CN102175655B - 一种双模式光学成像探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双模式光学成像探针及其制备方法，该探针包括分散于水溶液中的纳米粒子，每个纳米粒子包括核体和包裹层，核体为金纳米或银纳米聚集体，包裹层为交替吸附的多层聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)，包裹层最外层为吸附有荧光材料的PDDA；其制备方法包括制备拉曼标记物诱导的金或银纳米聚集体，然后在其水溶液中加入PDDA水溶液、搅拌，再交替吸附PSS和PDDA数次，然后加入荧光材料与PDDA水溶液等步骤。本发明的双模式光学成像探针兼具表面增强拉曼信号和荧光信号，灵敏度高，易于实现光学探针的多功能，在药物靶向运输、生物传感及探测等领域具有重要的应用价值；其制备方法操作简单、可重复性好、成本低廉并且环境友好。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料学和生物分析化学领域，具体涉及一种双模式光学成像探针及其制备方法，该双模式光学成像探针集荧光和表面增强拉曼散射（SERS）信号于一体；该制备方法操作简单、可重复性好、成本低廉并且环境友好。
背景技术
光学成像技术能够直观显示生物活体内的基因表达和细胞活动，是分子及细胞影像技术中的强有力手段，正在被越来越广泛地应用于医学及生物学研究领域。与其他活体动物体内的成像技术，如超声（ultrasound）、计算机断层显像（computed tomography,CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）、正电子衍射成像（positron-emission tomography，PET）相比，光学成像具有许多独特的优点，如操作简便、结果直观、测量快速、灵敏度高及费用低廉等。目前该技术已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等领域。
各种活体成像技术中，荧光成像技术发展最快，并在生物传感、药物研发、肿瘤诊断治疗等领域中得到广泛应用。近年来，新型荧光成像材料的出现，大大提高了荧光成像的灵敏度和信噪比，促进了荧光成像的应用。比如，Lakadamyali等人在宽场显微镜下用pH敏感的荧光探针标记流感病毒，对病毒从细胞膜至细胞核的过程进行了跟踪，Rieder等人对活细胞有丝分裂进行了实时观察，在56分钟内记录了一个细胞分裂的全过程，为研究活细胞生命活动复杂过程提供了清晰的图像。尽管荧光成像技术已经广泛应用于生命科学领域并取得了显著的成果，但它仍然存在光漂白、发射谱宽等问题，制约了其在某些探测领域中的进一步应用。
在目前的各种光学成像技术中，新兴的表面增强拉曼散射（SERS）光谱成像由于结合了传统拉曼散射和等离子激元波增强的优势，在其诞生后的短短几年内就得到了飞速发展。SERS突破了传统拉曼散射存在的散射截面低而带来的瓶颈，避免了荧光光谱成像中存在的光漂白以及荧光标记的毒性等问题，是当前国际上备受瞩目的研究焦点，已成功地应用于材料分析、生物分子探测、蛋白质相互作用研究等领域。SERS成像技术由于具有可以避免荧光标记中的光漂白，降低对细胞的毒性，提供丰富的光谱信息等优势，成为人们研究的热点。尽管关于SERS探针的结构和制备方法已有大量报道，但能适用于生物活体的探针并不多，并且制备方法较为繁琐，灵敏度、稳定性和生物兼容性尚有待进一步提高。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明的第一目的为：提供一种双模式光学成像探针，该双模式光学成像探针集荧光和表面增强拉曼散射（SERS）信号于一体，灵敏度高，稳定性和生物兼容性好；本发明的第二目的为：提供一种该双模式光学成像探针的制备方法，该制备方法操作简单、可重复性好、成本低廉并且环境友好。
技术方案：为实现上述第一目的，本发明的双模式光学成像探针，包括分散于水溶液中的纳米粒子，每个纳米粒子包括核体和包裹层，所述核体为金纳米或银纳米聚集体，所述包裹层为交替吸附的多层聚二烯丙基二甲基氯化铵和聚苯乙烯磺酸钠，包裹层最外层为吸附有荧光材料的聚二烯丙基二甲基氯化铵；该双模式光学成像探针的制备方法包括以下步骤：
1）制备金纳米粒子溶液或银纳米粒子溶液，将拉曼标记物加入金纳米粒子溶液或银纳米粒子溶液，混合10～20分钟，形成拉曼标记物诱导的金纳米聚集体或银纳米聚集体；
2）在金纳米聚集体或银纳米聚集体的水溶液中加入2～4mL质量浓度为1.5～2.5％的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液，搅拌1.5～2.5小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
3）加入与步骤2）中聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶等体积等浓度的聚苯乙烯磺酸钠水溶液，搅拌1.5～2.5小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
4）重复上述步骤2）和3）至少两次；
5）将荧光材料与质量浓度为1.5～2.5％的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液混合，搅拌后，将混合液加入到步骤4）中得到的纳米粒子水溶液中，搅拌2.5～3.5小时，离心洗涤后重新分散在水溶液中，即得双模式光学成像探针；
所述步骤1）中制备金纳米粒子溶液所需的金纳米粒子，是采用氧化还原法通过还原氯金酸HAuCl4制备的金纳米粒子；制备银纳米粒子溶液所需的银纳米粒子是通过还原硝酸银AgNO3制备的银纳米粒子；
所述步骤1）的拉曼标记物为易于通过化学键插入或静电作用吸附到金属表面的拉曼标记物。
所述荧光材料为有机分子荧光染料或量子点材料。该双模式光学成像探针以金（或银）纳米聚集体为SERS基底，且该金（或银）纳米聚集体是直接通过拉曼标记物诱导生成；该双模式光学成像探针在激发光照射下，可以产生SERS和荧光信号。
为实现上述第二目的，本发明的双模式光学成像探针的制备方法，包括以下步骤：
1）制备金纳米粒子溶液或银纳米粒子溶液，将拉曼标记物加入金纳米粒子溶液或银纳米粒子溶液，混合10～20分钟，形成拉曼标记物诱导的金纳米聚集体或银纳米聚集体；2）在金纳米聚集体或银纳米聚集体的水溶液中加入2～4mL质量浓度为1.5～2.5％的聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）水溶液，搅拌1.5～2.5小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；3）加入与步骤2）中聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）水溶等体积等浓度的聚苯乙烯磺酸钠（PSS）水溶液，搅拌1.5～2.5小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；4）重复上述步骤2）和3）至少两次；5）将荧光材料与质量浓度为1.5～2.5％的聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）水溶液混合，搅拌后，将混合液加入到步骤4）中得到的纳米粒子水溶液中，搅拌2.5～3.5小时，离心洗涤后重新分散在水溶液中，即得双模式光学成像探针。
作为优选，所述步骤1）中制备金纳米粒子溶液所需的金纳米粒子，是采用氧化还原法通过还原氯金酸HAuCl4制备的金纳米粒子；制备银纳米粒子溶液所需的银纳米粒子是通过还原硝酸银AgNO3制备的银纳米粒子。所述步骤1）的拉曼标记物为易于通过化学键插入或静电作用吸附到金属表面的拉曼标记物，该拉曼标记物具有较大拉曼散射截面。所述步骤5）中的荧光材料为有机分子荧光染料或量子点材料。
有益效果：与现有技术相比，本发明的双模式光学成像探针及其制备方法具有如下优点：
1、本发明利用金或银纳米粒子聚集体作为SERS基底，与传统的以单个金或银纳米粒子为增强基底的SERS探针相比，SERS信号明显增强；
2、本发明利用拉曼标记物诱导生成的金或银纳米粒子聚集体作为SERS基底，与传统的加入聚集剂（如NaCl等）形成聚集体的方法相比，这种直接诱导聚集的方法具有更好的可控性和重复性；
3、本发明的制备方法操作简单、可重复性好、成本低廉并且环境友好，金纳米粒子、荧光材料和拉曼标记物也只需要极少量就可以完成探针的制备；
4、本发明的双模式光学成像探针兼具表面增强拉曼信号和荧光信号，灵敏度高，易于实现光学探针的多功能，在药物靶向运输、生物传感及探测等应用领域具有重要的应用价值。
附图说明
图1是拉曼标记物DTNB诱导形成的金纳米聚集体的消光谱；
图2是双模式光学成像探针的纳米粒子的结构示意图；
图3是以罗丹明6G为荧光材料并以DTNB分子为拉曼标记物的双模式光学成像标记在溶液中的荧光光谱；
图4是以罗丹明6G为荧光材料并以DTNB分子为拉曼标记物的双模式光学成像标记在溶液中的SERS光谱；
图5是以罗丹明6G为荧光材料并以DTNB分子为拉曼标记物的双模式光学成像标记在Hela细胞中的荧光成像；
图6是以罗丹明6G为荧光材料并以DTNB分子为拉曼标记物的双模式光学成像标记在Hela细胞中的SERS光谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1和实施例2以金纳米粒子作为SERS基底，以5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）DTNB作为拉曼标记物，以罗丹明6G作为荧光材料为例进行说明。
实施例1
制备以罗丹明6G为荧光材料并以DTNB分子为拉曼标记物的双模式光学成像标记，该方法包括如下步骤：
1）实验采用Frens报道的方法制备金胶溶液。在剧烈搅拌下，将4mL柠檬酸水溶液（浓度为1％）加入沸腾的100mL氯金酸水溶液（浓度为10－4g/mL）中，持续搅拌并维持沸腾20分钟得到金纳米粒子水溶液，粒子的平均粒径为15nm。将0.2mL拉曼标记物DTNB的水溶液加入20mL金纳米粒子溶液中，使其终浓度为10－5～10－6M，混合搅拌15分钟，可以观察到溶液的颜色由红色变为蓝色，即通过DTNB的诱导作用形成了金纳米聚集体。图1为该金纳米聚集体的消光谱，其中在650nm处出现的吸收峰表明金纳米粒子已经形成了聚集体。
2）在步骤1）的金纳米聚集体的水溶液中加入3mL质量浓度为2％的PDDA水溶液，搅拌2小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
3）加入3mL质量浓度为2％的PSS水溶液，搅拌2小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
4）重复上述步骤2）加入PDDA和步骤3）加入PSS的步骤两次，得到最外层为PSS包裹的金纳米聚集体；
5）将荧光材料罗丹明6G的水溶液与质量浓度为2％的PDDA水溶液混合（罗丹明6G的终浓度为10－5M），搅拌3小时；然后，取3mL上述混合液并加入到步骤4）得到的PSS包裹的金纳米聚集体的水溶液中，搅拌3小时；离心洗涤后重新分散在水溶液中，即得双模式光学成像探针。
如图2所示，该双模式光学成像探针，包括分散于水溶液中的纳米粒子，每个纳米粒子包括核体1和包裹层，核体1为金纳米聚集体，包裹层为交替吸附的多层聚二烯丙基二甲基氯化铵2和聚苯乙烯磺酸钠3，包裹层最外层为吸附有荧光材料4的聚二烯丙基二甲基氯化铵2。荧光材料4为罗丹明6G。
该双模式光学成像探针的荧光通过荧光光谱仪探测，如图3所示，激发波长为540nm。探测SERS光谱时，将双模式光学成像探针滴于硅片上，并固定在共焦拉曼光谱仪上，如图4所示。激光源为633nm的氩离子激光器，样品上的照射功率为1.2mW，积分时间为30s。该标记既有荧光又有信噪比很高的SERS信号，两种光学信号可以通过选择不同的激发波长进行切换，适用于生物成像和靶分子探测。
实施例2
双模式光学成像探针在活细胞中的荧光以及SERS特性（以罗丹明6G为荧光材料并以DTNB分子为拉曼标记物的探针为例）
1）将宫颈癌细胞（HeLa）置于培养基中进行体外培养（37℃，5%CO2）。24小时后，将双模式成像探针的水溶液按体积比（3：1）加入细胞培养基中，轻轻摇匀，并且重新置于培养箱内。探针通过被细胞吞噬而进入细胞内部。1.5小时之后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞3次以去除未被细胞吞噬而残留在培养基中的双模式成像探针，待用。
2）将用缓冲液冲洗过的细胞置于共焦显微镜的载物台上，以543nm为激发波长，以560nm～640nm为接收波长范围，得到其细胞荧光成像图，如图5所示。细胞在吞噬双模式成像探针之后仍然保持良好的形态。
3）选定一个细胞区域测量细胞内的SERS光谱，选用633nm为激发波长，积分时间为60s。测得的SERS光谱如图6所示。可以看出，双模式成像探针在活细胞内仍然保持了很高的SERS灵敏度。
该双模式成像探针可以通过吞噬等方式进入活细胞内部，具有良好的化学稳定性和生物兼容性。在活细胞内部仍然保持了其荧光和SERS两种光学信号的特性，适用于生物成像领域。
实施例3
以银纳米聚集体作为SERS基底，制备以碲化镉（CdTe）量子点为荧光材料并以4-巯基苯甲酸分子（4MBA）为拉曼标记物的双模式光学成像标记，该方法包括如下步骤：
1）实验采用Lee和Meisel报道的方法制备银胶溶液。将1.0×10-2M硝酸银溶液按照与欲得到的银胶溶液体积比1：10加入去离子水中，搅拌并加热至沸腾。将1%柠檬酸钠溶液按照与欲得到的银胶溶液体积比1：50加入到沸腾的硝酸银溶液中，持续搅拌并加热沸腾40分钟得到银胶溶液。将0.2mL4MBA的水溶液加入20mL银纳米粒子溶液中，使其终浓度为10－5～10－6M，混合搅拌30分钟，可以观察到溶液的颜色由深绿色变为浅褐色，即通过4MBA的诱导作用形成了银纳米聚集体。
2）在步骤1）的银纳米聚集体的水溶液中加入3mL质量浓度为2％的PDDA水溶液，搅拌2小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
3）加入3mL质量浓度为2％的PSS水溶液，搅拌2小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
4）重复上述步骤2）加入PDDA和步骤3）加入PSS的步骤五次，得到最外层为PSS包裹的银纳米聚集体；
5）将荧光材料CdTe量子点的水溶液与质量浓度为2％的PDDA水溶液混合（CdTe量子点的终浓度为10－5M），搅拌2小时；然后，取3mL上述混合液并加入到步骤4）得到的PSS包裹的银纳米聚集体的水溶液中，搅拌3小时；离心洗涤后重新分散在水溶液中，即得双模式光学成像探针。
如图2所示，该双模式光学成像探针，包括分散于水溶液中的纳米粒子，每个纳米粒子包括核体1和包裹层，核体1为银纳米聚集体，包裹层为交替吸附的多层聚二烯丙基二甲基氯化铵2和聚苯乙烯磺酸钠3，包裹层最外层为吸附有荧光材料4的聚二烯丙基二甲基氯化铵2。荧光材料4为碲化镉（CdTe）量子点。
上述方法制成的双模式光学成像探针的荧光通过荧光光谱仪探测，激发波长为400nm。探测SERS光谱时，将双模式光学成像探针滴于硅片上，并固定在共焦拉曼光谱仪上。激光源为633nm的氩离子激光器，样品上的照射功率为1.2mW，积分时间为30s。该标记既有荧光又有信噪比很高的SERS信号，两种光学信号可以通过选择不同的激发波长进行切换，适用于生物成像和靶分子探测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种双模式光学成像探针，其特征在于：包括分散于水溶液中的纳米粒子，每个纳米粒子包括核体（1）和包裹层，所述核体（1）为金纳米或银纳米聚集体，所述包裹层为交替吸附的多层聚二烯丙基二甲基氯化铵（2）和聚苯乙烯磺酸钠（3），包裹层最外层为吸附有荧光材料（4）的聚二烯丙基二甲基氯化铵（2）；
该双模式光学成像探针的制备方法包括以下步骤：
1）制备金纳米粒子溶液或银纳米粒子溶液，将拉曼标记物加入金纳米粒子溶液或银纳米粒子溶液，混合10～20分钟，形成拉曼标记物诱导的金纳米聚集体或银纳米聚集体；
2）在金纳米聚集体或银纳米聚集体的水溶液中加入2～4mL质量浓度为1.5～2.5％的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液，搅拌1.5～2.5小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
3）加入与步骤2）中聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶等体积等浓度的聚苯乙烯磺酸钠水溶液，搅拌1.5～2.5小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
4）重复上述步骤2）和3）至少两次；
5）将荧光材料与质量浓度为1.5～2.5％的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液混合，搅拌后，将混合液加入到步骤4）中得到的纳米粒子水溶液中，搅拌2.5～3.5小时，离心洗涤后重新分散在水溶液中，即得双模式光学成像探针；
所述步骤1）中制备金纳米粒子溶液所需的金纳米粒子，是采用氧化还原法通过还原氯金酸HAuCl4制备的金纳米粒子；制备银纳米粒子溶液所需的银纳米粒子是通过还原硝酸银AgNO3制备的银纳米粒子；
所述步骤1）的拉曼标记物为易于通过化学键插入或静电作用吸附到金属表面的拉曼标记物。
2.根据权利要求1所述的双模式光学成像探针，其特征在于：所述荧光材料（4）为有机分子荧光染料或量子点材料。
3.一种制备权利要求1或2所述的双模式光学成像探针的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）制备金纳米粒子溶液或银纳米粒子溶液，将拉曼标记物加入金纳米粒子溶液或银纳米粒子溶液，混合10～20分钟，形成拉曼标记物诱导的金纳米聚集体或银纳米聚集体；
2）在金纳米聚集体或银纳米聚集体的水溶液中加入2～4mL质量浓度为1.5～2.5％的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液，搅拌1.5～2.5小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
3）加入与步骤2）中聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶等体积等浓度的聚苯乙烯磺酸钠水溶液，搅拌1.5～2.5小时后离心洗涤并重新分散在水溶液中；
4）重复上述步骤2）和3）至少两次；
5）将荧光材料与质量浓度为1.5～2.5％的聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液混合，搅拌后，将混合液加入到步骤4）中得到的纳米粒子水溶液中，搅拌2.5～3.5小时，离心洗涤后重新分散在水溶液中，即得双模式光学成像探针；
所述步骤1）中制备金纳米粒子溶液所需的金纳米粒子，是采用氧化还原法通过还原氯金酸HAuCl4制备的金纳米粒子；制备银纳米粒子溶液所需的银纳米粒子是通过还原硝酸银AgNO3制备的银纳米粒子；
所述步骤1）的拉曼标记物为易于通过化学键插入或静电作用吸附到金属表面的拉曼标记物。
4.根据权利要求3所述的制备双模式光学成像探针的方法，其特征在于：所述步骤5）中的荧光材料为有机分子荧光染料或量子点材料。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
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Granted publication date: 20131030 Termination date: 20181224 |
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