CN110787320B - 一种直写成型3d打印生物墨水的制备及其3d打印方法 - Google Patents

一种直写成型3d打印生物墨水的制备及其3d打印方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110787320B
CN110787320B CN201911211062.6A CN201911211062A CN110787320B CN 110787320 B CN110787320 B CN 110787320B CN 201911211062 A CN201911211062 A CN 201911211062A CN 110787320 B CN110787320 B CN 110787320B
Authority
CN
China
Prior art keywords
printing
methacrylate
biological
cellulose nanofiber
direct
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911211062.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110787320A (zh
Inventor
吴耀彬
黄文华
许益超
利时雨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Priority to CN201911211062.6A priority Critical patent/CN110787320B/zh
Publication of CN110787320A publication Critical patent/CN110787320A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110787320B publication Critical patent/CN110787320B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C64/00—Additive manufacturing, i.e. manufacturing of three-dimensional [3D] objects by additive deposition, additive agglomeration or additive layering, e.g. by 3D printing, stereolithography or selective laser sintering
    • B29C64/30—Auxiliary operations or equipment
    • B29C64/386—Data acquisition or data processing for additive manufacturing
    • B29C64/393—Data acquisition or data processing for additive manufacturing for controlling or regulating additive manufacturing processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3821—Bone-forming cells, e.g. osteoblasts, osteocytes, osteoprogenitor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3826—Muscle cells, e.g. smooth muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C64/00—Additive manufacturing, i.e. manufacturing of three-dimensional [3D] objects by additive deposition, additive agglomeration or additive layering, e.g. by 3D printing, stereolithography or selective laser sintering
    • B29C64/20—Apparatus for additive manufacturing; Details thereof or accessories therefor
    • B29C64/264—Arrangements for irradiation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y30/00—Apparatus for additive manufacturing; Details thereof or accessories therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y50/00—Data acquisition or data processing for additive manufacturing
    • B33Y50/02—Data acquisition or data processing for additive manufacturing for controlling or regulating additive manufacturing processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B3/00—Preparation of cellulose esters of organic acids
    • C08B3/08—Preparation of cellulose esters of organic acids of monobasic organic acids with three or more carbon atoms, e.g. propionate or butyrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/30—Materials or treatment for tissue regeneration for muscle reconstruction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Polymerisation Methods In General (AREA)
  • Graft Or Block Polymers (AREA)

Abstract

本发明公开了一种直写成型3D打印生物墨水的制备及其3D打印方法。该3D打印生物墨水以纤维素纳米纤维为主体，将甲基丙烯酸酐接枝到主体链段合成纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯。利用纤维素纳米纤维水凝胶剪切变稀的特性和甲基丙烯酸酯聚合物可光固化的特点，制备出具有生物相容性高，力学性能强，无毒可降解，并具备结构取向性可引导生物细胞生长分化的能力的3D打印生物墨水。应用该3D打印生物墨水打印的生物仿生结构，适合生物细胞在其中粘附、增殖和分化，是理想的生物组织重建和修复替代物。

Description

一种直写成型3D打印生物墨水的制备及其3D打印方法
技术领域
本发明涉及3D打印生物墨水制备领域，特别是涉及一种直写成型3D打印生物墨水的制备及其3D打印方法。
背景技术
直写成型3D打印技术(Direct ink Writing，DIW)，是3D打印技术的一个分支。直写成型3D打印技术的成型工艺不同于需要模具才能成型的传统机械成型方法，是一种用途广泛的自由成型方式。
直写成型3D打印技术是将特定成分的材料按照计算机软件设定的结构进行精密成型的技术，将安装在Z轴方向上的墨水材料在X-Y打印平台上移动挤出，形成所需要的立体结构。在这其中，一般是将墨水材料存储在一个温度可控的料筒中，喷头与料筒相连并固定在Z轴定位平台上，由压力控制供料，将材料由喷头挤出，再根据材料的固化方式选择合适的固化工艺，进行固化成型。
直写成型3D打印技术对生物墨水的要求是要具备合适的流变能和保形性，流变性保证可以将其顺利挤出，保形性保证挤出后可维持预设的形态结构。打印出来样品的丝径范围是几百纳米到毫米之间，与材料属性、打印速度、针孔直径和供料压力有关。
应用于直写成型3D打印技术的生物墨水需要具备以下特性：(1)良好生物相容性：打印后细胞在生物墨水支架内部以及表面可以黏附存活，增殖以及分化。(2)良好的机械性能：①黏度可调，比如通过温度变化改变稠度和剪切变稀等。只有黏度可调才能设计适合的打印方式及打印参数。②生物墨水在打印前保持液态，以避免堵塞喷嘴，打印后要能迅速固化，维持预设的目标结构。
现有技术中，可用来打印的生物墨水材料多为高分子水凝胶，主要分为天然高分子水凝胶和人工合成高分子水凝胶。天然高分子水凝胶有海藻酸钠、明胶、透明质酸、胶原、丝素蛋白等。合成高分子水凝胶有聚乙二醇、明胶甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚D,L-丙交酯等。
天然高分子水凝胶虽具有良好生物相容性以及与人体软组织相似的生物结构取向，但其本身不具备良好的机械性能，导致其并不能直接应用于生物仿生结构的3D打印。
人工合成高分子水凝胶部分具备光固化特性，可以应用于生物仿生结构的3D打印，但是合成高分子存在可降解性不佳，降解产物碎片毒性未知，以及生物相容性不理想等问题。
纤维素纳米纤维作为近年来新兴的生物墨水材料之一，相对于其他生物墨水材料，它本身拥有黏度可调节(剪切变稀)、取向性内部结构、来源广泛、机械性能良好等特性。虽然纤维素纳米纤维可以自固化保持原有的形态结构，但是纤维素纳米纤维易分散于水中，稳定性较差，所以需要借助一种无毒简单的固化方式增加其稳定性。因此，针对现有技术不足，本发明提供一种直写成型3D打印生物墨水的制备及其3D打印方法，以克服现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种直写成型3D打印生物墨水的制备及其3D打印方法，该生物墨水具有天然高分子水凝胶和人工合成高分子水凝胶的优点，由该生物墨水打印得到的生物仿生结构具有生物相容性高，力学性能强，以及无毒可降解的特点。
为实现上述目的，本发明的第一个方面提供了一种直写成型3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
S1，制备纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维
将纤维素纳米纤维粉末置于去离子水中搅拌均匀，再加入甲基丙烯酸酐液体，甲基丙烯酸酐液体的体积数值是纤维素纳米纤维粉末的质量数值的1～20倍，反应2～3h，再加入3～10mol/L的氢氧化钠溶液，调节混合溶液的pH值为8.0～9.0，继续反应12～24h，得到纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯；将所述纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯经过透析、冷冻干燥，得到纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维，于干燥避光处常温保存备用；
S2，制备纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液
按照光引发剂与纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维的重量比为1:15～30的比例，将光引发剂加入PBS缓冲液中，常温下磁力搅拌20～40min，再加入经过265nm紫外光消毒杀菌2～4h的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维，搅拌分散1～3h，以转速5000～8000r/min，离心5min，得到纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液，避光备用；
在纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯的质量百分比为1～5％，光引发剂的质量百分比为0.05～0.5％，PBS缓冲液的质量百分比为94.5～98.95％；
S3，制备直写成型3D打印生物墨水
将生物细胞重悬液按照体积浓度为10～20％的比例，与纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液混合均匀，制备得到直写成型3D打印生物墨水；
在直写成型3D打印生物墨水中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液的体积百分比为80～90％，生物细胞重悬液的体积百分比为10～20％，上述组分的体积百分比之和为100％。
优选的，所述纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯的质量百分比为5％，光引发剂的质量百分比为0.2％，PBS缓冲液的质量百分比为94.8％，上述组分的质量百分比之和为100％。
优选的，所述步骤S1中纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯用5000～14000分子量透析袋夹闭，在25～40℃的通风处，用超纯水透析3～7天，直至透析产物均质透明为止。
优选的，所述步骤S1中经过透析的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯在-80℃预冻后，继续在-60℃～-45℃下冻干2～4天。
优选的，所述纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液与生物细胞重悬液在4～25℃，以转速20～100r/min，均匀搅拌5～10min，避光备用。
优选的，所述光引发剂为LAP光引发剂。
优选的，所述纤维素纳米纤维来自于桉木树浆，经脱木质素化后，应用羧基法提取纳米化合成，直径为3～40nm，长度为200～3000nm。
优选的，所述生物细胞重悬液中，生物细胞计数1×106～1×108个/mL，培养基为含有胎牛血清的DMEM培养基。
本发明的第二个方面提供了一种直写成型3D打印生物墨水。该生物墨水通过上述方法制备而成。
本发明的第三个方面提供了一种应用该生物墨水进行3D打印的方法，通过如下步骤进行：
(1)将所述直写成型3D打印生物墨水装载入3D打印机的打印料仓内，设置料仓和打印喷头的温度为4～25℃、打印喷头移动速度为8～15mm/s、打印喷头挤出压力为0.5～1.0bar，所得打印丝径为100～1000μm；
(2)根据构建好的CAD仿生数字模型进行3D打印，打印的同时进行紫外灯照射，并对打印结构进行逐层光交联；所采用的紫外光的波长为365～405nm，光照强度为10～180mW/cm2，照射距离10～30cm，照射时间为10～45s，得到固化成型的3D生物仿生结构。
本发明的有益效果是：
1.本发明使用的纤维素纳米纤维是天然高分子材料，具有黏度可调节、结构取向性、来源广泛、机械性能良好等特性。在纤维素纳米纤维体系中接枝烯烃基团使其获得人工合成高分子所具有的光固化特性。通过蓝光引发光固化，可制备得到稳定的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯水凝胶。
2.本发明使用蓝光引发光固化的方式，比起使用紫外光引发固化，对细胞组织的损伤小，有利于提高生物墨水支架中的生物细胞的存活率，有利于生物细胞在生物墨水支架的增殖和分化。
3.本发明应用的纤维素纳米纤维来自于树木纤维，其本身长径比(长度与直径的比值)较大，故具有结构取向性，如纵向延伸，致密排列等，可以引导粘附在由其构成的生物墨水支架上的生物细胞分化生长，形成有固定延伸方向和致密排列的仿生组织环境。特别适合打印有固定取向性的横纹肌肌肉组织和致密排列的网状皮肤组织等。
4.本发明提供的直写成型3D打印生物墨水具有天然高分子水凝胶和人工合成高分子水凝胶的优点，由该生物墨水打印得到的生物仿生结构具有生物相容性高，力学性能强，以及无毒可降解的特点。该生物墨水制备方法简单易行。应用该生物墨水打印的生物仿生结构，适合生物细胞在其中粘附、增殖和分化，是理想的生物组织重建和修复替代物。
附图说明
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1是实施例1的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯合成路线图；
图2是实施例1和实施例5的直写成型3D打印生物墨水制备方法及应用示意图；
图3是生物细胞在实施例4中的生物墨水支架中分别经过1天、3天、5天、7天培养的活死染色共聚焦图像。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1。
一种直写成型3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
S1，制备纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维
将1～5g纤维素纳米纤维粉末分散于4～50℃的去离子水中，以转速200～1000r/min，机械搅拌30～120min，分散均匀。在4～25℃水浴下，搅拌12～24h，得到质量百分比为1～5％的纤维素纳米纤维分散液。在分散液中按照纤维素纳米纤维粉末的质量，以0.5～1mL/min的速度滴加入1～20倍体积的甲基丙烯酸酐液体，反应2～3h后，加入3～10mol/L的氢氧化钠溶液，调节混合溶液的pH值至8.0～9.0范围，继续反应12～24h，得到纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯前体。将纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯前体用5000～14000分子量透析袋夹闭，在25～40℃通风处用超纯水透析3～7天，去除未反应的甲基丙烯酸小分子，直至透析产物透明均质为止。将透析产物放入冻干机，在-80℃预冻，然后在-60℃～-45℃下冻干2～4天，得到纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维。产物呈轻盈的无冰晶粉末状，需避光常温保存于干燥器中备用。
需要说明的是，制备过程中所用的纤维素纳米纤维购自于桂林奇宏科技有限公司。该纤维素纳米纤维来源于桉木树浆，经脱木质素化后，应用羧基法提取纳米化合成的以β-1-4糖苷键链接的纤维素集合体，直径为3～40nm，长度为200～3000nm。甲基丙烯酸酐(methacrylic anhydride)试剂购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，优级纯(GR)级别。氢氧化钠(NaOH)试剂购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，优级纯(GR)级别。
S2，制备纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液
按照光引发剂与纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维的重量比为1:15～30的比例，将光引发剂加入PBS缓冲液中，常温下磁力搅拌20～40min，再加入经过265nm紫外光消毒杀菌2～4h的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维，搅拌分散1～3h，以转速5000～8000r/min，离心5min，得到纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液，避光备用。
在纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯的质量百分比为1～5％，光引发剂的质量百分比为0.05～0.5％，PBS缓冲液的质量百分比为94.5～98.95％，上述组分的质量百分比之和为100％；
需要说明的是，制备过程中所用的光引发剂是LAP光引发剂。苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)是用于高分子水凝胶或其他聚合物材料聚合的水溶性、细胞相容性光引发剂。其改进的聚合反应动力学机理，使高分子水凝胶或其他聚合物材料能够在较低的引发剂浓度和较长波长的光照下对生物细胞进行封装。在蓝光作用下，LAP迅速引发光敏水凝胶材料固化。与紫外光引发剂相比，蓝光对生物细胞的损伤小，从而增加生物细胞的存活率，所以LAP更适合于含有生物细胞的高分子水凝胶的固化。近年来，蓝光固化已广泛用于含有生物细胞的生物3D打印之中。
PBS缓冲液是磷酸缓冲盐溶液，购自于美国Gibco公司。
S3，制备直写成型3D打印生物墨水
将生物细胞重悬液按照体积浓度为10～20％的比例，与纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液混合，使用搅拌器以转速20～100r/min，搅拌5～10min，制备得到直写成型3D打印生物墨水；
在直写成型3D打印生物墨水中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液的体积百分比为80～90％，生物细胞重悬液的体积百分比为10～20％，上述组分的体积百分比之和为100％。
需要说明的是，制备过程中所使用的生物细胞为小鼠C2C12成肌细胞或小鼠MC3T3成纤维细胞，购自于中科院细胞库。生物细胞重悬液的制备过程是：取培养至85～95％融合度的上述生物细胞，加入1～2mL胰酶，放置于细胞培养箱内消化1～5min，使用显微镜观察到上述生物细胞的形态变圆分散，继续加入4～6mL含胎牛血清的完全培养基终止消化，转移入50mL离心管，以转速800～1000r/min，离心5min，弃上清液，加入含胎牛血清的完全培养基重悬，生物细胞计数1×106～1×108个/mL。上述DMEM培养基、胎牛血清(FBS)为细胞培养常用试剂，购自于美国Gibco公司。
本发明的有益效果是：
1.本发明使用的纤维素纳米纤维是天然高分子材料，具有黏度可调节、结构取向性、来源广泛、机械性能良好等特性。在纤维素纳米纤维体系中接枝烯烃基团使其获得人工合成高分子所具有的光固化特性。通过蓝光引发光固化，可制备得到稳定的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯水凝胶。
2.本发明使用蓝光引发光固化的方式，比起使用紫外光引发固化，对细胞组织的损伤小，有利于提高生物墨水支架中的生物细胞的存活率，有利于生物细胞在生物墨水支架的增殖和分化。
3.本发明应用的纤维素纳米纤维来自于树木纤维，其本身长径比(长度与直径的比值)较大，故具有结构取向性，如纵向延伸，致密排列等，可以引导粘附在由其构成的生物墨水支架上的生物细胞分化生长，形成有固定延伸方向和致密排列的仿生组织环境。特别适合打印有固定取向性的横纹肌肌肉组织和致密排列的网状皮肤组织等。
4.本发明提供的直写成型3D打印生物墨水具有天然高分子水凝胶和人工合成高分子水凝胶的优点，由该生物墨水打印得到的生物仿生结构具有生物相容性高，力学性能强，以及无毒可降解的特点。该生物墨水制备方法简单易行。应用该生物墨水打印的生物仿生结构，适合生物细胞在其中粘附、增殖和分化，是理想的生物组织重建和修复替代物。
实施例2。
一种直写成型3D打印生物墨水，其制备过程与实施例1相同，不同的是步骤S1中，加入1g纤维素纳米纤维粉末，所制得的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯的质量百分比为1％，光引发剂的质量百分比为0.05％，PBS缓冲液的质量百分比为98.95％，上述组分的质量百分比之和为100％。
本发明使用的LAP光引发剂，其改进的聚合反应动力学机理，使高分子水凝胶或其他聚合物材料能够在较低的引发剂浓度和较长波长的光照下对生物细胞进行封装。在蓝光作用下，LAP迅速引发光敏水凝胶材料固化。与紫外光引发剂相比，蓝光对生物细胞的损伤小，从而增加生物细胞的存活率。
实施例3。
一种直写成型3D打印生物墨水，其制备过程与实施例1相同，不同的是步骤S1中，加入5g纤维素纳米纤维粉末，所制得的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯的质量百分比为5％，光引发剂的质量百分比为0.5％，PBS缓冲液的质量百分比为94.5％，上述组分的质量百分比之和为100％。
本发明应用的纤维素纳米纤维是天然高分子材料，具有黏度可调节、结构取向性、来源广泛、机械性能良好等特性。在纤维素纳米纤维体系中接枝烯烃基团使其获得人工合成高分子所具有的光固化特性。通过蓝光引发光固化，可制备得到稳定的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯水凝胶。
实施例4。
一种直写成型3D打印生物墨水，其制备过程与实施例1相同，不同的是步骤S1中，加入5g纤维素纳米纤维粉末，所制得的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯的质量百分比为5％，光引发剂的质量百分比为0.2％，PBS缓冲液的质量百分比为94.8％，上述组分的质量百分比之和为100％。
如图3所示，生物细胞在本实施例制备而得的生物墨水中分别经过1天、3天、5天、7天培养的活死染色共聚焦图像，说明该生物墨水构造的仿生环境适合生物细胞在其中粘附、增殖和分化。
本发明应用的纤维素纳米纤维来自于树木纤维，其本身长径比(长度与直径的比值)较大，故具有结构取向性，如纵向延伸，致密排列等，可以引导粘附在由其构成的生物墨水支架上的生物细胞分化生长，形成有固定延伸方向和致密排列的仿生组织环境。特别适合打印有固定取向性的横纹肌肌肉组织和致密排列的网状皮肤组织等。
本发明提供的直写成型3D打印生物墨水具有天然高分子水凝胶和人工合成高分子水凝胶的优点，由该生物墨水打印得到的生物仿生结构具有生物相容性高，力学性能强，以及无毒可降解的特点。该生物墨水制备方法简单易行。应用该生物墨水打印的生物仿生结构，适合生物细胞在其中粘附、增殖和分化，是理想的生物组织重建和修复替代物。
实施例5。
如图2所示，一种应用该生物墨水进行3D打印的方法，通过如下步骤进行：
(1)将所述直写成型3D打印生物墨水装载入3D打印机的打印料仓内，设置料仓和打印喷头的温度为4～25℃、打印喷头移动速度为8～15mm/s、打印喷头挤出压力为0.5～1.0bar，所得打印丝径为100～1000μm；
(2)根据构建好的CAD仿生数字模型进行3D打印，打印的同时进行紫外灯照射，并对打印结构进行逐层光交联；所采用的紫外光的波长为365～405nm，光照强度为10～180mW/cm2，照射距离10～30cm，照射时间为10～45s，得到固化成型的3D生物仿生结构。
本发明使用的纤维素纳米纤维是天然高分子材料，具有黏度可调节、结构取向性、来源广泛、机械性能良好等特性。在纤维素纳米纤维体系中接枝烯烃基团使其获得人工合成高分子所具有的光固化特性。通过蓝光引发光固化，可制备得到稳定的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯水凝胶。
本发明提供的直写成型3D打印生物墨水具有天然高分子水凝胶和人工合成高分子水凝胶的优点，由该生物墨水打印得到的生物仿生结构具有生物相容性高，力学性能强，以及无毒可降解的特点。该生物墨水制备方法简单易行。应用该生物墨水打印的生物仿生结构，适合生物细胞在其中粘附、增殖和分化，是理想的生物组织重建和修复替代物。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种直写成型3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，制备纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维
将纤维素纳米纤维粉末置于去离子水中搅拌均匀，再加入甲基丙烯酸酐液体，甲基丙烯酸酐液体的体积数值是纤维素纳米纤维粉末的质量数值的1~20倍，反应2~3 h，再加入3~10 mol/L的氢氧化钠溶液，调节混合溶液的pH值为8.0~9.0，继续反应12~24 h，得到纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯；将所述纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯经过透析、冷冻干燥，得到纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维，于干燥避光处常温保存备用；
S2，制备纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液
按照光引发剂与纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维的重量比为1:15~30的比例，将光引发剂加入PBS缓冲液中，常温下磁力搅拌20~40 min，再加入经过265 nm紫外光消毒杀菌2~4 h的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯冻干纤维，搅拌分散1~3 h，以转速5000~8000r/min，离心5min，得到纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液，避光备用；
在纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯的质量百分比为1~5%，光引发剂的质量百分比为0.05~0.5%，PBS缓冲液的质量百分比为94.5~98.95%；
S3，制备直写成型3D打印生物墨水
将生物细胞重悬液按照体积浓度为10~20%的比例，与纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液混合均匀，制备得到直写成型3D打印生物墨水；
在直写成型3D打印生物墨水中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液的体积百分比为80~90%，生物细胞重悬液的体积百分比为10~20%，上述组分的体积百分比之和为100%；
由所述制备方法制备的直写成型3D打印生物墨水进行3D打印方法，通过如下步骤进行：
(1) 将所述直写成型3D打印生物墨水装载入3D打印机的打印料仓内，设置料仓和打印喷头的温度为4~25℃、打印喷头移动速度为8~15 mm/s、打印喷头挤出压力为0.5~1.0 bar，所得打印丝径为100~1000 μm；
(2) 根据构建好的CAD仿生数字模型进行3D打印，打印的同时进行紫外灯照射，并对打印结构进行逐层光交联；所采用的紫外光的波长为365~405 nm，光照强度为10~180 mW/cm2，照射距离10~30 cm，照射时间为10~45 s，得到固化成型的3D生物仿生结构。
2.根据权利要求1所述的直写成型3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，所述纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液中，纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯的质量百分比为5%，光引发剂的质量百分比为0.2%，PBS缓冲液的质量百分比为94.8%。
3.根据权利要求1或2所述的直写成型3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯用5000~14000分子量透析袋夹闭，在25~40℃的通风处，用超纯水透析3~7天，直至透析产物均质透明为止。
4.根据权利要求3所述的直写成型3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中经过透析的纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯在-80℃预冻后，继续在-60℃~ -45℃下冻干2~4天。
5.根据权利要求4所述的直写成型3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，所述纤维素纳米纤维甲基丙烯酸酯液与生物细胞重悬液在4~25℃，以转速20~100 r/min，均匀搅拌5~10 min，避光备用。
6.根据权利要求5所述的直写成型3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为LAP光引发剂。
7.根据权利要求6所述的直写成型3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，所述纤维素纳米纤维来自于桉木树浆，经脱木质素化后，应用羧基法提取纳米化合成，直径为3~40nm，长度为200~3000 nm。
8.根据权利要求7所述的直写成型3D打印生物墨水的制备方法，其特征在于，所述生物细胞重悬液中，生物细胞计数1×106~1×108个/mL，培养基为含有胎牛血清的DMEM培养基。
9.一种直写成型3D打印生物墨水，其特征在于，通过如权利要求1至8任意一项所述的制备方法制备而成。
CN201911211062.6A 2019-12-02 2019-12-02 一种直写成型3d打印生物墨水的制备及其3d打印方法 Active CN110787320B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911211062.6A CN110787320B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种直写成型3d打印生物墨水的制备及其3d打印方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911211062.6A CN110787320B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种直写成型3d打印生物墨水的制备及其3d打印方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110787320A CN110787320A (zh) 2020-02-14
CN110787320B true CN110787320B (zh) 2021-10-29

Family

ID=69447118

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911211062.6A Active CN110787320B (zh) 2019-12-02 2019-12-02 一种直写成型3d打印生物墨水的制备及其3d打印方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110787320B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113956506B (zh) * 2020-07-03 2023-07-21 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种双网络水凝胶及其制备方法与应用
CN112140544A (zh) * 2020-07-31 2020-12-29 西安交通大学 一种生物打印机温控直写喷头
CN112169019B (zh) * 2020-09-10 2021-11-02 南方医科大学 一种直写成型3d打印生物墨水及其制备方法
CN114633468B (zh) * 2020-12-16 2024-02-27 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种悬浮3d打印制备立体芳纶气凝胶的方法及应用
CN113082286A (zh) * 2021-04-07 2021-07-09 江南大学 一种基于3d打印技术的三层仿生皮肤支架及其制备方法
CN113559330B (zh) * 2021-06-18 2022-04-29 东华大学 一种低填充量高度有序排列的ha基复合树脂的制备方法
CN114618022B (zh) * 2022-02-24 2023-08-11 华源再生医学(香港)有限公司 一种纤维素微凝胶及其制备方法与应用
FI20225454A1 (en) 2022-05-24 2023-11-25 Aabo Akademi Ink composition, process for its preparation and uses of the ink composition

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016100856A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 Advanced Polymer Technology Ab Cellulose nanofibrillar bionik for 3d bioprinting for cell culturing, tissue engineering and regenerative medicine applications
CN108329683A (zh) * 2018-02-27 2018-07-27 中山市精微新材料有限公司 一种含有纳米纤维素的3d打印光敏材料及其制备方法
CN109224133A (zh) * 2018-09-21 2019-01-18 浙江大学 一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法
CN110078947A (zh) * 2019-04-25 2019-08-02 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种复合凝胶微球的制备方法、复合凝胶微球及其应用
CN110478529A (zh) * 2019-09-24 2019-11-22 广西医科大学 一种3d打印魔芋胶水凝胶支架及制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016100856A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 Advanced Polymer Technology Ab Cellulose nanofibrillar bionik for 3d bioprinting for cell culturing, tissue engineering and regenerative medicine applications
CN108329683A (zh) * 2018-02-27 2018-07-27 中山市精微新材料有限公司 一种含有纳米纤维素的3d打印光敏材料及其制备方法
CN109224133A (zh) * 2018-09-21 2019-01-18 浙江大学 一种含有间充质干细胞的生物型多层神经导管制备方法
CN110078947A (zh) * 2019-04-25 2019-08-02 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种复合凝胶微球的制备方法、复合凝胶微球及其应用
CN110478529A (zh) * 2019-09-24 2019-11-22 广西医科大学 一种3d打印魔芋胶水凝胶支架及制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110787320A (zh) 2020-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110787320B (zh) 一种直写成型3d打印生物墨水的制备及其3d打印方法
Kim et al. Precisely printable and biocompatible silk fibroin bioink for digital light processing 3D printing
Fan et al. Hybrid printing using cellulose nanocrystals reinforced GelMA/HAMA hydrogels for improved structural integration
US10995186B2 (en) Light-activated preparation of hydrogels
CN106474560B (zh) 一种用于3d生物打印的水凝胶材料及其制备方法与应用
US20130172985A1 (en) Crosslinked hydrogels and methods of making and using thereof
Li et al. Submerged and non-submerged 3D bioprinting approaches for the fabrication of complex structures with the hydrogel pair GelMA and alginate/methylcellulose
CN106310380B (zh) 一种纳米纤维化丝素蛋白凝胶及其制备方法
Jiang et al. Preparation of cellulose nanofiber-reinforced gelatin hydrogel and optimization for 3d printing applications.
CN109942752A (zh) 改性羧甲基纤维素生物相容性复合水凝胶前驱液、复合水凝胶及其应用
WO2010087912A1 (en) Hydrogels crosslinked with gold nanoparticles and methods of making and using thereof
CN114874455B (zh) 一种中性溶解、具有自组装能力和光交联能力的改性胶原和凝胶的构建方法
CN113150561B (zh) 一种用于3d生物打印的胶原基生物墨水及其制备方法与应用
Kim et al. Silk fibroin bioinks for digital light processing (DLP) 3D bioprinting
Dutta et al. Electrically stimulated 3D bioprinting of gelatin-polypyrrole hydrogel with dynamic semi-IPN network induces osteogenesis via collective signaling and immunopolarization
Zhang et al. Photopolymerizable chitosan hydrogels with improved strength and 3D printability
Chu et al. Long-term stability, high strength, and 3D printable alginate hydrogel for cartilage tissue engineering application
Taneja et al. Hydrogel based 3D printing: Bio ink for tissue engineering
CN112126080A (zh) 基于巯基-烯点击反应的光固化水凝胶、其制法与应用
CN115521627A (zh) 一种结构蛋白/透明质酸复合微纳米颗粒及颗粒水凝胶材料和应用
CN113577386A (zh) 一种双网络生物墨水及其制备方法和用途
Kumar Synthetic polymer-derived single-network inks/bioinks for extrusion-based 3D printing towards bioapplications
Dutta et al. Trackable and highly fluorescent nanocellulose-based printable bio-resins for image-guided tissue regeneration
CN112169019B (zh) 一种直写成型3d打印生物墨水及其制备方法
CN110755685A (zh) 一种3d打印瓜尔胶水凝胶支架及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant