CN109054496A - 一种复合生物墨水及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合生物墨水，其制备原料包括脱细胞基质水凝胶、交联固化剂和生物活性分子；本发明还公开了复合生物墨水的制备方法，包括步骤：(1)脱细胞基质水凝胶的制备：去掉目标组织或器官的脂肪组织和结缔组织后，用1～5％trion x‑100水溶液，1.5～7％脱氧胆酸钠水溶液先后反复多次处理得到脱细胞组织；冷冻干燥所述脱细胞组织，然后粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，然后在2～8℃下调节pH和离子强度，升温至33～39℃得到脱细胞基质水凝胶；(2)加入交联固化剂、活性因子或短肽，在1～8℃复合得到复合生物墨水。通过本发明的方法制备的复合生物墨水兼具良好的生物活性和可3D打印性质。

Description

一种复合生物墨水及其制备方法
技术领域
本发明涉及3D打印技术领域，尤其是一种复合生物墨水及其制备方法。
背景技术
生物3D打印技术具有高精度、高效率、个性化制造等特点，在生物医药领域已引起人们足够重视，具有非常广泛的应用前景。生物3D打印最为核心的技术是细胞三维受控组装工艺，按照器官解剖学的数字模型，通过控制单个细胞和细胞团簇的3D组装，实现可整合于人体新陈代谢系统的用于修复和替代病损组织和器官的人造器官的制造。目前，生物3D打印在包括牙齿、骨骼、软骨等结构性组织的再造方面已取得一定进展。
迄今为止，采用3D打印技术制造真正适合于体内植入的器官或组织还面临很大的挑战，其中研发适合于3D打印的生物材料是关键。目前广泛采用的3D打印材料是热塑性可降解吸收聚酯塑料(PLA、PLGA、PCL，PEG及它们的共聚物等)以及一些天然高分子材料(海藻酸盐、纤维蛋白、胶原等)。前者大多通过有机溶剂或者高温处理进行3D打印，打印出的支架结构稳定，但精度有限，不能与细胞或活性分子混合打印；后者多为水溶性，普遍具有好的生物相容性和特定的生物活性，可以负载细胞实现细胞打印，但支架仿真性和稳定性差，难以完成精细的生物结构的构建以及体内长期稳定的使用。现有材料无论单独使用还是复合都很难兼顾细胞相容性、生物活性和力学性能，特别是用于细胞打印的水凝胶材料，天然来源的组分具有良好的细胞相容性，仿真性和结构稳定性却很低；端基丙烯酰化的聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇-聚丙二醇三嵌段共聚物(F127类)聚醚化学交联水凝胶有较好的力学强度，但不利于包埋细胞的存活和生长。
近年来，去细胞组织或器官基质材料作为一种良好的组织工程支架，对其研究的进展很大。目前已经制备出去细胞心脏瓣膜，心包，血管，皮肤，神经，骨骼肌，韧带，小肠粘膜下层(SIS)，膀胱粘膜下层(UBM)和肝脏等。已经上市的去细胞基质产品除神经去细胞基质外，还包括膜再生修复补片、防粘连膜、疝和瘘补片、以及一些软组织修复产品。这类去细胞基质之所以在临床上取得如此卓越的效果，除了保留了它特定组织的织态结构外，还保留了很多复杂的生物信息。去细胞基质粉末(粒径50-200mm)保留了特殊的结构和表面特性以及促进组织再生的多种活性物质，去细胞基质粉末可经酶消化制备的水凝胶，虽然在纯化过程中损失了一些生物活性分子，但仍然保留了母体ECM支架的天然活性，灵活的水凝胶的存在形态，拓宽了其应用范围，使其可操作性更强。此外，本申请的发明人分别用去细胞的周围神经水凝胶(DNM-Gel)和去细胞脊髓的水凝胶(DSC-Gel)对周围神经损伤的修复研究发现，其具有组织特异性的修复作用，即对于周围神经损伤而言，周围神经来源的水凝胶的修复效果好于脊髓来源的水凝胶。
显然，去细胞基质水凝胶具有优异的生物活性，是生物3D打印墨水最佳选择之一。但是，包括本申请的发明人相关研究表明，单独的去细胞基质水凝胶的力学强度依然较小，不足以自支撑实现3D模型的构建。同时，其凝胶化是通过分子的自主组装实现的，力学及结构稳定性较差，不利于体内外长时间的应用。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有生物活性的复合生物墨水，其适用于3D打印的基础材料，可在人体内被吸收降解。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：
在第一个方面，本发明提供了一种复合生物墨水，其制备原料包括脱细胞基质水凝胶、交联固化剂和生物活性分子。其中，脱细胞基质水凝胶与交联固化剂复合形成复合生物墨水，从而提高墨水的可打印性及打印后的稳定性。脱细胞基质水凝胶是本发明复合生物墨水的核心组分，为复合墨水中生物活性组分，起到支持细胞的生长，促进组织损伤区域再生的作用。此外，还可以对负载的生物活性分子起到保护作用，以延长其活性半衰期。
优选地，所述交联固化剂为PEG类聚醚酯/碳酸脂、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、琼脂、透明质酸，或上述物质的不饱和双键改性产物中的一种或多种；更优选为PLGA-PEG-PLGA(聚(DL-乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇)共聚物)或双键改性透明质酸和双键改性明胶的混合物，其中双键改性透明质酸和双键改性明胶的质量百分浓度为1％～10％；PLGA-PEG-PLGA、双键改性透明质酸、双键改性明胶作为第二组分(交联固化剂)，主要功能是起到打印后快速固化、精确成型的作用；PLGA-PEG-PLGA的作用是两亲性相互作用交联成型；双键改性透明质酸兼具剪切变稀和紫外光原位聚合双敏感交联成型的作用；双键改性明胶兼具温度敏感相转变和紫外光原位聚合双敏感交联成型的作用；其中，双键改性透明质酸、双键改性明胶中双键指丙烯酸酯双键或降冰片烯双键。
优选地，所述PEG类聚醚酯/碳酸脂为PLGA-PEG-PLGA、PLA-PEG-PLA(聚(乳酸-聚乙二醇)共聚物)、PCL-PEG-PCL(聚(己内酯-聚乙二醇)共聚物)、4-armed PEG(4臂聚乙二醇)、6-armed PEG(6臂聚乙二醇)或8-armd PEG(8臂聚乙二醇)。
优选地，所述生物活性分子为活性因子或功能短肽，其中，所述活性因子为β-NGF(神经生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、BDNF(脑源性神经营养因子)或NT-3(神经营养因子)；所述功能短肽为RGD或IKVAV(合成神经活性多肽，氨基酸序列为异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)。其中，RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，可与11种整合素特异性结合，能有效地促进细胞对生物材料的粘附。
优选地，所述制备原料中脱细胞基质水凝胶的质量百分浓度为0.1～5％。
优选地，所述制备原料中，交联固化剂的质量百分浓度为2～30％。
优选地，所述脱细胞基质水凝胶源自哺乳动物的周围神经、脊髓、心脏、胎盘、羊膜或小肠黏膜下层；哺乳动物优选为人或猪。应当说明的是，不同组织来源的水凝胶具有不同的生物功能，因而本墨水具有组织来源特异性的生物功能，可以满足不同组织器官的修复及相关疾病的治疗。
在第二个方面，本发明提供上述复合生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
(1)脱细胞基质水凝胶的制备：去掉目标组织或器官脂肪组织和结缔组织后，用1～5％trion x-100水溶液，1.5～7％脱氧胆酸钠水溶液先后反复多次处理得到脱细胞组织；冷冻干燥所述脱细胞组织，然后粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，然后在2～8℃下调节pH和离子强度，升温至33～39℃得到脱细胞基质水凝胶；
(2)加入交联固化剂和(预定使用量的)活性因子或短肽，在1～8℃交联复合得到所述复合生物墨水。由此，采用上述方法制备的生物墨水，可以有效提高脱细胞基质水凝胶在复合生物墨水中的稳定性，避免脱细胞基质水凝胶在使用前从复合生物墨水中析出而无法使用；单独的脱细胞水凝胶强度低，不可自支撑，无法用作3D打印，上述复合生物墨水可以较好的实现脱细胞基质水凝胶为主的墨水的高精度3D打印。最优选地，trion x-100水溶液浓度为3％，脱氧胆酸钠水溶液浓度为4％，在4℃下调节pH(7)和离子强度，升温至37℃，交联温度为4℃。
优选地，所述交联固化剂为PEG类聚醚酯、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、琼脂、透明质酸，或上述物质的不饱和双键改性产物中的一种或多种。
优选地，所述PEG类聚醚酯为PLGA-PEG-PLGA、PLA-PEG-PLA、PCL-PEG-PCL、4-armedPEG、6-armed PEG或8-armd PEG。
优选地，所述生物活性分子为活性因子或功能短肽，其中，所述活性因子为β-NGF、VEGF、BDNF或NT-3，功能短肽为RGD或IKVAV。
优选地，所述脱细胞基质水凝胶源自哺乳动物的周围神经、脊髓、心脏、胎盘、羊膜或小肠黏膜下层；哺乳动物优选为人。
综上所述，本发明的有益效果包括：
(1)本发明的复合生物墨水兼具良好的生物活性和可3D打印性质；
(2)本发明的复合生物墨水中细胞外基质来源的水凝胶对生物墨水中负载的NGF、VEGF、BDNF、RGD、IKVAV等活性因子或功能短肽具有保护和控制释放作用；
(3)本发明的复合生物墨水在制备过程中，涉及可选的多固化成型的原理，赋予其快速固化成型特点。
附图说明
图1为复合生物墨水储能模量的检测结果图；
图2为复合生物墨水对β-NGF控制释放曲线图；
图3为复合生物墨水打印网格模型的实物图；其中，A图中矩形对应B图中的矩形，B图中的矩形对应C图。
具体实施方式
本发明涉及一种复合生物墨水，其可在人体内被降解吸收，兼具生物活性和可3D打印性质，旨在解决现有的生物墨水无法兼顾良好的生物活性和生物3D打印精确成型的问题。本发明的生物墨水通过3D打印，可实现结构功能高仿生和高分辨率，突破软组织或器官的仿生制造的技术瓶颈。该墨水的主要成分是源于组织的脱细胞基质水凝胶；其制备方法简节，可批量制备。不同组织来源可赋予墨水特异性的生物功能；该墨水可以复合细胞进行打印；该墨水还可以复合不同的生物活性因子。
本发明的“生物墨水”主要是由多种组织或器官来源的脱细胞基质水凝胶、提高3D可打印及稳定性的第二组分(即交联固化剂)、提供特殊生物功能的各类活性分子组成。
进一步地，上述多种组织或器官包括周围神经、脊髓、心脏、胎盘、羊膜和小肠黏膜下层。
进一步地，上述组织或器官处理所得水凝胶的制备过程如下：清理目标组织或器官的脂肪、结缔组织后，用3％trion x-100水溶液，4％脱氧胆酸钠水溶液先后反复处理得到脱细胞组织；然后冷冻干燥脱细胞组织，用粉碎机粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，4℃下调节pH为7～8，因为pH大于9使胃蛋白酶失活，之后加入凝胶溶液十分之一体积的高浓度PBS(10倍浓度的标准PBS，升温至37℃即得到脱细胞基质水凝胶。
进一步地，交联固化剂可为PEG类聚醚酯(PLGA-PEG-PLGA，PCL-PEG-PCL，4-armed/6-armed/8-armd PEG)，胶原蛋白/明胶/壳聚糖/琼脂/透明质酸，或上述物质的不饱和双键改性产物中的一种或多种。
进一步地，脱细胞基质水凝胶的浓度为0.1～5％，交联固化剂的浓度为2～30％。
进一步地，复合生物墨水可以负载β-NGF、VEGF、BDNF、NT-1，RGD、IKVAV等活性因子或功能短肽。
进一步地，复合生物墨水打印快速相转变的原理包括温度敏感快速固化、紫外光原位快速聚合固化、两亲性自组装相转变固化的一种或多种。
进一步地，复合生物墨水固化成型后会形成相互独立的两个分子网络，其一是脱细胞基质水凝胶的自组装纳米纤维网络，其二是第二组分(交联固化剂)的交联网络，两个网络相互贯穿，产生协同作用，在宏观上提高了复合生物墨水的打印物的力学性质及稳定性。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本申请中试剂的单位均为质量浓度。
实施例1
本发明的复合生物墨水的一种实施例，其制备原料包括以下质量百分浓度的组分：脱细胞基质水凝胶1％，PLGA-PEG-PLGA 30％，因子为β-NGF(终浓度为60ng/ml)，余量为水。
上述复合生物墨水的制备方法包括如下步骤：
(1)脱细胞基质水凝胶的制备：去掉猪心脂肪组织和结缔组织后，用1％trion x-100水溶液，7％脱氧胆酸钠水溶液先后反复多次处理得到脱细胞组织；冷冻干燥所述脱细胞组织，然后粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，然后在2℃下调节pH(7.5)和离子强度，升温至39℃得到脱细胞基质水凝胶，控制终浓度为1％。
(2)用上述脱细胞基质水凝胶溶解定量的PLGA-PEG-PLGA和β-NGF，在1℃复合得到所述生物墨水。
实施例2
本发明的复合生物墨水的一种实施例，其制备原料包括以下质量百分浓度的组分：脱细胞基质水凝胶1％，双键改性透明质酸2％，因子为VEGF(终浓度为40ng/ml)，余量为水。
上述复合生物墨水的制备方法包括如下步骤：
(1)脱细胞基质水凝胶的制备：去掉猪胎盘脂肪组织和结缔组织后，用2％trionx-100水溶液，5.5％脱氧胆酸钠水溶液先后反复多次处理得到脱细胞组织；冷冻干燥所述脱细胞组织，然后粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，然后在3℃下调节pH(7.9)和离子强度，升温至38℃得到脱细胞基质水凝胶，控制终浓度为1％。
(2)用上述脱细胞基质水凝胶溶解定量的双键改性透明质酸和VEGF，在2℃复合得到所述生物墨水。
实施例3
本发明的复合生物墨水的一种实施例，其制备原料包括以下质量百分浓度的组分：脱细胞基质水凝胶2％，双键改性明胶8％，因子为BDNF(终浓度为20ng/ml)，余量为水。
上述复合生物墨水的制备方法包括如下步骤：
(1)脱细胞基质水凝胶的制备：去掉猪心脂肪组织和结缔组织后，用3％trion x-100水溶液，4％脱氧胆酸钠水溶液先后反复多次处理得到脱细胞组织；冷冻干燥所述脱细胞组织，然后粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，然后在4℃下调节pH(7)和离子强度，升温至37℃得到脱细胞基质水凝胶，控制终浓度为2％。
(2)用上述脱细胞基质水凝胶溶解定量的双键改性明胶和BDNF，在4℃复合得到所述生物墨水。
实施例4
本发明的复合生物墨水的一种实施例，其制备原料包括以下质量百分浓度的组分：脱细胞基质水凝胶2％，双键改性透明质酸1％和双键改性明胶6％，因子为β-NGF(终浓度为60ng/ml)，余量为水。
上述复合生物墨水的制备方法包括如下步骤：
(1)脱细胞基质水凝胶的制备：去掉猪心脂肪组织和结缔组织后，用4％trion x-100水溶液，3％脱氧胆酸钠水溶液先后反复多次处理得到脱细胞组织；冷冻干燥所述脱细胞组织，然后粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，然后在5℃下调节pH(7.7)和离子强度，升温至36℃得到脱细胞基质水凝胶，控制终浓度为2％。
(2)用上述脱细胞基质水凝胶溶解定量的双键改性透明质酸、双键改性明胶和β-NGF，在5℃交联复合得到所述生物墨水。
实施例5
本发明的复合生物墨水的一种实施例，其制备原料包括以下质量百分浓度的组分：脱细胞基质水凝胶0.1％，双键改性透明质酸5％和双键改性明胶10％，因子为β-NGF(终浓度为60ng/ml)，余量为水。
上述复合生物墨水的制备方法包括如下步骤：
(1)脱细胞基质水凝胶的制备：去掉猪心脂肪组织和结缔组织后，用5％trion x-100水溶液，2％脱氧胆酸钠水溶液先后反复多次处理得到脱细胞组织；冷冻干燥所述脱细胞组织，然后粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，然后在6℃下调节pH(7.3)和离子强度，升温至35℃得到脱细胞基质水凝胶，控制终浓度为0.1％。
(2)用上述脱细胞基质水凝胶溶解定量的双键改性透明质酸、双键改性明胶和β-NGF，在6.5℃交联复合得到所述生物墨水。
实施例6
本发明的复合生物墨水的一种实施例，其制备原料包括以下质量百分浓度的组分：脱细胞基质水凝胶5％，PLGA-PEG-PLGA 20％和双键改性明胶4％，因子为β-NGF(终浓度为60ng/ml)，余量为水。
上述复合生物墨水的制备方法包括如下步骤：
(1)脱细胞基质水凝胶的制备：去掉猪心脂肪组织和结缔组织后，用2％trion x-100水溶液，1.5％脱氧胆酸钠水溶液先后反复多次处理得到脱细胞组织；冷冻干燥所述脱细胞组织，然后粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，然后在8℃下调节pH(7.1)和离子强度，升温至33℃得到脱细胞基质水凝胶，控制终浓度为0.1％。
(2)用上述脱细胞基质水凝胶溶解定量的PLGA-PEG-PLGA、双键改性明胶和β-NGF，在8℃交联复合得到所述生物墨水。
实施例7脱细胞基质水凝胶的组分对复合生物墨水储能模量的影响
测试对象：待测试的复合生物墨水中，脱细胞基质水凝胶源于周围神经组织，交联固化剂为双键改性明胶，测试组的因子均为60ng/ml的β-NGF，所测试的复合生物墨水样品还包括：
A：生物墨水为0.25％的DNM-Gel(去细胞的周围神经水凝胶)；
B:生物墨水为5％w/w的Gel-MA(丙烯酸酯双键改性明胶)；
C:复合生物墨水含0.25％的DNM-Gel和5％w/w的Gel-MA；
D:生物墨水为0.5％的DNM-Gel；
E:复合生物墨水含0.5％的DNM-Gel和5％w/w的Gel-MA。
测试方法：取0.2ml的样品置于流变仪平行板上，37℃下恒温2分钟，闭合平行板，为防止测试过程中样品蒸发失水，平行板加装密封套。在37℃下使用动态流变仪进行测试(测试条件：扫描1Hz频率，扫描形变1％)，随后在连续测试状态下开启UV-360nm辐照1min，记录最后的储能模量。
测试结果：统计储能模量随组分的变化(见图1)。
从图1可知，0.25％的DNM-Gel(A)的储能模量约为240Pa，0.5％DNM-Gel的储能模量约为710Pa(D)，5％的Gel-MA的储能模量约为820Pa(B)，实验组复合生物墨水的储能模量分别为：0.25％的DNM-Gel、5％w/w的Gel-MA的复合墨水(C)为1340Pa，0.5％的DNM-Gel、5％w/w的Gel-MA的复合墨水(E)为2130Pa。显然，复合生物墨水(C和E)的储能模量要显著高于同等浓度的单一组分墨水的储能模量之和(A+B，D+B)，表现出显著的协同作用，表明本发明的复合生物墨水(C和E)具有更好的力学性质。
实施例8复合生物墨水对β-NGF的控制释放的效果测试
测试对象：待测试的复合生物墨水组分为0.5％w/w的DNM-Gel和5％w/w的Gel-MA，即脱细胞基质水凝胶源于周围神经组织，交联固化剂为双键改性明胶。
测试方法：取1ml上述生物墨水，添加60ng的β-NGF及3mg光引发剂I2959，搅拌使之溶解分布均匀；28℃下将1ml的墨水注入直径为2cm的圆形槽中，降低温度至4℃，选用365nm紫外光照射240s，使之固化形成圆形凝胶薄片。将凝胶薄片浸泡到10ml的PBS释放液中，37℃下在预定时间取1ml留作检测浓度，随即补加等量新鲜PBS释放液。采用检测β-NGF的Elisa试剂盒，测试取样浓度。计算不同时间下累计释放量，统计误差并作图。
测试结果：结果如图2的累计释放曲线图所示，初期7天β-NGF略有快速释放(爆释)，释放量约20ng；随后的7-34天，累计释放量缓慢均匀增加，呈现一级释放规律。释放结果提示，本发明的复合生物墨水有利于β-NGF因子在1个月内持续稳定的发挥作用。
实施例9复合生物墨水的3D可打印性测试
测试对象：待测试的复合生物墨水组分为0.5％w/w的DNM-Gel和5％w/w的Gel-MA，即脱细胞基质水凝胶源于周围神经组织，交联固化剂为双键改性明胶。
测试方法：用3ml注射器取1ml上述生物墨水，添加60ng的β-NGF及3mg光引发剂I2959，搅拌使之溶解分布均匀；将注射器置于3D生物打印机恒温挤出槽内，维持温度为28℃；打印接受地板区域温度维持4℃；运行如图3实物所示的网格状模型程序进行3D打印。
测试结果：由复合生物墨水3D打印的实物如图3所示。由不同放大尺寸的光学显微镜拍摄的实物图可以得出，所打印的网格状线条之间、层与层之间结构清晰；网格状呈现通透的多孔状；由下排的扫描电镜结果可以得出，墨水材料所本身也是呈现多孔的结构。由此，本实施例可以体现出本生物墨水体系采用3D打印出的支架结构具有宏微观两级结构，其中，宏观结构是由3D打印技术所控制，微观结构是由墨水水凝胶材料自身性质所控制。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种复合生物墨水，其特征在于，所述复合生物墨水的制备原料包括脱细胞基质水凝胶、交联固化剂和生物活性分子。
2.根据权利要求1所述的复合生物墨水，其特征在于，所述交联固化剂为PEG类聚醚酯/碳酸酯、胶原、明胶蛋白、壳聚糖、琼脂、透明质酸，或上述物质的不饱和双键改性产物中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的复合生物墨水，其特征在于，所述PEG类聚醚酯/碳酸酯为PLGA-PEG-PLGA、PLA-PEG-PLA、PCL-PEG-PCL、4-armed PEG、6-armed PEG或8-armd PEG。
4.根据权利要求1所述的复合生物墨水，其特征在于，所述生物活性分子为活性因子或功能短肽，其中，所述活性因子为β-NGF、VEGF、BDNF或NT-3，功能短肽为RGD或IKVAV。
5.根据权利要求1所述的复合生物墨水，其特征在于，所述制备原料中脱细胞基质水凝胶的质量百分浓度为0.1～5％。
6.根据权利要求1所述的复合生物墨水，其特征在于，所述制备原料中，交联固化剂的质量百分浓度为2～30％。
7.根据权利要求1所述的复合生物墨水，其特征在于，所述脱细胞基质水凝胶源自哺乳动物的周围神经、脊髓、心脏、胎盘、羊膜或小肠黏膜下层。
8.权利要求1～7任一项所述的复合生物墨水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)脱细胞基质水凝胶的制备：去掉目标组织或器官的脂肪组织和结缔组织后，用1～5％trion x-100水溶液，1.5～7％脱氧胆酸钠水溶液先后反复多次处理得到脱细胞组织；冷冻干燥所述脱细胞组织，然后粉碎，经胃蛋白酶处理得到粘稠的凝胶溶液，然后在2～8℃下调节pH和离子强度，升温至33～39℃得到脱细胞基质水凝胶；
(2)加入交联固化剂、活性因子或短肽，在1～8℃复合得到所述复合生物墨水。
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