CN113577386A - 一种双网络生物墨水及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双网络生物墨水及其制备方法和用途，所述双网络生物墨水的制备原料包括可自由基光固化的天然高分子材料、脱细胞基质、可见光引发剂、共引发剂、溶剂；所述可见光引发剂为适用于450‑550nm波长可见光的引发剂。当脱细胞基质为消化脱细胞基质粉末时，制备方法如下：1)将消化脱细胞基质粉末和可自由基光固化的天然高分子材料溶解在酸溶液中，在冰浴条件下，调节pH至7‑8，并加入PBS溶液或培养基；2)向1)中加入引发剂、共引发剂，混合均匀后得到双网络生物墨水。本发明的生物墨水兼具良好的生物活性和可见光3D打印性质。
Description
技术领域
本发明属于3D打印、生物医用材料技术领域，具体涉及一种可用于生物3D打印的新型双网络生物墨水及其制备方法和用途。
背景技术
生物3D打印是通过打印物的计算机辅助设计模型或计算机断层扫描获得数据后转化的模型，通过材料、细胞、生长因子的精确3D堆积，快速制造指定形状的具备生物活性的支架材料的技术。而当前，采用3D打印的方法制造的体内植入物虽然可以具备一定的生物活性，但是想要制造出真正的适合体内植入的器官或组织还存在很大的挑战，而最关键的部分就是适合的生物墨水，即可以支持细胞存活并维持因子活性的生物材料的研发。
细胞外基质是生物进化过程中高度保守的部分，不同种属间相容组织内的细胞外基质差异不大，通过物理或化学方法脱去组织中的所有细胞、抗原、脂质、可溶性蛋白质等物质、保留下具有完整外观形态、组织学特性以及超微结构的不溶性成分即是脱细胞基质。脱细胞基质可以不仅保留了其组织微结构，同时保留了相应的生物活性信息分子。脱细胞基质在经过胃蛋白酶消化后可以制备形成水凝胶，扩展了其应用范围。但是单独的脱细胞基质水凝胶力学强度差，不方便单独使用，不便于用作生物3D打印。
光固化3D打印反应条件温和、具备时空可控性，反应方便控制，适合用于生物3D打印。但是目前常用的是紫外光固化，在制备过程中，长时间的紫外光照射可能造成潜在的细胞损伤，不利于大结构的长时间打印过程。虽有文献报道采用可见光，但是其采用的为近紫外的强蓝光405nm，长时间照射也会造成细胞损伤。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的技术问题，本发明的目的是提供一种双网络生物墨水及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一方面，本发明提供了一种双网络生物墨水，所述双网络生物墨水的制备原料包括可自由基光固化的天然高分子材料，脱细胞基质，可见光引发剂，共引发剂，溶剂；所述可见光引发剂为适用于450-550nm波长可见光的引发剂。
进一步地，所述可自由基光固化的天然高分子材料包括可光固化的透明质酸衍生物、可光固化的丝素蛋白衍生物、可光固化的明胶衍生物、可光固化的壳聚糖衍生物中的一种或至少两种的组合；
优选地，所述可光固化的透明质酸衍生物包括甲基丙烯酸酯化透明质酸、降冰片烯化透明质酸或酪氨酸化透明质酸；
优选地，所述可光固化的丝素蛋白衍生物包括甲基丙烯酸化丝素蛋白；
优选地，所述可光固化的明胶衍生物包括甲基丙烯酸化明胶、降冰片烯化明胶；
优选地，所述可光固化的壳聚糖衍生物包括甲基丙烯酸化壳聚糖。
进一步地，所述脱细胞基质为脱细胞基质水凝胶或消化脱细胞基质粉末；优选地，所述脱细胞基质为消化脱细胞基质粉末。
进一步地，所述脱细胞基质为软骨脱细胞基质；
优选地，所述软骨脱细胞基质包括椎间盘软骨脱细胞基质、半月板脱细胞基质或关节软骨脱细胞基质。
进一步地，所述可见光引发剂为曙红Y及其衍生物、钌吡啶络合物或核黄素；优选地，所述可见光引发剂为曙红Y及其衍生物；优选地，所述曙红Y衍生物包括曙红Y二钠盐、曙红Y二钾盐、曙红Y二铵盐；
所述共引发剂为三乙醇胺/乙烯吡咯烷酮、过硫酸钠。当可见光引发剂为曙红Y及其衍生物时，共引发剂为三乙醇胺和乙烯吡咯烷酮，当可见光引发剂为钌吡啶络合物或核黄素时，共引发剂为过硫酸钠。
进一步地，所述制备原料中可自由基光固化的天然高分子材料的质量体积百分数为3-10％、脱细胞基质的质量体积百分数为0.5-4％、可见光引发剂的质量体积百分数为0.0008～0.008％、共引发剂的质量体积百分数为0.05～0.5％。
进一步地，所述双网络生物墨水的制备原料包括可自由基光固化的天然高分子材料，消化脱细胞基质粉末，曙红Y及其衍生物，三乙醇胺，N-乙烯吡咯烷酮；
优选地，所述制备原料中可自由基光固化的天然高分子材料的质量体积百分数为3-10％、消化脱细胞基质粉末的质量体积百分数为0.5-4％、曙红Y及其衍生物的质量体积百分数为0.0008～0.008％、三乙醇胺的质量体积百分数为0.025～0.25％、N-乙烯吡咯烷酮的质量体积百分数为0.025～0.25％。
另一方面，本发明提供了一种上述任一所述的双网络生物墨水的制备方法，
当脱细胞基质为消化脱细胞基质粉末时，制备方法如下：
1)将消化脱细胞基质粉末和可自由基光固化的天然高分子材料溶解在酸溶液中，在冰浴条件下，调节pH至7-8，并加入PBS溶液或培养基；
2)向1)中加入可见光引发剂、共引发剂，混合均匀后得到双网络生物墨水；
优选地，1)将消化脱细胞基质粉末和可自由基光固化的天然高分子材料溶解在0.01M HCl溶液中，在冰浴条件下，加入NaOH溶液调节pH至7-8，并加入PBS溶液调节离子至平衡到1×PBS溶液的环境或加入培养基调节成为1×培养基的环境；
2)向1)中加入可见光引发剂、共引发剂，混合均匀后得到双网络生物墨水；
当脱细胞基质为脱细胞基质水凝胶时，制备方法如下：
将可自由基光固化的天然高分子材料、脱细胞基质水凝胶、可见光引发剂、共引发剂与PBS溶液或培养基混合均匀后得到双网络生物墨水。
进一步地，所述消化脱细胞基质粉末的制备方法包括以下步骤：
1)将脱细胞基质冷冻干燥，然后粉碎；
2)将1)所得产物进行消化处理；
3)将2)中所得产物冷冻干燥，粉碎之后得到消化脱细胞基质粉末；
优选地，所述消化处理所用的物质包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶。
进一步地，步骤1)具体为：将软骨在去离子水中漂洗后，用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的EDTA(乙二胺四乙酸)溶液、pH＝7.4的含有50-100U/ml DNA酶与5-15U/ml RNA酶的Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷)溶液或pH＝7.4的含有50-100U/ml DNA酶与5-15U/ml RNA酶的水溶液或pH＝7.4的含有50-100U/ml DNA酶与5-15U/ml RNA酶的PBS溶液、体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，粉碎。
上述脱细胞基质制备过程中不包含表面活性剂易于漂洗。
进一步地，步骤2)具体为：将1)所得产物经过质量体积百分数为0.1％胃蛋白酶的0.01-0.1M盐酸水溶液处理得到粘稠的均相溶液。
进一步地，步骤3)具体为：将2)中所得产物冷冻干燥，粉碎，放置0℃以下待用。
再一方面，本发明提供了一种上述任一所述的双网络生物墨水作为生物3D打印墨水的用途。
本发明的有益效果是：
1)本发明采用的可见光引发剂、共引发剂一方面提高了生物墨水的力学性能，一方面可使生物墨水在450-550nm波长可见光下实现交联固化，光照条件温和，该波长下的可见光对细胞损伤更小，长时间照射也不会损伤细胞，细胞存活率在刚制备完成时存活率在99％以上，避免了紫外光和近紫外的强蓝光造成的潜在细胞损伤以及实验者操作过程中的损害；
2)可自由基光固化的天然高分子材料可以确保在低使用比例下，溶液具备高粘度，有利于3D打印；脱细胞基质可以促进细胞的粘附，支持细胞生长增殖；
3)生物相容性良好，该生物墨水可以很好的支持细胞粘附生长，脱细胞基质的使用，促使细胞在水凝胶中7天内出现了明显的增殖与形态舒展；
4)本发明将消化后脱细胞基质制备成为冻干的粉末状，便于储存，且其与可自由基光固化的天然高分子材料两种组分混合在一起到使用可以在5min以内完成，简单高效，提高了生物墨水的使用性；其次，原料易于保存，所制备的原料可以在0℃以下保存即可，用时取出快速混合，且常温下短期不会变形，便于携带和转移；
5)可见光生物3D打印，可以避免紫外光的缺点，且可见光的穿透性更强，利于生物墨水的内部深层聚合，且可见光可以降低设备的成本；
6)本发明脱细胞基质的制备方法比较易于漂洗，不容易残留有机溶剂。
附图说明
图1为本发明实施例8中将实施例2中消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末和甲基丙烯酸酯化透明质酸快速混合流程图；
图2为本发明实施例9中不同组分生物墨水凝胶压缩性能图，(A)压缩强度，(B)压缩模量，(C)压缩应力应变曲线；
图3为本发明实施例10中生物墨水内细胞死活染色图；
图4为本发明实施例11中打印效果图，(A)折线条，(B)曲线，(C)多层网格。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1双网络生物墨水的制备(3％甲基丙烯酸酯化透明质酸/0.5％椎间盘软骨脱细胞基质，简写为3％MeHA/0.5％dECM)
一种用于3D打印的双网络生物墨水，制备原料由甲基丙烯酸酯化透明质酸、消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末、曙红Y、三乙醇胺、N-乙烯吡咯烷酮以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)1g透明质酸与3ml甲基丙烯酸酐在水溶液中，冰浴碱性环境下，反应后透析冻干制备得到甲基丙烯酸酯化透明质酸；
2)消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末的制备：利用牛尾取出的新鲜椎间盘软骨在去离子水漂洗后，利用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液，含有100U/ml DNA酶与10U/ml RNA酶混合的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)，体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，冷冻研磨粉碎后，经过质量体积百分数为0.1％胃蛋白酶的0.01M盐酸水溶液处理得到粘稠的均相溶液后，冷冻干燥后，研磨粉碎，放置-20℃待用；
3)将质量体积百分数为0.5％的消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末和质量体积百分数为3％的甲基丙烯酸酯化透明质酸溶解在0.01M HCl溶液中，在冰浴条件下，加入0.1MNaOH调节pH至7，并加入10×PBS溶液调节离子至平衡到1×PBS溶液的环境；
4)向3)中加入0.008％引发剂曙红Y、质量体积百分数为0.25％的三乙醇胺、质量体积百分数为0.25％的N-乙烯吡咯烷酮，混合均匀后得到双网络生物墨水。
实施例2双网络生物墨水的制备(3％甲基丙烯酸酯化透明质酸/1％椎间盘软骨脱细胞基质，简写为3％MeHA/1％dECM)
一种用于3D打印的双网络生物墨水，制备原料由甲基丙烯酸酯化透明质酸、消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末、曙红Y、三乙醇胺、N-乙烯吡咯烷酮以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)1g透明质酸与3ml甲基丙烯酸酐在水溶液中，冰浴碱性环境下，反应后透析冻干制备得到；
2)消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末的制备：利用牛尾取出的新鲜椎间盘软骨在去离子水漂洗后，利用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液，含有100U/ml DNA酶与10U/ml RNA酶混合的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)，体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，冷冻研磨粉碎后，经过质量体积百分数为0.1％胃蛋白酶的0.01M盐酸水溶液处理得到粘稠的均相溶液后，冷冻干燥后，研磨粉碎，放置-20℃待用；
3)将质量体积百分数为1％的消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末和质量体积百分数为3％的甲基丙烯酸酯化透明质酸溶解在0.01M HCl溶液中，在冰浴条件下，加入0.1M NaOH调节pH至7，并加入10×PBS溶液调节离子至平衡到1×PBS溶液的环境；
4)向3)中加入0.008％引发剂曙红Y、质量体积百分数为0.25％的三乙醇胺、质量体积百分数为0.25％的N-乙烯吡咯烷酮，混合均匀后得到双网络生物墨水。
实施例3双网络生物墨水的制备
一种用于3D打印的双网络生物墨水，制备原料由甲基丙烯酸酯化透明质酸、消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末、曙红Y、三乙醇胺、N-乙烯吡咯烷酮以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)1g透明质酸与3ml甲基丙烯酸酐在水溶液中，冰浴碱性环境下，反应后透析冻干制备得到；
2)消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末的制备：利用牛尾取出的新鲜椎间盘软骨在去离子水漂洗后，利用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液，含有100U/ml DNA酶与10U/ml RNA酶混合的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)，体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，冷冻研磨粉碎后，经过质量体积百分数为0.1％胃蛋白酶的0.01M盐酸水溶液处理得到粘稠的均相溶液后，冷冻干燥后，研磨粉碎，放置-20℃待用；
3)将质量体积百分数为2％的消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末和质量体积百分数为3％的甲基丙烯酸酯化透明质酸溶解在0.01M HCl溶液中，在冰浴条件下，加入0.1M NaOH调节pH至7，并加入10×PBS溶液调节离子至平衡到1×PBS溶液的环境；
4)向3)中加入0.008％引发剂曙红Y、质量体积百分数为0.25％的三乙醇胺、质量体积百分数为0.25％的N-乙烯吡咯烷酮，混合均匀后得到双网络生物墨水。
实施例4双网络生物墨水的制备
一种用于3D打印的双网络生物墨水，制备原料由甲基丙烯酸酯化透明质酸、消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末、曙红Y、三乙醇胺、N-乙烯吡咯烷酮以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)1g透明质酸与3ml甲基丙烯酸酐在水溶液中，冰浴碱性环境下，反应后透析冻干制备得到；
2)消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末的制备：利用牛尾取出的新鲜椎间盘软骨在去离子水漂洗后，利用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液，含有100U/ml DNA酶与10U/ml RNA酶混合的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)，体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，冷冻研磨粉碎后，经过质量体积百分数为0.1％胃蛋白酶的0.01M盐酸水溶液处理得到粘稠的均相溶液后，冷冻干燥后，研磨粉碎，放置-20℃待用；
3)将质量体积百分数为1％的消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末和质量体积百分数为3％的甲基丙烯酸酯化透明质酸溶解在0.01M HCl溶液中，在冰浴条件下，加入0.1M NaOH调节pH至7，并加入10×PBS溶液调节离子至平衡到1×PBS溶液的环境；
4)向3)中加入0.0008％引发剂曙红Y、质量体积百分数为0.025％的三乙醇胺、质量体积百分数为0.025％的N-乙烯吡咯烷酮，混合均匀后得到双网络生物墨水。
实施例5双网络生物墨水的制备
一种用于3D打印的双网络生物墨水，制备原料由甲基丙烯酸酯化透明质酸、消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末、曙红Y、三乙醇胺、N-乙烯吡咯烷酮以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)1g透明质酸与3ml甲基丙烯酸酐在水溶液中，冰浴碱性环境下，反应后透析冻干制备得到；
2)消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末的制备：利用牛尾取出的新鲜椎间盘软骨在去离子水漂洗后，利用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液，含有100U/ml DNA酶与10U/ml RNA酶混合的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)，体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，冷冻研磨粉碎后，经过质量体积百分数为0.1％胃蛋白酶的0.01M盐酸水溶液处理得到粘稠的均相溶液后，冷冻干燥后，研磨粉碎，放置-20℃待用；
3)将质量体积百分数为1％的消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末和质量体积百分数为6％的甲基丙烯酸酯化透明质酸溶解在0.01M HCl溶液中，在冰浴条件下，加入0.1M NaOH调节pH至7，并加入10×PBS溶液调节离子至平衡到1×PBS溶液的环境；
4)向3)中加入0.008％引发剂曙红Y、质量体积百分数为0.25％的三乙醇胺、体积百分数为0.25％的N-乙烯吡咯烷酮，混合均匀后得到双网络生物墨水。
实施例6双网络生物墨水的制备
一种用于3D打印的双网络生物墨水，制备原料由酪氨酸化透明质酸、消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末、曙红Y、三乙醇胺、N-乙烯吡咯烷酮以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末的制备：利用牛尾取出的新鲜椎间盘软骨在去离子水漂洗后，利用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液，含有100U/ml DNA酶与10U/ml RNA酶混合的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)，体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，冷冻研磨粉碎后，经过质量体积百分数为0.1％胃蛋白酶的0.01M盐酸水溶液处理得到粘稠的均相溶液后，冷冻干燥后，研磨粉碎，放置-20℃待用；
2)将质量体积百分数为1％的消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末和质量体积百分数为3％的酪氨酸化透明质酸溶解在0.01M HCl溶液中，在冰浴条件下，加入0.1M NaOH调节pH至7，并加入10×PBS溶液调节离子至平衡到1×PBS溶液的环境；
3)向2)中加入0.008％引发剂曙红Y、质量体积百分数为0.25％的三乙醇胺、体积百分数为0.25％的N-乙烯吡咯烷酮，混合均匀后得到双网络生物墨水。
实施例7双网络生物墨水的制备
一种用于3D打印的双网络生物墨水，制备原料由甲基丙烯酸化明胶、消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末、曙红Y、三乙醇胺、N-乙烯吡咯烷酮以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末的制备：利用牛尾取出的新鲜椎间盘软骨在去离子水漂洗后，利用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液，含有100U/ml DNA酶与10U/ml RNA酶混合的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)，体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，冷冻研磨粉碎后，经过质量体积百分数为0.1％胃蛋白酶的0.01M盐酸水溶液处理得到粘稠的均相溶液后，冷冻干燥后，研磨粉碎，放置-20℃待用；
2)将质量体积百分数为1％的消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末和质量体积百分数为10％的甲基丙烯酸化明胶溶解在0.01M HCl溶液中，在冰浴条件下，加入0.1M NaOH调节pH至7，并加入10×PBS溶液调节离子至平衡到1×PBS溶液的环境；
3)向2)中加入0.008％引发剂曙红Y、质量体积百分数为0.25％的三乙醇胺、质量体积百分数为0.25％的N-乙烯吡咯烷酮，混合均匀后得到双网络生物墨水。
对比例1生物墨水的制备(3％甲基丙烯酸酯化透明质酸，简写为3％MeHA)
一种用于3D打印的生物墨水，制备原料由甲基丙烯酸酯化透明质酸、曙红Y、三乙醇胺、N-乙烯吡咯烷酮以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)1g透明质酸与3ml甲基丙烯酸酐在水溶液中，冰浴碱性环境下，反应后透析冻干制备得到甲基丙烯酸酯化透明质酸；
2)将质量体积百分数为3％的甲基丙烯酸酯化透明质酸溶解在PBS溶液之中；
3)向2)中加入0.008％引发剂曙红Y、质量体积百分数为0.25％的三乙醇胺、质量体积百分数为0.25％的N-乙烯吡咯烷酮，混合均匀后得到生物墨水。
对比例2生物墨水的制备(1％椎间盘软骨脱细胞基质dECM，简写为1％dECM)
一种用于3D打印的生物墨水，制备原料由消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末、曙红Y、三乙醇胺、N-乙烯吡咯烷酮以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末的制备：利用牛尾取出的新鲜椎间盘软骨在去离子水漂洗后，利用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的EDTA溶液，含有100U/ml DNA酶与10U/ml RNA酶混合的Tris-HCl溶液(pH＝7.4)，体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，冷冻研磨粉碎后，经过质量体积百分数为0.1％胃蛋白酶的0.01M盐酸水溶液处理得到粘稠的均相溶液后，冷冻干燥后，研磨粉碎，放置-20℃待用；
2)将质量体积百分数为1％的消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末溶解在0.01M HCl溶液中，在冰浴条件下，加入0.1M NaOH调节pH至7，并加入10×PBS溶液调节离子至平衡到1×PBS溶液的环境；
3)向2)中加入0.008％引发剂曙红Y、质量体积百分数为0.25％的三乙醇胺、质量体积百分数为0.25％的N-乙烯吡咯烷酮，混合均匀后得到生物墨水。
对比例3生物墨水的制备(3％甲基丙烯酸酯化透明质酸，简写为3％MeHA(I2959))
一种用于3D打印的生物墨水，制备原料由甲基丙烯酸酯化透明质酸、紫外光引发剂I2959以及溶剂组成，其制备方法如下：
1)1g透明质酸与3ml甲基丙烯酸酐在水溶液中，冰浴碱性环境下，反应后透析冻干制备得到甲基丙烯酸酯化透明质酸；
2)将质量体积百分数为3％的甲基丙烯酸酯化透明质酸溶解在PBS溶液之中；
3)向2)中加入质量体积分数为0.1％紫外光引发剂I2959，混合均匀后得到生物墨水。
将实施例1、2以及对比例1、2、3制备得到的样品做如下性能测试
实施例8混合速度测试
以1ml实施例2复合生物墨水预聚液的配置为例，取消化椎间盘软骨脱细胞基质粉末10mg、甲基丙烯酸酯化透明质酸30mg，加入0.01M HCl溶液涡旋3-5min，观察溶液状态，即可得到透明均相溶液。过程与溶解后效果如图1所示。
实施例9压缩性能测试
测试对象：
A：生物墨水为对比例1制备得到的生物墨水(3％MeHA)
B：生物墨水为对比例2制备得到的生物墨水(1％dECM)
C：生物墨水为对比例3制备得到的生物墨水(3％MeHA(I2959))
D：复合生物墨水为实施例1制备得到的新型双网络生物墨水(3％MeHA/0.5％dECM)
E：复合生物墨水为实施例2制备得到的新型双网络生物墨水(3％MeHA/1％dECM)
测试方法：将上述A-E生物墨水分别倒入聚四氟乙烯模具中，515nm绿光下照射5min初步交联，放入37℃恒温干燥箱中一小时进行二次交联后，制成直径10mm，高6mm的圆柱形样品。使用万能压缩试验机，以1mm/min的速度进行压缩至水凝胶断裂，记录压缩应力应变曲线。
测试结果：压缩强度随组分变化情况如图2所示。
生物墨水为了实现不同结构的打印，最重要的性能之一就是要求其具有一定的机械强度，能够支撑其结构和细胞的存活。图2是五种不同组份的生物墨水凝胶的压缩性能。由图中可以看出，可见光引发的甲基丙烯酸酯化透明质酸的力学强度比紫外光引发的水凝胶力学强度显著性增加(原因可能是可见光引发剂中，共引发剂乙烯吡咯烷酮的存在参与了反应，低浓度的乙烯吡咯烷酮不会影响细胞存活，同时可以与甲基丙烯酸化的透明质酸共聚，从而增强了水凝胶的力学性能)；纯消化椎间盘软骨脱细胞基质水凝胶本身的力学强度很差，其最大压缩强度是837±153Pa左右，和甲基丙烯酸酯化透明质酸复合、可见光引发后水凝胶的形变达到50％的时候，水凝胶就会发生断裂，并且随着消化椎间盘软骨脱细胞基质含量的增加，复合水凝胶抗压强度随之增强，杨氏模量随之增大，说明水凝胶的刚性增强。而当复合水凝胶中dECM的含量为1％的时候，最大压缩强度为102.38±5.27kPa，压缩模量为782±20.36kPa，而纯甲基丙烯酸酯化透明质酸水凝胶的最大压缩强度有38.57±7.81kPa，复合脱细胞基质之后，其压缩强度与模量远大于1+1产生的效果，且断裂时的应变也随着脱细胞基质含量增加而增大，这证明了在双网络结构中，脱细胞基质凝胶网络起到了增强韧性的作用，同时脱细胞基质存在大量氨基，而透明质酸中存在有大量羧基，可以形成分子间氢键作用，进而增强水凝胶的力学强度。
实施例10生物墨水细胞相容性测试
测试对象：对比例1、实施例1、实施例2
测试方法：将实施例1、2与对比例1生物墨水各取1ml，在4℃下滴加100μl 1×106cells/ml的MC3T3-E1细胞悬液，涡旋30s混合均匀后，取100μl滴加在48孔板中，使用515nm绿光照射1min，使之固化成为凝胶薄片，加入α-MEM培养基500μl，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养1,3,7天后取出，进行死活染色后，使用荧光显微镜拍照观察。
测试结果：死活染色的结果如图3所示。
图3是不同脱细胞基质含量的MeHA水凝胶包裹细胞后培养1、3、7天的死活染色图和细胞7天内增殖情况。在培养1天后，MC3T3-E1细胞在各组水凝胶内，都呈现为圆球型，说明细胞还未能实现粘附在水凝胶中。但是细胞通过死活染色可以计算出，细胞存活率在99％以上，证明了材料高细胞相容性。然而在培养3天之后，细胞大多数仍旧呈现圆球型，细胞形态未能展开，但是细胞存活率依旧在99％以上。培养7天之后，随着消化椎间盘软骨脱细胞基质含量的增加，可以明显的观察到MC3T3-E1细胞出现了细长、有触角形态。且消化椎间盘软骨脱细胞基质含量越高，舒展开的细胞越多，细胞存活率也保持在99％。实验结果表明，消化椎间盘软骨脱细胞基质的存在可以有效的促进细胞的粘附与形态的扩展。这可能是由于脱细胞基质中的天然蛋白和多糖可以促进细胞的附着，同时在促进细胞的生长上有极佳效果。
实施例11复合生物墨水3D打印效果测试
测试对象：实施例2
测试过程：在4℃下，将实施例2中制备得到的双网络生物墨水加入打印针筒中，超声10min除去气泡之后，将打印针头与针筒组装，与气动挤出式打印机相连之后，将打印温度设定为37℃，在打印进行时，附加515nm绿光照射，打印一层的时间设置为30s。在打印完成后，继续在515nm绿光下照射交联固化5min，置于37℃下孵育半小时。
测试结果：打印效果如图4所示。可以观察到打印结构十分清晰，满足可见光固化生物墨水的要求。
综上，本发明双网络生物墨水原料混合便利，可以在5min内完成溶解。
脱细胞基质的使用，促进双网络结构的生成，两层网络之间也存在氢键作用，显著增强了生物墨水的压缩强度与模量。且可见光引发剂、共引发剂的使用也提高了生物墨水的力学性能。
本发明双网络生物墨水可以在短时间内实现固化，同时在7天培养过程中可以观察到，随着细胞外基质的含量的增加，可以明显的观察到细胞在水凝胶中可以更快的实现细胞形态的舒展以及高的存活率(99％)。
本发明双网络生物墨水可以在可见光下进行生物3D打印，支持多种形状与结构。
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双网络生物墨水，其特征在于，所述双网络生物墨水的制备原料包括可自由基光固化的天然高分子材料，脱细胞基质，可见光引发剂，共引发剂，溶剂；所述可见光引发剂为适用于450-550nm波长可见光的引发剂。
2.根据权利要求1所述的双网络生物墨水，其特征在于，所述可自由基光固化的天然高分子材料包括可光固化的透明质酸衍生物、可光固化的丝素蛋白衍生物、可光固化的明胶衍生物、可光固化的壳聚糖衍生物中的一种或至少两种的组合；
优选地，所述可光固化的透明质酸衍生物包括甲基丙烯酸酯化透明质酸、降冰片烯化透明质酸或酪氨酸化透明质酸；
优选地，所述可光固化的丝素蛋白衍生物包括甲基丙烯酸化丝素蛋白；
优选地，所述可光固化的明胶衍生物包括甲基丙烯酸化明胶或降冰片烯化明胶；
优选地，所述可光固化的壳聚糖衍生物包括甲基丙烯酸化壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的双网络生物墨水，其特征在于，所述脱细胞基质为脱细胞基质水凝胶或消化脱细胞基质粉末；优选地，所述脱细胞基质为消化脱细胞基质粉末。
4.根据权利要求1所述的双网络生物墨水，其特征在于，所述脱细胞基质为软骨脱细胞基质；
优选地，所述软骨脱细胞基质包括椎间盘软骨脱细胞基质、半月板脱细胞基质或关节软骨脱细胞基质。
5.根据权利要求1所述的双网络生物墨水，其特征在于，所述可见光引发剂包括曙红Y及其衍生物、钌吡啶络合物或核黄素；优选地，所述可见光引发剂为曙红Y及其衍生物；优选地，所述曙红Y衍生物包括曙红Y二钠盐、曙红Y二钾盐、曙红Y二铵盐；
所述共引发剂为三乙醇胺/乙烯吡咯烷酮、过硫酸钠，其中当可见光引发剂为曙红Y及其衍生物时，共引发剂为三乙醇胺和乙烯吡咯烷酮，当可见光引发剂为钌吡啶络合物或核黄素时，共引发剂为过硫酸钠。
6.根据权利要求1所述的双网络生物墨水，其特征在于，所述制备原料中可自由基光固化的天然高分子材料的质量体积百分数为3-10％、脱细胞基质的质量体积百分数为0.5-4％、可见光引发剂的质量体积百分数为0.0008～0.008％、共引发剂的质量体积百分数为0.05～0.5％。
7.根据权利要求1所述的双网络生物墨水，其特征在于，所述双网络生物墨水的制备原料包括可自由基光固化的天然高分子材料，消化脱细胞基质粉末，曙红Y及其衍生物，三乙醇胺，N-乙烯吡咯烷酮；
优选地，所述制备原料中可自由基光固化的天然高分子材料的质量体积百分数为3-10％、消化脱细胞基质粉末的质量体积百分数为0.5-4％、曙红Y及其衍生物的质量体积百分数为0.0008～0.008％、三乙醇胺的质量体积百分数为0.025～0.25％、N-乙烯吡咯烷酮的质量体积百分数为0.025～0.25％。
8.权利要求1-7任一项所述的双网络生物墨水的制备方法，其特征在于，
当脱细胞基质为消化脱细胞基质粉末时，制备方法如下：
1)将消化脱细胞基质粉末和可自由基光固化的天然高分子材料溶解在酸溶液中，在冰浴条件下，调节pH至7-8，并加入PBS溶液或培养基；
2)向1)中加入可见光引发剂、共引发剂，混合均匀后得到双网络生物墨水；
当脱细胞基质为脱细胞基质水凝胶时，制备方法如下：
将可自由基光固化的天然高分子材料、脱细胞基质水凝胶、可见光引发剂、共引发剂与PBS溶液或培养基混合均匀后得到双网络生物墨水。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述消化脱细胞基质粉末的制备方法包括以下步骤：
1-1)将脱细胞基质冷冻干燥，然后粉碎；
1-2)将1-1)所得产物进行消化处理；
1-3)将1-2)中所得产物冷冻干燥，粉碎之后得到消化脱细胞基质粉末；
优选地，所述步骤1-1)具体为：将软骨在去离子水中漂洗后，用质量体积百分数为0.25％胰蛋白酶的乙二胺四乙酸溶液、pH＝7.4的含有50-100U/ml DNA酶与5-15U/ml RNA酶的三(羟甲基)氨基甲烷溶液或水溶液或PBS溶液、体积分数为3％的青霉素和链霉素双抗水溶液多次反复处理之后得到脱细胞基质，冷冻干燥所述脱细胞基质后，粉碎。
10.权利要求1-7任一所述的双网络生物墨水作为生物3D打印墨水的用途。
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