CN105688279B - 一种肺替代物及其三维打印与注射成形制造方法 - Google Patents

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Abstract

一种肺替代物及其三维打印与注射成形制造方法，属于生物医用材料和器官制造技术领域。该肺替代物包括左右肺叶、气管网络、血管网络、肺泡组织及肺外膜；所述左右肺叶、气管网络、血管网络和肺外膜通过3D打印成形，肺泡组织则是由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液/微球，或干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液在肺外膜、支气管网络和支血管网络3D打印成形过程中由针管在三者间注射成形。本发明的肺替代物，具有左右肺叶、支血管网络和支气管网络，可与人体血管、气管相连，实现肺器官的再生修复；采用的多喷头3D打印与注射成形技术保证了非均质异向材料从不同角度、不同方向快速成形，提高了异质材料的复合效率和成形结构的生理功能。

Description

一种肺替代物及其三维打印与注射成形制造方法
技术领域
本发明属于生物医用材料与实体器官人工制造技术领域，特别涉及一种含支气管网络的可移植肺的制备方法。
背景技术
器官衰竭是人类目前最大的威胁之一,每年器官供体个数只是需要进行器官移植病人数目的几十万分之一。通过先进的成形技术将多种细胞和生物材料组装成可供移植的活体器官是千百年来人类的一个梦想。快速成形，又称为三维打印(three-dimensional,3D,printing)或增材制造(additive manufacturing,AM)是20世纪80年代发展起来的一项先进制造技术，能使多种细胞材料单元在数字模型驱动下自动组装成相应的三维结构，在器官制造领域有着非常广泛的应用前景[Wang X,et al.Rapid prototyping as tool formanufacturing bioartificial livers.Trends in Biotechnology,2007；25(11)：505-513]。
低温沉积制造(low-temperature deposition manufacturing,LDM)是清华大学机械系生物制造工程中心(2004年7月更名为器官制造中心)针对生物材料成形的特殊要求自主研发的一种特殊3D打印工艺。其核心技术是指将生物材料制成液态，经由喷头在工作台上挤出，通过低温凝固堆积成形。目前该中心已经有了活塞挤压式单喷头和双喷头的生物材料受控成型装置。如MEM-300-I生物材料快速成形机，能对两种细胞材料单元直接受控组装。
人体中实体器官都是由两种以上不同细胞和细胞外基质材料组成的复合结构，各种细胞和结构与生物学功能密切相关，可移植实体器官制造对非均质多种不同材料三维结构的成形提出了更高的要求。原有的单喷头和双喷头无法满实体器官快速制造的需求。如，中国专利文献(申请号201110205970.1)的喷射装置为两个固定式的电机助推式喷头，不同喷头组件中可装有不同的成形材料，通过成形台在同一平面内控制材料成形。
此种成形网络有以下不足之处：一、成形台只能依靠三维运动装置进行运动，加工圆截面和圆环截面类材料成型时位置参数由相互垂直的X轴Y轴控制，精确度有待提高。二、固定式喷头均为螺杆挤压式且不可更换，在进行细胞组装或打印加工时存在结构性弊端，无法精确控制细胞打印数量、细胞层的厚度和准确位置。三、成形效率较低，电机助推式快速成形喷头喷出的浆料的直径取决于喷嘴直径，喷嘴的直径一般为微米级的，对于需要大范围平面喷涂含细胞的水溶胶时，其工作量巨大，工作时间长。四、不能喷涂稀高分子溶液、单层细胞、细胞微球，电机助推式快速成形喷头喷出的浆料直径一般都在100微米以上，但是高等动物细胞的直径大都小于25微米，其一次会喷出多层细胞。五、无法对成形体侧表面进行喷涂，电机助推式快速成形喷头需要竖直安装，如果进行水平安装，则浆料从喷嘴挤出后会在自身重力的作用下滴落，无法在成形体侧表面附着。
发明内容
本发明针对已有技术的不足之处，提供一种肺替代物及其3D打印与注射成形制造方法。该肺替代物具备左右肺叶、支血管网络和支气管网络，可与人体血管、气管相连，实现实体器官肺的再生修复。该3D打印与注射成形制造网络综合了目前各种成形技术的优势，提高了多种细胞、多种材料多层次、多方位成形时的灵活性和生理功能，实现了三种以上含不同材料尤其是细胞微球在三维空间的精确定位装配。
本发明的技术方案如下：
一种肺替代物，其特征在于，所述肺替代物包括右肺叶、左肺叶、气管、支气管网络、支动脉血管网络、支静脉血管网络、肺泡组织与肺外膜；
所述的右肺叶和左肺叶呈扁平树叶状对称分布于气管下方，所述的支动脉血管和支静脉血管并列开口于气管下方，分别与人体心脏主动脉和胸腔主静脉相连；
所述的支气管网络、支动脉血管网络和支静脉血管网络分支后呈树枝状伸入左肺叶和右肺叶中，与肺泡组织和肺外膜共同组成左肺叶和右肺叶中的类组织；
所述的气管和支气管网络由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液，或由干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分以及合成高分子溶液通过3D打印成形；支气管网络由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液,或由干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液通过3D打印成形；支动脉血管网络和支静脉血管网络由内皮细胞和细胞外基质成分溶液，或由干细胞、内皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液以及合成高分子溶液通过3D打印成形；
肺泡组织由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液，或由干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液，或含肺上皮细胞和细胞外基质成分的微球，或含干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分的微球在支气管网络、支动脉血管网络和支静脉血管网络3D打印成形过程中由针管注射成形；肺外膜由合成高分子溶液通过3D打印成形
上述技术方案中，所述的细胞外基质成分溶液采用质量百分浓度为1-15％海藻酸钠、活性肽、胶原、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、粘多糖、糖蛋白、基质胶、右旋糖、壳聚糖、明胶和纤维蛋白原溶液中的至少一种；细胞外基质成分中细胞密度为1×101-6个/mL；细胞外基质成分中复合质量百分比为0.01-1％的抗凝血因子、细胞冻存因子和生长因子。
所述干细胞为脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种。所述的合成高分子材料采用聚乙烯、聚己内酯、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚乳酸、聚酯以及乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。
所述干细胞为脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种。所述的合成高分子材料采用聚乙烯、聚己内酯、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚乳酸、聚酯以及乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。
本发明提供的一种肺替代物的3D打印与注射成形制造方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
1)分别准备细胞、细胞外基质溶液、高分子交联剂、细胞培养液和合成高分子溶液，通过3D扫描设备扫描患者肺部，根据所扫描的数据构建肺替代物3D数字模型；
2)将干细胞、肺上皮细胞、内皮细胞与分别与相应的细胞外基质成分溶液混合均匀，细胞密度为1×101-6个/mL；在干细胞与细胞外基质成分溶液中分别加入质量百分比为0.01-1％内皮细胞生长因子或上皮细胞生长因子；采用非接触式高压静电发生器将肺上皮细胞与海藻酸钠溶液快速滴入氯化钙溶液中，制备肺上皮细胞微球；将干细胞与细胞外基质成分溶液、高分子交联剂、细胞培养液、合成高分子溶液分别装在3D打印设备的料桶中，将肺上皮细胞与细胞外基质成分溶液制成的溶液或微球、高分子交联剂、细胞培养液分别装在注射器针管中；
3)根据3D软件对肺替代物3D模型进行数据处理，并将数据转化为3D打印设备利用的数字模型或工艺参数；
4)利用多喷头3D打印设备按照步骤3)简化数字模型将含内皮细胞生长因子的干细胞与细胞外基质成分溶液混合物、含上皮细胞生长因子的干细胞与细胞外基质成分溶液混合物、合成高分子溶液分别打印形成支血管网络、支气管网络和肺外膜，每打印一层或几层，将肺上皮细胞与细胞外基质成分制成的溶液或微球用注射针管注射到肺外膜与支气管网络、支血管网络的间隙中，并向所形成的三维结构上喷射高分子交联剂和细胞培养液，通过支血管网络、支气管网络和肺外膜层层叠加和肺上皮细胞微球的不断注射最后形成肺替代物三维结构。
本发明与现有技术相比，有以下优点及突出性的技术效果：
①本发明的肺替代物，具有左右肺叶、支血管网络和支气管网络，可与人体血管、气管相连，实现肺器官的再生修复，完成人体肺的各种生理功能；②本发明采用的多喷头3D打印与注射成形技术保证了非均质异向材料从不同角度、不同方向快速成形，扩大了细胞、水凝胶、合成高分子溶液的应用范围；③将合成高分子材料复合到含细胞与细胞外基质成分外围，增强了血管和气管网络的抗缝合强度，使其可直接与体内相应网络相连接，增强了植入细胞的存活力和在体内的稳定性；④将含上皮细胞的细胞外基质成分溶液或微球在肺外膜与血管、气管网络3D打印过程直接注射到三者间的缝隙中，提高了异质材料的复合效率和成形结构的生理功能。
附图说明
图1本发明提供的肺替代物剖面示意图。
图1中：101-右肺叶；102-肺外膜；103-支动脉血管网络；104-气管；105-左肺叶；106-肺泡组织；107-支气管网络；108-支静脉血管网络。
具体实施方法
图1本发明提供的肺替代物剖面示意图，所述肺替代物包括右肺(101、左肺叶105、气管104、支气管网络107、支动脉血管网络103、支静脉血管网络108、肺泡组织106与肺外膜102；所述的右肺叶101和左肺叶105呈扁平树叶状对称分布于气管104下方，所述的支动脉血管103和支静脉血管108并列开口于气管下方，分别与人体心脏主动脉和胸腔主静脉相连；所述的支气管网络107、支动脉血管网络103和支静脉血管网络108分支后呈树枝状伸入左肺叶和右肺叶中，与肺泡组织106和肺外膜102共同组成左肺叶和右肺叶中的类组织；所述的气管(104)和支气管网络107由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液，或由干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分以及合成高分子溶液通过3D打印成形；支气管网络由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液,或由干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液通过3D打印成形；支动脉血管网络103和支静脉血管网络108由内皮细胞和细胞外基质成分溶液，或由干细胞、内皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液以及合成高分子溶液通过3D打印成形；肺泡组织106由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液，或由干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液，或含肺上皮细胞和细胞外基质成分的微球，或含干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分的微球在支气管网络、支动脉血管网络103和支静脉血管网络1083D打印成形过程中由针管注射成形；肺外膜102由合成高分子溶液通过3D打印成形
所述的细胞外基质成分溶液采用质量百分浓度为1-15％海藻酸钠、活性肽、胶原、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、粘多糖、糖蛋白、基质胶、右旋糖、壳聚糖、明胶和纤维蛋白原溶液中的至少一种；细胞外基质成分中细胞密度为1×101-6个/mL；细胞外基质成分中复合质量百分比为0.01-1％的抗凝血因子、细胞冻存因子和生长因子。肺上皮细胞微球采用海藻酸钠基水溶液包裹肺上皮细胞，其中海藻酸钠基水凝胶包括海藻酸钠、海藻酸钠/胶原、海藻酸钠/明胶溶液中的至少一种。所述干细胞为脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种。所述的合成高分子材料采用聚乙烯、聚己内酯、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚乳酸、聚酯以及乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。
所述的肺替代物的3D打印与注射成形制造方法，其具体包括如下步骤：
1)分别准备细胞、细胞外基质溶液、高分子交联剂、细胞培养液和合成高分子溶液，通过3D扫描设备扫描患者肺部，根据所扫描的数据构建肺替代物3D数字模型；
2)将干细胞、肺上皮细胞、内皮细胞与分别与相应的细胞外基质成分溶液混合均匀，细胞密度为1×101-6个/mL；在干细胞与细胞外基质成分溶液中分别加入质量百分比为0.01-1％内皮细胞生长因子或上皮细胞生长因子；采用非接触式高压静电发生器将肺上皮细胞与海藻酸钠溶液快速滴入氯化钙溶液中，制备肺上皮细胞微球；将干细胞与细胞外基质成分溶液、高分子交联剂、细胞培养液、合成高分子溶液分别装在3D打印设备的料桶中，将肺上皮细胞与细胞外基质成分溶液制成的溶液或微球、高分子交联剂、细胞培养液分别装在注射器针管中；
3)根据3D软件对肺替代物3D模型进行数据处理，并将数据转化为3D打印设备利用的数字模型或工艺参数；
4)利用多喷头3D打印设备按照步骤3)简化数字模型将含内皮细胞生长因子的干细胞与细胞外基质成分溶液混合物、含上皮细胞生长因子的干细胞与细胞外基质成分溶液混合物、合成高分子溶液分别打印形成支血管网络、支气管网络和肺外膜，每打印一层或几层，将肺上皮细胞与细胞外基质成分制成的溶液或微球用注射针管注射到肺外膜与支气管网络、支血管网络的间隙中，并向所形成的三维结构上喷射高分子交联剂和细胞培养液，通过支血管网络、支气管网络和肺外膜层层叠加和肺上皮细胞微球的不断注射最后形成肺替代物三维结构。
下面举出两个具体的实施例，以进一步理解本发明。
实施例1
1)3D打印材料制备
取0.1g壳聚糖和1g明胶置于100mL培养液中使其完全溶解，灭菌处理得到壳聚糖‐明胶溶液；制备0.05g/ml的过磷酸钠水溶液作为壳聚糖交联剂和细胞培养液(DMEM培养液)；提取脂肪干细胞(ADSCs)和肺上皮细胞，培养传代；将脂肪干细胞(ADSCs)与壳聚糖‐明胶溶液混合，其中脂肪干细胞浓度为1×105个/mL；将脂肪干细胞‐壳聚糖‐明胶溶液中分别加入质量百分比0.1％的内皮细胞生长因子和上皮细胞生长因子；将可降解聚氨酯溶于四乙二醇中得到质量体积浓度为2％的合成高分子溶液，灭菌处理待用。
2)肺上皮细胞微球制备
将肺上皮细胞与质量体积比为2％的海藻酸钠水溶液混合均匀，制成肺上皮细胞与海藻酸钠溶液混合物，其中肺上皮细胞浓度为1×104个/mL；采用非接触式高压静电发生器将肺上皮细胞与海藻酸钠溶液混合物快速滴入0.1g/ml氯化钙溶液中制成肺上皮细胞微球。
3)建模
采用计算机三维建模方法用三维绘图软件设计肺替代物三维结构，包括分支血管网络结构、分支气管网络结构以及左右肺叶外部轮廓结构。
4)成形
将含脂肪干细胞与内皮细胞生长因子或上皮细胞生长因子的壳聚糖‐明胶溶液、聚氨酯溶液分别装入多喷头3D打印设备的料桶中，按步骤3)中分支血管网络、分支气管网络和肺外膜结构模型通过3D打印设备控制软件打印成形；将肺上皮细胞微球、过磷酸钠交联剂、细胞培养液分别装在5、10、20mL注射针管中；在支血管网络、支气管网络和肺外膜打印成形过程中，每打印一层或几层，将肺上皮细胞微球用注射针管注射到肺外膜与支气管网络、支血管网络的间隙中，然后向所形成的三维结构上喷射过磷酸钠交联剂和细胞培养液；通过支血管网络、支气管网络和肺外膜层层叠加和肺上皮细胞微球的不断注射最后形成肺替代物三维结构。
5)后续培养
将所构建的肺替代物三维结构置于体外生物反应器中进行培养，促使细胞间建立连接并诱导脂肪干细胞细胞定向生长分化，最终形成含有支血管和分支气管网络的可植入型肺替代物。
实施例2
1)3D打印材料制备
取1g海藻酸钠和20g明胶置于100mL培养液中使其完全溶解，灭菌处理得到海藻酸钠‐明胶溶液；制备1g/ml的氯化钙水溶液作为海藻酸钠交联剂和细胞培养液(DMEM培养液)；提取骨髓干细胞和肺上皮细胞，培养传代；将骨髓干细胞与海藻酸钠‐明胶溶液混合，其中骨髓干细胞浓度为3×104个/mL；将骨髓干细胞‐海藻酸钠‐明胶溶液中分别加入质量百分比0.1％的内皮细胞生长因子与细胞转移因子、血小板因子混合物和上皮细胞生长因子；将可降解聚己内酯溶于四乙二醇中得到质量体积浓度为2％的合成高分子溶液，灭菌处理待用。
2)针管注射材料制备
将肺上皮细胞与质量体积比为1％的胶原水溶液混合均匀，制成肺上皮细胞与胶原溶液混合物，其中肺上皮细胞浓度为2×106个/mL。
3)建模
采用计算机三维建模方法用三维绘图软件设计肺替代物三维结构，包括分支血管网络结构、分支气管网络结构以及左右肺叶外部轮廓结构。
4)成形
将含细胞海藻酸钠‐明胶溶液、聚己内酯溶液分别装入多喷头3D打印设备的料桶中，按步骤3)中分支血管网络、分支气管网络和肺外膜结构模型通过3D打印设备控制软件打印成形；将肺上皮细胞与胶原溶液混合物、氯化钙交联剂、细胞培养液分别装在注射针管中；在支血管网络、支气管网络和肺外膜打印成形过程中，每打印一层或几层，将肺上皮细胞与胶原溶液混合物用注射针管注射到肺外膜与支气管网络、支血管网络的间隙中，然后向所形成的三维结构上喷射氯化钙交联剂和细胞培养液；通过支血管网络、支气管网络和肺外膜层层叠加和肺上皮细胞微球的不断注射最后形成肺替代物三维结构。
5)后续培养
将所构建的肺替代物三维结构置于体外生物反应器中进行培养，促使细胞间建立连接并诱导骨髓干细胞细胞定向生长分化，最终形成含有支血管和分支气管网络的可植入型肺替代物。

Claims (5)

1.一种肺替代物，其特征在于，所述肺替代物包括右肺叶(101)、左肺叶(105)、气管(104)、支气管网络(107)、支动脉血管网络(103)、支静脉血管网络(108)、肺泡组织(106)与肺外膜(102)；
所述的右肺叶(101)和左肺叶(105)呈扁平树叶状对称分布于气管(104)下方，所述的支动脉血管(103)和支静脉血管(108)并列开口于气管下方，分别与人体心脏主动脉和胸腔主静脉相连；
所述的支气管网络(107)、支动脉血管网络(103)和支静脉血管网络(108)分支后呈树枝状伸入左肺叶和右肺叶中，与肺泡组织(106)和肺外膜(102)共同组成左肺叶和右肺叶中的类组织；
所述的气管(104)和支气管网络(107)由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液，或由干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分以及合成高分子溶液通过3D打印成形；支气管网络(107)由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液,或由干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液通过3D打印成形；支动脉血管网络(103)和支静脉血管网络(108)由内皮细胞和细胞外基质成分溶液，或由干细胞、内皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液以及合成高分子溶液通过3D打印成形；
肺泡组织(106)由肺上皮细胞和细胞外基质成分溶液，或由干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分溶液，或含肺上皮细胞和细胞外基质成分的微球，或含干细胞、上皮细胞生长因子和细胞外基质成分的微球在支气管网络、支动脉血管网络(103)和支静脉血管网络(108)3D打印成形过程中由针管注射成形；肺外膜(102)由合成高分子溶液通过3D打印成形。
2.如权利要求1所述的一种肺替代物，其特征在于：所述的细胞外基质成分溶液采用质量百分浓度为1-15％海藻酸钠、活性肽、胶原、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、粘多糖、糖蛋白、基质胶、右旋糖、壳聚糖、明胶和纤维蛋白原溶液中的至少一种；细胞外基质成分中细胞密度为1×101-6个/mL；细胞外基质成分中复合质量百分比为0.01-1％的抗凝血因子、细胞冻存因子和生长因子；肺上皮细胞微球采用海藻酸钠基水溶液包裹肺上皮细胞，其中海藻酸钠基水凝胶包括海藻酸钠、海藻酸钠/胶原、海藻酸钠/明胶溶液中的至少一种。
3.如权利要求1所述的一种肺替代物，其特征在于：所述干细胞为脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种。
4.如权利要求1、2或3所述的一种肺替代物，其特征在于：所述的合成高分子材料采用聚乙烯、聚四氟乙烯、聚酯以及乳酸与乙醇酸共聚物中的一种或几种材料的复合物。
5.一种如权利要求1所述的肺替代物的三维打印与注射成形制造方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
1)分别准备细胞、细胞外基质溶液、高分子交联剂、细胞培养液和合成高分子溶液，通过3D扫描设备扫描患者肺部，根据所扫描的数据构建肺替代物3D数字模型；
2)将干细胞、肺上皮细胞、内皮细胞与分别与相应的细胞外基质成分溶液混合均匀，细胞密度为1×101-6个/mL；在干细胞与细胞外基质成分溶液中分别加入质量百分比为0.01-1％内皮细胞生长因子或上皮细胞生长因子；采用非接触式高压静电发生器将肺上皮细胞与海藻酸钠溶液快速滴入氯化钙溶液中，制备肺上皮细胞微球；将干细胞与细胞外基质成分溶液、高分子交联剂、细胞培养液、合成高分子溶液分别装在3D打印设备的料桶中，将肺上皮细胞与细胞外基质成分溶液制成的溶液或微球、高分子交联剂、细胞培养液分别装在注射器针管中；
3)根据3D软件对肺替代物3D模型进行数据处理，并将数据转化为3D打印设备利用的数字模型或工艺参数；
4)利用多喷头3D打印设备按照步骤3)简化数字模型将含内皮细胞生长因子的干细胞与细胞外基质成分溶液混合物、含上皮细胞生长因子的干细胞与细胞外基质成分溶液混合物、合成高分子溶液分别打印形成支血管网络、支气管网络和肺外膜，每打印一层或几层，将肺上皮细胞与细胞外基质成分制成的溶液或微球用注射针管注射到肺外膜与支气管网络、支血管网络的间隙中，并向所形成的三维结构上喷射高分子交联剂和细胞培养液，通过支血管网络、支气管网络和肺外膜层层叠加和肺上皮细胞微球的不断注射最后形成肺替代物三维结构。
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