CN110358098A - 一种peg桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物及其制备方法，属于生物医药技术领域。本发明的方法通过氨基先修饰一端带叠氮的PEG,甘露糖上修饰炔基后再通过click反应与壳聚糖上的叠氮发生桥联，从而得到PEG桥联甘露糖修饰的壳聚糖衍生物。该反应的全过程在冰水浴中进行，产物通过透析纯化处理，然后再冷冻干燥，既有效避免了因烘烤导致壳聚糖侧链上甘露糖基团的脱落,同时冷冻干燥使样品具有大孔结构，有利于溶解过程中溶剂的快速渗入提高了样品的溶解速度。应用该方法制备的化合物具有良好的生物安全性，具有显著的抑菌作用，并能有效地抑制癌细胞生长，可应用于抗菌领域和肿瘤治疗。

Description

一种PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物及其制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
壳聚糖作为甲壳素的脱乙酰物，是一种天然可再生资源，原料来源异常丰富，地球上的储量仅次于纤维素。壳聚糖是一种聚阳离子碱性多糖，除了具有无毒、无免疫原性、良好的生物可降解性和生物相容性外,它还具有许多高分子材料所不具备的消炎作用以及促进药物对生物膜表面的渗透和吸收的作用，因此壳聚糖被应用于医药、食品、化工及环保等行业。然而由于壳聚糖的化学性质相对稳定，难溶于水，极大地限制了在以上诸多领域的广泛应用。壳聚糖上含有大量活泼羟基和氨基，通过控制与羟基或氨基的反应条件，不仅可以提高壳聚糖的水溶解性，而且可以赋予壳聚糖更多的功能化特性(J.Adv.Drug.Deliv.Rev.2001,50,591.)。例如壳聚糖衍生物用于药物传输载体，可达到缓释和控释药物的目的,提高药物的稳定性，降低药物的不良反应，从而提高药物的生物利用度。
甘露糖既是一种单糖，也是一种六元环碳糖，更是多种多糖的组成结构单元。它在人体内有生理效应如下：1)调节免疫系统；2)巨噬细胞表面有4种接受器可以捕捉抗原，都有甘露糖成分；3)增加伤口愈合；4)抗发炎效果；5)抑制肿瘤生长与转移，增加癌症存活率；6)可以避免某些细菌感染，如泌尿道感染。
英国癌症中心的Kevin Ryan团队研究了不同种类己糖包括甘露糖(Mannose)、半乳糖(Galactose)、果糖(Fructose)、岩藻糖(Fucose)、葡萄糖(Glucose)对不同肿瘤细胞株生长的影响(使用浓度为25nM)，发现甘露糖对肿瘤细胞的靶向抑制效果最明显(Nature,2018,563,719)。另外，对壳聚糖进行甘露糖配体修饰，通过受体介导的主动靶向作用，可有效地提高载DNA疫苗的壳聚糖微粒对抗原提呈细胞的靶向性，促进细胞摄取，提高疫苗的免疫原性(Journal ofNanoscience and Nanotechnology，2006，6，2796-2803)。因此，对壳聚糖进行甘露糖配体修饰，可以使其成为更有效的药物载体。
目前公开报道的有关甘露糖改性壳聚糖的合成方法有两种，第一种是直接用对异硫氰酸苯基甘露吡喃糖苷与壳聚糖进行反应，制得甘露糖改性壳聚糖(KR20070029982(A))，这种方法价格昂贵，实用性较低。第二种甘露糖化壳聚糖的制备方法，是利用甲酰甲基甘露糖苷与壳聚糖进行还原胺化反应制得甘露糖化壳聚糖[Biotechnol.Lett.，2006，8，815-821.]，该这种成路线中臭氧氧化反应条件苛刻，需要使用超低温装置和特定的制备臭氧设备，存在较大安全隐患。
聚乙二醇(PEG)，也称为聚(环氧乙烷)(PEO)，是指环氧乙烷的寡聚物或聚合物，由于其兼有很多优良的性质：水溶性、不挥发性、生理惰性、温和性、润滑性和使皮肤润湿、柔软、有愉快用后感等，被广泛的应用于化妆品行业和制药工业。在PEG的应用中，其端基种类直接决定了可与哪些材料进行化学键连或反应。商业化的PEG端基一般为羟基，通过端基改性可使其转化为其它功能性基团，比如氨基、羧基等，更易于进行化学键连反应，从而在生物医药领域具有更广阔的应用前景[Ji H,et.al.,J.Mater.Chem,2011,21,5484.]。
发明内容
本发明的第一个目的是克服现有技术的不足，提供一种反应条件相对温和、操作可控的具有靶向功效的PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物，其结构式如式1所示；
其中，x为自然数，200≦x≦2000。
本发明的第二个目的在于提供含有所述PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物的组合物。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物是药物组合物，包括式(1)所示的化合物及药学上可接受的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述药物的剂型包括固体粉末、水溶液、醇溶液、乳液、注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩剂、微丸。
本发明的第三个目的是提供所述PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物的制备方法，所述方法利用PEG两端的端基官能团作为过渡桥联，通过click反应将甘露糖修饰到壳聚糖侧链上。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(a)将壳聚糖加入到pH值在4.0-5.0之间的2-(-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，用浓度为0.1-1mol/L的稀盐酸溶液促溶；
(b)将(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺加入到2-(-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，随后加入mPEG-COOH，在冰水浴中活化1-4小时；
(c)将步骤(a)的壳聚糖溶液加入步骤(b)的活化液中继续反应12-48小时，透析处理后冷冻干燥得式(2)所示壳聚糖侧链PEG末端叠氮修饰的化合物；
其中，x为自然数，200≦x≦2000。
(d)将对甲苯磺酸、三氨基苯乙炔和亚硝酸钠按照摩尔比为1:2:1的比例混合，在冰水浴中避光搅拌1-2小时制备重氮盐；
(e)将步骤(d)制备的重氮盐缓慢加入甘露糖的去离子水溶液中，甘露糖与三氨基苯乙炔的摩尔比为(1～2)：1，混合液在冰水浴中避光搅拌30分钟后，过硅胶色谱柱分离纯化，减压蒸馏浓缩再冷冻干燥得式(3)炔基修饰的甘露糖；
(f)将式(2)所得化合物溶于去离子水，配制成质量百分比浓度为0.1-4％的溶液，然后按摩尔比计加入过量5-30倍的式(3)炔基修饰的甘露糖，冰水浴中避光搅拌30分钟，随后，加入乙二胺四乙酸/氢氧化钠溶液(0.5M，pH 8.0，100μL)并搅拌5min终止反应；
(g)将步骤(f)所的反应液过滤，透析纯化，冷冻干燥可得所述PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物。
在本发明的一种实施方式中，步骤(a)中，所述壳聚糖数均分子量在102～107之间，脱乙酰度在50～100％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(b)中，(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1，(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与mPEG-COOH的摩尔比为(1～4)：1，且mPEG-COOH的数均分子量在200-2000之间。
在本发明的一种实施方式中，步骤(c)中，活化的mPEG-COOH与壳聚糖的摩尔比为(1～3)：1。
本发明的第四个目的是提供所述化合物在制备抑制肿瘤的靶向药物中的应用。
本发明还要求保护所述方法在制备含PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物及其上、下游的产品方面的应用。
有益效果：本发明提供了一种具有靶向功能的新的化合物，并建立了该化合物的制备方法。该方法的click反应的全过程在冰水浴中进行，产物通过透析纯化处理，然后再冷冻干燥，既有效避免了因烘烤导致壳聚糖侧链上甘露糖基团的脱落,同时冷冻干燥使样品具有大孔结构，有利于溶解过程中溶剂的快速渗入，提高了样品的溶解速度。该方法制备的PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物，甘露糖的接枝率为50％以上，该衍生物在0.5mg/mL的用量下，可达到对肝癌细胞抑制率50％的效果；在浓度为1mg/mL时对大肠杆菌的抑制率达90％以上。
具体实施方式
实施例1
按如下步骤制备PEG桥联甘露糖修饰的壳聚糖衍生物：
(a)将数均分子量在102～107之间，脱乙酰度在50～100％的壳聚糖加入到pH值在4.0-5.0之间的2-(-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，用浓度为0.1-1mol/L的稀盐酸溶液促溶；
(b)将(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺按1:1的摩尔比加入到2-(-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，随后加入与(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)摩尔比为0.25～1的数均分子量在200-2000之间的mPEG-COOH；
(c)将步骤(a)的壳聚糖溶液按照加入步骤(b)的活化液中继续反应12-48小时，活化的mPEG-COOH与壳聚糖的摩尔比为(1～3)：1；透析处理后，冷冻干燥，得式(2)所示壳聚糖侧链PEG末端叠氮修饰的化合物；
其中，x为自然数，200≦x≦2000。
(d)将对甲苯磺酸、三氨基苯乙炔和亚硝酸钠按照摩尔比为1:2:1的比例混合，在冰水浴中避光搅拌1-2小时制备重氮盐；
(e)将步骤(d)制备的重氮盐缓慢加入甘露糖的去离子水溶液中，甘露糖与三氨基苯乙炔的摩尔比为(1～2)：1，混合液在冰水浴中避光搅拌30分钟后，过硅胶色谱柱分离纯化，减压蒸馏浓缩再冷冻干燥得式(3)炔基修饰的甘露糖；
(f)将式(2)所得化合物溶于去离子水，配制成质量百分比浓度为0.1-4％的溶液，然后按摩尔比计加入过量5-30倍的式(3)炔基修饰的甘露糖，冰水浴中避光搅拌30分钟，随后，加入乙二胺四乙酸/氢氧化钠溶液(0.5M，pH 8.0，100μL)并搅拌5min终止反应；
(g)将步骤(f)所的反应液过滤，透析纯化，冷冻干燥可得所述PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物。
采用核磁共振技术对制备获得的PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物结构进行验证，其1H NMR(400MHz,D2O)图谱结果显示：δ5.46(s,1H),3.98-3.84(m,2H),3.84-3.71(m,3H),3.66(t,J＝9.5Hz,1H)，这一结果充分说明甘露糖通过PEG桥联成功的接枝到了壳聚糖的分子链上。元素分析结果表明甘露糖接枝度约为63.4％。
实施例2
肿瘤细胞的培养和处理方法：将人源肝癌细胞(HepG2)用DMEM高糖型培养基加10％的胎牛血清及0.1％的双抗溶液培养细胞。将装有细胞的10cm盘置于含5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养。采用MTT法评价PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物对肿瘤细胞的抑制活性，结果显示，与对照组相比，培养液中加入浓度为0.5mg/mL的PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物的肝癌细胞存活率约为对照组的50％左右，表现出对肝癌细胞明显的抑制作用。
实施例3
取对数生长期的MHCC97H、SMMC-7721肝癌细胞，传代培养在10％胎牛血清的DMEM培养液，制成1×106/ml的细胞悬液，按100μl/孔转移至96孔板中，培养过夜，按照0.5mg/mL的比例向每孔加入实施例1制备的PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物，以不外源添加物质的DMEM培养基为对照组，将96孔板在培养箱培养(37℃、5％CO2)，分别在作用24、48和72h后每孔加入20μlCCK-8，继续培养4h后在450nm处检测吸光度值。
结果显示，48h和72h下的抑制率PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物分别为38％和66％。
实施例4
将HEK 293和HepG2细胞分别在含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养，2天传代1次，取对数生长期的细胞，以5×103/孔的密度接种于96孔板中培养。细胞贴壁后，将培养基换成100μL含有浓度分别为10μg/mL，20μg/mL，和50μg/mL的PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物的溶液，孵育24h后将溶液吸出，用PBS小心润洗三次，加入100μL 0.5mg/mLMTT溶液，置于培养箱继续孵育4h，吸去MTT溶液，加入DMSO并振荡15min，置于酶标仪上检测。以未加衍生物的空白组作为对照。
结果显示，实施例1制备的PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物对正常人体组织细胞显示出较好的生物相容性，细胞存活率均在90％以上；针对HepG2癌细胞，含有浓度为0.2mg/mLPEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物的细胞存活率为34％；浓度为0.5mg/mL时细胞存活率仅为18％左右。
实施例5
将500μL大肠杆菌细胞(浓度为2×107CFU/mL)与同样体积浓度为50mg/mL的PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物溶液在37℃混合孵化5分钟，接种至到LB培养基(2％,v/v)，每2h检测OD600直到增长结束。随着大肠杆菌细胞的生长，PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物在大肠杆菌生长的初始阶段就表现出明显的抑制作用，培养24h后对大肠杆菌的抑制率仍保持在90％以上。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于，结构式如式1所示；
其中，x为自然数，200≦x≦2000。
2.含有权利要求1所述化合物的组合物。
3.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述化合物的组合物，和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括固体粉末、水溶液、醇溶液、乳液、注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩剂或微丸。
5.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，利用PEG两端的端基官能团作为过渡桥联，通过click反应将甘露糖修饰到壳聚糖侧链上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将壳聚糖加入到pH值在4.0～5.0之间的2-(-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，用浓度为0.1～1mol/L的稀盐酸溶液促溶；
(b)将(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺加入到2-(-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，随后加入mPEG-COOH，在冰水浴中活化1～4小时；
(c)将步骤(a)的壳聚糖溶液加入步骤(b)的活化液中继续反应12～48小时，透析处理后冷冻干燥得式(2)所示壳聚糖侧链PEG末端叠氮修饰的化合物；
其中，x为自然数，200≦x≦2000。
(d)将对甲苯磺酸、三氨基苯乙炔和亚硝酸钠按照摩尔比为1:2:1的比例混合，在冰水浴中避光搅拌1～2小时制备重氮盐；
(e)将步骤(d)制备的重氮盐缓慢加入甘露糖的去离子水溶液中，甘露糖与三氨基苯乙炔的摩尔比为(1～2)：1，混合液在冰水浴中避光搅拌20-30分钟后，过硅胶色谱柱分离纯化，减压蒸馏浓缩再冷冻干燥得式(3)所示的炔基修饰的甘露糖；
(f)将式(2)所示的化合物溶于去离子水，配制成质量百分比浓度为0.1～4％的溶液，然后按摩尔比计加入过量5-30倍的式(3)炔基修饰的甘露糖，冰水浴中避光搅拌30分钟，随后，加入乙二胺四乙酸/氢氧化钠溶液(0.5M，pH8.0，100μL)并搅拌5min终止反应；
(g)将步骤(f)所得的反应液过滤，透析纯化，冷冻干燥可得所述PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述壳聚糖数均分子量在102～107之间，脱乙酰度在50～100％。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1，(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与mPEG-COOH的摩尔比为(1～4)：1，且mPEG-COOH的数均分子量在200～2000之间；步骤(c)中，活化的mPEG-COOH与壳聚糖的摩尔比为(1～3)：1。
9.权利要求1所述的化合物在制备抑制肿瘤的靶向药物中的应用。
10.权利要求5～8任一所述方法在制备含PEG桥联甘露糖修饰壳聚糖衍生物及其上、下游产品方面的应用。
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