CN107621553B - 一种微生物放大成像检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术和快速检测领域，具体的说是一种基于纳米探针多层包裹的微生物放大成像检测方法。向待检测样品中加入与样品中微生物细胞识别的物质，其在微生物细胞表面组装吸附至少一层包裹层，使其形成聚沉颗粒，再通过对聚沉颗粒的识别统计，实现对微生物细胞的直接绝对计数。相较于传统涂布培养检测方法，本发明方法无需依赖于长时间的宏观培养和复杂的生化反应，大大降低了检测计数时间，另外，微生物样品无需染色、荧光等标记方法，因此摆脱了对高分辨率或荧光成像设备的要求，实现了现场快速微生物检测。

Description

一种微生物放大成像检测方法

技术领域

本发明属于生物技术和快速检测领域，具体的说是一种基于纳米探针多层包裹的微生物放大成像检测方法。

背景技术

长期以来，微生物的分析方法大多是建立在样品涂布培养的基础之上，通过微生物在特定培养基上的生长，菌落的形态学特征和辅助一系列生化鉴别反应结果来对微生物进行识别分析。但受制于微生物的增殖周期，常规微生物定量指标通常需要1-2天时间才能得出结果，培养和分析周期长，并且难于自动化，很大程度上依赖检测人员经验，这一系列的问题长期存在且一直困扰着相关领域的研究和从业人员，没有得到很好的解决。

近年来随着分子生物学技术和其他相关技术的发展，大量基于分子水平的微生物检测技术不断涌现，其中包括免疫方法，核酸扩增方法等。这些方法都在一定程度得到应用，部分方法已经不需要繁琐的微生物培养过程，实现了微生物的快检，但这些方法均依赖于特定的分子生化反应过程，如核酸扩增需设计识别不同微生物基因的引物对，在通用性上受到很大的限制，而且难以消除灭菌残留分子(如核酸)对检测结果的影响，假阳性率比较高。

如果能直接对样本中的微生物细胞进行单细胞水平的直接识别计数，则无需依赖于长时间的宏观培养和复杂的生化反应，一方面可以缩短检测时间，同时还可降低间接检测方法中由于复杂生化过程带来的检测误差。因此，实现单细胞水平的直接识别计数能有效解决目前微生物快检的困局。

纳米探针技术如免疫胶体金技术在实际样品检测中已经得到广泛应用，具有灵敏度高、成本低、操作简单等优点，为微生物的检测提供了新的思路。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足之处，本发明目的在于提供一种基于纳米探针多层包裹的微生物放大成像检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种微生物放大成像检测方法，向待检测样品中加入与样品中微生物细胞识别的物质，其在微生物细胞表面组装吸附至少一层包裹层，使其形成聚沉颗粒，再通过对聚沉颗粒的识别统计，实现对微生物细胞的直接绝对计数。

所述与微生物细胞识别的物质为具有亲和力的纳米颗粒溶胶(探针一)，其实现在微生物细胞表面的组装吸附，形成细胞-纳米颗粒复合放大结构。

所述形成细胞-纳米颗粒复合放大结构表面再吸附与放大结构中纳米颗粒能够亲和结合的修饰层(探针二)，进而实现层层吸附成放大可见的聚沉颗粒。

通过对所述沉淀颗粒数目的统计，计算出样品中所含微生物细胞的含量。

所述具有亲和力的纳米颗粒溶胶为以纳米金、纳米银、石墨烯、碳纳米管、二氧化硅微球纳米颗粒或聚吡咯微球作为支撑体，再包裹修饰保护剂；其中，包裹修饰保护剂为静电作用物质或免疫结合物。

所述静电作用物质为带有正电荷或负电荷的高分子或小分子物质；其中，正电荷高分子物质为聚乙烯亚胺或聚二烯丙基二甲基氯化铵，负电荷高分子物质为聚苯乙烯磺酸钠，负电荷小分子物质为柠檬酸钠；免疫结合物为具有特异性识别作用的生物分子，如抗体、适配体。

所述具有亲和力的纳米颗粒溶胶，包括表面正电荷的聚二烯丙基二甲基氯化铵包裹的聚吡咯颗粒，表面正电荷的聚乙烯亚胺包裹的金颗粒，表面负电荷的柠檬酸钠还原的金颗粒。

进一步的说：

纳米探针一制备：利用单分散性优良的纳米金、纳米银、石墨烯、碳纳米管、二氧化硅微球等纳米颗粒作为探针支撑体，通过正电荷高分子作为保护剂包裹修饰，或者通过具有特异性识别功能的抗体蛋白、适配体、亲和素等修饰。纳米探针一可以通过静电作用或者免疫结合作用与微生物细胞结合。

纳米探针二制备：利用负电荷的小分子或高分子修饰纳米颗粒，如柠檬酸钠还原的胶体金或者聚苯乙烯磺酸钠修饰的石墨烯等，纳米探针二与纳米探针一具有结合作用。

依据纳米探针修饰方法的不同，所述发明可适用于样品中总体微生物数目的检测和特异性目标微生物，如通过静电修饰的纳米探针与大部分微生物细胞具有结合作用，可以应用于样品中总体微生物的检测；通过特异性免疫蛋白修饰的纳米探针，可以适用于具体单一微生物的检测。

微生物悬浮样品液和纳米探针一胶体混合均匀，使得在微生物细胞表面结合上一层致密的纳米颗粒，形成细胞-纳米颗粒复合结构，形成第一层放大。之后加入纳米探针二，纳米探针二与纳米探针一具有亲和力，因此在第一层放大结构基础上形成第二层放大。之后由于体系中同时存在两种纳米探针，在微生物细胞表面产生发生层层组装吸附，最终形成放大可见的聚沉颗粒。通过对沉淀颗粒的识别统计，实现了对微生物细胞的直接绝对计数。

本发明具有以下优点及有益效果：

1.本发明整个检测过程中无需微生物培养放大过程，相较于传统涂布培养方法，大大减少所需时间。

2.本发明所构建的系统和方法同时适用于便携式即时现场和实验室微生物检测。

3.本发明所构建的系统和方法适用于包括食品、药品、化妆保洁等产品、以及产品在线质量控制和产品安全的快速检测。

附图说明

图1为本发明检测原理示意图。

图2为本发明实施例1提供的液滴微生物检测微流控芯片示意图，该芯片结构可将样品中的细菌包裹在油包水液滴中，并在液滴中发生探针与细菌细胞的结合反应：其中，1、纳米颗粒-微生物细胞复合物入口；2、柠檬酸钠还原金颗粒入口；3、夹流生成部分；4、混合部分；5油相入口；6、液滴生成部分；7、储存观测室；8、废液口。

图3为本发明实施例1提供的纳米探针一(A)，及探针一与微生物细胞吸附后(B为探针一吸附后直接滴样照片，C为探针一吸附后离心富集滴样照片)的电子透射显微镜照片。

图4为本发明实施例1提供的液滴包裹微生物单细胞后，纳米探针多层包裹吸附后成像。

图5为本发明实施例2提供的在PDMS基片上大肠杆菌检测成像。

图6为本发明实施例3提供的微生物细胞探针包裹后的电子透射显微镜照片。

图7为本发明实施例3提供的在PDMS基片上大肠杆菌检测成像。

图8为本发明实施例4提供的在复杂微生物样本中针对大肠杆菌在PDMS基片上的特异性放大成像。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步描述。本发明相较于传统涂布培养检测方法，本方法无需依赖于传统的涂板培养和复杂的生化反应，大大降低了检测计数时间，另外，微生物样品无需染色、荧光等标记方法，因此摆脱了对高分辨率或荧光成像设备的要求，实现了现场快速微生物检测。

本发明制备出与微生物细胞具有亲和力的纳米颗粒作为识别探针。当纳米探针与微生物细胞混合时，纳米探针在微生物细胞表面发生吸附组装，进而多层包裹放大，形成纳米探针-微生物复合结构，最终结果形成低倍显微镜下明显可见的聚集沉淀颗粒。通过对沉淀颗粒的识别统计，实现了对微生物在单细胞水平上的直接绝对计数。相较于传统涂布培养检测方法，本发明方法无需依赖于长时间的宏观培养和复杂的生化反应，大大降低了检测计数时间，另外，微生物样品无需染色、荧光等标记方法，因此摆脱了对高分辨率或荧光成像设备的要求，实现了现场快速微生物检测。

本发明向待检测样品中加入与样品中微生物细胞识别的物质，其在微生物细胞表面组装吸附至少一层包裹层，使其形成聚沉颗粒，再通过对聚沉颗粒的识别统计，实现对微生物细胞的直接绝对计数。相较于传统涂布培养检测方法，本发明方法无需依赖于长时间的宏观培养和复杂的生化反应，大大降低了检测计数时间，另外，微生物样品无需染色、荧光等标记方法，因此摆脱了对高分辨率或荧光成像设备的要求，实现了现场快速微生物检测。

实施例1

基于纳米探针吸附和微流控芯片技术的微生物放大成像绝对定量技术，包括如下步骤：

(1)取分子量5万到10万的聚乙烯亚胺，溶于水配制成质量分数为3％的溶液。取所述1毫升配好的聚乙烯亚胺溶液与浓度为4mM的氯金酸溶液混合，室温下搅拌10-24小时，得到紫色金溶胶，作为纳米探针一。将纳米探针一溶胶与待检测微生物(大肠杆菌)细胞悬浮液混合搅拌均匀，得到连续相一。纳米探针一及与微生物细胞混合吸附结构透射显微镜照片如图3A所示。

(2)用传统方法获得柠檬酸钠还原制备胶体金，得到纳米探针二，作为连续相二。

(3)芯片(参见图2)由上下两层PDMS组成，上层包括宽15-100微米，深30-70um的微通道网络，下层为PDMS基片。上下两层基片超声清洗后，使用等离子体轰击进行键合。

(4)如图2所示，将连续相一与连续相二分别通过1、2入口注入芯片，调整各自流速，使其在交汇口3处生成稳定夹流。油相加入司盘80作为表面活性剂，通过入口5注入芯片。调节连续相、油相各自流速，使其在交汇口6处形成连续稳定的液滴。

同时，储存观测室内测到的大小与计数时显微镜视野相符，也就是在检测时物镜倍数下，观察室刚好填充整个视野。

液滴为油包水液滴，包含有纳米探针一、纳米探针二、微生物细胞，三种物质在液滴流动过程中不断发生混合吸附，最终形成显微镜下明显可见的聚沉颗粒结构，如图3C所示。

(5)液滴流入储存观察室，显微镜下通过判断液滴是否包裹有聚沉颗粒，判断微生物个数。如附图4所示，当液滴中存在微生物细胞时，通过纳米探针的识别吸附，形成显微镜下明显可见的聚沉颗粒，当液滴中不存在微生物细胞时，无现象放生。整个实验无需染色、荧光标记、放大培养，实现了对微生物的标记放大成像和定量检测。

(6)累计统计储存观察室的聚沉颗粒总数，所得结果与菌落统计数一致。根据芯片内样品进样体积与稀释倍数，换算得出样品中细菌细胞浓度。

实施例2

(1)在玻片上旋图PDMS基底层，置于70℃烘箱中1小时固化，等离子体轰击使其疏水表面变为亲水表面。将基片浸入质量分数为1％的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，室温下静置2到4小时。将基片取出，去离子水清洗表面。处理后的PDMS基底层表面结合上了聚二烯丙基二甲基氯化铵分子，带有正电荷性质，可用于捕获细菌细胞。

(2)将大肠杆菌悬浮液滴加在基片表面，静置15分钟，去离子水冲洗表面。

(3)采用上述实施例1制备纳米探针一和纳米探针二。将基片浸入纳米探针一溶胶中10分钟取出，去离子水冲洗表面，再浸入纳米探针二溶胶中10分钟取出，去离子水冲洗表面。重复以上步骤3次。

(4)显微镜下观察技术基片上形成的沉淀物颗粒数目，计算大肠杆菌细胞总数。如图5所示，在显微镜下成像，可明显观察到大肠杆菌细胞起的凝聚颗粒。

实施例3

(1)在玻片上旋图PDMS基底层，采用等离子体轰击使其疏水表面变为亲水表面。将基片浸入质量分数为1％的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液中，室温下静置2-4小时。将基片取出，去离子水清洗表面。

(2)将大肠杆菌悬浮液滴加在基片表面，静置15分钟，去离子水冲洗表面，此时基片表面吸附有微生物细胞。

(3)取3毫升质量分数为30％聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液，将其溶于200毫升二次水中，再加入1克六水合三氯化铁，搅拌一小时充分溶解，而后向获得的溶解液中再加入140微升吡咯单体，室温搅拌4-6小时，溶液变为黑色，所得溶液透析48小时，得到聚吡咯微球溶液探针一，将其与大肠杆菌样品液混合。所得聚吡咯微球与微生物细胞的复合结构如图6所示，证明吡咯纳米探针一对微生物细胞具有亲和作用。

(4)将上述吸附有微生物细胞的基片浸入聚吡咯探针一溶液中10分钟取出，去离子水冲洗表面，浸入聚苯乙烯磺酸钠溶液(探针二)中10分钟取出，去离子水冲洗表面。重复以上步骤3次。

(5)显微镜下观察技术基片上形成的沉淀物颗粒数目，计算大肠杆菌细胞总数。如附图7所示，在显微镜下成像，可明显观察到大肠杆菌细胞起的凝聚颗粒。

实施例4

类似于实施例2，用针对大肠杆菌的免疫抗体代替聚乙烯亚胺修饰纳米金颗粒，制备出只针对大肠杆菌特异识别的纳米探针，针对含有多种细菌的复杂样品中，大肠杆菌的特异检测：

(1)类似于实施例3，采取PDMS玻璃基片先固定样本中总菌。

(2)用2％碳酸钾溶液调节金溶胶溶液pH值至大肠杆菌抗体等电点附近。将100μL100μg/μL大肠杆菌抗体溶液加入到2毫升金溶胶中，震荡过夜。用超纯水离心洗涤，作为免疫探针于4℃冰箱中保存待用。

(3)将固定好总菌的基片浸泡于免疫探针溶液(探针一)中，使基片上的菌形成第一层包裹，之后将基片用超纯水洗涤，浸泡入盐酸羟胺(1％wt)与氯金酸(0.4mM)混合液中，在第一层包裹的基础上再次放大成像，实现在微生物混合样品中，实现对单一大肠杆菌的检测识别；如图8所示，该实例中以盐酸羟胺(1％wt)与氯金酸(0.4mM)混合液作为探针二的反应物，由于探针一对反应物有催化作用，由此可见其可以直接在探针一表面催化反应行成探针二的多层包裹。

Claims (2)

1.一种微生物放大成像检测方法，其特征在于：向待检测样品中加入与样品中微生物细胞识别的物质，其在微生物细胞表面组装吸附大于一层包裹层，使其形成聚沉颗粒，再通过对聚沉颗粒的识别统计，实现对微生物细胞的直接计数；

与微生物细胞识别的物质为具有亲和力的纳米颗粒溶胶，其实现在微生物细胞表面的组装吸附，形成细胞-纳米颗粒复合放大结构；

所述形成细胞-纳米颗粒复合放大结构表面再吸附与放大结构中纳米颗粒能够亲和结合的修饰层，进而实现层层吸附成放大可见的聚沉颗粒；

所述修饰层为利用负电荷的小分子或高分子修饰纳米颗粒；

所述具有亲和力的纳米颗粒溶胶为以纳米金、纳米银、石墨烯、碳纳米管、二氧化硅微球纳米颗粒或聚吡咯微球作为支撑体，再包裹修饰保护剂；其中，包裹修饰保护剂为静电作用物质或免疫结合物；

所述静电作用物质为带有正电荷或负电荷的高分子或小分子物质；其中，正电荷高分子物质为聚乙烯亚胺或聚二烯丙基二甲基氯化铵，负电荷高分子物质为聚苯乙烯磺酸钠，负电荷小分子物质为柠檬酸钠；免疫结合物为具有特异性识别作用的生物分子。

2.按权利要求1所述的微生物放大成像检测方法，其特征在于：通过对所述聚沉颗粒数目的统计，计算出样品中所含微生物细胞的浓度。

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