CN102247621A - 一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架及其制备方法。即将丙氨酸乙酯通过化学键合固定在聚磷腈组织工程材料上,以CH2Cl2为溶剂,注入模具后,先采用基于水相体系的盐溶-沥出技术制孔,再通过静定自组装技术,活化氨基酸中的氨基,使聚丙氨酸乙酯磷腈表面带正电,将各种类细胞基质组分如蛋白质、聚多糖等天然大分子材料固定在阳离子化的聚磷腈材料表面,以此来构建其生物相容性表面,既得到该聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架。本发明首次将静电自组装技术和盐溶-沥出技术相结合来制备聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架。所得的支架机械性能强、生物相容性好。另外,本发明的制备工艺简单,操作简捷。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织工程材料领域,具体是指一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架及其制备方法。
背景技术
支架在组织工程研究中的的地位非常重要。组织工程支架具有将细胞传递到体内特定位置,然后为再生的组织预先占据一定的空间,并引导组织发展的作用。绝大多数哺乳动物是贴壁型的细胞,如果没有支架提供粘附的空间细胞将不能成活。聚合物基材可以作为组织工程支架,将高密度细胞移植到指定的位置。聚合物基材具有非常优异的物理机械性能,具有足够的抗压缩和抗拉伸能力,因而可以在体内培养的条件下保持原有的形状和结构。支架可以根据不同设计,作为隔绝宿主免疫系统的物理阻碍,也可以作为引导组织再生的基体。
近年来,三维立体网络支架发展十分迅速,它是用化学方法将两种以上的聚合物互相贯穿成交织网络状的一类新型复相聚合物材料,是聚合物共混改性技术发展的新领域,但也存在一定的问题,对于天然大分子而言虽然生物相容性良好,但机械性能差;而一些聚合物则是机械性能良好,但生物相容性差。近年来有许多对聚磷腈生物支架的研究,并表明其对成骨细胞等具有良好的生物相容性及机械强度,但是目前运用静电自组装技术和盐溶-沥出技术相结合制备高生物活性的聚磷腈成骨细胞复合微载体还没有先例,通过对聚磷腈生物支架的合理设计,无论从支架材料的机械性能还是生物活性都得到很大的提高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的问题而提供一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架的新型制备方法。即通过静电自组装技术和盐溶-沥出技术相结合来制备三维立体网络聚磷腈微载体,从而制备出一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架。
本发明的技术方案
一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架,通过如下方法制备,即将丙氨酸乙酯通过化学键合固定在聚磷腈组织工程材料上,以CH2Cl2为溶剂,注入模具后,先采用基于水相体系的盐溶-沥出技术制孔,再通过静定自组装技术,活化氨基酸中的氨基,使聚丙氨酸乙酯磷腈表面带正电,将各种类细胞基质组分如蛋白质、聚多糖等天然大分子材料固定在阳离子化的聚磷腈材料表面,以此来构建其生物相容性表面,既得到该聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架。
上述的一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架的制备过程具体包括以下步骤:
(1)、合成聚丙氨酸乙酯磷腈
①、在氮气的保护下将丙氨酸乙酯盐酸盐在四氢呋喃(THF)和三乙胺溶液中搅拌下并回流24h得到L-丙氨酸乙酯溶液;
其中丙氨酸乙酯盐酸盐/THF/三乙胺的摩尔比为9:3:1;
②、步骤①所得的L-丙氨酸乙酯溶液,过滤并将滤液加入搅拌中的含聚二氯磷腈的THF溶液中,并在室温下搅拌反应48h,过滤除去不溶性盐后,将所得的粘性聚合物溶液加入正己烷中得到白色纤维状聚合物沉淀物,其中粘性聚合物溶液与正己烷的量按体积比计算,粘性聚合物溶液与正己烷的体积比为1:2;
上述的含聚二氯磷腈的THF溶液中,THF/聚二氯磷腈的摩尔比为
144000:1,丙氨酸乙酯盐酸盐/聚二氯磷腈的摩尔比为4000:1;
将所得的白色纤维状聚合物沉淀物加入到THF溶液中浸泡5min,过滤将所得的沉淀物再加入到正己烷中浸泡5min,重复此过程3次,所用的THF溶液和正己烷的用量以使聚合物沉淀物浸入到溶液中即可,最终得到白色纤维状聚合物;
③、再把步骤②中最终所得的白色纤维状聚合物产物完全浸入到体积比为50/50的THF/甲醇混合液中3天,再真空干燥4h后得到白色固体的聚丙氨酸乙酯磷腈聚合物,将该聚合物放入CH2Cl2溶液中保存;
所述的真空干燥过程控制温度为60℃,真空度为0.02-0.09MPa
(2)、采用基于水相体系的盐溶-沥出技术制孔
将KCl颗粒经研磨后,用标准筛过筛,优选取粒径为100-150μm之间的KCl颗粒;将这些颗粒加入到步骤(1)所得的聚丙氨酸乙酯磷腈的CH2Cl2混合液中,使KCl颗粒/聚合物的重量比为9:1,将混合物搅拌均匀,分散,浇铸于聚丙乙烯模具上;待溶剂挥发48h后,真空干燥24h,真空干燥过程控制温度为60℃,真空度为0.02-0.09MPa;
然后将得到的聚丙氨酸乙酯磷腈/KCl盐复合物浸入盛有250ml去离子水的烧杯中,搅拌48h,每隔6h换一次水,确保盐能充分析出,得到的聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架;
(3)、聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架的活化
将步骤(2)中得到的聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架控制温度为121℃,时间为20min进行高压蒸汽消毒后,浸泡于pH=4.0的盐酸溶液中30min进行活化后取出,用去离子水冲洗干净,再用氮气吹干或直接用于下一步的生物大分子静电自组装;
(4)、生物大分子静电自组装
将步骤(3)经活化后的聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架浸入带负电性的0.5mg/ml pH=7.4的明胶或海藻酸钠的PBS或去离子水溶液中20min,取出后用pH=7.4的PBS溶液或去离子水冲洗干净,再浸入pH=4.0的壳聚糖乙酸溶液中20min,最后将聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架浸入到2mg/ml的戊二醛水溶液中固定15min,取出用去离子水冲洗,氮气吹干,储存于干燥容器中,既得到聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架;
所述的pH=4.0的壳聚糖乙酸溶液即在含有0.5%(W/V)的乙酸水溶液中加入3.0g壳聚糖。
本发明的有益效果
本发明首次将静电自组装技术和盐溶-沥出技术相结合来制备三维立体网络聚磷腈微载体。由于通过合理设计聚磷腈支架的制备工艺,将聚合物和天然大分子的优点相结合,从而使得到的聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架机械性能强、生物相容性好。
另外,本发明的聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架的制备工艺简单,操作简捷,易于推广。
附图说明
图1、聚丙氨酸乙酯磷腈合成反应示意图,其中R为CH3,n为12,000-14,000。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图,对本发明作进一步地详细说明,但并不限制本发明。
本发明所用的原料的规格均为分析纯AR,厂家为国药集团化学试剂有限公司,并可直接使用。
本发明所用的聚丙乙烯模具即为聚丙乙烯塑料。
实施例1
聚丙氨酸乙酯磷腈/海藻酸钠/壳聚糖三维立体细胞支架,其合成包括如下步骤:
(1)、合成聚丙氨酸乙酯磷腈
由六氯环三磷腈在一个密封的真空耐热管下250℃开环反应生成聚二氯磷腈。聚二氯磷腈与丙氨酸乙酯反应,最终产生聚丙氨酸乙酯磷腈;其合成反应示意图如图1所示:
即由丙氨酸乙酯取代聚二氯磷腈上的两个Cl,从而得到聚丙氨酸乙酯磷腈。下面是具体反应过程:
首先,在氮气保护下,106.04 g,即0.690 mol的丙氨酸乙酯盐酸盐在500ml的四氢呋喃THF和288ml,2.071mol的三乙胺溶液中搅拌下并回流24h得到L-丙氨酸乙酯溶液,将该溶液过滤并将溶液加入搅拌中的20.00g,0.173mmol的聚二氯磷腈THF(2000ml)溶液中,并在室温下搅拌反应48h,过滤除去不溶性盐,并将粘性聚合物溶液加入5000ml正己烷中得到白色纤维状聚合物沉淀物;
将得到的白色纤维状聚合物沉淀物加入到THF溶液中浸泡5min,过滤将所得的沉淀物再加入到正己烷中浸泡5min,重复此过程3次,最终得到白色纤维状聚合物;
再把所得的白色纤维状聚合物放入THF/甲醇(50/50)混合液中3天,使白色纤维状聚合物完全浸没在混合液中,最终产物的分子量为89000,再将最终产物真空干燥4h后得到白色固体的聚丙氨酸乙酯磷腈聚合物,将该聚合物放入适当的CH2Cl2溶液中保存;
(2)、采用基于水相体系的盐溶-沥出技术制孔
将KCl颗粒经研磨后,用标准筛过筛,取粒径为100-150μm之间的KCl颗粒;
将这些KCl颗粒加入步骤(1)所得的聚丙氨酸乙酯磷腈聚合物的CH2Cl2混合液中,使KCl盐/聚丙氨酸乙酯磷腈聚合物的重量比为9:1,将混合物搅拌均匀,分散,浇铸于聚丙乙烯模具上,待溶剂自然挥发48h后,真空干燥24h;
然后将得到的KCl盐/聚丙氨酸乙酯磷腈聚合物复合物浸入盛有250ml去离子水的烧杯中,搅拌48h,每隔6h换一次水,待水中经测定没有盐析出为止,即得到的聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架;
(3)、聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架的活化
将步骤(2)中得到的聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架首先用50%的乙醇水溶液,再用高压蒸汽消毒,控制温度为121℃,时间为20min,再用去离子水冲洗干净,氮气吹干,然后浸泡于pH=4.0的盐酸(HCl)溶液中3min,取出,用去离子水冲洗干净,再用氮气吹干或直接用于下一步的生物大分子静电自组装;
(4)、聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架的生物大分子静电自组装
配制0.5mg/ml pH=7.4的海藻酸钠PBS溶液,并配制pH=4.0的壳聚糖乙酸溶液,即在含有0.5%(W/V)的乙酸水溶液中加入3.0g壳聚糖;
先将步骤(3)活化后的聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架浸入pH=7.4的海藻酸钠PBS溶液中20min,取出后用pH=7.4的PBS溶液冲洗干净,再浸入pH=4.0的壳聚糖乙酸溶液中20min;
最后将聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架浸入到2mg/ml的戊二醛水溶液中固定15min,取出用去离子水冲洗,氮气吹干,储存于干燥容器中,既得到聚丙氨酸乙酯磷腈/海藻酸钠/壳聚糖三维立体细胞支架。
以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明,而依据本发明的技术方案所做的任何等效变换,均应属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架,其特征在于通过如下方法制备:
(1)、合成聚丙氨酸乙酯磷腈
①、在氮气的保护下将丙氨酸乙酯盐酸盐在THF和三乙胺溶液中搅拌下并回流24h得到L-丙氨酸乙酯溶液;
其中丙氨酸乙酯盐酸盐/THF/三乙胺的摩尔比为9:3:1;
②、步骤①所得的L-丙氨酸乙酯溶液,过滤并将滤液加入搅拌中的含聚二氯磷腈的THF溶液中,并在室温下搅拌反应48h,过滤除去不溶性盐后,将所得的粘性聚合物溶液加入正己烷中得到白色纤维状聚合物沉淀物;
所述的含聚二氯磷腈的THF溶液中,THF/聚二氯磷腈的摩尔比为 144000:1,所用的丙氨酸乙酯盐酸盐/聚二氯磷腈的摩尔比为4000:1;
所述的粘性聚合物溶液与正己烷的量按体积比计算,粘性聚合物溶液与正己烷的体积比为1:2;
将所得的白色纤维状聚合物沉淀物加入到THF溶液中浸泡5min,过滤将所得的沉淀物再加入到正己烷中浸泡5min,重复此过程3次;所用的THF溶液和正己烷的用量以使聚合物沉淀物浸入到溶液中即可,最终得到白色纤维状聚合物;
③、再把步骤②中最终所得的白色纤维状聚合物产物完全浸入到体积比为
50/50的THF/甲醇混合液中3天,再真空干燥4h后得到白色固体的聚
丙氨酸乙酯磷腈聚合物,将该聚合物放入CH2Cl2溶液中保存;
所述的真空干燥过程的控制温度为60℃,真空度为0.02-0.09MPa;
(2)、采用基于水相体系的盐溶-沥出技术制孔
将KCl盐加入到步骤(1)所得的聚丙氨酸乙酯磷腈的CH2Cl2混合液中,使KCl盐/聚丙氨酸乙酯磷腈聚合物的重量比为9:1;
将混合物搅拌均匀,分散,浇铸于聚丙乙烯模具上;待溶剂自然挥发48h后,真空干燥24h,真空干燥过程控制温度为60℃,真空度为0.02-0.09MPa;
然后将得到的KCl盐/聚丙氨酸乙酯磷腈聚合物复合物浸入盛有250ml去离子水的烧杯中,搅拌48h,每隔6h换一次水,待盐能充分析出后即得到的聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架;
(3)、聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架的活化
将步骤(2)中得到的聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架控制温度为121℃,时间为20min进行高压蒸汽消毒后,浸泡于pH=4.0的盐酸水溶液中30min进行活化后取出,用去离子水冲洗干净,再用氮气吹干或直接用于下一步的生物大分子静电自组装;
(4)、生物大分子静电自组装
将步骤(3)经活化后的聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架浸入带负电性的0.5mg/ml pH=7.4的明胶或海藻酸钠的PBS水溶液中20min,取出后用pH=7.4的PBS溶液水冲洗干净,再浸入pH=4.0的壳聚糖乙酸溶液中20min,最后将聚丙氨酸乙酯磷腈三维多孔支架浸入到2mg/ml的戊二醛水溶液中固定15min,取出用去离子水冲洗,氮气吹干,储存于干燥容器中,既得到聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架。
2.如权利要求1所述的一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架,其特征在于制备步骤(2)中所用的KCl盐的粒径为100-150μm 。
3.如权利要求2所述的一种聚丙氨酸乙酯磷腈三维立体细胞支架,其特征在于制备步骤(4)中所述的pH=4.0的壳聚糖乙酸溶液即在含有0.5%(W/V)的乙酸水溶液中加入3.0g壳聚糖。
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