CN106645669B - 一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，对鲳鲹进行解剖并分离得到其头肾的巨噬细胞，通过Percoll溶液密度梯度离心方法，提取头肾的巨噬细胞。通过台盼蓝染色的方法对其体外培养的细胞存活数量进行计数，并且检测其一周内的存活状况。通过吞噬实验，测定卵形鲳鯵头肾巨噬细胞对鰤鱼诺卡氏菌和酵母等的吞噬情况，以观察其吞噬功能。通过实验结果可以发现，本发明能够良好地提取鲳鲹巨噬细胞，并能够良好地观察鲳鲹巨噬细胞的存活情况与吞噬情况。本发明为进一步研究鲳鲹巨噬细胞的生理学、病理学、毒理学奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及表征免疫细胞与微生物相互作用的方法，具体涉及一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法。
背景技术
卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)(Linnaeus)，俗称金鲳，黄腊鲳，属硬骨鱼纲，脊椎动物门，硬骨鱼纲，鲈形目，鲹科，鲳鲹属。卵形鲳鲹体型侧扁，卵圆形，体型大，生长快，抗病力强。自然水域中卵形鲳鲹喜卵形鲳鱼集群觅食洄游，争抢食物凶猛，主要以小型软体动物、小型螺类为食。大的个体有5-10kg，肉细嫩，味鲜美，为名贵的食用鱼类。
卵形鲳鲹是一种抗病力较强的海水鱼类，过去关于其病害方面的报道极少。但随着工业化的发展，水产养殖业也越趋现代化，养殖规模不断扩大、养殖密度也逐渐增加，卵形鲳鲹疾病的发生率也不断增高，病毒性、细菌性等的疾病时常出现，其中近年来以诺卡氏菌病例最多。诺卡氏菌病的主要症状为病鱼体表有点状出血斑小而隆起的浓肿，有时口唇部糜烂本病的典型症状是脾脏及肾脏上有白色结节的病变，另一种流行症状主要发生鳃，也叫鳃型诺卡氏菌症，可在鳃上见到直径为5mm的不规则结节，也有两种症状混合出现的。卵形鲳鲹诺卡氏菌病发病率达20％～60％，死亡率10％～30％，未死鱼由于体表溃疡症状也严重影响其市场价值。
鱼类诺卡氏菌病主要致病菌为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea)。鰤鱼诺卡氏菌在分类学上属放线菌目(Actinomycetales)，诺卡氏菌科(Nocardiaceae)，诺卡氏菌属(Nocardioides)。鰤鱼诺卡氏菌菌体形态为长杆、短杆或分支状；属于放线菌类生物，呈弱抗酸性，在培养基上生长迟缓。其菌落形态呈白色沙粒状，培养3-7天可转变为黄色沙粒状。
近年来水产动物病害进行免疫学角度的研究，对于病害防控和治疗以后的发展越来越重要，并且逐渐成为研究的热点。鱼类头肾是其重要的免疫器官，头肾的巨噬细胞是非特异性防御系统的重要的细胞。当受到病原生物的入侵时，巨噬细胞将被激活并吞噬病原体，并且发生一系列反应杀死病原生物。同时其免疫活性参数溶酶体活性、补体活性的都得到加强。
巨噬细胞的吞噬作用(phagocytosis)是指细胞把入侵的病原体(如细菌和病毒)转运到细胞内并加以清除的过程。此过程构成生物体先天免疫的第一道防线。吞噬作用是所有后生动物的一种原始的防御机制。
现今，在水产养殖方面，诺卡氏菌对鱼类的影响越来越严重，而相关的研究却还比较少，所以探讨鱼类本身对于诺卡氏菌等细菌的免疫，将有利于我们更好地了解卵形鲳鲹对于鰤鱼诺卡氏菌的免疫情况。从而有利于我们更好地研究出防控其病害影响的药物，同时也为其他鱼类巨噬细胞对于诺卡氏菌的病害防控的研究提供一个参考。促进卵形鲳鲹水产养殖业的发展，并且为水产养殖户提供一定的理论知识，帮助他们获得更好的收益。
有关卵形鲳鲹免疫功能的报道较少，头肾是鱼类的重要免疫器官，未见到卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的分离、纯化、培养和表征的报道。
对卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的分离、纯化、培养和表征为卵形鲳鲹巨噬细胞的生理学、病理学、毒理学等方面奠定基础，有利于更深入地研究卵形鲳鲹的免疫功能，有利于研究微生物-卵形鲳鲹的致病机理，有利于研究卵形鲳鲹对微生物等成分的吞噬作用，有利于对卵形鲳鲹病害的控制，为卵形鲳鲹巨噬细胞的分子生物学研究提供材料保障。
本文相关背景技术：
袁思平,王国良,金珊.养殖鱼类致病诺卡氏菌研究进展[J].微生物学通报,2006,33(2):137-141.
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黄郁葱,简纪常,吴灶和,等.卵形鲳鲹结节病病原的分离与鉴定[J].广东海洋大学学报,2008,28(4):49-53.
王瑞旋,刘广锋,王江勇,等.养殖卵形鲳鲹诺卡氏菌病的研究[J].海洋湖沼通报,2010(1):52-58.
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发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物是通过下面步骤进行的：
1).用无水乙醇洗涤显微镜载玻片，并用蜡笔在所述显微镜的干净的区域上圈画圆形区域，所述圆形区域的直径为1.5cm；
2).将鲳鲹巨噬细胞悬液滴加在所述圆形区域，所述鲳鯵巨噬细胞悬液的用量为50μl，所述鲳鲹巨噬细胞浓度为2×106细胞/ml；
3).将所述载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中并加盖，25℃条件下培养1-2小时；
4).所述鲳鲹巨噬细胞孵育完毕后，用25℃左右的L-15洗涤所述载玻片；
5).将50μl细菌悬液加入所述圆形区域，巨噬细胞：微生物细胞为1:10的比例；
6).将所述载玻片放铺有湿润滤纸的加盖培养皿中，25℃培养60min；
7).用磷酸盐缓冲液或L-15洗所述载玻片5次；
8).用100μl 100％甲醇固定所述载玻片上的所有细胞5min，用70％甲醇冲洗所述载玻片5次；
9).用迪夫快速染色液染色所述载玻片后，空气干燥，滴加封片剂后用盖玻片封片；
10).用油镜观察计数所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物细胞的情况。
可选地，所述微生物细胞为鰤鱼诺卡氏菌细胞，步骤5)中用含20％(v/v)鲳鲹血清的L-15制备鰤鱼诺卡氏菌悬液，浓度为1×107cfu/ml，在20℃，孵育30分钟；用PBS洗菌2次，3000rpm，10min；用含5％(v/v)卵形鲳鲹血清的L-15将所述鰤鱼诺卡氏菌悬液浓度调整到2×107cfu/ml。
可选地，所述微生物细胞可为酵母菌细胞，步骤5)中酵母悬液的制备方法为：酵母干粉按0.5％(w/v)溶解于含20％(v/v)卵形鲳鲹血清或小牛血清的L-15。
为了获取鲳鲹巨噬细胞，所述鲳鲹巨噬细胞可按照下面的步骤制备：
a.解剖鲳鲹，取出头肾；
b.将所述头肾放置在一个无菌的100目细胞筛上，该细胞筛下放置一个装含有20i.u./ml肝素的装有5ml L-15培养基的培养皿；
c.将所述培养皿放置冰块上，在所述细胞筛的网格上摩擦所述头肾，使所述头肾细胞落入所述含L-15的培养皿中形成鲳鯵细胞悬液；
d.将细胞悬液贴壁轻柔的转移到Percoll梯度离心管的34％Percoll层之上；
e.移动加样完毕的所述Percoll梯度离心管，于4℃，400g，离心25分钟；
f.用无菌吸管小心吸取并弃去所述Percoll梯度离心管的上层34％Percoll液体，再用无菌吸管吸取临近34％Percoll/51％Percoll界面处的细胞悬液层，即得到鲳鲹头肾巨噬细胞；
g.加入1ml L-15到所述鲳鲹头肾巨噬细胞悬液，然后在4℃，2000rpm条件下离心7min，弃上清；
h.取沉淀加入1ml灭菌双蒸水冲洗所述鲳鲹头肾巨噬细胞15-30s，4℃，2000rpm离心7min，弃上清。
在进行步骤h后，可用1ml L-15培养基重悬所述鲳鲹头肾巨噬细胞，用台盼蓝溶液染色，用血球计数板计数细胞。
为了所获鲳鲹巨噬细胞能够在体外培养和/或增殖，步骤h所获得的所述鲳鲹巨噬细胞可进行如下步骤的培养：
A.用L-15培养基重悬所述鲳鲹巨噬细胞沉淀形成巨噬细胞悬液后用血球计数板，显微镜观察，计数所述鲳鲹巨噬细胞；
B.根据鲳鲹巨噬细胞计数结果用L-15培养基调整所述鲳鲹巨噬细胞浓度为1×107细胞/ml，用含钾青霉素/链霉素硫酸盐的无血清L-15培养液进行稀释，其中钾青霉素/链霉素硫酸盐用量:每100mlL-15培养基中青霉素和链霉素各100i.u；
C.将所述巨噬细胞悬液转入细胞培养板或细胞瓶，无血清L-15培养液中25℃培养2h；
D.待头肾巨噬细胞贴壁后，吸弃无血清L-15培养液，加入含10％小牛血清、含钾青霉素/链霉素硫酸盐的L-15培养液，继续培养。
为了减少红细胞对实验结果的干扰，在进行步骤a之前，可用针筒对所述鲳鲹进行抽血,抽血体积为15-30mL血/Kg鲳鲹体重。
所述Percoll梯度离心管可按照下面步骤制备：
i.用10×HBSS和灭菌双蒸水稀释Percoll溶液至34％浓度的34％Percoll；
ii.用10×HBSS和灭菌双蒸水稀释Percoll溶液至51％浓度的51％Percoll；将51％Percoll加入0.01g/L酚红，或将34％Percoll加入0.01g/L酚红；
iii.取离心管，加入34％Percoll；
iv.用吸管将51％Percoll缓慢注入所述离心管的34％Percoll的底部；
其中，所述34％Percoll溶液和所述51％Percoll溶液的体积百分比范围分别为35-65％和35-65％。
可选地，为了鲳鲹巨噬细胞的保藏，步骤h所获得的所述鲳鲹巨噬细胞进行如下步骤的培养：
A.用L-15培养基重悬所述鲳鲹巨噬细胞沉淀形成巨噬细胞悬液后用血球计数板，显微镜观察，计数所述鲳鲹巨噬细胞；
B.根据鲳鲹巨噬细胞计数结果用L-15培养基调整所述鲳鲹巨噬细胞浓度为1×107细胞/ml，用含钾青霉素/链霉素硫酸盐的无血清L-15培养液进行稀释，其中钾青霉素/链霉素硫酸盐用量:每100mlL-15培养基中青霉素和链霉素各100i.u；
C.将所述巨噬细胞悬液转入细胞培养板或细胞瓶，无血清L-15培养液中25℃培养2h；
D.待头所述肾巨噬细胞贴壁后，吸弃无血清L-15培养液，加入含10％小牛血清、含钾青霉素/链霉素硫酸盐的L-15培养液，继续培养。
本发明还提供了上述用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法在检测鲳鲹巨噬细胞浓度或数量中的应用。
本发明还提供了上述用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法在研究鲳鲹巨噬细胞与微生物细胞相互作用中的应用。
本申请的方法至少还适用于对布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)等其他鲳鲹属(Trachinotus)鱼类吞噬微生物等方面的表征。
本发明通过观察卵形鲳鯵头肾的巨噬细胞对鰤鱼诺卡氏菌的吞噬情况来探讨其吞噬作用。为卵形鲳鲹对鰤鱼诺卡氏菌等微生物的致病机理方面的研究打下基础，为今后鰤鱼诺卡氏菌等细菌致病因子基因在巨噬细胞内的功能研究奠定基础。
附图说明
图1示出了卵形鲳鲹头肾巨噬细胞离心分离效果。
图2示出了获取头肾前对卵形鲳鲹抽血的预处理对卵形鲳鲹头肾巨噬细胞分离效果的影响的图像。
图3示出了本发明方法对卵形鲳鲹头肾巨噬细胞存活情况的图像。
图4示出了卵形鲳鲹头肾巨噬细胞一周的存活情况的曲线图。
图5示出了卵形鲳鲹头肾巨噬细胞染色情况的图像。
图6示出了卵形鲳鲹头肾巨噬细胞吞噬酵母情况的图像。
图7示出了卵形鲳鲹头肾巨噬细胞吞鰤鱼诺卡氏菌情况的图像。
图8示出了卵形鲳鲹头肾巨噬细胞吞海豚链球菌情况的图像。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的各个实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。
1.实验材料
1.1 实验鱼
卵形鲳鲹，俗称金鲳鱼。体呈鲳形，高而侧扁；体长为体高1.7-1.9倍，为头长3.8倍。尾柄短细，侧扁。头小，高小于长。枕骨嵴明显。头长为吻长4.4-4.9倍，为眼径4.9-5.4倍。吻钝，前端几呈截形。体质量250g-500g，体长15cm-20cm。
2.2 菌株
广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室于2005年3月在广东省湛江港和阳江闸坡海水网箱养殖场，对患结节病卵形鲳鲹体内分离获得一株鰤鱼诺卡氏菌野生毒株ZJ0503，并将其保存于-80℃冰箱。
休眠的酵母菌为安琪酵母干粉产品。
海豚链球菌为广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室分离并保存。
2.3 试剂
leibovitz-15(L15)、卵形鲳鲹的鱼血清、小牛血清、青霉素/链霉素(P/S)双抗、肝素、Percoll、汉克斯缓冲盐溶液(×10)(HBSS)、酚红、无菌蒸馏水灭菌蒸馏水、迪夫快速染色液、无水乙醇、70％甲醇、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、氯化钠、Tween 20、柠檬酸、结晶紫、甲醇、DMSO、KOH、NBT(nitroblue tetrazolium硝基蓝四氮唑)、PMA((Phorbol-12-myristate-13-acetate，佛波酯)、台盼蓝染色液。
1.4 缓冲液
1.4.1 裂解缓冲液
0.1M柠檬酸，1％Tween 20，0.05％(重量/体积比)结晶紫。
1.4.2 磷酸盐缓冲液(PBS)
0.02M磷酸盐，0.15M氯化钠，用浓盐酸调节pH至7.2。
NaH2PO4.2H2O 0.876g/L
Na2HPO4.2H2O 2.56g/L
NaCl 8.77g/L
1.4.3 34％/51％Percoll
10ml的51％Percoll制备：5.1ml Percoll+1ml 10×HBSS+3.9ml蒸馏水；
10ml 34％Percoll制备：3.4ml Percoll+1ml 10×HBSS+5.6ml蒸馏水；
酚红(0.01g/L)作为颜色指示剂加入其中一个浓度的Percoll溶液中，另一个浓度不加酚红。
1.5 试剂制备
1.5.1 1mg/ml NBT
将10mg NBT(nitroblue tetrazolium硝基蓝四氮唑)溶于10ml1×HBSS中(用前取1ml 10×HBSS加入到9ml去离子水中)。
1.5.2 1mg/ml PMA
将1mg PMA溶于1ml无水乙醇，分装到200ul PCR管中，每管10ul，共100管，保存到-20℃冰箱。
1.5.3 NBT/PMA(1mg/ml NBT含终浓度1ug/ml PMA)
将10ul 1mg/ml PMA储备液加入到10ml 1mg/ml NBT溶液中，需要按照实验需要体积配置(现配现用，用前将PMA加入NBT，注意避光)。
1.5.4 KOH(2mol/L)
称取5.6g KOH溶于50ml去离子水。
1.6 器材
灭菌离心管、自动移液器、无菌枪头、一次性无菌吸管(移液管)、尼龙或不锈钢细胞筛(100目)、培养皿(9厘米)、镊子、手术刀片和手柄、注射器(2毫升)、注射器5毫升)、冷冻离心机、含透明区域的磨砂载玻片、蜡笔(或巴氏抹片笔)、显微镜盖玻片、自动移液器、无菌枪头、冷冻离心机、培养皿、血细胞计数器、细胞培养板。
1.7 仪器设备
低温超速离心机、电子天平、细胞培养箱、超净工作台、高温灭菌锅、低温冰箱、烘箱、超纯水器、制冰机、光学显微镜、荧光显微镜、酶标仪、冰箱。
2 实验方法
2.1 实验方法1：卵形鲳鲹预处理实验
卵形鲳鲹巨噬细胞的分离实验前，用一次性针筒对卵形鲳鲹进行抽血,尽量将鱼体内的血抽尽。抽血体积为15-30mL血/Kg卵形鲳鲹体重。
抽血有助于减少巨噬细胞中红细胞的掺杂量，特别地在进行细菌吞噬实验中，减少潜在的杂细胞干扰。保留鱼血清，可以用于进行细菌吞噬实验。
抽血后，把注射器针头去掉后，将鱼血从注射器中转入灭菌离心管，4℃放置2－4小时，3000-4000rpm离心10min，将上清吸出移新的至灭菌离心管，-20℃保存。
2.2 实验方法2：Percoll梯度离心管的制备实验
用10×HBSS和灭菌双蒸水稀释Percoll溶液至34％和51％浓度，其中一个浓度加入酚红(0.01g/L)作为颜色指示剂，另一个浓度不加酚红。更具体地：
10ml的51％Percoll制备：5.1ml Percoll+1ml 10×HBSS+3.9ml蒸馏水；
10ml 34％Percoll制备：3.4ml Percoll+1ml 10×HBSS+5.6ml蒸馏水；
取1.5ml离心管制备Percoll梯度离心管，加入34％Percoll。
将51％Percoll加入0.01g/L酚红作为颜色指示剂。
再用移液枪或用一次性吸管吸取含有酚红的51％Percoll，小心地插到离心底部(34％Percoll的下层)缓慢释放含有酚红的51％Percoll，形成有颜色差异的Percoll梯度(如图1a所示)。
注意不要在这个步骤引入气泡。34％Percoll溶液和51％Percoll溶液的加入体积与离心管大小及所需分离的巨噬细胞悬液的多少相关。34％Percoll溶液和51％Percoll溶液的体积百分比范围分别为35-65％和35-65％。
离心管根据需要可选择1.5ml至50ml或其他容积的离心管。
也可选择将0.01g/L酚红加入34％Percoll，而51％Percoll不加酚红。
2.3 实验方法3：卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的分离实验
卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的分离步骤如下：
a.在超净工作台内冰上解剖卵形鲳鲹，用无菌手术刀片切开胸腔，用无菌镊子取出头肾。
小心处理，避免破坏动物的内脏，以减少其他细胞对巨噬细胞的污染。
b.将头肾放置在一个无菌的100目细胞筛上，网下放置一个装含有20i.u./ml肝素的装有5ml L-15培养基的培养皿。
该处细胞筛可以换为尼龙网。
c.将培养皿放置冰块上，轻轻在细胞筛的网格上摩擦头肾，使头肾细胞落入含L-15的培养皿中形成细胞悬液。
为了提高产量，可用5-10毫升培养液进一步冲洗细胞筛，将冲洗产物混合入细胞悬液。
d.仔细的将细胞悬液贴壁轻柔的转移到Percoll梯度离心管的34％Percoll层(如图1b所示)。
e.小心移动加样完毕的离心管，于4℃，400g，离心25分钟。
为避免造成细胞破碎，需调小离心机的升速速率为4；为了避免破坏离心后已经形成的头肾细胞分离层，需将离心机的减速速率调小为1。
升速速率是指离心机的离心速度从0升至目标离心转速(这里是400g)的速率，数值大则速度增加的快、最大值为10。减速速率反之，当离心机从高速降到0时，需要非常慢，才能不破坏已经形成的头肾细胞离心层，便于后续的吸取细胞。
f.用无菌吸管小心吸取并弃去上层34％Percoll液体，再用无菌吸管吸取临近34％Percoll/51％Percoll界面处细胞悬液层，即得到鲳鲹头肾巨噬细胞。
离心后仔细观察，在34％Percoll/51％Percoll界面附近，会有一层细胞带，这里是富含巨噬细胞的一层(如图1c所示)。快到巨噬细胞层时，可以换一根新的无菌吸管，收集这部分的细胞至新离心管中，减少其他细胞的污染。
g.加入1ml L-15到细胞悬液，然后4℃，2000rpm离心7min，弃上清。
h.取沉淀加入1ml灭菌双蒸水轻柔冲洗细胞15-30s，4℃，2000rpm离心7min，弃上清。
可选使用双蒸水来使血红细胞破裂。观察细胞沉淀，如有较多血红细胞，则通过水的低渗作用使血红细胞破裂从而提高巨噬细胞纯度，减少红细胞对后续使用的结果的干扰。
i.用1ml L-15培养基重悬细胞后用台盼蓝溶液染色，用血球计数板计数细胞。
该步骤为可选步骤，根据是否需要定量表征而确定。
2.4 实验方法4：卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的培养实验
a.用1毫升L-15培养基重悬细胞沉淀后用血球计数板，计数细胞。活力计数用台盼蓝溶液染色后再计数，显微镜观察。
b.根据计数结果用L-15培养基调整细胞浓度为1×107细胞/ml，用含钾青霉素/链霉素硫酸盐(pen/strep)的无血清L-15培养液进行稀释。其中，双抗pen/strep用量:每100mlL-15培养基中青霉素和链霉素各100i.u。
c.将巨噬细胞悬液转入细胞培养板或细胞瓶，无血清L-15培养液中25℃培养2h。
实验表明，卵形鲳鲹头肾细胞从体内分离出来，在体外培养的最初2h，细胞培养液中如果含小牛血清(FCS)，会抑制卵形鲳鲹头肾巨噬细胞贴壁生长。实验过程如下：取步骤b中卵形鲳鲹头肾细胞悬液(1×107细胞/ml)各400μl，分别加样在24孔细胞培养板的6个孔中，其中3个孔加入小牛血清至终浓度为10％(v/v),其余3个孔不加血清。25℃培养2h后，吸弃培养液，用1×HBSS冲洗细胞1-2次后，用100μl/孔胰酶消化细胞，加入300μl/孔L-15培养液制成细胞悬液，用血球计数板计数。发现无血清培养组的贴壁细胞数为5.76±0.57×106细胞/ml，而含10％FCS培养组的贴壁细胞数为2.92±0.39×106细胞/ml。因此分离后在不含血清培养基中培养2h，有利于卵形鲳鲹头肾细胞贴壁，同时通过洗涤去除非贴壁的细胞，可以进一步提高头肾细胞的纯度。
d.待头肾巨噬细胞贴壁后，吸弃无血清L-15培养液，加入含10％FCS、含钾青霉素/链霉素硫酸盐的L-15培养液，继续培养。
2.5 实验方法5：卵形鲳鲹巨噬细胞吞噬细菌实验
a.细菌悬液的准备：酵母干粉按0.5％(w/v)溶解于含20％(v/v)卵形鲳鲹血清或小牛血清的L-15，使用前新鲜配置；
含20％(v/v)卵形鲳鲹血清的L-15制备鰤鱼诺卡氏菌悬液，浓度为1×107cfu/ml，在20℃，孵育30分钟；用PBS洗菌2次(3000rpm，10min)；用含5％(v/v)卵形鲳鲹血清的L-15将细菌调整到2×107cfu。
b.准备单层贴壁巨噬细胞：使用显微镜载玻片，用无水乙醇洗涤载玻片，并用蜡笔在干净的区域上画圈，直径约1.5cm。
蜡能阻止液体溢出，将细胞悬液限定在圈内的圆形区域。
一块玻片上可画2个圈，可一共准备多块玻片、多个蜡圈，以进行样品平行试验和/或对照试验。
c.将巨噬细胞悬液滴加在蜡圈内的圆形区域，巨噬细胞悬液的用量为50μL，细胞浓度2×106cells/ml。
d.将载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中并加盖，25℃培养1-2小时。
湿润滤纸用于保持湿度。
e.巨噬细胞孵育完毕后，用25℃左右的L-15洗涤去除非贴壁细胞。
实验过程中巨噬细胞所处的温度要保持在25℃左右，过高的温度会使细胞失去活性，过冷则会导致已贴壁细胞的脱离。
f.将准备好的酵母菌悬液和鰤鱼诺卡氏菌悬液分组分别加入e中准备好的巨噬细胞已贴壁的圆形区域内，以巨噬细胞：微生物细胞为1:10的比例，每个圆形区域使用50μl微生物细胞悬液，以添加5％鱼血清的L-15(v/v)作为阴性对照组。
g.将载玻片放铺有湿润滤纸的加盖培养皿中，25℃培养60min，让巨噬细胞吞噬作用发生。
h.用磷酸盐缓冲液(PBS)或L-15洗5次，除去未被吞噬的细菌。
i.用100μl 100％甲醇固定5min，用70％甲醇冲洗5次。
j.用迪夫快速染色液染色后，空气干燥，滴加封片剂后用盖玻片封片。
k.油镜下观察，随机选择100-200个巨噬细胞计数吞噬细菌的情况。
3.实验
3.1 实验1：鲳鲹头肾巨噬细胞分离实验
图1为鲳鲹头肾巨噬细胞分离效果图，其中a为通过实验方法2制备的Percoll梯度离心管，其中上层透明液体为34％Percoll，下层红色液体为51％Percoll；b和c显示了通过实验方法2的鲳鲹头肾巨噬细胞分离过程和结果情况，其中b显示了将巨噬细胞转移到Percoll梯度离心管中34％/51％Percoll梯度buffer的上层；c显示了离心后的结果，箭头所指是离心后位于Percoll梯度离心管中34％/51％Percoll梯度界面的巨噬细胞。
从上图可见看到，通过本申请的实验方法，可以有效地使目的产物鲳鲹头肾巨噬细胞聚集到34％/51％Percoll梯度界面，且肉眼可见聚集的鲹头肾巨噬。因此，本发明的方法可以有效地提取鲳鲹头肾巨噬细胞。
3.2 实验2：抽血对卵形鲳鲹头肾巨噬细胞分离的影响
在进行卵形鲳鲹头肾巨噬细胞分离前，对鱼体进行抽血，会大幅减少分离细胞中夹杂的血红细胞数量。结合实验方法1、2、3，所得分离细胞培养于24孔细胞培养板中，并在Leica显微镜下观察血红细胞数量并拍照，以进行抽血对卵形鲳鲹头肾巨噬细胞分离的影响的验证性实验，结果如图2所示。
图a为结合实验方法2、3，即未抽血，直接进行头肾巨噬细胞分离所得的细胞悬液的显微图像，其中含有大量的呈椭圆形的血红细胞(如箭头所示)；图b结合实验方法1、2、3的实验结果，为先抽血，然后在进行巨噬细胞分离所得到的细胞悬液，其中所含的血红细胞数量大幅减少。
由此可见，实验方法1所述的卵形鲳鲹预处理后卵形鲳鲹巨噬细胞纯度更高，减少血细胞的干扰，更有利于鲳鲹巨噬细胞的纯化、活性测定与表征。
3.3 实验3：卵形鲳鲹头肾巨噬细胞一周的存活情况实验
使用实验方法3所分离到的卵形鲳鲹头肾巨噬细胞，根据实验方法4的步骤，将分离到的卵形鲳鲹头肾巨噬细胞在含10％FCS、钾青霉素/链霉素硫酸盐的L-15培养液中，于24孔细胞培养板内25℃贴壁培养一周，每天取3个孔的头肾巨噬细胞，经胰酶消化后，加入L-15培养液制成细胞悬液，细胞悬液经台盼蓝染色液(终浓度0.2％)后，取10μl染色后的细胞悬液滴加在血球计数板上进行活细胞计数，染色后3分钟内完成计数。结果参见图3和图4。
根据活细胞不会被台盼蓝染色、而死细胞会被台盼蓝染成蓝色来判断细胞的存活状态。如图3所示，其中1-7分别为培养第1-7天的卵形鲳鲹巨噬细胞存活情况。8和9分别为活细胞和死细胞在台盼蓝染色下的染色情况示意图，活细胞透明，而死细胞被染为蓝色。在光镜下可以发现染成蓝色的细胞随培养天数的增加而增多。
这说明通过本实验的方法，能够检测到卵形鲳鲹头肾巨噬细胞随着培养时间的延长，成活率在下降。
通过更大视野中统计存活与死亡的细胞，计数分析结果表明卵形鲳鲹巨噬细胞的存活率在培养后第1天急剧下降至约50％，之后呈现缓慢下降的趋势，到第7天存活率为10-20％，卵形鲳鲹头肾巨噬细胞存活率随时间变化情况如图3所示。
活细胞不会被台盼蓝染色，而第一天存活率为百分之百，也说明本发明的方法分离培养的卵形鲳鲹头肾巨噬细胞纯度很高。
两条鱼分离出的卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的存活曲线极其接近，这也说明本发明的方法的可重复性较好。
3.4 实验4：卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的吞噬实验
实验方法3所获得的卵形鲳鲹巨噬细胞，涂抹载玻片，在100×的油镜下，可观察到卵形鲳鲹巨噬细胞呈椭圆形，形状不一，被染成偏紫红色，其平均长度在5μm左右，如图5所示。
而被巨噬细胞吸附或吞噬的酵母菌和鰤鱼诺卡氏菌则被染成较深的蓝色(如图6、图7所示)。
图6显示了按照实验方法5所示的卵形鲳鲹巨噬细胞吞噬酵母情况的结果，其中1为酵母吸附在巨噬细胞上，但未被吞噬进巨噬细胞；2为巨噬细胞吞噬1个酵母；3和4为巨噬细胞吞噬了两个酵母进细胞内；5和6分别为巨噬细胞吞噬3个酵母和4个酵母的情况，7-9为较大视野下观察巨噬细胞吞噬酵母的情况,图中展示了多个染色偏紫红色的巨噬细胞，深蓝色呈椭圆形的是酵母，图中的巨噬细胞有的吞噬了1-2个酵母，有的尚未发生吞噬作用。
由图6可看出，酵母菌的体积比较大，其直径约为3μm，其体积差不多为卵形鲳鲹巨噬细胞的大小的1/4。因此每个巨噬细胞能吞噬的酵母菌个数并不多，大多数的巨噬细胞只能吞噬1-2个酵母菌，偶尔可看到吞噬3个及以上个数的酵母菌的巨噬细胞，而且从显微镜下可看出吞噬超过3个酵母菌的巨噬细胞常被撑破，造成细胞形态不完整。
图7显示了按照实验方法5所示的卵形鲳鲹巨噬细胞吞噬鰤鱼诺卡氏细菌情况的结果，其中1为2个鰤鱼诺卡氏细菌吸附在卵形鲳鲹的巨噬细胞表面，但未被吞噬的情况；2和3都为巨噬细胞吞噬1个鰤鱼诺卡氏细菌的情况；4和5分别为巨噬细胞吞噬2个和3个鰤鱼诺卡氏细菌的情况；6和7为巨噬细胞吞噬了4个鰤鱼诺卡氏细菌的情况；8则为巨噬细胞吞噬了6个鰤鱼诺卡氏细菌的情况；9-10为较大视野下观察的巨噬细胞吞噬了鰤鱼诺卡氏细菌的情况，图中展示了多个巨噬细胞，深蓝色呈点状的是鰤鱼诺卡氏菌，图中的多个巨噬细胞发生了吞噬作用，巨噬细胞内有数量不等的鰤鱼诺卡氏菌。
由图7可看出，尽管大多数的卵形鲳鲹巨噬细胞吞噬了1-2个鰤鱼诺卡氏菌，但由于诺鰤鱼卡氏细菌体积相对较小，因而一个卵形鲳鲹的巨噬细胞吞噬3个及以上鰤鱼诺卡氏细菌的情况增多，观察到的最多的能吞噬6个鰤鱼诺卡氏细菌。在视野中还能看到许多尚未被吞噬，但是已经被吸附在巨噬细胞表面的鰤鱼诺卡氏菌。
对鰤鱼诺卡氏细菌与酵母吞噬的载玻片的结果，各自随机选取100个巨噬细胞进行统计(如表1、表2所示)，根据吞噬指数和吞噬容量的公式进行计算：
吞噬指数(Phagocytic Index，PI)＝吞噬的细菌总数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬容量(Phagocytic Capacity，PC)＝吞噬的细菌总数/发生吞噬的巨噬细胞数×100
结果表明(如表3所示)，卵形鲳鲹巨噬细胞对酵母的吞噬指数(PI)为60，对鰤鱼诺卡氏菌的吞噬指数为86，即在相同的条件下，相同数目的卵形鲳鲹巨噬细胞，吞噬鰤鱼诺卡氏细菌的数目比吞噬酵母的数目多。同样，卵形鲳鲹巨噬细胞对酵母的吞噬容量(PC)为153，对鰤鱼诺卡氏菌的吞噬容量为183，即卵形鲳鲹巨噬细胞对鰤鱼诺卡氏菌的吞噬容量比酵母高。
表1.酵母被卵形鲳鲹巨噬细胞吞噬的情况
表2 鰤鱼诺卡氏菌被卵形鲳鲹巨噬细胞吞噬的情况
表3.卵形鲳鲹巨噬细胞吞噬鰤鱼诺卡氏细菌和酵母的比较
3.5 实验5：卵形鲳鲹头肾巨噬细胞的吞噬实验
海豚链球菌为链球属细菌，无芽胞，无鞭毛，革兰氏染色阳性，是兼性胞内菌，可感染卵形鲳鲹。卵形鲳鲹头肾巨噬细胞也可用于海豚链球菌的吞噬、吸附研究。实验过程中，取海豚链球菌培养物，离心收集菌体、并用PBS清洗菌沉淀后，用含20％(v/v)卵形鲳鲹血清的L-15制备海豚链球菌悬液，浓度为1×107cfu/ml。其他实验方法同2.5实验方法5。
图8示出了卵形鲳鲹头肾巨噬细胞海豚链球菌情况的图像。由图可见海豚链球菌呈球形或卵圆形，直径0.6-1.0μm，呈链状排列，短者4-8个细菌组成，长者有20-30个细菌组成。图中所示呈链状的海豚链球菌有些紧贴在巨噬细胞上，说明海豚链球菌可被卵形鲳鲹头肾巨噬细胞有效吸附；有些链状海豚链球菌的一部分已经被吞噬进入巨噬细胞内。实验证明海豚链球菌可被分离所得卵形鲳鲹头肾巨噬细胞有效吸附及吞噬。因此可用于海豚链球菌逃避巨噬细胞杀灭并在胞内生存机制的研究，也可用于比较不同菌株的特征差异，如比较特定缺失株与野生株，在巨噬细胞吸附、吞噬、吞噬后菌细胞存活率等方面的研究。
从实验结果可以看出，本发明中用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法可以有效地表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的细节，这对进一步研究鲳鲹巨噬细胞杀伤病原菌的机制、胞内菌逃避巨噬细胞杀灭并在胞内生存的机制等奠定基础。对从细胞水平研究鲳鲹的抗病、致病机理具有重要意义。
以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物是通过下面步骤进行的：
1).用无水乙醇洗涤显微镜载玻片，并用蜡笔在所述显微镜的干净的区域上圈画圆形区域，所述圆形区域的直径为1.5cm；
2).将鲳鲹巨噬细胞悬液滴加在所述圆形区域，所述鲳鯵巨噬细胞悬液的用量为50μl，所述鲳鲹巨噬细胞浓度为2×106细胞/ml；
3).将所述载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中并加盖，25℃条件下培养1-2小时；
4).所述鲳鲹巨噬细胞孵育完毕后，用25℃左右的L-15洗涤所述载玻片；
5).将50μl微生物细胞悬液加入所述圆形区域，巨噬细胞：微生物细胞为1:10的比例；
6).将所述载玻片放铺有湿润滤纸的加盖培养皿中，25℃培养60min；
7).用磷酸盐缓冲液或L-15洗所述载玻片5次；
8).用100μl 100％甲醇固定所述载玻片上的所有细胞5min，用70％甲醇冲洗所述载玻片5次；
9).用迪夫快速染色液染色所述载玻片后，空气干燥，滴加封片剂后用盖玻片封片；
10).用油镜观察计数所述鲳鲹巨噬细胞吞噬所述微生物细胞的情况；
其中，所述鲳鲹巨噬细胞是按照下面的步骤制备的：
a.解剖鲳鲹，取出头肾；
b.将所述头肾放置在一个无菌的100目细胞筛上，该细胞筛下放置一个装含有20i.u./ml肝素的装有5ml L-15培养基的培养皿；
c.将所述培养皿放置冰块上，在所述细胞筛的网格上摩擦所述头肾，使所述头肾细胞落入所述含L-15的培养皿中形成鲳鯵细胞悬液；
d.将细胞悬液贴壁轻柔的转移到Percoll梯度离心管的34％Percoll层之上；
e.移动加样完毕的所述Percoll梯度离心管，于4℃，400g，离心25分钟；
f.用无菌吸管小心吸取并弃去所述Percoll梯度离心管的上层34％Percoll液体，再用无菌吸管吸取临近34％Percoll/51％Percoll界面处的细胞悬液层，即得到鲳鲹头肾巨噬细胞；
g.加入1ml L-15到所述鲳鲹头肾巨噬细胞悬液，然后在4℃，2000rpm条件下离心7min，弃上清；
h.取沉淀加入1ml灭菌双蒸水冲洗所述鲳鲹头肾巨噬细胞15-30s，4℃，2000rpm离心7min，弃上清；
步骤h所获得的所述鲳鲹巨噬细胞进行如下步骤的培养：
A.用L-15培养基重悬所述鲳鲹巨噬细胞沉淀形成巨噬细胞悬液后用血球计数板，显微镜观察，计数所述鲳鲹巨噬细胞；
B.根据鲳鲹巨噬细胞计数结果用L-15培养基调整所述鲳鲹巨噬细胞浓度为1×107细胞/ml，用含钾青霉素/链霉素硫酸盐的无血清L-15培养液进行稀释，其中钾青霉素/链霉素硫酸盐用量:每100ml L-15培养基中青霉素和链霉素各100i.u；
C.将所述巨噬细胞悬液转入细胞培养板或细胞瓶，无血清L-15培养液中25℃培养2h；
D.待头所述肾巨噬细胞贴壁后，吸弃无血清L-15培养液，加入含10％小牛血清、含钾青霉素/链霉素硫酸盐的L-15培养液，继续培养。
2.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，
所述微生物细胞为鰤鱼诺卡氏菌细胞，步骤5)中用含20％(v/v)鲳鲹血清的L-15制备鰤鱼诺卡氏菌悬液，浓度为1×107cfu/ml，在20℃，孵育30分钟；用PBS洗菌2次，3000rpm，10min；用含5％(v/v)卵形鲳鲹血清的L-15将所述鰤鱼诺卡氏菌悬液浓度调整到2×107cfu/ml。
3.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，
所述微生物细胞为酵母菌细胞，步骤5)中酵母悬液的制备方法为：酵母干粉按0.5％(w/v)溶解于含20％(v/v)卵形鲳鲹血清或小牛血清的L-15。
4.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，
在进行步骤h后，用1ml-15培养基重悬所述鲳鲹头肾巨噬细胞，用台盼蓝溶液染色，用血球计数板计数细胞。
5.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，
在进行步骤a之前，用针筒对所述鲳鲹进行抽血,抽血体积为15-30mL血/Kg鲳鲹体重。
6.如权利要求1所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法，其特征在于，所述Percoll梯度离心管是按照下面步骤制备的：
i.用10×HBSS和灭菌双蒸水稀释Percoll溶液至34％浓度的34％Percoll；
ii.用10×HBSS和灭菌双蒸水稀释Percoll溶液至51％浓度的51％Percoll；将51％Percoll加入0.01g/L酚红，或将34％Percoll加入0.01g/L酚红；
iii.取离心管，加入34％Percoll；
iv.用吸管将51％Percoll缓慢注入所述离心管的34％percoll的底部；
其中，所述34％Percoll溶液和所述51％Percoll溶液的体积百分比范围分别为35-65％和35-65％。
7.如权利要求1-6中任一项所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法在检测鲳鲹巨噬细胞浓度或数量中的应用。
8.如权利要求1-6中任一项所述的用于表征鲳鲹巨噬细胞吞噬微生物的方法在研究鲳鲹巨噬细胞与微生物细胞相互作用中的应用。
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