CN114225098B - 一种具有抗菌和促进伤口愈合的医用敷料 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种具有抗菌和促进伤口愈合的医用敷料，以PEG化壳聚糖为主要原料。其中，PEG化壳聚糖具有良好的抗菌性、水溶性、生物安全性、生物相容性，同时PEG化壳聚糖能够诱导巨噬细胞极化成为具有抗炎修复作用的M2表型，促进伤口处血管、肉芽等组织的生成，促进伤口愈合。因此，本发明中的医用敷料同时具有抗菌和促进伤口愈合的功效，具有广泛的应用潜力。

Description

一种具有抗菌和促进伤口愈合的医用敷料

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域。更具体地，涉及一种具有抗菌和促进伤口愈合的医用敷料。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，一旦皮肤完整性受到破坏，人体将失去保护病原微生物入侵的第一道天然屏障。包括烧烫伤、慢性溃疡、外科手术创面等在内的皮肤创伤给家庭、社会的经济、健康带来严重负担，而当创面受到金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌等病原微生物的感染，会使原本治疗需求大、恢复周期长、治疗费用高的创面迁延不愈，严重时还将引起全身性的脓毒症，最终导致组织坏死甚至截肢。因此，创面治疗是国家的重大需求。而缩短创面愈合时间是创面治疗中全球一致性的金标准。

壳聚糖是自然界中唯一带有正电荷的碱性天然多糖，具有良好的抗菌性、生物相容性、生物可降解性。尽管天然壳聚糖具有多种优异的生物活性，但由于其分子结构中存在丰富的规整氢键，导致其难溶于水或普通的有机溶剂，从而极大地限制了天然壳聚糖在生理条件下的使用。

为了充分改善天然壳聚糖的溶解性，并最大限度地保留其固有的多种生物活性，现有大量研究及专利报道了天然壳聚糖的改性方法或改性壳聚糖的制备技术。例如，申请人在ZL201811631159.8、ZL201811633735.2、ZL201710817411.3、ZL201910762351.9、ZL201710556550.5等中公开了利用聚乙二醇、胍基化合物、氨基酸等物质改性壳聚糖的方法以及改性壳聚糖作为生物大分子材料在抗菌或生物墨水等领域的应用。在现有技术手段中，通过天然壳聚糖的氨基与含有羧基官能团的物质反应，是改性壳聚糖最为常用的方法，其反应条件温和，反应产物纯净，且成本较低。

聚乙二醇(PEG)是聚醚类高分子材料中应用最为广泛的聚合物，也是美国食品与药物管理局(FDA)认可能够被用于生物医药领域的亲水性聚合物。PEG在人体内能够溶于组织液中，生物相容性好，无毒副作用。当把PEG和其它疏水性聚合物链段结合时，可以提高材料的亲水性能。PEG不同种类的端基直接决定了其能够参与的化学反应。商业化的PEG端基一般为羟基，通过端基改性可使其转化为其它功能性基团，比如氨基、羧基等，更易于进行化学键连反应，从而在生物医药领域具有更广阔的应用前景。一端含有羧基，另一端为甲氧基或叠氮基的聚乙二醇链段也常被用来偶联壳聚糖中的氨基，从而得到PEG改性的可溶性壳聚糖。如专利ZL201710817411.3、ZL201910762351.9中的双改性壳聚糖制备方法中的第一步均是通过羧基聚乙二醇单甲醚制备PEG化的壳聚糖，并用于下一步反应。

PEG化的可溶性壳聚糖在生物医用领域有较为广泛的应用，如CarbohydrateResearch 2008,343,282报道了聚乙二醇单甲醚改性壳聚糖的制备方法以及产物的化学结构分析。ACS appliedmaterials&interfaces 2017,9,12203中进一步研究了由该方法制备的可溶性壳聚糖作为基因载体，受不同PEG链长影响而导致的转染效率差异。可溶性壳聚糖中由于含有可以延长在体内循环时间的聚乙二醇链段，也常作为药物载体或环境敏感型水凝胶，被应用于药物控制释放领域。如Ji等人将壳聚糖中的氨基改性成为活性羧基，再将丙氨酸-聚乙二醇嵌段共聚物接枝到壳聚糖侧链，得到温度、pH双重敏感的环境响应聚合物(J.Mater.Chem,2011,21,5484)。但目前仍未发现PEG改性的可溶性壳聚糖在促进感染性或慢性创面愈合领域的应用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种具有抗菌和促进伤口愈合的医用敷料，以PEG化壳聚糖为主要原料，在经典的伤口愈合炎症期具有抗菌性的同时，能够诱导巨噬细胞极化成为具有抗炎修复作用的M2表型而在组织形成期和组织重塑期提高抗炎效果、促进血管生成，在普通感染创面以及慢性创面中均能起到促进创面愈合的作用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种具有抗菌和促进伤口愈合的医用敷料，主要原料为PEG化壳聚糖。

现有技术中，基于PEG化壳聚糖的可溶解性、环境敏感性等特点，常用作药物载体、环境敏感剂等，主要是应用在药物控制释放领域。本发明创造性的发现PEG化壳聚糖具有诱导巨噬细胞极化成为M2表型的功能，结合壳聚糖良好的抗菌性，将PEG化壳聚糖作为主要原料，得到了一种兼具抗菌和促进伤口愈合的医用敷料。

优选地，所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖上羟基或/和氨基的PEG化得到的；

在本发明中，壳聚糖的PEG化有三种方式，分别为羟基PEG化、氨基PEG化、羟基和氨基同时PEG化。

壳聚糖主链具有抗菌性，但是其不溶于水，通过PEG化改善了其水溶性，增加了其生物安全性、生物相容性，还保留了其抗菌性能。同时，本发明还创造性的发现PEG化壳聚糖能够诱导巨噬细胞极化成为具有抗炎修复作用的M2表型，促进伤口处血管、肉芽等组织的生成，促进伤口愈合。

进一步优选地，所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖上氨基PEG化得到的。壳聚糖2位C上的氨基具有较为活泼的反应活性，通常无需加热或冰浴，室温水溶液体系中即可实现氨基的PEG化，反应条件温和，效率较高。

优选地，所述PEG化壳聚糖中PEG的端基为羟基、甲氧基、叠氮基、炔基、羧基或其他惰性官能团；

PEG的双端基团中，一端用于连接壳聚糖，另一端将在反应后直接暴露。稳定的壳聚糖-聚乙二醇结构有利于抗菌性和促进巨噬细胞M2极化作用的保持。因此，直接暴露端基的选用一方面能够在反应过程中保证不对壳聚糖与PEG的连接产生干扰(如非惰性官能团将有可能同时参与反应，使整个体系交联)，从而获得相对纯净的产物；另一方面也对产物结构的调控及稳定起到重要作用。进一步优选地，直接暴露的端基即所述PEG化壳聚糖中PEG的端基为甲氧基、叠氮基或其他惰性官能团。

优选地，所述PEG化壳聚糖中壳聚糖主链的分子量为5～100万Da(例如可以为8万Da、10万Da、20万Da、40万Da、50万Da、70万Da、90万Da等)间任意分子量之间的任何范围，脱乙酰度不低于70％。

进一步优选地，所述壳聚糖主链的分子量为20～50万Da(例如可以为25万Da、30万Da、40万Da等)间任意分子量之间的任何范围，脱乙酰度不低于90％。

合适的壳聚糖主链分子量既可保证壳聚糖的高分子属性，又不会因为分子量过高影响材料的水溶性；较高的脱乙酰度范围可以确保聚糖分子链上有尽可能多的可以被PEG化。

优选地，所述PEG化壳聚糖中PEG的分子量为550～5000Da(例如可以为700Da、1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da等等)间任意分子量之间的任何范围；

PEG化壳聚糖同时具有抗菌性以及促进巨噬细胞M2极化作用的主要原因在于PEG组分与壳聚糖主链的平衡关系，PEG分子量需要限定在一定范围，若PEG分子量太低，所得的PEG化壳聚糖溶解性不充分，不利于抗菌性的发挥；若PEG分子量过高，由于其强烈的亲水作用将会把壳聚糖主链包裹在内部，难以直接暴露而发挥促进巨噬细胞极化的作用。进一步优选地，所述PEG化壳聚糖中PEG的分子量为1000～2000Da(例如可以为1100Da、1300Da、1500Da、1700Da、1900Da等等)间任意分子量之间的任何范围；

优选地，所述壳聚糖上羟基或/和氨基的PEG化比例为50～75％(例如可以为55％、58％、60％、63％、65％、68％、70％或73％等)间任意比例之间的任何范围。

PEG化壳聚糖中不仅PEG的分子量直接影响结构从而影响抗菌性和促进巨噬细胞极化作用的平衡关系；PEG化率也至关重要。过低的取代度会使水溶性不充分，氨基难以充分质子化，抗菌性不理想；PEG化率过高也会降低壳聚糖的占比，同时包裹壳聚糖，失去促进巨噬细胞M2极化的作用。进一步优选地，所述壳聚糖上羟基或/和氨基的PEG化比例为65～70％(例如可以为66％、67％、68％或69％等)间任意比例之间的任何范围。

本发明对以PEG化壳聚糖为主要原料的医用敷料的具体形式没有限制，可以是溶液、凝胶、膏状等适用的形式。

优选地，所述医用敷料是将PEG化壳聚糖溶于溶剂得到的溶液。在具体使用过程中，可将医用敷料定期喷涂于创伤、冻伤、烧烫伤、糖尿病足、压疮、下肢静脉溃疡等急性或慢性难愈性伤口，并用无菌纱布覆盖。该医用敷料中PEG化壳聚糖具有良好的血液相容性和细胞相容性，可以通过诱导巨噬细胞极化成为具有抗炎修复作用的M2表型而促进血管生成从而缩短伤口愈合时间，促进伤口愈合。

优选地，医用敷料中PEG化壳聚糖的浓度为0.1～50mg/mL(例如为0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL等)间的任何范围；优选地，所述溶液中PEG化壳聚糖的浓度为1～10mg/mL(例如为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL)间任意浓度之间的任何范围。

根据伤口的情况，可以每间隔一段时间喷涂本发明中医用敷料一次，例如1～48h喷涂一次，优选为12～24h喷涂一次。本发明中医用敷料具有良好的生物相容性、生物安全性、生物降解性，抗菌的同时又能够诱导巨噬细胞极化成为具有抗炎修复作用的M2表型而促进血管生成并促进伤口愈合。

本发明的有益效果如下：

本发明提供一种以PEG化壳聚糖为主要原料的医用敷料，PEG化壳聚糖具有良好的抗菌性、水溶性、生物安全性、生物相容性，同时PEG化壳聚糖能够诱导巨噬细胞极化成为具有抗炎修复作用的M2表型，促进伤口处血管、肉芽等组织的生成，促进伤口愈合。因此，本发明中的医用敷料同时具有抗菌和促进伤口愈合的功效，具有广泛的应用潜力。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出实施例1中PEG化壳聚糖的血液相容性(***p<0.01)。

图2示出实施例2中PEG化壳聚糖对小鼠成纤维细胞(L929)、人角质形成细胞(HaCat)的细胞相容性。

图3示出实施例3中PEG化壳聚糖对小鼠单核巨噬细胞(Raw264.7)极化表型的影响，其中a)为FITC标记的CD86表达量，用以表示M1型巨噬细胞的数目，b)为APC标记的CD206表达量，用以表示M2型巨噬细胞的数目。

图4示出实施例4中未处理组、商业样品组、空白对照组及PEG化壳聚糖组处理普通小鼠伤口后，伤口随时间变化的照片。

图5示出实施例5中未处理组、商业样品组、空白对照组及PEG化壳聚糖组处理普通小鼠伤口后，14天时伤口中创面菌浓度的统计结果(*p<0.5,**p<0.1)。

图6示出实施例6中未处理组、商业样品组、空白对照组及PEG化壳聚糖组普通小鼠伤后14天的愈合伤口组织HE染色结果。

图7示出实施例7中未处理组、商业样品组、空白对照组及可溶性壳聚糖组普通小鼠伤后14天后的愈合伤口组织中CD31标记结果(箭头标记的红色荧光)。

图8示出实施例8中未处理组、商业样品组、空白对照组及可溶性壳聚糖组糖尿病小鼠伤口后，伤口随时间变化的照片。

图9示出未实施例9中处理组、商业样品组、空白对照组及可溶性壳聚糖组糖尿病小鼠伤后14天后愈合伤口组织HE染色结果

图10示出实施例10中未处理组、商业样品组、空白对照组及可溶性壳聚糖组糖尿病小鼠伤后14天后愈合伤口组织中CD31标记结果(箭头标记的红色荧光)

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

合成例

合成例1

合成甲氧基PEG化壳聚糖

称取0.16g分子量为2×10^5Da、脱乙酰度为95％的壳聚糖加入到10mL MES缓冲液(25mM,pH＝4.90)中，并滴入0.1mL HCl室温下搅拌半小时，使壳聚糖完全溶解，从而得到质量体积百分比浓度为1.6％的均一溶液；然后将在室温下活化1小时的羧基聚乙二醇单甲醚、NHS和EDC·HCl的混合溶液(溶剂为25mM pH＝4.90的MES缓冲溶液)20mL加入上述反应液中，于室温下持续搅拌反应24小时，其中壳聚糖、羧基聚乙二醇单甲醚、NHS、EDC·HCl的物质的量之比为1:1:2:2；反应结束后加入与羧基聚乙二醇单甲醚等物质的量的盐酸羟胺终止反应，随后将反应液转移至截留分子量为8000-14000Da的透析袋中，将透析袋两端扎紧置于去离子水中透析处理，每隔6小时换水一次，换水6次后将透析液放入-20℃冷冻过夜后，放入真空冷冻干燥机直至充分干燥至恒重即可得到甲氧基PEG化壳聚糖。

合成例2

合成叠氮基PEG化壳聚糖

称取0.16g分子量为5×10^4Da、脱乙酰度为98％的壳聚糖加入到10mLMES缓冲液(25mM,pH＝4.80)中，并滴入0.1mL HCl室温下搅拌半小时，使壳聚糖完全溶解，从而得到质量体积百分比浓度为1.6％的均一溶液；然后将在室温下活化1小时的分子量为1000Da的羧基-聚乙二醇-叠氮基、NHS和EDC·HCl的混合溶液(溶剂为25mM pH＝4.80的MES缓冲溶液)20mL加入上述反应液中，于室温下持续搅拌反应24小时，其中壳聚糖、羧基-聚乙二醇-叠氮基、NHS、EDC·HCl的物质的量之比为1:2:4:4；反应结束后加入与羧基聚乙二醇单甲醚等物质的量的盐酸羟胺终止反应，随后将反应液转移至截留分子量为3500-7000Da的透析袋中，将透析袋两端扎紧置于去离子水中透析处理，每隔4小时换水一次，换水8次后将透析液放入-20℃冷冻过夜后，放入真空冷冻干燥机直至充分干燥至恒重即可得到叠氮基PEG化壳聚糖。

实施例

实施例1

实验用红细胞悬液的制备：取1体积兔全血于50mL离心管中，向内加入4体积Tris缓冲液(10mM Tris,150mM NaCl,pH＝7.2)，1000×g离心10分钟，小心倾倒上清液，并向下层红细胞沉淀中补加5体积Tris缓冲液，1000×g再次离心10分钟。待上清液洗至无色，将所得红细胞沉淀用Tris缓冲液稀释至5％(v/v)得到红细胞悬液待用。

可溶性壳聚糖水溶液溶血值测定：用上述Tris缓冲液溶解并稀释合成例2中的PEG化壳聚糖，配制成浓度分别为20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL和50mg/mL的样品溶液。向0.5mL5％(v/v)红细胞悬液中加入等体积样品溶液，等体积Tris缓冲液做阴性对照，等体积0.1％Triton X-100(Tris缓冲液配制)做阳性对照，100rpm摇床中37℃恒温孵育至分层，1000×g离心10分钟，取上清转移至一96孔板中，通过多模式微孔板检测仪测定540nm处各孔的吸光值。不同浓度样品血液相容性通过溶血值进行表征，溶血值计算公式如下：

其中，H样品表示含有血细胞、样品溶液孔中的吸光度；H阴性表示含有血细胞、Tris缓冲液孔中的吸光度；H阳性表示含有血细胞、0.1％Triton X-100孔中的吸光度。结果如图1所示，说明PEG化壳聚糖溶血活性较低，有良好的血液相容性。

实施例2

选取生长状态良好的细胞，移去细胞培养瓶中的培养基，经预热的1×PBS(pH＝7.4)漂洗、消化液消化、完全生长培养基中和消化液后，将细胞吹打均匀后将细胞转移至15mL无菌离心管中，1000rpm离心5min，小心倾倒上清液后，取少量完全生长培养基重新悬浮细胞，取出10μL细胞悬液与等体积0.4％台盼蓝溶液充分混匀后，采用血球计数板对细胞悬液进行活细胞计数。根据细胞数目在96孔板中接种细胞悬液100μL/孔，使每孔内细胞数保持在6000-8000个。随后将接种有细胞的培养板置于37℃、5％CO₂培养条件下过夜培养。在每个孔中添加100μL的不含血清、抗生素的无菌基础培养基溶解或稀释的浓度为0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL、2.00mg/mL、4.00mg/mL、8.00mg/mL的合成例2中PEG化壳聚糖溶液，同时以基础培养基100μL/孔作为对照。可溶性PEG化壳聚糖样品每个浓度设置3组平行。将培养板在培养箱中孵育24h后，移除旧的液体同时补加等量新鲜的完全生长培养基，并向每孔加入10μL的CCK-8溶液，培养箱中培养2-4h后通过多模式微孔板检测仪测定450nm处各孔的吸光值。经不同浓度样品处理的细胞的存活率可通过以下公式进行计算：

其中，A_样品表示含有细胞、CCK-8溶液以及样品孔中的吸光度；A_空白表示含有CCK-8溶液以及样品孔中的吸光度；A_培养基表示含有细胞、CCK-8溶液以及基础培养基孔中的吸光度。利用上述方法测试可溶性壳聚糖对L929及HaCat的细胞毒性，结果如图2所示。图2说明本发明中PEG化壳聚糖在较大的浓度范围内都具有促进细胞生长的作用，细胞相容性和生物安全性优良。

实施例3

在12孔板中接种小鼠单核巨噬细胞Raw264.7细胞悬液1mL/孔，使每孔内细胞数保持在10000-20000个。待细胞贴壁后，将孔中的条件培养基置换为PEG化壳聚糖(合成例2)含量为128μg/mL的条件培养基，并在37℃、5％CO₂培养条件下孵育24小时，以10ng/mL LPS以及2ng/mL IFN-γ作为M1极化的对照组，以2ng/mL IL-4作为M2极化的对照组。用细胞刮刀收集经PEG化壳聚糖或细胞因子刺激的巨噬细胞，PBS清洗一次后用FITC-CD86与APC-CD206对其进行染色，随后以中速通过流式细胞仪收集10000个细胞进行分别进行荧光强度分析，结果如图3所示，表明PEG化壳聚糖刺激的巨噬细胞有少量的M1促炎极化表型，但大部分以M2抗炎极化为主。

实施例4

对小鼠进行称重，使用4％体积分数水合氯醛以0.1mL/10g对小鼠进行麻醉，使用电动剃毛刀对小鼠背部进行剃毛，使用镊子和剪刀在小鼠背部皮肤制造一个直径约为15mm的圆形伤口，避免伤及肌肉组织。对伤口滴加50μL培养12小时的MRSA菌液。放回笼中饲养72小时。对小鼠进行随机分组，每组为3只。观察小鼠伤口并拍照记录。对样品组进行上样，并用无菌纱布覆盖于伤口上，使用PE(透气)型压敏胶带进行固定，放回笼中继续饲养。其中，未处理组伤口不做任何处理，空白对照组喷涂生理盐水，商业样品组覆盖磺胺嘧啶银水胶敷料，PEG化壳聚糖组喷涂医用敷料，医用敷料是将合成例2中PEG化壳聚糖溶于生理盐水溶液得到的，溶度为1mg/mL。于第2、3、5、7、11、14天进行上样并对小鼠伤口进行拍照记录，结果如图4所示。可见，使用了本发明中以PEG化壳聚糖为主要原料的医用敷料后，小鼠伤口恢复的更快。

实施例5

伤后14天，用棉拭子在实施例4中动物创面区域取样，分散到生理盐水中并稀释适当倍数后，在琼脂平皿上涂布，倒置于37℃培养箱中过夜培养待菌落形成，统计各组创面菌落数，如图5所示。可见，使用了本发明中以PEG化壳聚糖为主要原料的医用敷料后，创面菌落数明显减少，与其他各对照组相比有显著性差异。

实施例6

伤后14天处死实施例4中的动物，对创面组织进行取材、固定。随后组织样本取材3mm厚，70％、80％、95％、100％乙醇梯度脱水各30分钟，1L二甲苯处理各20分钟，石蜡浸蜡两缸各12分钟后包埋，切片4μm，烤片。

1.5L二甲苯分三次脱蜡，每次8分钟；1L无水乙醇处理两次，每次500mL，8分钟；90％、80％、60％乙醇各处理8分钟。苏木精染色4分钟，流水清洗；盐酸乙醇分化2-3秒，流水清洗；0.5％氨水处理20秒，流水清洗；光学显微镜观察。0.5％伊红染色1分钟；80％、90％乙醇各分化3-5秒；95％乙醇处理5分钟；1.5L无水乙醇分三次处理，每次5分钟；1L二甲苯处理两次，每次5分钟；中性树脂胶封固，光学显微镜下观察创面肉芽组织、成纤维细胞等结构的生长情况，结果如图6所示，用箭头指出尚未被表皮细胞覆盖的创缘宽度。图6说明与另外三个对照组相比，可溶性壳聚糖处理的伤口表皮覆盖率较高，且新生表皮光滑完整。

实施例7

实施例4中的创面组织切片用PBS洗涤，室温下用山羊血清封闭，随后用兔CD31多克隆抗体孵育3小时后，用PBS洗涤切片，并用相应的荧光二抗对新生血管进行标记，同时用含有DAPI的封片剂封片。通过激光共聚焦显微镜获取图像，其中蓝色荧光为细胞核，红色荧光用来标记新生血管情况，结果如图7所示，箭头所指即为红色荧光标记的新生血管。图7显示，使用了本发明中医用敷料的小鼠创面组织中新生血管数量更多，密度更大。

实施例8

对db/db小鼠进行称重，使用4％体积分数水合氯醛以0.1mL/10g对db/db小鼠进行麻醉，使用电动剃毛刀对db/db小鼠背部进行剃毛，使用镊子和剪刀在db/db小鼠背部皮肤制造一个直径约为20mm的圆形伤口，避免伤及肌肉组织。对伤口滴加80μL培养12小时的MRSA菌液。放回笼中饲养72小时。对db/db小鼠进行随机分组，每组为4只。观察db/db小鼠伤口并拍照记录。对样品组进行上样，并用无菌纱布覆盖于伤口上，使用PE(透气)型压敏胶带进行固定，放回笼中继续饲养。其中，未处理组伤口不做任何处理，空白对照组喷涂生理盐水，商业样品组覆盖磺胺嘧啶银水胶敷料，PEG化壳聚糖组喷涂医用敷料，医用敷料是将合成例2中PEG化壳聚糖溶于生理盐水溶液得到的，溶度为1mg/mL。于第2、7、11、14、21天进行上样并对db/db小鼠伤口进行拍照记录，结果如图8所示。

实施例9

伤后21天处死实施例7中的动物，对创面组织进行取材、固定。随后组织样本取材3mm厚，70％、80％、95％、100％乙醇梯度脱水各30分钟，1L二甲苯处理各20分钟，石蜡浸蜡两缸各12分钟后包埋，切片4μm，烤片。

1.5L二甲苯分三次脱蜡，每次8分钟；1L无水乙醇处理两次，每次500mL，8分钟；90％、80％、60％乙醇各处理8分钟。苏木精染色4分钟，流水清洗；盐酸乙醇分化2-3秒，流水清洗；0.5％氨水处理20秒，流水清洗；光学显微镜观察。0.5％伊红染色1分钟；80％、90％乙醇各分化3-5秒；95％乙醇处理5分钟；1.5L无水乙醇分三次处理，每次5分钟；1L二甲苯处理两次，每次5分钟；中性树脂胶封固，光学显微镜下观察创面肉芽组织、成纤维细胞等结构的生长情况，结果如图9所示，用箭头指出尚未被表皮细胞覆盖的创缘宽度。图9说明在慢性创面愈合过程中，与其他三个对照组相比，可溶性壳聚糖组同样具有较高的表皮覆盖率，且创缘宽度更小，愈合较好。

实施例10

实施例7中的创面组织切片用PBS洗涤，室温下用山羊血清封闭，随后用兔CD31多克隆抗体孵育3小时后，用PBS洗涤切片，并用相应的荧光二抗对新生血管进行标记，同时用含有DAPI的封片剂封片。通过激光共聚焦显微镜获取图像，其中蓝色荧光为细胞核，红色荧光用来标记新生血管情况，结果如图10所示，箭头所指即为红色荧光标记的新生血管。图10可见，使用了本发明中医用敷料的小鼠创面组织中新生血管密度和数量要远高于其他组别的小鼠，这说明本发明中以PEG化壳聚糖为主要原料的医用敷料具有良好的抗菌以及促进伤口愈合效果。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种PEG化壳聚糖在制作促进感染性或慢性创面愈合的医用敷料中的应用，其特征在于，

所述PEG化壳聚糖中壳聚糖主链的分子量为5~20万Da，脱乙酰度不低于90%；

所述PEG化壳聚糖中PEG的分子量为1000~2000 Da，壳聚糖上羟基或/和氨基的PEG化比例为50~75%；

所述PEG的双端基团中，一端用于连接壳聚糖，另一端将在反应后直接暴露，直接暴露的端基为甲氧基、叠氮基或其他惰性官能团。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖上羟基或/和氨基的PEG化得到的。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PEG化壳聚糖是通过壳聚糖上氨基PEG化得到的。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述医用敷料是将PEG化壳聚糖溶于溶剂得到的溶液。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述溶液中PEG化壳聚糖的浓度为0.1~50mg/mL。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述溶液中PEG化壳聚糖的浓度为1~10mg/mL。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述溶剂选自无菌水、生理盐水、缓冲溶液或细胞培养基。

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