CN103060259A - 鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法及其获得的细胞系。本发明是将处理获得的头肾组织进行原代培养和传代培养获得，其中所采用的细胞培养液为在基础细胞培养液中添加胎牛血清、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子。

Description

鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法

技术领域

本发明涉及一种体外培养的鱼类细胞系的方法，属于生物细胞培养技术领域。

背景技术

体外培养的鱼类细胞系是广泛应用于病毒学、免疫学、毒理学、发育生物学、肿瘤学基因组学、遗传学以及资源保护等方面的重要工具。截至目前已相继建立近280余株不同鱼类细胞系，在生理学、病毒学、毒理学、肿瘤及基因工程等领域发挥重要作用。

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Gunther）在我国主要分布于渤海、黄海海域，其肉质细腻、鲜美，营养丰富，经济价值高，自然资源量少。半滑舌鳎自2003年人工繁殖获得成功后，近年来已经成为我国北方主要的养殖种类，养殖年产值超过10亿元。随着养殖业的快速发展，鱼病给养殖业造成巨大损失，病原包括细菌、病毒、寄生虫等。对半滑舌鳎致病病原特性和免疫抗病基因功能的研究是从根本上解决病害问题的方法，细胞系作为一种体外培养系统，因其成本低、试验重复性好、条件可精确控制的优点，是其中必不可少的研究工具。

迄今为止，虽然有文献报道半滑舌鳎胚胎细胞系（中国水产研究院黄海水产研究所，沙珍霞，Acta Oceanologica Sinica .vol.29.No.2:81-87）、心肌细胞系（中国水产研究院黄海水产研究所，王贤丽，Fish Physiol Biochem  36:1181–1189）、肝脏细胞系（中国水产研究院黄海水产研究所，任国诚，High technology communication.18（6）：657-660）、精巢细胞系（中国水产研究院黄海水产研究所，张博，Int.J.Biol.7(4):452-459）等4个细胞系的建立，但是仍未见头肾来源细胞系的报道。

头肾（又名前肾）是鱼类的主要免疫器官，建立半滑舌鳎头肾来源体外细胞系，可以更有针对性地研究病原在体外培养条件下的致病机理，也可以为研究免疫抗病基因功能提供细胞平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种建立鱼类头肾来源细胞系的方法。本发明所要解决的技术问题是：通过选择细胞培养液，选取合适头肾组织经过原代培养和传代培养，获得可以连续传代，且细胞能维持良好生长状态的头肾来源细胞。作为优选的，本发明的鱼类是半滑舌鳎。

本发明提供的技术方案是：一种鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，包括以下步骤：

1、头肾组织的处理：将头肾组织剪成小块，加入胰蛋白酶进行消化，加入，细胞培养液终止消化，收集经消化处理的组织细胞悬液，离心去除上清；

2、原代培养：加入细胞培养液重悬后于培养箱中培养；

3、传代培养：原代培养细胞开始增殖至组织块周围细胞晕停止生长后，加入胰蛋白酶消化悬起细胞，利用细胞培养液进行传代培养；

优选地，其中所述鱼类为半滑舌鳎。

其中，采用的细胞培养液为在基础细胞培养液中添加胎牛血清、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子，优选进一步含有青霉素和/或链霉素。所述基础培养液优选pH为7.0-7.3，更优选为MEM培养基，最佳选用购自GIBCO公司MEM培养基。更具体的是，在使用时向基础细胞培养液中添加上述各种物质。

进一步的，其中胎牛血清添加量为占细胞培养液总体积10-20%的胎牛血清，最佳为20%；丙酮酸钠、2-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子在细胞培养液中的添加量分别达到0.1-5 mM、10-100 mM、1-20 ng/ml，优选为1 mM、50 mM、10ng/ml。青霉素和/或链霉素可按常规量添加，通常添加100 U/ml的青霉素，100 U /ml的链霉素。

上述第2步骤中，所述培养中在24℃培养箱中培养，每隔7天半量更换细胞培养液一次。

上述第3步聚传代培养更优选为：原代培养获得的用添加上述细胞培养液将细胞稀释至2×10⁵细胞/ml浓度进行原瓶传代培养；当瓶底细胞长至单层后在传代中以2×10⁴-2×10⁵细胞/ml浓度进行分瓶接种，传代间隔期为3-7天；传至11代以后，细胞培养液中的胎牛血清含量减为5%-15%。

本发明具有以下有益效果：通过本发明方法建立的细胞系可以在大致室温条件下连续传代，且细胞能维持良好生长状态，可以对其进行冷冻保存，能提供大量的头肾来源细胞。由于于头肾是鱼尤其对于半滑舌鳎而言是重要的免疫器官，因此，所建细胞系为开展病原特性及其致病机理研究、疫苗研制以及功能基因研究等相关领域的理论与应用研究提供了便利。

附图说明

图1：相差显微镜下传代培养的半滑舌鳎头肾来源细胞系

A: 第3代半滑舌鳎头肾来源细胞；B：第21代半滑舌鳎头肾来源细胞

图2：半滑舌鳎头肾来源细胞系在不同温度下的生长曲线

图3：半滑舌鳎头肾来源细胞系的染色体核型图

A：染色体数目分布；B：二倍体中期分相；C：核型 

图4：半滑舌鳎头肾来源细胞系感染牙鲆淋巴囊肿病毒图片

A：细胞感染病毒之前；B：细胞感染病毒5天后；C、D：感染病毒的细胞电镜切片图

图5：半滑舌鳎头肾组织的细胞系转染pEGFP-N₃后的荧光图片。

 具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

 实施例一、半滑舌鳎头肾来源细胞系的建立方法

1、配制细胞培养液：取9.6克GIBCO公司MEM培养基和4.76克Hepes，充分溶解混匀4小时后，用NaOH调节pH为7.0-7.3，然后抽滤，分装，4℃保存保存；使用前加入占总体积10-20%的胎牛血清、1mM的丙酮酸钠，50mM的2-巯基乙醇，10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子，100 U/ml的青霉素，100 U/ml的链霉素，4℃存放。

2、原代培养：取体重约250克半滑舌鳎的头肾组织，置于高压灭菌处理的玻璃平皿中，PBS冲洗两次，将肾组织剪成大约1 mm³的小块，加入0.25%胰蛋白酶1ml，室温消化20分钟。加入3 ml细胞培养液终止消化，将经消化处理的组织细胞悬液收集至15 ml离心管中，以2200 rpm离心5分钟，去上清。加1 ml细胞培养液重悬后接种至25cm²的培养瓶中，正置于24℃培养箱中培养。第二天补充细胞培养液至2ml，然后每隔7天半量更换细胞培养液一次。

3、传代培养：原代培养细胞开始增殖后，细胞数目增多，当组织块周围细胞晕停止生长后，以0.25%胰酶消化法传代悬起细胞，用血细胞计数板计数细胞。根据收集到的细胞数量用添加20%胎牛血清的MEM完全培养基将细胞稀释至2×10⁵细胞/ml浓度进行原瓶传代培养；当瓶底细胞长至单层后在传代中以2×10⁴-2×10⁵细胞/ml浓度进行分瓶接种，传代间隔期为3-7天；传至11代以后，细胞培养液中血清含量减为总体积的10%；自接种组织至今，已传代40多代，细胞已能稳定增值，可定为细胞系，命名为CGHKC。该细胞系主要细胞类型为成纤维样细胞（如图1，B所示）。

 实施例二、半滑舌鳎头肾组织来源细胞系的鉴定方法

1、细胞的冻存与复苏

1）细胞的冻存：选取生长旺盛、处于指数生长期的、细胞密度90%以上的一瓶细胞，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化2分钟，吸去消化液，用2 ml冻存液（含10%二甲基亚砜的细胞培养液）悬浮细胞，移至冻存管，4℃放置30分钟，-80℃冰箱放置12小时，然后移至液氮中保存，并做好记录。

2）细胞的复苏：自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于40℃水浴中融化，2200 rpm离心5分钟，弃上清，加入2 ml细胞培养液悬起细胞，转移至培养瓶中，放置于培养箱中24℃培养，待细胞贴壁后弃上清，加入2 ml新的细胞培养液。

2、细胞生长曲线绘制

为了分析半滑舌鳎头肾来源细胞系的生长情况，取第9代细胞接种于9个十二孔板，每板7孔，每孔16×10⁴个细胞，每3个十二孔板为一组，将三组孔板分别置于15℃，24℃，30℃的培养箱中培养。在接种后的第2，3，4，5，6，7，8天，在三组孔板中，每组每板各取一孔细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数板计数。以培养时间为横坐标，以每ml细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线，如图2所示。从图中可见，24℃为半滑舌鳎头肾来源细胞系的最适生长温度。

3、染色体分析

将22代半滑舌鳎头肾来源细胞系以1×10⁶个/瓶的密度接种于25cm²的培养瓶中，24℃培养24 h后，加入终浓度0. 1ug/ml的秋水仙素，1.5h后，消化收集细胞，离心后的细胞沉淀以0.075M KCl溶液37℃处理20分钟后加入1 ml的卡诺固定液（甲醇：乙酸=3：1），预固定2分钟，离心后细胞沉淀再次用卡诺固定液固定15分钟。最后离心，细胞重悬于0.5 ml的卡诺固定液中，-20℃保存过夜。第二天，细胞悬液以冷滴法滴片，风干，5%吉姆萨染色25分钟，最后用Nikon显微镜观察。半滑舌鳎头肾组织来源细胞的染色体数目在22-81之间，其中主要的染色体数目为42条，在观察的100个分裂相细胞中占43%（图3，A），染色体核型为2n=42（参见图3，B、C）。

4、病毒感染实验

以21代半滑舌鳎头肾组织来源细胞系为对象，检测该细胞牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）的敏感程度。细胞接种24小时后，将病毒溶液（10²TCID₅₀ml^-1）加入细胞培养瓶中，1小时后，移去病毒溶液，更换新鲜细胞培养液，继续培养，约4天后，观察到细胞病变效应（CPE）后（参见图4，A，B），将细胞做电镜切片观察。

将感染LCDV病毒的CGHKC细胞离心后，用2.5%戊二醛4℃固定4小时，0.1M PBS缓冲液冲洗3次，每次10分钟。1%锇酸4℃固定2小时，0.1M PBS缓冲液冲洗3次，每次10分钟。乙醇系列梯度脱水，30%，50%，70%，90%，100%的乙醇每次10分钟，其中100%两次。Epon812环氧树脂包埋，37℃、45℃、65℃温箱固化，每级温度24小时。Ultracut E超薄切片机超薄切片，醋酸双氧铀硝酸铅染色。JOEL公司JEM-1200EX透射电镜结果显示，在半滑舌鳎头肾组织来源细胞系中观察到LCDV病毒粒子和凋亡细胞（参见图4，C，D）。

5、GFP报告基因的细胞转染

转染前一天，将第9代CGHKC细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于六孔板中，24℃培养。转染时，细胞密度超过80%，以Invitrogen公司的Lipofectamine 2000转染pEGFP-N₃质粒。具体步骤为将5 ul Lipofectamine 2000加入到包含245 ul细胞培养液（不含血清）的1.5 ml离心管中，另一个离心管中加入10 ul pEGFP-N3（100 ng/ul）和240 ul不含血清的细胞培养液。5分钟后，将上述两管溶液混合，室温放置25分钟。500 ul混合液加入到包含2 ml细胞培养液（不含血清）的六孔板之一孔中，24℃培养4.5小时，然后，将培养液替换为正常包含血清的细胞培养液。36小时后，用Nikon ECLIPSE TE2000-U荧光显微镜观察绿色荧光的表达，发现约有10%以上的细胞表达较强荧光（具体参见图5）。

上述实施例表明，用本发明方法建立的半滑舌鳎头肾来源细胞系，其最适生长温度为24℃，生长曲线正常，染色体为正常的42条，可以进行连续传代，也可以对其进行冷冻保存。以牙鲆淋巴囊肿病毒转染细胞系可以检测到病毒粒子的存在，以pEGFP-N3进行基因转染实验，也观察到较强的绿色荧光，证实半滑舌鳎头肾组织来源细胞系可以直接应用于病毒感染试验及外源基因功能研究。

本发明半滑舌鳎头肾组织来源细胞系的建立方法重复性强，染色体鉴定方法可信，配制的培养液营养成分全面，取材的半滑舌鳎体重恰当，该建立方法可以适用于构建其他鱼类头肾来源的鱼类细胞系。

Claims (10)

1.一种鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，包括以下步骤：

(1) 头肾组织的处理：将头肾组织剪成小块，加入胰蛋白酶进行消化，加入，细胞培养液终止消化，收集经消化处理的组织细胞悬液，离心去除上清；

(2) 原代培养：加入细胞培养液重悬后于培养箱中培养；

(3) 传代培养：原代培养细胞开始增殖至组织块周围细胞晕停止生长后，加入胰蛋白酶消化悬起细胞，利用细胞培养液进行传代培养；

其中，采用的细胞培养液为在基础细胞培养液中添加胎牛血清、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子。

2.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述的鱼类是半滑舌鳎。

3.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述基础细胞培养液pH为7.0-7.3。

4.按照权利要求3所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述基础细胞培养液为MEM培养液。

5.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：在所述基础细胞培养液进一步添加青霉素和/或链霉素。

6.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述基础细胞培养液中的胎牛血清添加量为占细胞培养液总体积10-20%，优选20%。

7.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述基础细胞培养液中的添加丙酮酸钠、2-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子在细胞培养液中分别达到0.1-5 mM、10-100 mM、1-20 ng/ml。

8.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述第2步骤中，所述培养中在24℃培养箱中培养，每隔7天半量更换细胞培养液一次。

9.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述第3步聚传代培养为：原代培养获得的细胞用添加所述细胞培养液将细胞稀释至2×10⁵细胞/ml浓度进行原瓶传代培养；当瓶底细胞长至单层后在传代中以2×10⁴-2×10⁵细胞/ml浓度进行分瓶接种，传代间隔期为3-7天；传至11代以后，细胞培养液中的胎牛血清含量减为5%-15%。

10.按照权利要求1至9任一项所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法获得的细胞系。

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