CN103057123A - 一种三维生物打印系统及基于三维生物打印系统制备神经再生植入体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种三维生物打印系统，包括三维模型设计工作站和三维生物打印机，所述三维生物打印机包括打印头、墨盒和打印平台，其特征在于所述打印平台带有制冷装置。本发明还提供了一种利用三维打印系统制备神经再生植入体的方法。本发明可以广泛应用于各类细胞外基质分子以及多糖类分子支架的构建成型，且可以精确控制支架的形态和相应参数。

Description

一种三维生物打印系统及基于三维生物打印系统制备神经再生植入体的方法

技术领域

本发明涉及生物医学工程和医疗技术领域，涉及神经再生植入体成型制备领域，特别涉及一种三维生物打印系统及基于三维生物打印系统制备神经再生植入体的方法。

背景技术

由各种交通事故、创伤或自然灾害造成的人体外周神经组织损伤或缺损会导致神经功能障碍，传统的修复方法是自体组织移植术，被认为是神经损伤修复的金标准，但是这种方法虽然可以取得满意疗效，但它是以牺牲自体健康组织为代价的办法，并且供体器官来源极为有限，另外，因免疫排斥反应需长期使用免疫抑制剂，所以可能会导致很多并发症及附加损伤。自80年代科学家首次提出“组织工程学”概念以后，组织工程技术已经为众多的组织缺损、器官功能衰竭病人的治疗带来了曙光，组织工程中的三要素主要包括种子细胞、支架材料以及细胞生长的微环境，而其中支架材料是用于支撑细胞成长为一个完整的组织的框架材料，因此成为组织工程研究及其临床应用的关键之一。用于神经再生的理想的组织工程支架材料应具有以下特点：良好的生物组织相容性，不引起机体的免疫排斥反应，无毒性；具有生物可降解性及降解可调节性，可塑性和一定的机械强度；有一定孔隙率，良好的表面活性，维持生长其上的细胞形态和表型；并能增进细胞的黏附和增殖，诱导组织再生。目前，组织工程生物支架材料主要分两大类：天然生物材料(如脱细胞细胞外基质，多糖，丝素蛋白及胶原等)和人工合成的可降解材料(如聚羟基乙酸及其复合物、聚乳酸、聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物等)。天然生物材料突出的优点在于：生物相容性好，与细胞外基质结构相似，利于细胞的黏附、增殖和分化，毒性小，易降解，降解产物被人体吸收后不产生炎症，所以在组织工程中作为细胞培养的支架材料具有人工合成材料所不可比拟的优势。鉴于上述原因，采用天然生物材料制备适用于人体神经再生的组织工程支架已经成为人们研究的热点，但大多数文献中报导的支架成型方法（如粒子致孔法、静电纺丝法、冻干法等）往往存在着制备时间长，有机溶剂残留以及力学性能差等问题，在一定程度上限制了其应用。

近年来，三维打印技术在制备组织工程用天然生物材料支架方面得到了快速发展和应用。三维打印技术最早是由美国麻省理工学院Emanual Sachs等人1989年开发的，是一项基于喷射型的快速成型技术，它首先借助计算机辅助设计（CAD）技术制备所打印物体的STL电子文档模型，然后依据“逐层打印，层层叠加”的原理来打印具有特殊外形或复杂内部结构的物体。其成型过程不受任何几何形状的限制，打印位置、打印次数和打印速度都可以随意控制，不同的材料可以通过不同喷头打印，打印的物质可以是溶液、悬浮液或乳液，因此，三维打印可以很容易控制局部材料组成、微观结构以及表面特性。另外该技术具有操作方便、加工过程灵活、成型速度快、运行费用低且可靠性高的特点，现在已成为快速成型技术领域最有生命力的新技术之一。文献Porous Ti6Al4V scaffold directly fabricating by rapid prototyping（Jia Ping Li.Biomaterials 2006, 27 1223–1235）公开了将Ti6Al4V粉末溶解于有机溶剂中制备获得Ti6Al4V胶状物，然后将该胶状物放入打印机“墨盒”中，按照三维打印机中的CAD模型，成功打印出了纤维状的Ti6Al4V（容易干燥成型），并制备了具有多孔结构的矩形块状体，最后进一步对该多孔块状体进行烧结成型，并证实了该打印的多孔状Ti6Al4V块状体具有促进骨细胞粘附和生长的功能，在组织工程领域具潜在应用价值。文献3D Fiber-Deposited Electrospun Integrated Scaffolds Enhance Cartilage Tissue Formation（Lorenzo Moroni. Adv. Funct. Mater. 2008, 18, 53–60）公开了联合应用三维打印技术和熔融静电纺丝法则成功制备出了PEOT/PBT聚合物的多孔状结构,该多孔状聚合物结构同样具有较好的促进细胞生长的作用。此外，文献Incorporation of growth factor containing Matrigel promotes vascularization of porous PLGA scaffolds（M. W. Laschke, J Biomed Mater Res 85A:397–407, 2008）报导了将熔融的PLGA用三维打印机打印成多孔网状结构，并负载生长因子用于血管再生，发现负载生长因子的多孔PLGA网状支架能较快的促进组织工程化血管的构建。

上述用到的材料主要涉及无机材料以及人工合成高分子材料，这类材料往往具有较好的力学性能、耐高温性能以及容易加工成型等特点，所以比较容易用于三维打印成型制备领域。利用三维打印成型的这类材料已被尝试用于骨组织、皮肤组织、神经组织以及心血管组织等的修复，且取得了一定的初步研究成果。但是，对于一些天然生物材料（细胞外基质蛋白、多糖类分子以及丝素蛋白类分子等）来说，由于其性质的特殊性，如不耐高温、易变性、配制溶液后具有流动性等不易加工成型的特点，在很大程度上限制了其在三维打印成型领域的应用。目前用于组织工程的天然生物材料三维打印技术主要包括热注入打印技术、压电打印技术、激光打印等方法，其打印成型方法主要包括沉淀法、热固法、注入模塑法和交联法。其中，只有少量文献报导了将天然生物材料跟人工合成材料复合用以三维打印成型的研究，文献“Fabrication of 3D chitosan–hydroxyapatite scaffolds ”（ T.H. Ang. Materials Science and Engineering C 2002, 20: 35–42）采用三维打印技术和沉淀法相结合的方法，利用不可溶解性的特点，将壳聚糖和羟基磷灰石混合液打印到NaOH和乙醇的混合溶液中，形成一种类似水凝胶的沉淀物，然后对该沉淀物进行冻干成型，获得了壳聚糖和羟基磷灰石的复合支架。尽管将天然生物材料壳聚糖进行了打印成型，但是在打印的过程中主要还是借助了羟基磷灰石的作用来提高成型物的力学性能，而且由于是直接打印在溶液里成型，因此难以控制成型物形状的稳定性，支架形态易发生变化，另外，由于天然生物材料具有特定的生物学特性（构象变化，容易变性等），因此不是所有这类材料都适用于沉淀法成型。目前，尚无文献报道将三维打印技术专门应用于单独一种天然生物材料。

发明内容 

 本发明针对现有技术不足，提供了一种三维生物打印系统及基于三维生物打印系统制备神经再生植入体的方法，通过控制打印平台冷冻温度，在较短时间内使材料分子冷冻成型，尤其是对于一些容易变性的天然生物材料，不仅能使不易成型的天然生物材料液体快速冷冻成型且能够保留其在溶液中的构象以及生物活性。

 本发明具体技术方案如下：

一种三维生物打印系统，包括三维模型设计工作站和三维生物打印机，所述三维生物打印机包括打印头、墨盒和打印平台，所述打印平台带有制冷装置。

上述三维模型设计工作站可采用本领域常规使用的方法进行计算机辅助设计(CAD) 建模。这些设计可来源于对天然器官或组织的数字化图像重构。例如可通过对人体非侵害的扫描(如MRI 或CT)或精细分层的三维重构等得到图像数据，也可利用一些理论上的原理、法则进行空间结构的设计，得到组织的数据结构。

上述三维生物打印机可以按照需要对市售的打印机进行改造，如惠普型号为500、550或55C喷墨打印机，改装方法参考美国专利US7051654，采用墨盒型号为HP51626A。或者选用德国Envision Technology公司开发的Bioplotter三维生物打印设备（图1），可用于细胞/基质材料的直接打印，可以采用不同模式、梯度、格栅的形式对微量的生长因子和其它蛋白质，甚至是完整的细胞进行合理的分配，能够在指定的区域进行多次打印，该设备自带一套控制软件和一套分层软件，可选配Magics软件，将现成的CT或MRI文件转为STL格式导入分层软件进行分层处理，再导入控制软件进行三维打印操作。

在采用现有改装技术对打印机进行改造或者直接选用市售的三维生物打印系统的基础上，本发明对打印机的打印平台进行改造，使其带有制冷装置，所述制冷装置可以是市售的超低温制冷设备，可以为低温箱（图2-（1）），打印平台置于低温箱内，或者是低温传热板（图2-（2）），板内排布低温冷凝管，将打印平台置于低温传热板上，使打印平台保持低温，所述制冷装置还可以为装有低温材料的容器（图2-（3）），如干冰或液氮，将打印平台放置在容器顶盖上保持低温状态，这种方式下容器为非密闭状态，便于低温材料的取放以及气体溢出。进一步的，所述的超低温制冷制备还可以带有温控装置，如低温箱或者低温传热板，可以对制冷温度进行精确控制。由于打印机打印头本身可带有加热装置，可使打印头在打印时保持0℃以上，避免喷头堵塞。

 本发明还提供了一种利用上述三维打印系统制备神经再生植入体的方法，包括以下步骤：

（1）建立要打印的植入体的计算机实体模型，所述实体模型来源于人体的不同组织和器官，对其进行切片分层，得到每层的形状信息；

（2）配制需要进行神经再生植入体材料溶液，备用；

（3）将步骤（2）配制好的神经再生植入体材料溶液加入到三维打印机的墨盒中，将步骤（1）设计好的含有植入体形状信息的电子文档输入三维打印设备的配套软件，指导设备工作，上述电子文档文件可也可以为直接的CT或MRI扫描文件；将打印机平台温度控制在0℃以下，优选-20到-80℃，打印机喷头直径为50-100μm，打印机喷头（图3-（1））在打印平台（图3-（3））上首先在xy轴方向上移动喷涂（图3-（4）），优选打印机喷头在xy轴方向上的移动速度为1-50mm/s，形成支架的二维平面，打印完一层后（图3-（5）），打印机喷头沿z轴方向上移（图3-（6）），重新打印另一层，优选打印机喷头在z轴方向上的移动高度为100-150μm，打印机喷头在xy轴方向上打印完成后与在z轴方向上开始打印前的时间间隔控制在2～3min，如此反复，逐层堆积成型（图3-（8）），直到所打印的植入体成型完成；

（4）将植入体进行冻干，即得。

上述步骤（2）中材料可以为无机材料、人工合成高分子材料或天然生物材料，优选天然生物材料，更优选胶原、细胞外基质蛋白、多糖以及丝素蛋白中的一种或几种。

本发明所述的制备方法，还可以在步骤（2）配制天然生物材料溶液的同时还配制细胞因子溶液，将配制好的天然生物材料溶液和细胞因子溶液分别加入到不同的墨盒中，进行生物打印，在打印植入体的同时，将细胞因子打印在植入体表面，由于低温冷冻成型，细胞因子的活性可以得到很好的保留，上述细胞因子优选碱性成纤维生长因子（bFGF）、脑源神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（ NT-3 ）、胶质细胞源神经营养因子（ GDNF ）中的一种或几种，细胞因子在所打印支架材料上的量为1μg/g-10mg/g。

本发明的有益效果

（1）本发明采用低温速冻的方法使神经再生植入体材料溶液在打印到打印平台的同时即冷冻成型，无需在材料溶液中添加成型材料，尤其使难成型的天然生物材料可用于生物打印，扩大了可用材料的范围，且由于无需加入成型辅料，增加了材料的安全性和可降解性。此外在进行细胞因子复合打印时，低温环境有利于保持细胞因子的活性。本发明可以广泛应用于各类细胞外基质分子以及多糖类分子支架的构建成型，且可以精确控制支架的形态和相应参数。

（2）本发明方法简单，易于操作，成本低，能三维成型具有复杂形态的支架，能满足临床需要，适合于组织工程支架的制备；

（3）本发明能根据人体组织或器官的不同需要，调整打印参数，结合三维打印和冷冻成型技术的优势，能直接将溶液状的天然生物材料制备成具有各种结构（多孔、管状）和力学性能的三维支架，用于组织工程和再生医学；

（4）本发明能根据实际需要通过控制不同打印机喷头和变换打印的材料来制备不同天然生物材料的复合支架。

附图说明

图1是Bioplotter三维生物打印设备结构示意图。

图2是本发明所述制冷装置示例图。

图3是本发明所述三维打印机工作过程示意图（以低温箱为例）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的应用范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1 壳聚糖导管的三维生物打印

（1）利用CAD软件建立壳聚糖导管模型，设计壳聚糖导管的外径为1mm，内径为0.5mm，管厚0.5mm，高度为30mm。

（2）将3g脱乙酰壳聚糖溶解于100mL 2%的乙酸溶液中，然后在室温下进行磁力搅拌2h，使壳聚糖完全溶解，并在真空环境下除去气泡，获得3% w/v的壳聚糖-乙酸溶液；

（3）开启Bioplotter三维打印机，导入步骤（1）设计的要打印的壳聚糖导管模型电子文档文件，并调整相应的打印参数；

（3）使冷冻成型平台处于工作状态，保持冷冻成型室内温度在-20℃～-80℃；

（4）将上述制备好的壳聚糖-乙酸溶液加入到三维打印机的墨盒中。选用打印机喷头直径50μm。根据导管电子文档每一层的截面信息，首先在冷冻成型室内的样品台上按照xy轴方向打印并冷冻形成二维平面，每一层壳聚糖导管的打印速度为50mm/s。打印完一层后，静止2～3min，使其进一步充分凝固，然后打印机喷头上移100μm，进行下一层的打印，如此反复，逐层堆积成型，直至最终导管完成；

（5）导管成型完成后，尽快转移到冻干机中，对导管进行冷冻干燥处理，冻干时间大于24h；

（6）冷冻干燥完成后，将导管取出，放入0.1M NaOH溶液中中和掉多余的乙酸，室温下浸泡24h后弃掉NaOH溶液，然后再用去离子水将导管进行反复清洗，直至pH呈中性，最后晾干备用。

实施例2 丝素蛋白导管的三维生物打印

（1）利用CAD软件建立丝素蛋白导管模型，设计丝素蛋白导管的外径为1mm，内径为0.5mm，管厚0.5mm，高度为30mm；

（2）将5g丝素蛋白纤维溶解在50mL的三元溶剂体系 CaCl₂/H₂O/EtOH 溶液中（摩尔比 1:8:2），溶解温度为80℃，溶解时间为1h，然后置纤维素管（截留分子量： 12,000-14,000 ）用蒸馏水透析，在室温下放置3天。透析得的溶液用旋转式蒸发器真空条件40℃浓缩，获得丝素蛋白溶液；

（3）开启Bioplotter三维打印机，导入步骤（1）设计的要打印的丝素蛋白导管模型电子文档文件，并调整相应的打印参数；

（4）同时使冷冻成型平台处于工作状态，保持冷冻成型室内温度在-20℃～-80℃；

（5）将上述制备好的丝素蛋白溶液加入到三维打印机的墨盒中。选用打印机喷头直径100μm。根据导管电子文档中每一层的截面信息，打印头首先在冷冻成型室内的样品台上按照xy轴方向打印冷冻形成二维平面，每一层丝素蛋白导管的打印速度为25mm/s。打印完一层后，静止2～3min，使其进一步充分凝固，然后打印头上移150μm，进行下一层的打印，如此反复，逐层堆积成型，直至最终导管完成；

（5）导管成型完成后，尽快转移到冻干机中，对导管进行冷冻干燥处理，冻干时间大于24h；

（6）冷冻干燥完成后，将导管取出，放入80%（v/v）的甲醇溶液中进一步交联处理20min，最后晾干备用，如此制备的丝素蛋白导管不溶于水。

实施例3 复合碱性成纤维生长因子的壳聚糖导管的三维生物打印

（1）利用软件建立壳聚糖导管模型，设计壳聚糖导管的外径为1mm，内径为0.5mm，管厚0.5mm，高度为30mm；

（2）将3g脱乙酰壳聚糖溶解于100mL 2%的乙酸溶液中，然后在室温下进行磁力搅拌2h，使壳聚糖完全溶解，并在真空环境下除去气泡，获得3% w/v的壳聚糖-乙酸溶液；

配制碱性成纤维生长因子溶液：室温下将碱性成纤维生长因子溶解于磷酸盐缓冲液中制备获得50μg/mL的碱性成纤维生长因子溶液；

（3）开启Bioplotter三维打印机，导入步骤（1）设计的要打印的壳聚糖导管模型电子文档文件，并调整相应的打印参数，设计在打印至壳聚糖导管外表面层时，每喷完壳聚糖导管内表面层的壳聚糖材料溶液后，连有装有碱性成纤维生长因子墨盒的打印机喷头喷出碱性成纤维生长因子，使碱性成纤维生长因子包覆在壳聚糖导管的内表面层；

（3）使冷冻成型平台处于工作状态，保持冷冻成型室内温度在-20℃～-80℃；

（4）将上述制备好的壳聚糖-乙酸溶液和碱性成纤维生长因子溶液加入到各自的三维打印机的墨盒中。选用打印机喷头直径75μm。根据导管电子文档每一层的截面信息，首先在冷冻成型室内的样品台上按照xy轴方向打印并冷冻形成二维平面，每一层壳聚糖导管的打印速度为1mm/s。打印完一层壳聚糖支架层后，静止2～3min，使其进一步充分凝固，然后移动碱性成纤维生长因子打印机喷头到已打印好的壳聚糖导管内表面层，打印速度为1mm/s，打印完一层后，静止1～2min，使其进一步充分凝固，然后打印机喷头上移125μm，再重复进行上述打印操作，如此反复，逐层堆积成型，直至最终导管完成；

（5）导管成型完成后，尽快转移到冻干机中，对导管进行冷冻干燥处理，冻干时间大于24h；

（6）冷冻干燥完成后，将导管取出，放入0.1M NaOH溶液中中和掉多余的乙酸，室温下浸泡1h后弃掉NaOH溶液，然后再用去离子水将导管进行反复清洗，直至pH呈中性，最后晾干备用。

实施例4 复合神经营养因子3的丝素蛋白导管的三维生物打印

（1）利用软件建立丝素蛋白导管模型，设计丝素蛋白导管的外径为1mm，内径为0.5mm，管厚0.5mm，高度为30mm；

（2）将5g丝素蛋白纤维溶解在50mL的三元溶剂体系 CaCl₂/H₂O/EtOH 溶液中（摩尔比 1:8:2），溶解温度为80℃，溶解时间为1h，然后置纤维素管（截留分子量： 12,000-14,000 ）用蒸馏水透析，在室温下放置3天。透析得的溶液用旋转式蒸发器真空条件40℃浓缩，获得丝素蛋白溶液；

配制神经营养因子3溶液：室温下将神经营养因子3溶解于磷酸盐缓冲液中制备获得50μg/mL的神经营养因子3溶液；

（3）开启Bioplotter三维打印机，导入步骤（1）设计的要打印的丝素蛋白导管模型电子文档文件，并调整相应的打印参数，设计在打印至丝素蛋白导管内表面层时，每喷完丝素蛋白导管外表面层的丝素蛋白材料溶液后，连有装有神经营养因子3墨盒的打印机喷头喷出神经营养因子3，使神经营养因子3包覆在丝素蛋白导管的内表面层；

（4）同时使冷冻成型平台处于工作状态，保持冷冻成型室内温度在-20℃～-80℃；

（5）将上述制备好的丝素蛋白溶液和神经营养因子3的溶液加入到三维打印机各自的墨盒中。选用打印机喷头直径100μm。根据导管电子文档中每一层的截面信息，打印头首先在冷冻成型室内的样品台上按照xy轴方向打印冷冻形成二维平面，每一层丝素蛋白导管的打印速度为10mm/s。打印完一层丝素蛋白支架层后，静止2～3min，使其进一步充分凝固，然后移动神经营养因子3打印机喷头到已打印好的丝素蛋白导管内表面层，打印速度为1mm/s，打印完一层后，静止1～2min，使其进一步充分凝固，然后打印机喷头上移100μm，再重复进行上述打印操作，如此反复，逐层堆积成型，直至最终导管完成，；

（6）导管成型完成后，尽快转移到冻干机中，对导管进行冷冻干燥处理，冻干时间大于24h；

（7）冷冻干燥完成后，将导管取出，放入80%（v/v）的甲醇溶液中进一步交联处理20min，最后晾干备用，如此制备的丝素蛋白导管不溶于水。

Claims (11)

1.一种三维生物打印系统，包括三维模型设计工作站和三维生物打印机，所述三维生物打印机包括打印头、墨盒和打印平台，其特征在于所述打印平台带有制冷装置。

2.根据权利要求1所述的三维生物打印系统，其特征在于所述打印平台还带有温控装置。

3.一种利用如权利要求1所述的三维打印系统制备神经再生植入体的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）建立要打印的植入体的计算机实体模型，对其进行切片分层，得到每层的形状信息；

（2）配制需要进行三维打印的神经再生植入体材料溶液，备用；

（3）将步骤（2）配制好的神经再生植入体材料溶液加入到三维打印机的墨盒中，将步骤（1）设计好的含有植入体形状信息的电子文档输入三维打印设备的配套软件，指导设备工作；将打印机平台温度控制在0℃以下，打印机喷头在打印平台上首先在xy轴方向上移动喷涂，形成支架的二维平面，打印完一层后，打印机喷头沿z轴方向上移，重新打印另一层，如此反复，逐层堆积成型，直到所打印的植入体成型完成；

（4）将植入体进行冻干，即得。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述实体模型来源于人体的不同组织和器官，所述步骤（3）中的电子文档文件为直接的CT或MRI扫描文件。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中神经再生植入体材料为天然生物材料。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述天然生物材料为胶原、细胞外基质蛋白、多糖以及丝素蛋白中的一种或几种。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的打印平台的温度为-20到-80℃。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的打印机喷头直径为50-100μm，打印机喷头在xy轴方向上的移动速度为1-50mm/s。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的打印机喷头在z轴方向上的移动高度为100-150μm，中打印机喷头在xy轴方向上打印完成后与在z轴方向上开始打印前的时间间隔控制在2～3min。

10.根据权利要求3-8之一所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）配制天然生物材料溶液的同时还配制细胞因子溶液，所述步骤（3）将配制好的天然生物材料溶液和细胞因子溶液分别加入到如权利要求1所述的三维打印机不同的墨盒中，进行生物打印。

11.  根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述细胞因子选自碱性成纤维生长因子（bFGF）、脑源神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（ NT-3 ）、胶质细胞源神经营养因子（ GDNF ）中的一种或几种，细胞因子在所打印支架材料上的量为1μg/g-10mg/g。

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