CN103484425A

CN103484425A - 一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法

Info

Publication number: CN103484425A
Application number: CN201310474258.0A
Authority: CN
Inventors: 陈新华; 敖敬群; 王贤慧; 王琨茹
Original assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2013-10-12
Filing date: 2013-10-12
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-10-12
Also published as: CN103484425B

Abstract

一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法，涉及细胞系。所述大黄鱼头肾细胞系为大黄鱼头肾细胞系LYCK，保藏编号为CCTCC NO：C2013113。所述大黄鱼头肾细胞系的构建方法，包括以下步骤：1）配制细胞培养基；2）原代培养的建立；3）传代培养。建立的大黄鱼头肾细胞系形态为纤维状，该细胞系可以连续传代，大黄鱼头肾细胞系已传70代以上；能大量提供大黄鱼的头肾细胞系；该细胞系可以直接应用于各种大黄鱼免疫相关功能基因研究。该细胞系可应用于细胞生物学、分子生物学、病毒学、毒理学、肿瘤学、遗传学和免疫学等重要研究。

Description

一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法

技术领域

本发明涉及细胞系，尤其是涉及一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法。

背景技术

目前，世界上已建立的细胞株和细胞系至少有数千种，包括人和动物的正常细胞、肿瘤细胞以及遗传缺陷型细胞等，其中，海洋生物的细胞培养晚于陆生生物。鱼类养殖业的迅猛发展也促进了鱼类细胞系的建立及其在病毒检测、疫苗和病理毒理方面的应用。鱼类细胞系建立始于20世纪60年代。1962年，Wolf等(WOLF K，QUIMBY M.Established eurythermic line of fishcells in vitro.Science1962.135:1065-1066.)首次建立了虹鳟生殖腺细胞系RTG-2，该细胞系在实验室传代培养至今。此后，鱼类细胞系培养发展迅速，至2010年,全世界已报道建立的鱼类细胞系约有275类,其中大多数来自淡水鱼或溯河产卵的海洋鱼类。淡水鱼类和溯河洄游性鱼类来源的细胞系约175株,分别来源于71个科的89种鱼类的不同组织;而海水鱼类及咸水鱼类的细胞系仅有约100株,分别来源于23个科的35种海水鱼类的不同组织（张博，陈松林.近10年鱼类细胞培养研究进展及应用展望.Marine Sciences2011.35:113.）。

大黄鱼Pseudosciaena crocea（Richardson）俗称黄花鱼，属鲈形目石首鱼科黄鱼属，是我国特有的地方性种群，分布范围北起黄海南部，经东海、台湾海峡，南至南海雷州半岛以东。其肉质鲜嫩，是我国人民喜食的海产鱼，除供鲜食外还可加工制成风味和特色的水产品。此外，大黄鱼具有药用价值，其耳石具清热作用，鳔有润肺健脾、补气活血之功能。近年来，随着环境污染日益加剧和养殖业过度膨胀，大黄鱼病害问题日趋严重，各种传染性疾病频频暴发，造成大黄鱼死亡率逐年上升，经济损失严重，极大地影响了大黄鱼养殖业的健康发展。本发明利用大黄鱼重要免疫器官-头肾建立了能够在体外连续培养的细胞系，该细胞系目前在体外传至第70代以上，可用于大黄鱼免疫学及相关的细胞生物学、分子生物学研究。

发明内容

本发明的目的在于利用大黄鱼免疫组织—头肾，提供一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法。

本发明的另一目的在于提供一种大黄鱼头肾细胞系在分子免疫学、功能基因研究中的应用。

所述大黄鱼头肾细胞系为大黄鱼头肾细胞系LYCK，已于2013年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2013113，保藏中心地址为湖北省武汉市武汉大学。

所述大黄鱼头肾细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1）配制细胞培养基；

2）原代培养的建立；

3）传代培养。

在步骤1）中，所述配制细胞培养基的方法可为：取GIBCO公司的L-15培养基粉末，溶解后，抽滤，分装，取少量做无菌测试，4℃保存，得基础培养基；临用前加入10%～20%的胎牛血清，双抗，于4℃保存，得完全培养基。

在步骤2）中，所述原代培养的建立方法可为：取3尾健康大黄鱼，量体长，称重，浸入75%的乙醇中，进行体表消毒和麻醉，立即解剖；在事先备好的玻璃瓶中加入2mL含有2×双抗（青霉素200U/mL，链霉素0.2mg/mL）的L-15基础培养基，先剪断大黄鱼脊椎，依次分离大黄鱼的头肾组织，放入步骤1）所得到的基础培养基中清洗，至少漂洗3次，洗好后，在含上述基础培养基的玻璃瓶内将头肾组织剪成碎块，糜状最好；去除基础培养基，加入2mL胰酶消化15～20min，再加入含20%FBS和2×双抗的L-15完全培养基终止消化反应；用无菌尼龙滤网过滤上述消化产物；1000～1500rpm离心10min，弃上清；加入L-15完全培养基重悬细胞沉淀，1000rpm再次离心10min，弃上清；加入完全培养基重悬细胞沉淀，并转至25cm²细胞培养瓶中，补加完全培养基至5mL，28℃细胞培养箱中静置培养。

在步骤3）中，所述传代培养的方法可为：细胞长成单层后，吸出培养基，加入PBS漂洗细胞，加入含有0.25%EDTA的胰蛋白酶进行消化，显微镜观察下待细胞变圆即吸弃胰酶，加入新鲜培养基制备细胞悬液，一分为二接种至两个培养瓶中，于28℃培养箱中培养。

本发明具有以下突出优点：

1、本发明建立的大黄鱼头肾细胞系形态为纤维状，该细胞系可以连续传代，大黄鱼头肾细胞系已传70代以上；能大量提供大黄鱼的头肾细胞系；该细胞系可以直接应用于各种大黄鱼免疫相关功能基因研究。

2、用上述大黄鱼头肾细胞系的构建方法构建的大黄鱼头肾细胞系，其最适生长温度为28℃，生长曲线正常，染色体为48条，可以进行细胞系连续传代，或冷冻保存。以PEGFP-N1质粒DNA进行基因转染实验，可以观察到较强的绿色荧光，证实该细胞系可应用于细胞生物学、分子生物学、病毒学、毒理学、肿瘤学、遗传学和免疫学等重要研究。

附图说明

图1为倒置相差显微镜下传代培养的大黄鱼头肾细胞系。在图1中，A.大黄鱼头肾细胞原代（100×）；B.大黄鱼头肾细胞20代（100×）。

图2为大黄鱼头肾细胞系最佳生长条件的生长曲线。

图3为大黄鱼头肾细胞系的染色体数目分布图。

图4为大黄鱼头肾细胞系的染色体二倍体中期分相核型图。

图5为大黄鱼头肾细胞系转染pEGFP-N1质粒DNA后的荧光显微图片（200×）。

具体实施方式

一、大黄鱼头肾组织细胞系的构建方法，步骤如下：

1、配制细胞培养基：取GIBCO公司的L-15培养基粉末一袋，加无菌去离子水溶解，用适量3.6%的盐酸调节pH至7.6～7.7，再加入2.5mL无菌的HEPES缓冲液，补加无菌去离子水至900mL，用0.22μm滤膜抽滤，分装，取少量做无菌测试，4℃保存，为基础培养基；临用前加入适量的胎牛血清与双抗（1×双抗为青霉素100U/mL，链霉素0.1mg/mL），于4℃保存，为完全培养基。

2、原代培养的建立：无菌室中取3尾健康的大黄鱼，量体长，称重。浸入75%的乙醇中，进行体表消毒和麻醉，立即解剖。事先备好无菌玻璃瓶，瓶中加入约2mL含有2×双抗的L-15基础培养基。先剪断大黄鱼脊椎，迅速分离大黄鱼的头肾组织，放入上述培养基中清洗，至少漂洗3次。洗好后，在含上述基础培养基的小玻璃瓶内将组织剪成小碎块，剪成糜状最好。因头肾部分较小，需同时取3条鱼的头肾清洗剪碎后混合。去除培养基，加入2mL胰酶于室温消化15～30min。再加入含20%FBS和2×双抗（青霉素200U/mL，链霉素0.2mg/mL）的L-15完全培养基终止消化反应。用无菌尼龙滤网过滤上述消化产物。1000～1500rpm离心10min，弃上清。加入完全培养基重悬细胞沉淀，1000rpm再次离心10min，弃上清。加入少许完全培养基重悬细胞沉淀，并转至25cm²细胞培养瓶中，补加完全培养基至5mL，28℃细胞培养箱中静置培养。

3、传代培养：原代培养分离好的细胞第10天开始增殖，待长成单层后（如图1A所示），吸出培养基，加入PBS漂洗细胞。加入适量含有0.25%EDTA的胰蛋白酶进行消化，显微镜下观察待细胞变圆即吸出胰酶。加入新鲜培养基制备细胞悬液，一分为二接种至两个培养瓶中，补足完全培养基，28℃培养箱中培养。传至第10代时，细胞培养基中双抗浓度由2×降为1×，至第20代时，可以不加双抗培养。传至第20代时细胞培养基中胎牛血清含量由20%降至15%，传至第30代时，血清含量降至10%，以后细胞培养基固定为含有10%血清的L-15完全培养基。自培养至今，已传代70代以上，细胞增长稳定，呈纤维状，命名为LYCK（如图1B所示）。

二、大黄鱼头肾细胞系的鉴定和应用：

1、细胞的冻存与复苏：

1）、细胞的冻存：按常规方法消化处于对数生长期、密度达到90%以上的一瓶细胞，具体如下：将培养基吸出，加入2mL0.25%胰酶消化约3min至细胞变圆，弃消化液，加入基础细胞培养基制备单细胞悬液，计算细胞总数。将细胞悬液以1500rpm离心10min，去上清。加入冰预冷的冻存保护液（基础培养基+20%胎牛血清+10%二甲基亚砜），轻轻吹打混匀，令细胞密度达5×10⁶个/mL以上。按每管1mL的量分装于冻存管中，拧紧管盖。依次于4℃冰箱竖直放置2h，-20℃冰箱放置2h，-80℃放置过夜，最后保存于液氮中，作好记录。

2）、细胞的复苏：提前准备好37℃的温水，或将恒温水浴箱调至37℃。从液氮中取出冻存管，立即放入37℃温水中迅速晃动，直至冻存物融解至绿豆大小，迅速取出，浸入75%酒精中消毒管壁。再将细胞冻存悬液转移到预先加好5～10mL基础培养基的离心管内，1500rpm离心10min，弃上清液。加入含胎牛血清的完全培养基，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足完全培养基，28℃培养箱中培养。

2、细胞生长曲线：

经过不同生长条件的摸索，确定大黄鱼头肾细胞系生长的最佳条件为培养温度28℃，培养基为添加10%FBS的L-15完全培养基。取第35代对数生长末期细胞，消化收集后用适量培养基稀释，按每孔4×10⁴的量接种至24孔板，共21个孔，于28℃培养箱中培养。每隔24h以0.25%胰酶消化收集3孔细胞，细胞计数板计数。最后以培养时间为横坐标，每mL培养基中细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线，如图2所示。

3、染色体分析：

将第39代大黄鱼头肾细胞以2×10⁶/瓶的密度接种于25cm²培养瓶中，28℃培养17h后，加入终浓度为1μg/mL的秋水仙素（Sigma，溶解于0.9%生理盐水），4h后消化收集细胞悬液，离心后的细胞沉淀加入0.075M KCl溶液10mL置于37℃水浴锅进行低渗处理40min，1500rpm离心10min后弃上清，再加入10mL卡诺固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1，所用卡诺固定液均预冷）预固定30min，1500rpm离心10min弃上清，细胞沉淀再用10mL卡诺固定液分别固定两次，每次20min。每次固定结束后均通过1500rpm离心10min收集细胞，最后细胞重悬于0.5mL卡诺固定液中。用冷滴片法滴片，自然风干，10%吉姆萨（Sigma，1×PBS稀释）染色20min，用莱卡显微镜观察。结果显示大黄鱼头肾细胞的染色体数目在20～64之间，主要染色体数目为48条，在观察的100个分裂相中占50%（如图3），染色体核型图如图4。

4、GFP报告基因在LYCK细胞中的表达：

转染前一天，将LYCK细胞以3×10⁵/孔的密度接种于24孔板中，28℃培养。转染时，细胞密度处于90%左右，以Roche公司的X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent按操作说明书转染pEGFP-N1。转染48h后，用Nikon荧光显微镜观察绿色荧光的表达，发现约有10%左右的细胞表达较强荧光（图5）。

Claims

1.一种大黄鱼头肾细胞系，其特征在于为大黄鱼头肾细胞系LYCK，已于2013年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2013113。

2.如权利要求1所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）配制细胞培养基；

2）原代培养的建立；

3）传代培养。

3.如权利要求2所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于在步骤1）中，所述配制细胞培养基的方法为：取GIBCO公司的L-15培养基粉末，溶解后，抽滤，分装，取少量做无菌测试，4℃保存，得基础培养基；临用前加入10%～20%的胎牛血清，双抗，于4℃保存，得完全培养基。

4.如权利要求2所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于在步骤2）中，所述原代培养的建立方法为：取3尾健康大黄鱼，量体长，称重，浸入75%的乙醇中，进行体表消毒和麻醉，立即解剖；在事先备好的玻璃瓶中加入2mL含有2×双抗的L-15基础培养基，先剪断大黄鱼脊椎，依次分离大黄鱼的头肾组织，放入步骤1）所得到的基础培养基中清洗，至少漂洗3次，洗好后，在含基础培养基的玻璃瓶内将头肾组织剪成碎块；去除基础培养基，加入2mL胰酶消化15～20min，再加入含20%FBS和2×双抗的L-15完全培养基终止消化反应；用无菌尼龙滤网过滤上述消化产物；1000～1500rpm离心10min，弃上清；加入L-15完全培养基重悬细胞沉淀，1000rpm再次离心10min，弃上清；加入完全培养基重悬细胞沉淀，并转至25cm²细胞培养瓶中，补加完全培养基至5mL，28℃细胞培养箱中静置培养；所述2×双抗为青霉素200U/mL和链霉素0.2mg/mL。

5.如权利要求4所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于所述在含基础培养基的玻璃瓶内将头肾组织剪成碎块后形成糜状。

6.如权利要求2所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于在步骤3）中，所述传代培养的方法为：细胞长成单层后，吸出培养基，加入PBS漂洗细胞，加入含有0.25%EDTA的胰蛋白酶进行消化，显微镜观察下待细胞变圆即吸弃胰酶，加入新鲜培养基制备细胞悬液，一分为二接种至两个培养瓶中，于28℃培养箱中培养。

7.如权利要求1所述一种大黄鱼头肾细胞系在各种大黄鱼免疫相关功能基因研究中的应用。

8.如权利要求1所述一种大黄鱼头肾细胞系在细胞生物学、分子生物学、病毒学、毒理学、肿瘤学、遗传学和免疫学研究中的应用。