐烂，直至植物死亡。在花期可造成水葫芦花芽败育，不能开花，阻止水葫芦的有性繁殖。以此为特征实现水葫芦的有性/无性繁殖进行控制。

由于生炭疽菌F11是从自然发病的水葫芦分离、鉴定和筛选获得，其对水葫芦具有特异性的感染，经验证对其他植物、作物感染的概率极低，基本不会对环境造成危害。

生炭疽菌F11是筛选下获得的具有高效的侵染力和致病力的菌株，采用其用于菌剂，可提高了水葫芦生态治理效率。

为进一步适应水葫芦治理过程中面临多变的气候环境变化，当前菌株的生长最适温度为25-28℃,最适盐度为0-5‰，最适pH为4-6。后期对菌株进行高温、高盐度、高pH的培养驯化，提高了菌株广谱的环境适应力。

优选的，所述果生炭疽菌F11在水葫芦植株中的投放量为>10¹⁰CFU/亩。

使用中可根据待治理水葫芦区域面积大小及气候水文特征，分散布点投放生防菌剂，也可依据水域的形状随机补点，正常布点数为1-5个点/亩；投放量为>10¹⁰CFU/投放点。

为达到本发明的第三个发明目的，本发明提供了一种抑菌剂，所述抑菌剂中含有保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.21933的果生炭疽菌F11作为其有效成分。

优选的，所述抑菌剂中果生炭疽菌F11的含量为10⁸-10⁹CFU/ml。

优选的，所述抑菌剂中还包括以下含量的组分：马铃薯液体培养基 10-20g/L；海水盐5-20g/L；生石灰10-50g/L。

优选的，所述抑菌剂的pH值为6.5-8.5；所述抑菌剂中乳化剂含量为 5-10wt％。

优选的，所述抑菌剂的适用环境温度为10-40℃。

区别于现有技术，上述技术方案至少包括以下有益效果：提供了一种新的保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.21933的果生炭疽菌F11及其抑菌剂。所述果生炭疽菌F11可针对性的高效抑制水葫芦的生长与繁殖，对水体中的其他植物以及水体并无不良影响。

附图说明

图1为水葫芦来源的果生炭疽菌F11基于ITS-CHS-CAL基因进化树。

图2自然条件下采集的水葫芦染病植株(A)与F11感染的水葫芦病症植株(B)。

图3为实施方式中静态湖面(区域A)与流动河面(区域B)水葫芦的生物防控治理原理图。

图4为实施方式中生物防控棚的结构示意图。

图5为实施方式中使用抑菌剂对水葫芦防治的现场图片。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

本实施方式中，材料来源如下：

1、菌株：一种水葫芦治理的应用果生炭疽菌F11，其于2020年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为： CGMCC No.21933。

2、试剂：马铃薯葡萄糖液体培养基、查氏液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

实施例1、果生炭疽菌分离纯化：

1)菌株来源：在特定水源区域摘取不同的病害水葫芦进行微生物的培养，利用马铃薯葡萄糖液体培养基和查氏培养基对微生物进行培养，保存获得水葫芦致病菌株。

2)自然病害水葫芦样品采集与菌株分离：通过调查特定区域水葫芦的病害发病等级情况，通过筛选获得自然条件下存在的、出现的水葫芦炭疽病典型症状，病株呈现茎膨胀处和叶片部位枯萎腐烂病症，该病症可有效造成水葫芦绝育达到控制繁殖的效果(图2-A)。将获得的水葫芦炭疽病植株，带回实验室进行病菌分离培养。具体程序如下：取病健交界处(病斑与健康部分的交界处)的植株组织，剪成边长为0.5cm大小的方块，在70％的酒精溶液中浸泡10秒钟，而后0.1％升汞中灭菌40秒，最后无菌水冲洗三次，置于灭菌滤纸上自然晾干，接于含氨苄青霉素100μg/ml的PDA培养基上， 16-22℃倒置培养3-4天。菌丝长出后进行划线纯化培养，倒置培养2-3天后，挑取萌发的单菌落菌丝体再次划线纯化培养，纯化三代。采用无菌水稀释和水琼脂培养相结合的方法分离单孢，用弯曲的无菌玻璃棒将其均匀的涂抹在含有氨苄青霉素100μg/ml的水琼脂培养基上，倒置培养2-3天后，挑取单个孢子在含有含链霉素100μg/ml的查氏液体培养基中，于16-22℃下进行振荡培养，振荡速度为250r/min，该方法用于水葫芦病原菌的菌丝体。 3)菌株鉴定流程：经过筛选获得的菌株，提取微生物的DNA进行ITS-PCR扩增及测序分析，通过序列检索获得微生物基因信息，再利用显微镜进行微生物形态鉴定，获得菌株物种鉴定结果：果生炭疽病菌Colletotrichumfructicola，命名为Lactobacillus plantarum F11。

图1为水葫芦来源的果生炭疽菌F11基于ITS-CHS-CAL基因进化树。

4)菌株致病力测试：果生炭疽菌F11和现有其他水葫芦相关菌株的致病力进行比较试验。

接种方法采用水葫芦叶脉及茎膨胀处的微注射方法，接种的菌叶的孢子量为10⁵-10⁶CFU,并设置无菌水注射对照组。接种实验周期为12天，期间接种的水葫芦均置于温室内。

试验完成后水葫芦叶部及茎部的病菌侵染症状并评估致病等级。结果如图2-B所示。其经观察，果生炭疽菌F11感染后20天，水葫芦叶、茎上出现不规则坏死病变，以及冠和叶柄腐烂症状，为典型植物炭疽病症状。随着时间延长，水葫芦病症继续加深，最终导致水葫芦植株腐烂死亡或者丧失繁育功能。经筛选，F11接种的水葫芦病症严重程度高于自然条件下的染病植株，而且试验周期内F11接种发病率为83％，而自然条件下水葫芦发病率均低于 10％。相比自然条件的水葫芦发病病等级更为严重，且病程周期更短。因此，鉴于果生炭疽菌F11具有较强的致病性和感染性，采用果生炭疽菌F11进行开发水葫芦生物防控技术使用。

实施例2：一种水葫芦抑菌剂

1、果生炭疽菌F11培养：通过转接入马铃薯葡萄糖液体培养基或者查氏液体培养基中，28℃振荡大量培养果生炭疽菌F11，

2、抑菌剂的配制：每升菌剂配方为：菌体孢子OD600值为0.8(含量10⁸-10⁹ CFU/ML)，马铃薯液体培养基10g,海水盐(又名海水素，采购来源于青岛海科通用海水素有限公司)10g，生石灰20g,pH7.5，乳化剂10wt％。

3、菌剂投放环境温度36摄氏度，天气条件：晴天。

4、根据待治理水葫芦区域面积大小以及水体的环境条件，设计生物防控菌剂投放的分布点以及菌的投入方法，见图3、图5。具体措施如下所述：

区域A为静态湖面，湖面面积280亩，湖水的流动性较差，湖中水葫芦较为密集大多数处于静止状态，水葫芦植株密度大，且不会随着水流动。湖中水葫芦的区域大多是不规则的图案，生物防控棚正常布点数为1个/亩，每个布点数的面积大致为2平方米，合理分散排布于湖面四周及湖中央，大致为30-40 个。抑菌剂投放量为>10¹⁰CFU/投放点，利用喷雾器均匀使抑菌剂喷洒在生物防控棚，在抑菌剂中可加入润湿剂(投放量为0.5～2克/升)，增加抑菌剂与水葫芦表面的湿润性与延展性，使菌液孢子更长期、有效的附着在水葫芦的叶片上，增加菌株的侵染性。治理周期为10-20天，之后定期打捞病害腐烂的水葫芦。

区域B为完全河面，河面宽6-10米，水势比较湍急，水葫芦会随水四处漂流治理策略上与静态湖面有所区别。利用网体围隔，把水葫芦集中到一个区域，分段围隔或者分区域围隔，分区段治理。流动溪流水区域的生物防控棚布点数及菌剂投放均静态湖面相似。治理周期为30-40天，之后分段或者分区域定期打捞病害腐烂的水葫芦。

实施例3：一种水葫芦抑菌剂

1、果生炭疽菌F11培养：通过转接入马铃薯葡萄糖液体培养基或者查氏液体培养基中，28℃振荡大量培养果生炭疽菌F11。

2、抑菌剂的配制：每升菌剂配方为：菌体孢子OD600值为1.0(含量10⁸-10⁹ CFU/ML)，马铃薯液体培养基20g,海水盐5g，生石灰30g,pH8.0，乳化剂15wt％。

3、区域C在夏季治理阶段菌剂投放环境温度35-40摄氏度；区域C在冬季治理阶段，菌剂投放环境温度0-5摄氏度。

4、生物防控棚：为在短期提高水葫芦的生防菌感染效率而配套设计开发的生物防控棚，可保持一定立体空间和时间内生物防控菌感染水葫芦所需的温度和湿度环境，迅速造成生物防控棚内水葫芦的感染及负载菌体的指数型扩繁。后期在拆除生物防控棚后可加快水葫芦的治理区域的规模化病害流行，以实现利用生防菌规模控制水葫芦的繁殖机能和生长状态，治理水葫芦扩散和蔓延。所述的配套生物防控棚主要是用聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯以及其他树脂制成的薄膜，用作覆膜层，使水葫芦密集区有一个不受外界因素干扰的区域。冬天用黑色膜覆盖，夏天用透明膜覆盖，增强水葫芦的感染效率。图4为生物防控棚的结构示意图。

布置生物防控棚提高治理效果的如下所述：

1)区域C水葫芦在夏季治理，生物防控棚材料选用透明膜覆盖。夏季温度很高，一般生物防控棚中会达到50-65摄氏度，高温时会抑制水葫芦的生长，而菌剂功能受到一定程度的影响，但防控菌体还能正常生长并且发挥作用。然而高温使得水葫芦的生理受到温度胁迫，极大降低水葫芦植株免疫机能，加速生防菌体对水葫芦的侵染，显著提高治理效率。

2)区域D水葫芦在冬季时，生物防控棚材料选用黑色膜覆盖。冬季温度过低，用黑色膜覆盖可以使膜内比环境外温度高1-5摄氏度，膜中的温度适合防控菌体生长。于此同时，由于黑色膜完全避光，水葫芦缺少光照，不能进行光合作业，免疫力下降，总体加快了生防菌体对水葫芦的侵染速度，显著提高治理效率。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (8)

1.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.21933的果生炭疽菌F11。

2.保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.21933的果生炭疽菌F11在抑制水葫芦生长与繁殖方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述果生炭疽菌F11在水葫芦中的投放量为>10¹⁰CFU/亩。

4.一种抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂中含有权利要求1所述果生炭疽菌F11作为其有效成分。

5.根据权利要求4所述的抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂中果生炭疽菌F11的含量为10⁸-10⁹CFU/ml。

6.根据权利要求4所述的抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂中还包括以下含量的组分：马铃薯液体培养基10-20g/L；海水盐5-20g/L；生石灰10-50g/L。

7.根据权利要求4所述的抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂的pH值为6.5-8.5；所述抑菌剂中乳化剂含量为5-10wt％。

8.根据权利要求4所述的抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂的适用环境温度为10-40℃。

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