CN108340569A - 一种三维细胞水凝胶复合结构的3d打印方法 - Google Patents

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Abstract

一种三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，在无菌环境下采用多管同心微针打印机进行打印，包括以下步骤：(1)分别配制不同种水凝胶细胞的溶液；(2)设定3D打印底板温度等参数；(3)当底板温度达到设置的要求后，将配制好的一种水凝胶细胞溶液压入3D打印机的同心微针筒内，在气压作用下，在底板上混合交联后形成水凝胶；并将多个不同水凝胶细胞溶液分别压入3D打印机剩下的多根同心微针筒内，然后在设定的3D打印参数下，在气压作用下先打印一层水凝胶后，然后用配备好的凝固剂，微微的喷雾在该层水凝胶上，接着水凝胶和不同种细胞按照预先设定的打印路径进行混合交叉逐层打印。本发明的优点在于多头打印水凝胶细胞。

Description

一种三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法
技术领域
本发明涉及一种生物材料的3D打印方法，具体涉及一种三维细胞水凝胶复 合结构的3D打印方法。
背景技术
水凝胶因其高含水量和类似于细胞外基质的特点，是3D生物打印和人工器 官制备的首选基材，从而成为化学、材料和生命医学领域研究的热点。3D打印 技术是通过计算机数据模型与快速自动成型系统相结合，在无需附加模具的条 件下将液体、粉体、片材等材料逐层加工叠加，最终打印成所需形貌；然而由 于3D打印软件中配置参数太多，很难控制得好，使得3D打印机技术参数的确 定是影响3D打印的一个关键因素。
目前，3D打印机打印水凝胶难以满足三维打印所要求的精准控制、生物相 容性、力学强度、快速成型等苛刻条件，而且投入的3D打印机和打印水凝胶成 本较高。例如现有技术CN 106110399 A公开了一种多组分复合水凝胶的3D打 印方法，水凝胶流量和流速难以程序控制，打印凝胶的大小，粗细，厚度难以 精准控制，打印精度也难以达到微米级；且打印操作繁琐，大大降低了3D打印 的效率。
发明内容
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种三维细胞水凝胶复合结构 的3D打印方法，在无菌环境下采用四同心微针打印机进行打印，包括以下步骤：
(1)配制水凝胶：分别配制不同种水凝胶细胞的溶液；
(2)3D打印参数的设定：3D打印参数设定为打印底板的温度为30～65℃，若 底板温度低30℃，打印材料无法固定，若底板温度高于68℃，成型性差，堆积 尺寸难控制，打印速度为0.2mm/s～1cm/s，若打印速度低于0.2mm/s，喷头易 堵，若打印速度高于1cm/s，容易断线，结构堆积性差，打印体积流率为1 μL/s～5ml/s，若打印体积流率低于1μL/s，成型性差，堆积不起来，若打 印体积流率高于5ml/s，均匀性差，精度难控制，堆积尺寸也难控制，压力为 0.1bar～6bar，若压力低0.1bar，堆积不起来，若压力高于6bar，均匀 性差，精度难控制，堆积尺寸难控制；
(3)打印：当3D打印机底板温度达到设置的要求后，将配制好的一种水凝胶 细胞溶液压入3D打印机的同心微针筒内，在精准调校后的气压作用下，微针 出胶粗细均匀，在底板上混合交联后形成水凝胶；并将多个不同水凝胶细胞溶 液分别压入3D打印机剩下的多根同心微针筒内，然后在设定的3D打印参数下， 在气压作用下先打印一层水凝胶后，然后用先配制好的凝固剂微微喷雾在该层 水凝胶上，接着水凝胶和不同种细胞按照预先设定的打印路径进行混合交叉逐 层打印获得三维细胞水凝胶复合结构。
进一步，所述水凝胶是由带正电荷的水凝胶和带负电荷的水凝胶两种组份 组成，其中，所述带正电荷的水凝胶由以下重量份数的原料制成，氨基化透明 质酸8～15份，纤维素5～12份，阳离子甲壳素2～8份，水20～30份；所述 带负电荷的水凝胶原料由以下重量份数的原料制成，碱性明胶10～20份，海藻 酸30～40份。
进一步，所述带正电荷的水凝胶由以下重量份数的原料制成，氨基化透明 质酸10～13份，纤维素6～8份，阳离子甲壳素3～6份，水22～28份；所述 带负电荷的水凝胶原料由以下重量份数的原料制成，碱性明胶12～18份，海藻 酸32～38份。
进一步，所述带正电荷的水凝胶由以下重量份数的原料制成，氨基化透明 质酸12份，纤维素8份，阳离子甲壳素5份，水25份；所述带负电荷的水凝 胶原料由以下重量份数的原料制成，碱性明胶15份，海藻酸35份。
进一步，所述凝固剂由以下质量百分数的原料组成：水35％～45％、无水硫 酸镁25％～35％、无水氯化钙25％～35％。
进一步，所述凝固剂由以下质量百分数的原料组成：水35％～45％，固体氢 氧化钠25％～35％，碱石灰25％～35％。
进一步，所述水为医用纯化水。
进一步，所述无菌环境为密闭打印室内设置紫外灯，并在多个同心微针旁 设置随动的微型紫外灯,例如利用365紫外光LED光源，同步进行对单个喷头打 印时，对准针筒出胶部位灭菌。
进一步，还安装有无线wifi电子显微镜(优选具有400倍的放大功能的无 线wifi电子显微镜)，在打印过程中，可以同时监控到打印在底板上的多个细 胞变化；且安装有无线wifi摄像全程远程监控及录像设备。
本发明利用传统3D打印机的3维传动结构进行凝胶打印精度可以达到微 米级，利用气动原理，通过程序控制对水凝胶进行流量和流速控制，同时利用 同心微针和流体力学和打印机头的平面运动来控制打印凝胶的大小，粗细，厚 度。
综上，本发明的优点在于水凝胶材料可控性强，可实现精确3D打印，打印 精度高，打印精度可达6～10微米，且打印后材料的力学性能优异，整个打印 机及打印生物成本低。
具体实施方式
下面将参照更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然显示了本公开的示例性实施方 式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反， 提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给 本领域的技术人员。
实施例1
一种水凝胶材料的3D打印方法，开启密闭打印室内设置紫外灯密闭打印室 内设置紫外灯，同时开启同心微针旁设置随动的利用365紫外光LED光源的微 型紫外灯，开启400倍的放大功能的无线wifi电子显微镜，无线wifi摄像全 程远程监控及录像设备，具体包括以下步骤：
(1)配制水凝胶细胞：
①带正电荷的水凝胶的制备：在室温条件下，将12份氨基化透明质酸加入25 份水中搅拌充分溶解，然后滴入8份纤维素充分搅拌，最后加入5份阳离子甲 壳素搅拌混匀，再将所得的混合液涡旋震荡30S，置于37℃水浴中静置2min， 即得带正电荷的水凝胶；
②带负电荷的水凝胶的制备：在室温条件下，将15份碱性明胶和35份海藻酸 搅拌混匀，再将所得的混合液涡旋震荡30S，置于37℃水浴中静置2min，即得B凝胶；
③细胞悬浮液的制备：分别将成骨细胞、胰岛素细胞、平滑肌细胞、内皮细胞 配制成浓度为8×107个/ml的相应的细胞悬浮液；
④水凝胶细胞的配制：将相应的细胞悬浮液、带正电荷的水凝胶、带负电荷的 水凝胶按照1:1:1配比混合；
(2)3D打印参数的设定：3D打印参数设定为打印底板的温度为40℃，打印 速度为0.5mm/s，打印体积流率为1ml/s，压力为1bar；
(3)打印：当3D打印机底板温度达到设置的要求后，将配制好的水凝胶成骨 细胞溶液压入3D打印机的同心微针筒内，在精准调校后的气压作用下，微针 出胶粗细均匀，在底板上混合交联后形成水凝胶；并将水凝胶胰岛素细胞、水 凝胶平滑肌细胞、水凝胶内皮细胞溶液分别压入3D打印机剩下的多根同心微 针筒内，然后在设定的3D打印参数下，在气压作用下先打印一层水凝胶后，然 后用配备好的凝固剂，微微的喷雾在该层水凝胶上，其中，凝固剂由医用纯化 水40％、无水硫酸镁30％、无水氯化钙30％配制而成，接着水凝胶和不同种细胞 按照预先设定的打印路径进行混合交叉逐层打印获得三维细胞水凝胶复合结构。
实施例2
一种水凝胶材料的3D打印方法，开启密闭打印室内设置紫外灯密闭打印室 内设置紫外灯，同时开启同心微针旁设置随动的利用365紫外光LED光源的微 型紫外灯，开启400倍的放大功能的无线wifi电子显微镜，无线wifi摄像全 程远程监控及录像设备，具体包括以下步骤：
(1)配制水凝胶细胞：
①带正电荷的水凝胶的制备：在室温条件下，将8份氨基化透明质酸加入27份 水中搅拌充分溶解，然后滴入12份纤维素充分搅拌，最后加入3份阳离子甲壳 素搅拌混匀，再将所得的混合液涡旋震荡50S，置于35℃水浴中静置3min，即 得带正电荷的水凝胶；
②带负电荷的水凝胶的制备：在室温条件下，将10份碱性明胶和40份海藻酸 搅拌混匀，再将所得的混合液涡旋震荡50S，置于35℃水浴中静置3min，即得 带负电荷的水凝胶；
③细胞悬浮液的制备：分别将成骨细胞、胰岛素细胞、平滑肌细胞、内皮细胞 配制成浓度为1×108个/ml的相应的细胞悬浮液；
④水凝胶细胞的配制：将相应的细胞悬浮液、带正电荷的水凝胶、带负电荷的 水凝胶按照1:1:1配比混合；
(2)3D打印参数的设定：3D打印参数设定为打印底板的温度为35℃，打印 速度为0.6mm/s，打印体积流率为800μL/s，压力为4bar；
(3)打印：当3D打印机底板温度达到设置的要求后，将配制好的水凝胶内皮 细胞溶液压入3D打印机的同心微针筒内，在精准调校后的气压作用下，微针 出胶粗细均匀，在底板上混合交联后形成水凝胶；并将水凝胶胰岛素细胞、水 凝胶平滑肌细胞、水凝胶成骨细胞溶液分别压入3D打印机剩下的多根同心微 针筒内，然后在设定的3D打印参数下，在气压作用下先打印一层水凝胶后，然 后用配备好的凝固剂，微微的喷雾在该层水凝胶上，其中，凝固剂由医用纯化 水35％、无水硫酸镁35％、无水氯化钙30％配制而成，接着水凝胶和不同种细胞 按照预先设定的打印路径进行混合交叉逐层打印获得三维细胞水凝胶复合结构。
实施例3
一种水凝胶材料的3D打印方法，开启密闭打印室内设置紫外灯密闭打印室 内设置紫外灯，同时开启同心微针旁设置随动的利用365紫外光LED光源的微 型紫外灯，开启400倍的放大功能的无线wifi电子显微镜，无线wifi摄像全 程远程监控及录像设备，具体包括以下步骤：
(1)配制水凝胶细胞：
①带正电荷的水凝胶的制备：在室温条件下，将14份氨基化透明质酸加入25 份水中搅拌充分溶解，然后滴入6份纤维素充分搅拌，最后加入5份阳离子甲 壳素搅拌混匀，再将所得的混合液涡旋震荡40S，置于37℃水浴中静置2min， 即得带正电荷的水凝胶；
②带负电荷的水凝胶的制备：在室温条件下，将13份碱性明胶和37份海藻酸 搅拌混匀，再将所得的混合液涡旋震荡40S，置于37℃水浴中静置2min，即得 带负电荷的水凝胶；
③细胞悬浮液的制备：分别将成骨细胞、胰岛素细胞、平滑肌细胞、内皮细胞 配制成浓度为5×108个/ml的相应的细胞悬浮液；
④水凝胶细胞的配制：将相应的细胞悬浮液、带正电荷的水凝胶、带负电荷的 水凝胶按照1:1:1配比混合；
(2)3D打印参数的设定：3D打印参数设定为打印底板的温度为60℃，打印 速度为1cm/s，打印体积流率为5ml/s，压力为0.5bar；
(3)打印：当3D打印机底板温度达到设置的要求后，将配制好的水凝胶胰岛 素细胞压入3D打印机的同心微针筒内，在精准调校后的气压作用下，微针出 胶粗细均匀，在底板上混合交联后形成水凝胶；并将水凝胶内皮细胞溶液、水 凝胶平滑肌细胞、水凝胶成骨细胞溶液分别压入3D打印机剩下的多根同心微 针筒内，然后在设定的3D打印参数下，在气压作用下先打印一层水凝胶后，然 后用配备好的凝固剂，微微的喷雾在该层水凝胶上，其中，凝固剂由医用纯化 水40％，固体氢氧化钠30％，碱石灰30％配制而成，接着水凝胶和不同种细胞按 照预先设定的打印路径进行混合交叉逐层打印获得三维细胞水凝胶复合结构。
实施例1～3制备的水凝胶3D打印材料在3D打印机中分别挤出后利用电性 共混形成水凝胶，达到形状和空隙可调，可以任意用程序和源代码控制，安全 有效可控，同时具有良好的流变性、切力变稀特性和柔韧性，且生物相容性好， 对细胞易亲和，对细胞和组织无毒性，所有材料均是美国FDA批准可在临床上 使用，材料生物降解好，对人体也无害，成本低。
经测试，实施例1～3制备水凝胶材料的经3D打印机打印后，打印精度可 达6～10微米，且打印好的凝胶压缩模量为0.6kpa～505Kpa.粘度为0.3 pa.s～105kpa.s，拉伸强度为52pa～33MPa,拉伸应变为1％～302％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易 想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护 范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，在无菌环境下采用四同心微针打印机进行打印，包括以下步骤：
(1)配制水凝胶：分别配制不同种水凝胶细胞的溶液；
(2)3D打印参数的设定：3D打印参数设定为打印底板的温度为30～65℃，打印速度为0.2mm/s～1cm/s，打印体积流率为1μL/s～5ml/s，压力为0.1bar～6bar；
(3)打印：当3D打印机底板温度达到设置的要求后，将配制好的一种水凝胶细胞溶液压入3D打印机的同心微针筒内，在精准调校后的气压作用下，微针出胶粗细均匀，在底板上混合交联后形成水凝胶；并将多个不同水凝胶细胞溶液分别压入3D打印机剩下的多根同心微针筒内，然后在设定的3D打印参数下，在气压作用下先打印一层水凝胶后，然后用配备好的凝固剂，微微的喷雾在该层水凝胶上，接着水凝胶和不同种细胞按照预先设定的打印路径进行混合交叉逐层打印获得三维细胞水凝胶复合结构。
2.根据权利要求1所述的三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，所述水凝胶是由带正电荷的水凝胶和带负电荷的水凝胶两种组份组成，其中所述带正电荷的水凝胶由以下重量份数的原料制成，氨基化透明质酸8～15份，纤维素5～12份，阳离子甲壳素2～8份，水20～30份；所述带负电荷的水凝胶原料由以下重量份数的原料制成，碱性明胶10～20份，海藻酸30～40份。
3.根据权利要求2所述的三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，所述带正电荷的水凝胶由以下重量份数的原料制成，氨基化透明质酸10～13份，纤维素6～8份，阳离子甲壳素3～6份，水22～28份；所述带负电荷的水凝胶原料由以下重量份数的原料制成，碱性明胶12～18份，海藻酸32～38份。
4.根据权利要求3所述的三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，所述带正电荷的水凝胶由以下重量份数的原料制成，氨基化透明质酸12份，纤维素8份，阳离子甲壳素5份，水25份；所述带负电荷的水凝胶原料由以下重量份数的原料制成，碱性明胶15份，海藻酸35份。
5.根据权利要求1或2所述的三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，所述凝固剂由以下质量百分数的原料组成：水35％～45％、无水硫酸镁25％～35％、无水氯化钙25％～35％。
6.根据权利要求1或2所述的三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，所述凝固剂由以下质量百分数的原料组成：水35％～45％，固体氢氧化钠25％～35％，碱石灰25％～35％。
7.根据权利要求5或6所述的三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，所述水为医用纯化水。
8.根据权利要求1、2、5或6之一所述的三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，所述无菌环境为密闭打印室内设置紫外灯，并在多个同心微针旁设置随动的微型紫外灯。
9.根据权利要求1、2、5或6之一所述的三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，还安装有无线wifi电子显微镜；且安装有无线wifi摄像全程远程监控及录像功能。
10.根据权利要求9所述的三维细胞水凝胶复合结构的3D打印方法，其特征在于，所述无线wifi电子显微镜是具有400倍放大功能的无线wifi电子显微镜。
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