CN109481732B - 一种基于peg化壳聚糖-明胶体系的3d细胞打印材料及其应用 - Google Patents
一种基于peg化壳聚糖-明胶体系的3d细胞打印材料及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种基于PEG化壳聚糖‑明胶体系的3D细胞打印材料及其应用。本发明首先公开了一种基于PEG化壳聚糖‑明胶体系的3D细胞打印材料,包括质量比为1~80:10~60的PEG化壳聚糖和明胶。本发明进一步公开了上述3D细胞打印材料在打印细胞支架上的应用。本发明采用PEG化壳聚糖~明胶体系作为3D细胞打印材料,有效避免使用海藻酸盐,采用正负电荷相互作用的交联方法形成水凝胶网络,对细胞无毒性,最大限度地避免了交联过程对细胞活性的损害,具有良好的生物相容性、可降解性、成胶性和可打性,通过3D细胞打印得到的细胞支架性能稳定,可用于皮肤、韧带等软组织的构建及修复等临床工作。
Description
技术领域
本发明涉及3D细胞打印技术领域。更具体地,涉及一种基于PEG化壳聚糖-明胶体系的3D细胞打印材料及其应用。
背景技术
通过3D生物打印技术在体外构筑三维细胞体系,已成为现代组织工程学和再生医学研究的重点、热点和难点。在影响细胞3D打印效果的诸多因素中,生物材料至关重要。它不仅应具有良好的生物相容性和可降解性,还需具有理想的成胶性和可打性。同时,其交联过程还需满足无细胞毒性、条件温和的要求。发明专利“一种负载细胞三维支架的制备方法及应用”(CN 104548208B)公开的明胶-海藻酸钠-氯化钙水凝胶是目前使用较为普遍的细胞3D打印体系。该体系具有良好的成胶性和可打性,但是,由于降解缓慢限制其在3D生物打印领域的应用。
壳聚糖作为一种天然多糖,具有良好的生物相容性和生物可降解性,以及止血、促进伤口愈合的作用。壳聚糖衍生化后水溶性大幅提高,已用用修复医学与组织工程的研究(A tissue-mimetic nano-fibrillar hybrid injectable hydrogel for potentialsoft tissue engineering applications,Sci.Rep.2018,8:1047;Balancingantimicrobial activity with biological safety:bifunctional chitosanderivative for the repair of wounds with Gram-positive bacterial infections,J.Mater.Chem.B,2018,6,3884.)。发明专利“用于骨修复的可打印的形态发生阶段特异性壳聚糖-聚磷酸钙支架”(申请号201580037496.2)公开了羧甲基壳聚糖、聚磷酸盐和海藻酸盐组合,通过3D细胞打印技术,制备骨组织支架的方法。但上述支架中使用了海藻盐,降低了支架的可降解性。
因此,需要提供一种无需添加海藻酸盐的3D细胞打印材料,以解决上述问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种基于PEG化壳聚糖-明胶体系的3D细胞打印材料,该材料具有良好的生物相容性、可降解性。
本发明的另一个目的在于提供上述3D细胞打印材料的应用。
为达到上述目的,本发明采用下述技术方案:
本发明提供了一种基于PEG化壳聚糖-明胶体系的3D细胞打印材料,该3D细胞打印材料包括质量比为1~80:10~60的PEG化壳聚糖和明胶。
优选的,所述PEG化壳聚糖和明胶的质量比为1~6:1~3。
进一步,所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖的羟基或羟基和氨基的PEG化得到的。
优选的,所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖羟基的PEG修饰得到的。
进一步,所述PEG化壳聚糖PEG化修饰率在40%~200%之间。
优选的,所述PEG化壳聚糖PEG化修饰率在50%~100%之间。
进一步,所述PEG化壳聚糖的非PEG化的游离氨基被乙酰化、部分乙酰化、胍基化、部分胍基化中一种或多种。
优选的,所述PEG化壳聚糖的非PEG化的游离氨基被部分胍基化,所述部分胍基化比例在0~90%之间;更优选的,所述部分胍基化比例在30%~70%之间。
进一步,所述壳聚糖分子量在103~106Da之间,脱乙酰度为不低于70%;优选的,所述壳聚糖分子量在104~5×105Da之间;更优选的,所述脱乙酰度在90%以上。
进一步,所述PEG化壳聚糖中PEG分子量在40~5000Da之间。
优选的,所述PEG化壳聚糖中PEG分子量在40~2500Da之间。
本发明进一步提供了上述基于PEG化壳聚糖-明胶体系的3D细胞打印材料在打印三维细胞支架上的应用。
进一步,所述细胞支架可用于皮肤、韧带等软组织的构建及修复。
进一步,所述应用的方法,包括以下步骤:
将PEG化壳聚糖、明胶和溶剂混合,得到初级水凝胶;
细胞悬液与初级水凝胶混合,3D打印得到水凝胶支架;
水凝胶支架通过磷酸盐溶液交联得到三维细胞支架。
进一步,所述初级水凝胶中PEG化壳聚糖的浓度为1~80w/v%。
优选的,所述初级水凝胶中PEG化壳聚糖的浓度为10~60w/v%。
进一步,所述初级水凝胶中明胶的浓度为5~60w/v%。优选的,所述初级水凝胶中明胶的浓度为10~30w/v%。
进一步,所述溶剂为缓冲溶液、生理盐水、培养基中一种。
进一步,所述细胞悬液包括细胞培养液、血清和细胞,所述细胞培养液与血清的体积比为9:1,细胞浓度1.0×107~1.5×107个/mL;其中,所述细胞为纤维细胞、表皮细胞、皮肤附属成分细胞、软骨细胞、神经细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞中一种或多种。
进一步,所述磷酸盐溶液为果糖二磷酸钠溶液、甘油磷酸钠溶液、聚磷酸盐溶液中一种或多种混合物;优选的,所述磷酸盐溶液浓度在1~50w/v%之间;更优选的,所述磷酸盐溶液浓度在10~30w/v%之间。
本发明的有益效果如下:
1、本发明采用PEG化壳聚糖-明胶体系作为细胞3D打印材料,有效避免使用海藻酸盐,具有良好的生物相容性、可降解性、成胶性和可打性,通过3D细胞打印得到的三维细胞支架用于皮肤、韧带等软组织的构建及修复。
2、本发明采用正负电荷相互作用的交联方法形成水凝胶网络,对细胞无毒性,最大限度地避免了交联过程对细胞活性的损害。
3、本发明方法简单,成本低,提高了打印效率,得到的细胞支架性能稳定,能够满足临床需要。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
一方面,本发明提供了一种基于PEG化壳聚糖-明胶体系的3D细胞打印材料,该3D细胞打印材料包括质量比为1~80:10~60的PEG化壳聚糖和明胶。优选的,所述PEG化壳聚糖和明胶的质量比为1~6:1~3。
本发明3D细胞打印材料有效避免使用海藻酸盐,具有良好的生物相容性、可降解性、成胶性和可打性,通过3D细胞打印得到的细胞支架用于皮肤、韧带等软组织的构建及修复。
进一步,所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖的羟基或羟基和氨基的PEG化得到的。
在本发明中,壳聚糖的PEG化有两种方式,一种为羟基PEG化,另一种为羟基和部分氨基的PEG化。
优选的,所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖羟基的PEG修饰得到的,以避免壳聚糖氨基被大量占用,从而提高交联点密度,进而提高细胞支架网络的力学性能和稳定性。
进一步,所述PEG化壳聚糖PEG化修饰率在40%~200%之间(例如可以为40%、60%、100%、150%、200%等等)或任意修饰率之间的任何范围。
优选的,所述PEG化壳聚糖PEG化修饰率在50%~100%之间(例如可以为50%、60%、70%、80%、90%、100%等等)或任意修饰率之间的任何范围;该范围内既能够确保体系具有良好的生物相容性,还能够降低由于PEG柔性链对细胞支架力学性能的影响。
进一步,所述PEG化壳聚糖的非PEG化的游离氨基被乙酰化、部分乙酰化、胍基化、部分胍基化中一种或多种。
优选的,所述PEG化壳聚糖的非PEG化的游离氨基被部分胍基化,所述部分胍基化比例在0~90%之间,以提高壳聚糖与交联剂的相互作用,从而提高细胞支架的稳定性;更优选的,所述部分胍基化比例在30%~70%之间,在保证细胞支架稳定性的前提下,以避免由于胍基化比例过高导致的细胞毒性。
进一步,所述壳聚糖分子量在103~106Da(例如可以为103Da、104Da、105Da、106Da等等)或任意分子量之间的任何范围,脱乙酰度为不低于70%;优选的,所述壳聚糖分子量在104~5×105Da(例如可以为104Da、105Da、5×105Da等等)或任意分子量之间的任何范围,在该范围内既可保证壳聚糖的高分子属性,又不会因为分子量过高影响材料的水溶性;更优选的,所述脱乙酰度在90%以上,此脱乙酰度范围可以确保壳聚糖分子链上有尽可能多的交联位点,以提细胞支架的力学性能和稳定性。
进一步,所述PEG化壳聚糖中PEG分子量在40~5000Da(例如可以为40Da、100Da、1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da等等)或任意分子量之间的任何范围。
优选的,所述PEG化壳聚糖中PEG分子量在40~2500Da之间(例如可以为40Da、100Da、1000Da、2000Da、2500Da等等)或任意分子量之间的任何范围;该范围既能够确保体系具有良好的生物相容性,还能够降低由于PEG柔性链对细胞支架力学性能的影响。
另一方面,本发明提供了上述基于PEG化壳聚糖-明胶体系的3D细胞打印材料在打印三维细胞支架上的应用。
进一步,所述细胞支架可用于皮肤、韧带等软组织的构建及修复。
进一步,所述应用的方法,包括以下步骤:
将PEG化壳聚糖、明胶和溶剂混合,得到初级水凝胶;
细胞悬液与初级水凝胶混合,3D打印得到水凝胶支架;
水凝胶支架通过磷酸盐溶液交联得到三维细胞支架。
进一步,所述初级水凝胶中PEG化壳聚糖的浓度为1-80w/v%(例如可以为1w/v%、5w/v%、10w/v%、15w/v%、20w/v%、25w/v%、30w/v%、35w/v%、40w/v%、45w/v%、50w/v%、55w/v%、60w/v%、65w/v%、70w/v%、75w/v%、80w/v%等等)或任意浓度之间的任何范围。优选的,所述初级水凝胶中PEG化壳聚糖的浓度为10~60w/v%,以确保3D细胞打印材料具有较好的可打性,同时细胞支架具有理想的力学性能和稳定性。
进一步,所述初级水凝胶中明胶在初级水凝胶的浓度为5~60w/v%(例如可以为5w/v%、10w/v%、15w/v%、20w/v%、25w/v%、30w/v%、35w/v%、40w/v%、45w/v%、50w/v%、55w/v%、60w/v%等等)或任意浓度之间的任何范围。优选的,所述初级水凝胶中明胶在初级水凝胶的浓度为10~30w/v%,进一步为水凝胶提供良好的可打性,并且具有促进细胞增殖的作用。
进一步,所述溶剂为缓冲溶液、生理盐水、培养基中一种。
进一步,所述细胞悬液包括细胞培养液、血清和细胞,所述细胞培养液与血清的体积比为9:1,细胞浓度1.0×107~1.5×107个/mL;其中,所述细胞为纤维细胞、表皮细胞、皮肤附属成分细胞、软骨细胞、神经细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞中一种或多种。
进一步,所述磷酸盐溶液为果糖二磷酸钠溶液、甘油磷酸钠溶液、聚磷酸盐溶液中一种或多种混合物;优选的,所述磷酸盐溶液浓度在1~50w/v%(例如可以为1w/v%、5w/v%、10w/v%、15w/v%、20w/v%、25w/v%、30w/v%、35w/v%、40w/v%、45w/v%、50w/v%等等)或任意浓度之间的任何范围;更优选的,所述磷酸盐溶液浓度在10~30w/v%(例如可以为10w/v%、15w/v%、20w/v%、25w/v%、30w/v%等等)或任意浓度之间的任何范围,以足够多的交联位点,进而使细胞支架具有较为理想的力学性能和稳定性。
本发明采用正负电荷相互作用的交联方法形成水凝胶网络,对细胞无毒性,最大限度地避免了交联过程对细胞活性的损害。
另外注意的是,如果没有特别说明,本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应12h。反应结束后,经纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为104Da,脱乙酰度为95%。PEG分子量为550Da,接枝率为75%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:2。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂的摩尔比为1:1:4,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为70%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和PBS缓冲溶液混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为40w/v%、明胶浓度为15w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在甘油磷酸钠溶液(20w/v%)中交联,得到三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率大于100%。
本实施例所述三维细胞支架在PBS缓冲溶液中浸泡7天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例2
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应12h。反应结束后,经纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为106Da,脱乙酰度为80%。PEG分子量为1000Da,接枝率为50%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:1。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂的摩尔比为1:1:4,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为60%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和生理盐水混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为10w/v%、明胶浓度为40w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在甘油磷酸钠溶液(10w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率大于95%。
本实施例所述三维细胞支架在PBS缓冲溶液生理盐水中浸泡3天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例3
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应12h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为106Da,脱乙酰度为90%。PEG分子量为2000Da,接枝率为40%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:1。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、精氨酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、精氨酸、催化剂的摩尔比为1:1:4,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为90%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和生理盐水混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为1w/v%、明胶浓度为60w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在甘油磷酸钠溶液(1w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率为85%。
本实施例所述三维细胞支架在生理盐水中浸泡5天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例4
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应12h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为103Da,脱乙酰度为100%。PEG分子量为200Da,接枝率为190%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:4。胍基化比例为0%。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、明胶和PBS缓冲溶液混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为80w/v%、明胶浓度为10w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在聚磷酸盐溶液(30w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率大于100%。
本实施例所述三维细胞支架在PBS缓冲溶液中浸泡2天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例5
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应20h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为104Da,脱乙酰度为95%。PEG分子量为2500Da,接枝率为100%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:4。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、胍基己酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、胍基己酸、催化剂的摩尔比为1:1:1,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为30%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和细胞培养基混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为60w/v%、明胶浓度为10w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在聚磷酸盐溶液(30w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率大于100%。
本实施例所述三维细胞支架在细胞培养基中浸泡5天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例6
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入氯乙醇,60℃反应12h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为105Da,脱乙酰度为75%。氯乙醇接枝率为60%,氯乙醇修饰的壳聚糖单元分子量增加44Da。壳聚糖重复单元与氯乙醇的摩尔比为1:1。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂的摩尔比为1:1:1,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为50%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和PBS缓冲溶液混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为30w/v%、明胶浓度为30w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在聚磷酸盐溶液(40w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率大于100%。
本实施例所述三维细胞支架在PBS缓冲溶液中浸泡7天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例7
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入氯乙醇,60℃反应12h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为5×105Da,脱乙酰度为90%。氯乙醇接枝率为60%,氯乙醇修饰的壳聚糖单元分子量增加44Da。壳聚糖重复单元与氯乙醇的摩尔比为1:1。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、精氨酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂的摩尔比为1:1:1,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为40%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和细胞培养基混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为80w/v%、明胶浓度为5w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在果糖二磷酸钠溶液(50w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率为90%。
本实施例所述三维细胞支架在PBS缓冲溶液中浸泡7天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例8
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应20h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为105Da,脱乙酰度为95%。PEG分子量为5000Da,接枝率为70%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:1。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、胍基乙酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、胍基乙酸、催化剂的摩尔比为1:1:1,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为20%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和细胞培养基混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为80w/v%、明胶浓度为20w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在聚磷酸盐溶液(30w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率为95%。
本实施例所述三维细胞支架在细胞培养基中浸泡5天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例9
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应12h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为105Da,脱乙酰度为70%。PEG分子量为4000Da,接枝率为75%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:1。胍基化比例为0%。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、明胶和细胞培养基混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为50w/v%、明胶浓度为30w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在果糖二磷酸钠溶液(30w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率大于100%。
本实施例所述三维细胞支架在细胞培养基中浸泡3天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例10
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应20h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为5×105Da,脱乙酰度为95%。PEG分子量为1000Da,接枝率为75%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:1。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂的摩尔比为1:1:2,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为70%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和细胞培养基混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为40w/v%、明胶浓度为20w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在甘油磷酸钠与聚磷酸盐混合溶液(30w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。其中偏磷酸钠与聚磷酸盐摩尔比为2:1。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率大于100%。
本实施例所述三维细胞支架在生理盐水中浸泡7天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例11
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应12h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为105Da,脱乙酰度为85%。PEG分子量为3000Da,接枝率为100%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:2。胍基化比例为0%。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、明胶和细胞培养基混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为60w/v%、明胶浓度为30w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在果糖二磷酸钠和甘油磷酸钠混合溶液(30w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。其中果糖二磷酸钠和甘油磷酸钠摩尔比为1:1。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率大于100%。
本实施例所述三维细胞支架在细胞培养基中浸泡5天,形貌和尺寸未发现明显变化。
实施例12
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应12h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为106Da,脱乙酰度为90%。PEG分子量为2000Da,接枝率为40%。壳聚糖与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:1。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、精氨酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、精氨酸、催化剂的摩尔比为1:1:2,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为80%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和细胞培养基混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为1w/v%、明胶浓度为50w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架在果糖二磷酸钠和聚磷酸钠溶液(5w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。其中果糖二磷酸钠和聚磷酸钠摩尔比为1:1。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率为95%。
本实施例所述三维细胞支架在生理盐水中浸泡2天,形貌和尺寸未发现明显变化。
对比例1
1)将0.5g壳聚糖加入50mL质量体积浓度为50w/v%的氢氧化钠溶液。碱化24h后,在上述溶液中加入100mL体积比为1:1的异丙醇/水混合溶液。充分混合12h后,加入单甲氧基PEG-环氧基,60℃反应20h。反应结束后,纯化干燥,即得到PEG化壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为5×105Da,脱乙酰度为95%。PEG分子量为1000Da,接枝率为75%。壳聚糖重复单元与单甲氧基PEG-环氧基的摩尔比为1:1。
2)将步骤1)得到的PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂加入缓冲溶液。其中PEG化壳聚糖、胍基丙酸、催化剂的摩尔比为1:1:2,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的PEG化壳聚糖。胍基化比例为70%。
3)将步骤2)得到的PEG化壳聚糖、明胶和细胞培养基混合,充分溶解后,得到PEG化壳聚糖浓度为40w/v%、明胶浓度为20w/v%的初级水凝胶。将细胞悬液与初级水凝胶混匀,体积比为1:9。经3D打印后得到的水凝胶支架未经交联,在生理盐水中浸泡过夜。水凝胶支架形貌和尺寸明显变化。
对比例2
1)将壳聚糖、胍基丙酸、催化剂加入缓冲溶液。其中壳聚糖、胍基丙酸、催化剂的摩尔比为1:1:2,反应24h。反应结束后,纯化干燥,即得到氨基部分胍基化的壳聚糖。其中,壳聚糖分子量为5×105Da,脱乙酰度为95%。胍基化比例为70%。
2)将步骤1)得到的胍基化壳聚糖、明胶和细胞培养基混合,充分溶解后,得到胍基化壳聚糖浓度为40w/v%、明胶浓度为20w/v%的初级水凝胶。。经3D打印后得到的水凝胶支架在聚磷酸盐混合溶液(30w/v%)中交联,得到所述三维细胞支架。
依据GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验》方法要求,对本实施例使用的PEG化壳聚糖进行了检测。该结果显示,在本实施例使用浓度下,人用生化表皮细胞的细胞增值率为76%。
本实施例所述三维细胞支架在生理盐水中浸泡7天,形貌和尺寸未发现明显变化。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定,对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无法对所有的实施方式予以穷举,凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (13)
1.一种基于PEG化壳聚糖-明胶体系的3D细胞打印材料,其特征在于,所述3D细胞打印材料包括质量比为1~80:10~60的PEG化壳聚糖和明胶;
所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖的羟基或羟基和氨基的PEG化得到的;所述壳聚糖分子量在103~106Da之间,脱乙酰度为不低于70%。
2.根据权利要求1所述的3D细胞打印材料,其特征在于,所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖的羟基或羟基和氨基的PEG修饰得到的;所述PEG化壳聚糖的非PEG化游离氨基被乙酰化、部分乙酰化、胍基化、部分胍基化中一种或多种。
3.根据权利要求1所述的3D细胞打印材料,其特征在于,所述PEG化壳聚糖的非PEG化游离氨基被部分胍基化,所述部分胍基化的比例为0~90%。
4.根据权利要求1所述的3D细胞打印材料,其特征在于,所述壳聚糖分子量在104~5×105Da之间,所述脱乙酰度在90%以上。
5.根据权利要求1所述的3D细胞打印材料,其特征在于,所述PEG化壳聚糖中PEG分子量在40~5000Da之间。
6.根据权利要求1所述的3D细胞打印材料,其特征在于,所述PEG化壳聚糖PEG分子量在40~2500Da之间。
7.根据权利要求1所述的3D细胞打印材料,其特征在于,所述PEG化壳聚糖PEG修饰率在40%~200%之间。
8.根据权利要求1所述的3D细胞打印材料,其特征在于,所述PEG化壳聚糖PEG修饰率在50%~100%之间。
9.一种如权利要求1-8任一所述的3D细胞打印材料在打印三维细胞支架上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述应用的方法,包括以下步骤:
将PEG化壳聚糖、明胶和溶剂混合,得到初级水凝胶;
细胞悬液与初级水凝胶混合,3D打印得到水凝胶支架;
水凝胶支架通过磷酸盐溶液交联得到三维细胞支架。
11.根据权利要求10所述的应用,其特征在于,所述初级水凝胶中PEG化壳聚糖的浓度为1~80w/v%,所述初级水凝胶中明胶的浓度为5~60w/v%。
12.根据权利要求10所述的应用,其特征在于,所述初级水凝胶中PEG化壳聚糖的浓度为10~60w/v%,所述初级水凝胶中明胶的浓度为10~30w/v%。
13.根据权利要求10所述的应用,其特征在于,所述磷酸盐溶液为果糖二磷酸钠溶液、甘油磷酸钠溶液、聚磷酸盐溶液中一种或多种混合物;所述磷酸盐溶液浓度在1~50w/v%之间。
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