CN1609200A - 一种复杂组织器官前体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种复杂组织器官前体的制备方法,属于生物组织工程技术领域。本发明利用种子细胞或基因与基质材料制备成微胶珠或多管道三维结构,并利用计算机辅助快速成型法、涂覆法、一次性灌注成形等技术实现细胞和支架材料在空间的准确定位,克服了组织工程目前存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长、细胞在支架中分布不均匀、细胞很难渗入到深层结构中等缺点。利用零部件组合的原理可以达到复杂器官中不同部位不同细胞类型及结构类型的要求,实现复杂组织器官的重建,从而达到修复再生的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种复杂组织器官前体的制备方法,属于生物组织工程技术领域。
背景技术
世界上每年患有组织缺损或器官衰竭的病人数逾千万,仅美国每年以外科手术治疗此类病人约800万。然而,活体供体器官有限,现有的机械装置不具备器官的所以功能,不能防止患者的病情进一步恶化。据此,以提高此类疾患治疗水平为宗旨的组织工程(TissueEngineering)技术应运而生。组织工程是一门由生物学、医学、材料学、工程学等多学科交叉产生的高新技术学科。其含义是应用生命科学与工程学的原理与技术,在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上,研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物[Merem RM.Med & Biol Eng&Comput.1992;30:8-12]。近十年来,科学家们运用组织工程技术,利用人体残余器官的少量正常细胞进行体外繁殖,获得患者所需的、具有相同功能的器官,又不存在排斥反应,已取可喜的成果,不少新近成立的生物技术公司正准备正在投入巨资实现商品化。在美国,已形成价值40亿美元的产业,并以每年25%的速度递增。如Pro Osteon珊瑚骨移植材料产值超过1000万美元[Miller M,Biotech Bioeng,1996;50:4347-4348]。但现存的组织工程技术面临许多困难和限制,组织工程应用研究所取得的成功均是在那些结构与生理功能较为简单的组织器官如骨骼、软骨、皮肤。传统的支架制备技术不能准确地控制孔的大小、结构、空间分布及贯通的通道,营养供应和血管长入都受到很大的限制。传统组织工程方法一般先制备结构支架,在进行细胞培养过程中由于上层细胞消耗大部分的氧气和营养,限制了这些组分向底层扩散,从而限制了细胞向支架深层的迁移等。这种先制备支架,再培养细胞的方法,耗时又费力,细胞在向支架内迁移的过程中很可能就已经变型、老化,达不到及时治疗临床病人的要求。同时传统的组织工程技术不能满足将不同的细胞在空间准确定位与定点放置,构建复杂组织器官的功能梯度结构的需求。本发明在综合前人工作的基础上,利用各种先进技术,实现细胞和支架材料在空间的准确定位,利用零部件组合的原理实现复杂组织器官的重建,从而达到修复再生的目的,具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种复杂组织器官前体的制备方法,旨在前人工作的基础上,利用计算机辅助的快速成型技术、涂覆法或一次性灌注成形技术,实现细胞和支架材料在空间的准确定位,利用零部件组合的原理实现复杂组织器官的重建,从而达到修复再生的目的
本发明的技术方案如下:
一种复杂组织器官前体的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
1)种子细胞或基因与基质材料微胶珠的制备
a.分离或诱导所需的种子细胞或基因,将所得的不同种类的种子细胞或基因的悬浮液离心分离后分别与含有1~40%的基质材料的溶液均匀混合,制成细胞或基因与基质材料的混合物;所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠,其中所述的明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.5~100∶1,所述种子细胞或基因占所述基质材料混合溶液的0.01~10%;所述的基质材料的溶液为水溶液或pH=6~8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液;
b.用静电微囊发生器或微滴注入技术将细胞或基因与明胶/壳聚糖基质材料喷入1~20%三磷酸钠水溶液交联;对于明胶/海藻酸钠基质材料喷或注入浓度为1~20%乳酸钙或氯化钙水溶液交联,形成微球;然后将三磷酸钠水溶液或乳酸钙、氯化钙水溶液吸出;将微球与浓度为0.1~1%的戊二醛溶液进一步反应1~180秒钟,形成微胶珠;对于细胞或基因与明胶、胶原或明胶/胶原混合物直接喷或注入浓度为0.1~1%的戊二醛溶液反应1~180秒钟,形成微胶珠;对于细胞或基因与明胶/壳聚糖、明胶/海藻酸钠基质材料形成的微胶珠再与浓度为0.1~10%柠檬酸钠缓冲溶液反应10分钟~2小时,形成液化微胶珠;
2)制备网管状结构:将生物可降解高分子材料或其与肝素的复合物溶液,利用计算机辅助的快速成型技术、涂覆法或一次性灌注成形技术,经冷冻干燥,制成网管状组织器官不同零件的三维结构支架;所述的生物可降解高分子材料为聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯、胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物,其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯采用浓度为1~10%的1,4-二氧六环溶液;其中胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物采用浓度为1~40%的的水溶液或pH=6~8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液,成形后用浓度为0.1~1%的交联剂戊二醛或浓度1~10%的三磷酸钠平衡溶液交联;
3)组装:利用微囊注射技术将步骤1)b中的微胶珠注射到所述的三维结构支架相应的位置上,体外培养或进行体内植入;
上述步骤1)a中所述的细胞或基因与基质材料的混合物利用凝胶注射技术直接注射到步骤2)中的三维结构支架中,再用浓度为0.1~1%的戊二醛溶液、1~20%乳酸钙、氯化钙或三磷酸钠水溶液交联。所述的基质材料中复合有细胞生长因子。
本发明提供的另一种复杂组织器官前体的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
1)种子细胞或基因与基质材料管道状三维结构的制备
a.分离或诱导所需的种子细胞或基因,将所得的不同种类的种子细胞或基因的悬浮液离心分离后分别与含有1~40%的基质材料的溶液均匀混合,制成细胞或基因与基质材料的混合物;所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠,其中所述的明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.5~100∶1,所述种子细胞或基因占所述基质材料混合溶液的0.01~10%;所述的基质材料的溶液为水溶液或pH=6~8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液;
b.在0~30℃的环境下根据预先设计的结构和定义规划的路径,将上述细胞与基质材料的混合物通过微滴喷射、数字挤压技术利用细胞组装机在成形室中逐层堆积得到细胞与基质材料的多管道三维立体结构;对于基质材料为明胶/壳聚糖形成的管道状三维结构,用1~20%三磷酸钠水溶液交联;对于基质材料为明胶/海藻酸钠形成的管道状三维结构,用浓度为1~20%乳酸钙或氯化钙水溶液交联;然后将交联剂吸出,再与浓度为0.1~1%的戊二醛水或生理盐水溶液反应1~180秒钟;对于基质材料为明胶/壳聚糖、明胶/海藻酸钠基质材料形成的管道状三维结构再与浓度为0.1~10%柠檬酸钠缓冲溶液反应10分钟~2小时,形成内部液化的管道状三维结构;对于基质材料为明胶、胶原或明胶/胶原形成的管道状三维结构,直接用浓度为0.1~1%的戊二醛溶液交联1~180秒钟;
2)制备网管状结构:将生物可降解高分子材料或其与肝素的复合物溶液,利用计算机辅助的快速成型技术、涂覆法或一次性灌注成形技术,经冷冻干燥,制成网管状组织器官不同零件的三维结构支架;所述的生物可降解高分子材料为聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯、胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物,其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯采用浓度为1~10%的1,4-二氧六环溶液;其中胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物采用浓度为1~40%的的水溶液或pH=6~8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液,成形后用浓度为0.1~1%的交联剂戊二醛或浓度1~10%的三磷酸钠平衡溶液交联;
3)组装:将步骤2)制备的网管状结构插入步骤1)制备的管道状三维结构中,外包一层可降解的、降解速度在1~6个月的组织相容性的高分子膜。
本发明可以实现不同细胞和基质材料在空间的准确定位,克服了组织工程目前存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长,细胞在支架中分布不均匀,细胞很难渗入到深层结构中等缺点。利用零部件组合的原理可以达到复杂器官中不同部位不同细胞类型及结构类型的要求,实现复杂组织器官的重建,从而达到修复再生的目的。
具体实施方式
下面举出的几个实施例以进一步理解本发明
实施例1:人工复合肝前体的制备
1)采购已有的细胞系如HepG2肝细胞、内皮细胞,将两种类细胞悬液离心后分别与重量比1%明胶/海藻酸钠(100∶1w/w)0.09M NaCI溶液、细胞生长因子混合均匀。用静电微囊发生器喷入重量比5%乳酸钙溶液中,以形成微球。吸出乳酸钙溶液,加入浓度为0.1%的戊二醛溶液反应1秒钟,形成微胶珠;将微胶珠与重量比0.1%柠檬酸钠(也叫枸橼酸钠)缓冲溶液反应数分钟,以液化微珠芯,形成液化微胶囊。
2)制备网管状结构:将生物浓度为1%的可降解高分子材料聚氨酯(PU)1,4-二氧六环溶液利用计算机辅助的快速成型技术,制成网管状组织器官不同零件的三维结构支架;
3)组装:利用微囊注射技术将步骤1)制备的液化微胶囊注射到三维结构支架相应的位置上,体外培养,备用。
实施例2:人工复合肝前体的制备
1)采购已有的细胞系如HepG2肝细胞、内皮细胞。将两种细胞悬液离心后分别与重量比20%明胶/海藻酸钠(1∶1w/w)0.09M NaCI溶液、内皮细胞生长因子混合均匀。
2)制备网管状结构:将生物浓度为1%的可降解高分子材料聚氨酯(PU)1,4-二氧六环溶液利用计算机辅助的快速成型技术,制成网管状组织器官不同零件的三维结构支架;
3)组装:利用微滴注射技术将步骤1)制备的两种细胞与基质的复合物注射到三维结构支架相应的位置上,用重量比5%乳酸钙溶液交联。吸出乳酸钙溶液,加入浓度为0.1%的戊二醛溶液反应180秒钟;将微胶珠与重量比0.1%柠檬酸钠(也叫枸橼酸钠)缓冲溶液反应数分钟,体外培养或进行体内植入。
实施例3:人工复合肝前体的制备
分离病人的肝细胞、内皮细胞、星状细胞,体外培养、扩增。将三种细胞悬液离心后分别或混合与10%明胶/壳聚糖(1∶100w/w)的0.09M NaCI溶液、肝细胞生长因子和内皮细胞长因子,由细胞组装机制备由内皮细胞和肝细胞与星状细胞层组成的多管道三维立体结构。用浓度为1%的戊二醛溶液反应1秒钟,生理盐水冲洗。此结构可直接种植于肠膜或与肝损伤部位,也可与内附内皮细胞的管网状聚氨酯复合后再植入。
实施例4:人工复合肝前体的制备
分离病人的肝细胞、肺内皮细胞、星状细胞等,体外培养、扩增。将不同种类细胞悬液离心后分别或混合与40%明胶的0.09M的氯化钠·三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液混合均匀,由细胞组装机制备由内皮细胞和肝细胞(与星状细胞)层组成的多管道三维立体结构。用浓度为3%的三磷酸哪水溶液交联5分钟,再用1%的戊二醛溶液反应1秒钟,生理盐水冲洗。此结构可直接种植于肠膜或与肝损伤部位,也可与内附内皮细胞的管网状聚氨酯复合后再植入。
实施例5:人工复合肝前体的制备
分离肝的干细胞、肝细胞基因等,体外诱导、培养、扩增。将不同种类细胞悬液离心后分别与1%的胶原0.09M NaCI溶液、内皮细胞生长因子混合均匀由细胞组装机制备由内皮细胞和肝细胞层组成的多管道三维立体结构,外包一层肝素处理聚己内酯(PCL)膜种植于肠膜或与肝损伤部位。
附:肝素处理的PCL膜的制备:将丙酮与1wt%肝素钠水溶液按1∶1(v/v)混合,再将由PCL膜薄膜浸入其中浸泡8h。然后在浓度依次递减的丙酮水溶液中缩聚,使外套具备抗凝血性。
实施例6:人工复合肝前体的制备
分离肝的干细胞、肝细胞基因等,体外诱导、培养、扩增。将不同种类细胞悬液离心后分别与20%明胶/壳聚糖(100∶1w/w)的0.09M的氯化钠·三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液混合均匀,由细胞组装机制备干细胞、肝细胞基因与明胶/壳聚糖基质组成的多管道三维立体结构,用0.1%的戊二醛生理盐水交联10秒钟,外包一层肝素处理聚己内酯(PCL)膜种植于肠膜或与肝损伤部位。
附:肝素处理的PCL膜的制备:将丙酮与1wt%肝素钠水溶液按1∶1(v/v)混合,再将由PCL膜薄膜浸入其中浸泡8h。然后在浓度依次递减的丙酮水溶液中缩聚,使外套具备抗凝血性。
实施例7:复合皮肤的制备
用快速成形技术制备网格状成纤维细胞与20%明胶水溶液层(10×10×0.5mm3,贯通孔径50μm),更换针头或喷头,在原网格层上加一层上皮细胞与明胶基质材料(10×10×0.5mm3,贯通孔径50μm)。制成厚度为1mm的双层膜。膜上还可上覆一层无细胞壳聚糖膜或病人真皮,防止水份流失。
实施例8:复合皮肤的制备
用冻干技术将胶原/壳聚糖(10∶1,0.5%w/w)制成厚0.5mm厚的海绵层,将含成纤维生长因子细胞、成纤维细胞的明胶/壳聚糖微球(直径:50μm)用针头注射在底层,再在上层注射含上皮细胞的明胶/海壳聚糖微球(直径:50μm),上盖一层硅胶膜防止水份流失。
实施例9:乳房前体的制备
分离脂肪细胞,体外培养、扩增。将脂肪细胞悬液离心后分别与1%明胶/硫酸软骨素(100∶1w/w)0.09M NaCI、细胞生长因子混合均匀制备直径50μm的微球。将微球注射到由冻干技术形成的伞房形由0.25%戊二醛水溶液交联的胶原或胶原/壳聚糖海绵体内。外覆一层聚氨酯肝素膜,此复合体可直接植于乳房损伤处或经体外培养后再植入。
实施例10:乳房前体的制备
分离脂肪干细胞,体外培养、扩增。将脂肪干细胞悬液离心后分别与1%胶原(100∶1w/w)0.09M NaCI溶液(pH≈7.4)、脂肪细胞生长因子混合均匀按乳房的形状由快速成形技术制备多管道细胞与胶原/明胶基质的三维结构,将两个乳房状的管网结构,通过钻孔等技术并列插入到有一定形状的快速成形技术制备的细胞与基质材料的三维结构中。将三维结构进行修剪,外包(缝合,将材料保护起来外涂)一层经3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物膜。管口处与内层管网结构相吻合,但液体不泄漏。可直接种植于体内或体外培养一段时间再植入体内。
实施例11:肾脏前体的制备
分离肾细胞基因,体外培养、扩增。将肾细胞基因(DNA)与1%明胶/海藻酸钠(100∶1w/w)水溶液、细胞生长因子混合均匀,制备直径0.5μm的微球。用灌注成形技术、冻干技术制备肾形三维结构,用0.3%戊二醛水溶液交联。此复合体可直接植于肾损伤处或经体外培养后再植入。
实施例12:肾脏前体的制备
分离肾细胞,体外培养、扩增。将肾细胞悬液离心后分别与重量比10%明胶/胶原(10∶1w/w)0.09M NaCI溶液(pH:6)混合均匀由快速成形技术制备多管道肾形三维结构,用0.3%戊二醛水溶液交联2秒钟,外涂一层经PLGA膜。管口处与内层管网结构相吻合,但液体不泄漏。可直接种植于体内或体外培养一段时间再植入体内。
实施例13:胰腺前体的制备
分离胰岛细胞,体外培养、扩增。将胰岛细胞悬液离心后分别与重量比20%明胶水溶液、细胞生长因子混合均匀,制备直径100μm的微球。将微球注射到快速成形技术制备的网管状由0.3戊二醛水溶液交联的胶原或胶原/壳聚糖海绵体内。此复合体可直接植于胰腺、肝脏等部位。
实施例14:胰腺前体的制备
分离胰岛细胞基因,体外培养、扩增。将胰岛细胞基因与重量比20%明胶/海藻酸钠(1∶2w/w)0.09M NaCI溶液pH:8、细胞生长因子混合由快速成形技术制备多管道细胞与明胶/海藻酸钠基质的三维结构,5%乳酸钙溶液交联,用放在有一定形状的快速成形技术制备聚氨酯网管三维结构中。外包(缝合,将材料保护起来外涂)一层聚氨酯膜。管口处与内层管网结构相吻合,但液体不泄漏。可直接种植于体内或体外培养一段时间再植入体内。
实施例15:胰腺前体的制备
分离胰岛基因,体外培养、扩增。将胰岛基因与重量比1%明胶/壳聚糖(100∶1w/w)0.09M NaCI NaCI·三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液(pH≈7.4)、混合均匀,由快速成形技术制备多管道细胞与基质的三维结构,0.1%戊二醛生理盐水溶液交联20秒,外包一层聚羟基酸膜。管口处与内层管网结构相吻合,但液体不泄漏。可直接种植于体内或体外培养一段时间再植入体内。
实施例16:肺前体的制备
分离肺上皮细胞、肺细胞,体外培养、扩增。将分离细胞悬液离心后分别与重量比1%明胶/海藻酸钠(1∶1w/w)0.09M NaCI NaCI·三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液(pH≈7.4)、细胞生长因子混合均匀,制备直径0.5μm的微球。将微球注射到树枝状由戊二醛交联的胶原或胶原/壳聚糖海绵体内,再包一层聚己内酯膜(PCL)膜。此复合体可直接植于肺损伤处或经体外培养后再植入。
实施例17:肺前体的制备
分离肺上皮细胞、肺细胞。将肺上皮细胞、肺细胞悬液离心后分别与重量比10%明胶/壳聚糖(1∶2w/w)0.09M NaCI溶液(pH:7.4)、细胞生长因子混合均匀,由快速成形技术制备扁园形多管道细胞与基质的三维结构,5%三磷酸钠交联后再用0.1%戊二醛生理盐水溶液交联20秒,将三维结构外包一层丙酮:肝素/水(1∶1)溶液处理的聚氨酯膜。肺管与内层管网结构相吻合,但液体不泄漏。可直接种植于体内或体外培养一段时间再植入体内。
实施例18:脾前体的制备
分离脾细胞、内皮细胞,体外培养、扩增。将脾细胞、内皮细胞悬液离心后分别与20%的明胶/壳聚糖(pH:7.4)溶液混合备用;注射到胶原或胶原/壳聚糖海绵体内后,由0.2%戊二醛生理盐水溶液交联后。此复合体可直接植于脾损伤处或经体外培养后再植入。
实施例19:胰腺前体的制备
分离脾细胞岛基因,体外培养、扩增。将脾细胞岛基因与重量比1%明胶/海藻酸钠(3∶2w/w)0.09M NaCI溶液pH:7、细胞生长因子混合均匀按扁园形的形状由快速成形技术制备多管道细胞与基质的三维结构,0.5%戊二醛生理盐水溶液交联10秒,外包一层乳酸与乙醇酸共聚物(PLGA)膜。管口处与内层管网结构相吻合,但液体不泄漏。可直接种植于体内或体外培养一段时间再植入体内。
实施例20:神经修复导管的制备
用细胞装配机制备圆柱状多管道雪旺氏细胞(干细胞)与重量比20%明胶/胶原(1∶100w/w)0.09M NaCI溶液pH:7.4基质材料三维结构(圆柱外径4mm,贯通孔径50μm)。外套一层相当大小的胶原膜,1%戊二醛生理盐水溶液交联5秒,防止周围组织长入。
实施例21:神经修复导管的制备
用细胞装配机制备圆柱状多管道干细胞、生长因子、基因(DNA)与重量比20%明胶/胶原(10∶1w/w)0.09M NaCI·三(羟甲基)氨基甲烷盐酸溶液(pH:7.4)基质材料三维结构(直径4mm,贯通孔径900μm)。0.5%戊二醛生理盐水溶液交联30秒,外套一层相当大小的胶原/壳聚糖膜(10∶1w/w,由1%胶原/壳聚糖溶液反复涂覆,用1%戊二醛交联而得),防止周围组织长入。
实施例22:骨与软骨前体的制备
用快速成形技术将成骨细胞、骨形成蛋白(BMP)、软骨细胞与明胶/壳聚糖(20∶1w/w)基质材料三维结构(直径:3mm,贯通孔径:300μm,长:10mm),体外培养。
实施例23:心脏前体的制备
分别制备心肌细胞、血管内皮细胞与20%明胶基质,设计心血管和心包膜模型,利用双喷头快速成形技术将心肌细胞、血管内皮细胞与基质组装成多管道心包状结构(内皮细胞在外层,心肌细胞在内层)。用涂覆法制备管网状多管道心血管系统,并插入到心包状细胞/基质三维结构中,外包一层聚氨酯膜,管道可与提内心血管系统相连,液体不渗漏。
Claims (5)
1.一种复杂组织器官前体的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
1)种子细胞或基因与基质材料微胶珠的制备
a.分离或诱导所需的种子细胞或基因,将所得的不同种类的种子细胞或基因的悬浮液离心分离后分别与含有1~40%的基质材料的溶液均匀混合,制成细胞或基因与基质材料的混合物;所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠,其中所述的明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.5~100∶1,所述种子细胞或基因占所述基质材料混合溶液的0.01~10%;所述的基质材料的溶液为水溶液或pH=6~8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液;
b.用静电微囊发生器或微滴注入技术将细胞或基因与明胶/壳聚糖基质材料喷入1~20%三磷酸钠水溶液交联;对于明胶/海藻酸钠基质材料喷或注入浓度为1~20%乳酸钙或氯化钙水溶液交联,形成微球;然后将三磷酸钠水溶液或乳酸钙、氯化钙水溶液吸出;将微球与浓度为0.1~1%的戊二醛溶液进一步反应1~180秒钟,形成微胶珠;对于细胞或基因与明胶、胶原或明胶/胶原混合物直接喷或注入浓度为0.1~1%的戊二醛溶液反应1~180秒钟,形成微胶珠;对于细胞或基因与明胶/壳聚糖、明胶/海藻酸钠基质材料形成的微胶珠再与浓度为0.1~10%柠檬酸钠缓冲溶液反应10分钟~2小时,形成液化微胶珠;
2)制备网管状结构:将生物可降解高分子材料或其与肝素的复合物溶液,利用计算机辅助的快速成型技术、涂覆法或一次性灌注成形技术,经冷冻干燥,制成网管状组织器官不同零件的三维结构支架;所述的生物可降解高分子材料为聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯、胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物,其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯采用浓度为1~10%的1,4-二氧六环或氯仿溶液;其中胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物采用浓度为1~40%的的水溶液或pH=6~8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液,成形后用浓度为0.1~1%的交联剂戊二醛或浓度1~10%的三磷酸钠平衡溶液交联;
3)组装:利用微囊注射技术将步骤1)b中的微胶珠注射到所述的三维结构支架相应的位置上,体外培养或体内植入;
2.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤1)a中所述的细胞或基因与基质材料的混合物利用凝胶注射技术直接注射到步骤2)中的三维结构支架中,再用浓度为0.1~1%的戊二醛溶液、1~20%乳酸钙、氯化钙或三磷酸钠水溶液交联。
3.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述的基质材料中复合有细胞生长因子。
4.一种复杂组织器官前体的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
1)种子细胞或基因与基质材料管道状三维结构的制备
a.分离或诱导所需的种子细胞或基因,将所得的不同种类的种子细胞或基因的悬浮液离心分离后分别与含有1-40%的基质材料的溶液均匀混合,制成细胞或基因与基质材料的混合物;所述的基质材料为明胶、胶原、明胶/胶原、明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠,其中所述的明胶/壳聚糖或明胶/海藻酸钠的混合溶液中明胶与壳聚糖或明胶与海藻酸钠的质量比0.5~100∶1,所述种子细胞或基因占所述基质材料混合溶液的0.01~10%;所述的基质材料的溶液为水溶液或pH=6~8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液;
b.在0~30℃的环境下根据预先设计的结构和定义规划的路径,将上述细胞与基质材料的混合物通过微滴喷射、数字挤压技术利用细胞组装机在成形室中逐层堆积得到细胞与基质材料的多管道三维立体结构;对于基质材料为明胶/壳聚糖形成的管道状三维结构,用1~20%三磷酸钠水溶液交联;对于基质材料为明胶/海藻酸钠形成的管道状三维结构,用浓度为1~20%乳酸钙或氯化钙水溶液交联;然后将交联剂吸出,再与浓度为0.1~1%的戊二醛水或生理盐水溶液反应1~180秒钟;对于基质材料为明胶/壳聚糖、明胶/海藻酸钠基质材料形成的管道状三维结构再与浓度为0.1~10%柠檬酸钠缓冲溶液反应10分钟~2小时,形成内部液化的管道状三维结构;对于基质材料为明胶、胶原或明胶/胶原形成的管道状三维结构,直接用浓度为0.1~1%的戊二醛溶液交联1~180秒钟;
2)制备网管状结构:将生物可降解高分子材料或其与肝素的复合物溶液,利用计算机辅助的快速成型技术、涂覆法或一次性灌注成形技术,经冷冻干燥,制成网管状组织器官不同零件的三维结构支架;所述的生物可降解高分子材料为聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯、胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物,其中聚氨酯、聚乳酸、乳酸与乙醇酸共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物、聚己内酯采用浓度为1~10%的1,4-二氧六环溶液;其中胶原、明胶、纤维蛋白、纤维粘连蛋白、胶原/壳聚糖、胶原/硫酸软骨素、明胶/壳聚糖或其中两种复合物采用浓度为1~40%的的水溶液或pH=6~8的0.09M的氯化钠或0.09M的氯化钠和3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液,成形后用浓度为0.1~1%的交联剂戊二醛或浓度1~10%的三磷酸钠平衡溶液交联;
3)组装:将步骤2)制备的网管状结构插入步骤1)制备的管道状三维结构中,外包一层可降解的、降解速度在1~6个月的组织相容性的高分子膜。
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