KR101796914B1

KR101796914B1 - 콜라겐 및 디알데히드전분을 포함하는 필러용 고분자 복합체

Info

Publication number: KR101796914B1
Application number: KR1020170095245A
Authority: KR
Inventors: 이광일; 이정수; 최재원; 장주웅; 심영복
Original assignee: 주식회사 셀루메드; 이광일; 심영복; 장주웅
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2017-07-27
Publication date: 2017-11-13

Abstract

본 발명은, 콜라겐(COL: collagen), 디알데히드 전분(DAS: dialdehyde starch) 및 헤파린을 포함하는 생체적합성 고분자 복합체를 포함하는 필러용 조성물, 이의 제조 방법과 관련된다.

Description

콜라겐 및 디알데히드전분을 포함하는 필러용 고분자 복합체{POLYMER COMPOSITE FOR FILLER COMPRISING COLLAGEN AND DIALDEHYDE STARCH}

본 발명은, 디알데히드 전분(DAS: dialdehyde starch), 콜라겐(COL: collagen) 및 헤파린(heparin)을 포함하는 생체적합성 필러용 고분자 복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 필러와 관련된다.

미용 및 성형 (재건 등)을 목적으로 판매되고 있는 의료기기 중 필러(filler)는 주름 및 함몰부위 피부조직에 주입하는 방식으로 사용된다. 대부분의 필러들은 피부조직에 주입되어 그 물질 자체의 부피를 통해 피부 조직의 부피를 증대시키는 방식으로 피부 주름 또는 함몰부위를 개선한다. 현재 가장 많이 사용되는 필러로는 히알루론산과 콜라겐 등의 겔 형태의 무형 물질이 있으나, 시간의 경과에 따라 빠르게 분해되어 피부 조직 내로 흡수되므로 그 효과가 장기간 유지되지 않아 주름살 개선 효과를 보기 위해서는 반복적인 주입이 필요하다는 단점이 존재한다. 따라서, 분해 거동 기간이 길어 주름살 개선 효과를 장기간 볼 수 있고, 효과가 보다 개선된 필러의 필요성이 존재한다.

필러의 재료로서 사용될 수 있는 일 재료인, 콜라겐은 피부, 건, 연골, 뼈 및 인대를 포함하여 포유류의 결합조직의 세포외 매질(extracellular matrix)의 주된 성분이다. 이의 가수분해물(겔라틴) 및 다른 바이오 폴리머들과 비교하여 콜라겐은 더 나은 생분해성, 생체적합성, 약한 항원성, 및 독특한 피브릴-형성 특성을 나타낸다 (Liu Y et al., J Biomed Mater Res Part A 2011:99A:485-492.).

반면, 일반적으로, 물리적으로 형성된 콜라겐 겔은 저조한 물성을 나타내고, 따라서, 이들은 종종 UV 선 조사, 다가 금속 이온, 포름알데히드, 또는 글루타르알데히드 등에 의해 가교된다. 이들 중, UV 처리의 경우, 무독성이지만, 이는 콜라겐 전체 대신 이의 표면만을 변형시키는 문제점이 있다. 글루타르알데히드 또는 포름알데히드와 같은 화학적 가교의 경우, 콜라겐의 삼중나선 구조 또는 이의 생물학적 특성을 변화시키지는 않지만, 이에 의해 가교된 콜라겐은 종종 세포 성장을 억제하고, 염증성 반응 또는 석회화를 유발하는데, 이는 가수분해된 저-분자량의 알데히드에 기인된다(Changdao Mu et al., Macromol. Mater. Eng. 2010, 295, 100-107).

따라서, 콜라겐의 생분해성, 생체적합성, 피브릴-형성 특성 등의 특성을 유지 또는 개선함과 동시에, 지속성을 향상시킬 수 있는 필러용 재료의 개발에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 제조가 용이하면서도, 물리적 특성이 개선되고 분해 거동이 길며, 안정적인 성장 인자의 도입이 가능하여 개선된 효과를 가지는 필러용 고분자 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 해결하고자 하는 과제는 상기 고분자 복합체를 포함하는 필러를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 콜라겐(COL: collagen), 디알데히드 전분(dialdehyde starch), 및 헤파린(heparin)을 포함하는 생체적합성 필러용 고분자 복합체로, 상기 콜라겐이 디알데히드 전분(DAS:dialdehyde starch)에 의해 이민(imine)결합으로 가교되고, 상기 헤파린은 콜라겐과 아마이드(amide) 결합에 의해 상호 연결되는 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 필러용 고분자 복합체는 성장인자(growth factor)를 추가로 포함하고, 상기 성장 인자는 상기 고분자 복합체 내 헤파린에 의해 상기 고분자 복합체와 컨쥬게이트(conjugate)를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자(FGF, fibroblast growth factor), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF, platelet derived growth factor), 변환성장인자-베타1 또는 베타3 (TGF-beta 1 or beta 3, transforming growth factor), 상피세포성장인자 (EGF, Epidermal growth factor)로 구성된 군에서 선택되고, 더욱 바람직하게는, 상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자 7 (FGF-7) 또는 혈소판 유래 성장인자 (PDGF)일 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 고분자 복합체는 콜라겐을 20 내지 100mg/ml, 바람직하게는 20 내지 70mg/ml, 더욱 바람직하게는 25 내지 60mg/ml, 더욱 바람직하게는 30 내지 58mg/ml 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 고분자 복합체는 디알데히드 전분을 3 내지 40 mg/ml, 바람직하게는 4 내지 30mg/ml, 더욱 바람직하게는 5 내지 20mg/ml 범위를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 고분자 복합체는 상온에서 액체 형태, 특히 졸 형태로 존재하고, 37℃의 온도에서 겔 형태로 변화될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 고분자 복합체가 주변 성장인자 및 세포외 기질의 축적과 저장을 유도하고 및/또는 피부 세포의 이동 및 증식을 촉진한다.

또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 필러용 고분자 복합체의 제조방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(a) 디알데히드전분 용액을 콜라겐 용액과 혼합하여 혼합물을 획득하는 단계; 및

(b) 상기 획득된 혼합물에 헤파린 염을 첨가하는 단계.

바람직한 일 구현예에서, 상기 단계 (a)의 디알데히드전분 용액의 농도는, 5 내지 20%(wt/v), 바람직하게는 6 내지 15%(wt/v), 더욱 바람직하게는 8 내지 12%(wt/v) 범위, 가장 바람직하게는 10%(wt/v)일 수 있고, 상기 단계(a)의 콜라겐 용액의 농도는 3 내지 20%(wt/v), 바람직하게는 4 내지 10%(wt/v), 더욱 바람직하게는 5 내지 8%(wt/v)일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 콜라겐 용액과 디알데히드 전분 용액이 20:1 내지 1:1, 바람직하게는 10:1 내지 4:1, 더욱 바람직하게는 9:1 내지 4:1의 범위의 용량비율(COL(v):DAS(v))로 혼합될 수 있다.

바람직하게는, 상기 단계 (a)의 혼합은 상온에서 및/또는 30분 미만의 온도에서 수행된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 필러용 고분자 복합체를 포함하는 필러를 제공한다. 상기 필러는 비경구 경로로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 필러 내 고분자 복합체는 액체 형태, 특히 졸(sol)로 주사기 내 충진되고 투여 된후 체온, 바람직하게는 37℃의 온도에서 겔화된다.

본 발명에 따른 디알데히드전분-콜라겐-헤파린을 포함하는 생체적합성 고분자 복합체는, 물성이 우수하고, 분해 거동시간이 길어, 필러의 주름 개선 효과를 장시간 유지시킬 수 있어, 필러로 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 보다 적은 횟수로 필러를 시술하여도 그 효과가 유지될 수 있어서 피부 자극 역시 줄어든다는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 디알데히드전분-콜라겐-헤파린 고분자 복합체는 체내 또는 체외에서 성장인자의 안정적인 도입을 가능하도록 하여, 성장인자의 보충에 의한 세포의 신속한 생성, 노화된 세포의 각질화에 의한 탈락을 유도하며, 이에 의한 변질된 콜라겐 섬유와 탄성 섬유의 축적 및 피부 세포의 재생을 촉진하여 피부 탄력을 강화하고 주름 개선 효과에 대한 시너지 효과를 나타낼 수 있어 필러로서 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 필러용 고분자 복합체는 짧은 시간 내에 제조할 수 있고, 상온에서도 제조할 수 있어 비용-효율적인 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 콜라겐과 디알데히드전분의 반응에 대한 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 콜라겐-디알데히드 전분 및 헤파린의 결합을 보여주는 개략도이다.
도 3은 본 발명에 따른 고분자 복합체의 졸에서 겔 형태로 변화된 외관 모습을 나타낸 도면이다. 액상 형태 주입으로 고형의 형태인 필러로서의 기능 구현이 가능함을 보여준다.
도 4는 본 발명에 따른 고분자 복합체의 세포독성실험결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 고분자 복합체의 분해 거동 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 고분자 복합체와 TGF, PDGF와 유사한 분자량을 가진 10kD(붉은색 형광), 40kD(녹색형광)의 덱스트란을 혼합한 후 고형화된 지지체 각각에 대하여 덱스트란의 존재 및 분포를 확인할 수 있는 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 성장인자와 컨쥬게이트된 고분자 복합체의 세포 이동 및 증식 효능을 확인할 수 있는 도면이다.

이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 발명의 설명 및 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시 예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본 발명은 콜라겐(COL: collagen), 디알데히드 전분(dialdehyde starch), 및 헤파린(heparin)을 포함하는 생체적합성 필러용 고분자 복합체를 제공한다.

본 발명에 따른 콜라겐은 진피, 인대, 힘줄, 뼈, 연골 등을 구성하는 단백질의 하나로, 다세포 동물의 세포외 기질의 주성분으로 콜라겐 단백질은 28종류 이상 있는 것으로 보고되고 있다. 이 중 대표적으로 진피, 인대, 힘줄, 뼈 등에서는 I형 콜라겐이, 관절 연골에서는 II형 콜라겐이 주성분으로 구성되어 있으며, 아텔로콜라겐의 분자량은 200 내지 300kda이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 콜라겐은 I형 콜라겐이다. 바람직한 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 콜라겐은 고분자 복합체 내에 20 내지 100mg/ml, 바람직하게는 20 내지 70mg/ml, 더욱 바람직하게는 25 내지 60mg/ml, 가장 바람직하게는 30 내지 58mg/ml의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 디알데히드 전분은 밀 또는 옥수수 전분에서 화학적 변형에 의해 유도되는 다당류로서 전분의 요오드 산화반응에 의해 제조될 수 있다. 일 구현예에서, 천연전분은 냉수에 녹지 않고 노화되면 이수현상이 일어나는 등의 성질상의 한계가 있기 때문에, 전분의 고분자 물성을 이용하여 보다 유용하게 이용하기 위하여 새로운 기능을 부여하고, 이용성을 증대시킬 목적으로 특별하게 물리, 화학적 처리로 변환시킨 전분이 바람직하다. 이와 같이 전분에 각종 가공처리를 하여 본래의 구조나 물성의 일부를 변화, 개선한 변성전분의 종류에는 아세틸아디핀산이전분(Acetylated Distarch Adipate), 아세틸인산이전분(Acetylated Distarch Phosphate), 옥테닐호박산나트륨전분(Starch Sodium Octenyl Succinate), 인산이전분(Distarch Phosphate), 인산일전분(Monostarch Phosphate), 인산화인산이전분(Phosphated Distarch Phosphate), 초산전분(Starch Acetate), 히드록시프로필인산이전분(Hydroxypropyl Distarch Phosphate)등의 산분해전분, 산처리전분, ester전분, ether 전분, 가용성 전분, dextrin, 가교전분이 포함된다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 디알데히드 전분의 분자량은 30 내지 800 kda으로 분포된다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 디알데히드 전분은 고분자 복합체 내에 3 내지 40mg/ml, 바람직하게는 4 내지 30mg/ml, 더욱 바람직하게는 5 내지 20mg/ml 범위의 함량으로 포함될 수 있다 .

본 발명에 따른 상기 고분자 복합체 내 콜라겐은 디알데히드전분에 의해 가교되어, 이민결합(imine)을 형성한다 (Schiff's base reaction). 상기 반응의 개략도가 도 1에 개시된다. 이와 같은 콜라겐에 대한 디알데히드 전분의 첨가는 콜라겐의 라이신(lysine) 또는 히드록시라이신(hydroxylysine)의 측쇄의 -아미노 그룹과 디알데히드 전분의 알데히드 그룹 간에 Schiff's base 형성으로 C=N 그룹으로 변환되어 가교 결합을 형성한다.

상기 반응에 의해, 본 발명에 따른 콜라겐은 디알데히드 전분과 이민(imine) 결합에 의해 상호 가교된다. 상기 가교는, 본 발명의 고분자 복합체에, 우수한 기계적 강도 및 물성을 부여하고, 늦은 분해 거동을 나타내는 데 기여한다.

또한, 본 발명에 따른 고분자 복합체는 헤파린을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 헤파린은 천연 폴라사카라이드로서, 하기 식의 구조를 가진다:

[식 I]

본 발명에 따른 상기 헤파린은 본 발명에 따른 고분자 복합체에 첨가되어 콜라겐과 아마이드 결합(amide bond)에 의해 상호 연결되어 COL-DAS-HEP 복합체를 형성한다. 이에 대한 개략도를 도 2에 개시한다. 일 구현예에서, 상기 첨가되는 헤파린은 헤파린 나트륨일 수 있으며, 바람직하게는 17,000 내지 19,000 Da의 분자량을 가질 수 있다.

일 구현예에서, 상기 헤파린은 고분자 복합체 내에 0.5 내지 5mg/mL, 바람직하게는 0.5 내지 2mg/ml, 더욱 바람직하게는, 0.8 내지 1.5 mg/ml, 가장 바람직하게는 1mg/mL의 함량으로 포함된다.

상기 형성된 고분자 복합체 내 헤파린은, 복합체 내에 성장 인자의 안정적인 도입을 유도하는데 기여할 수 있다. 일 구현예에서 본 발명에 따른 고분자 복합체가 필러로서 피부에 주입되는 경우, 성장 인자의 축적 및 저장이 가능하도록 한다. 이에 의해, 피부 세포, 특히 진피 세포의 활성 (이동, 증식)을 촉진시킬 수 있다. 또한, 세포외 기질 단백질의 생성을 유도함으로서, 조직 재생을 유도할 수 있고, 이의 작용에 의하여 생성된 콜라겐, 엘라스틴 등 등의 다양한 세포외기질 단백질이 다시 축적 및 저장 될 수 있는 저장소의 역할을 수행할 수 있도록 한다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 고분자 복합체는 성장인자(growth factor)를 추가로 포함한다. 상기 성장 인자는 헤파린에 의해 콜라겐-디알데히드전분-헤파린 복합체와 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 상기 형성된 컨쥬게이트가 필러로서 피부에 투입되는 경우, 서방형으로 방출되게 되어 피부 세포, 특히 진피 세포의 활성 (이동, 증식)을 유발하고, 세포외 기질 단백질의 생성 및 축적을 유도함으로서, 조직 재생을 유도할 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor), 혈소판 유래 성장인자 (platelet derived growth factor), 변환성장인자-베타1 또는 베타3 (TGF-beta 1 or beta 3, transforming growth factor), 상피세포성장인자 (EGF, Epidermal growth factor)에서 선택될 수 있다.

특히 바람직한 일 구현예로서, 상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자 7 (FGF-7) 또는 혈소판 유래 성장인자 (PDGF)일 수 있고, 특히, FGF-7 (섬유아세포 성장인자-7)가 포함되는 경우 주름개선효과가 있어 FGF-7의 보충에 의해 새로운 진피, 표피세포가 신속히 생성되고 노화된 세포는 각질화되어 탈락하고, 세포의 총량이 크게 늘어나 이미 변질된 콜라겐 섬유와 탄성 섬유가 재생되고, 피부탄력이 강화되면서 주름이 옅어지거나 사라지게 되는 시너지 효과가 발생할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 성장인자, 특히 FGF-7 혹은 PDGF는, DAS-COL-HEP 고분자 복합체에 100 내지 400ng/ml, 바람직하게는 150 내지 300ng/ml, 더욱 바람직하게는 150 내지 250ng/ml의 범위의 함량으로, 특히, 200ng/ml로 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 고분자 복합체는 체온, 특히 37℃의 온도에서, 액체 형태, 특히 졸 형태에서 겔 형태로 변화될 수 있다.

본 발명은 또한 하기를 포함하는 생체적합성 필러용 고분자 복합체의 제조방법을 제공한다:

(b) 상기 획득된 혼합물에 헤파린 염을 첨가하는 단계

특히, 본 발명에 따른 상기 방법은 상기 단계 (a)가 상온, 바람직하게는 4 내지 30℃에서 수행될 수 있어, 제조가 용이하고 저렴한 비용으로 제조될 수 있다는 장점이 있다. 또한, 상기 혼합은 30분 미만의 시간 동안 수행될 수 있어, 종래 공지된 방법과 비교하여, 신속하고 저렴한 비용으로 제조될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 단계(a)의 디알데히드 전분 용액의 농도는 5 내지 20%(wt/v), 바람직하게는 6 내지 15%(wt/v), 더욱 바람직하게는 8 내지 12%(wt/v), 특히 바람직하게는 약 10%(wt/v)일 수 있다. 또 다른 일 구현예에서, 상기 단계 (b)의 콜라겐 용액의 농도는 3 내지 20%(wt/v), 바람직하게는 4 내지 10%(wt/v), 더욱 바람직하게는 5 내지 8%(wt/v)일 수 있다. 상기 디알데히드 전분 용액 및 콜라겐 용액은 바람직하게는 20:1 내지 1:1, 더욱 바람직하게는 10:1 내지 4:1, 특히 바람직하게는 9:1 내지 4:1의 범위의 혼합 비율(COL(v):DAS(v))로 혼합될 수 있다. 상기와 같은 농도 및/또는 혼합 비율로 혼합되어 생성된 고분자 복합체는 겔화가 용이하여 필러로 투여 시 겔화가 용이하고, 느린 분해 거동 특성을 가진다.

또한, 본 발명에 따른 상기 방법은 성장인자를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 성장인자는 앞서 정의된 바와 같다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 필러용 고분자 복합체를 포함하는 필러를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 필러는 히알루론산, 알긴산, 젤라틴, 피브린, 아가로스, 플루란 등을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 필러는 비경구 투여 경로, 특히 피하 또는 근육으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 필러 내 고분자 복합체는, 바람직하게는 상온에서, 액체 형태, 특히 졸(sol)형태로 주사기 내 충진되고 투여 후 또는 체온과 유사한 온도, 특히 37℃의 온도에서 겔화된다. 따라서, 투여가 용이하고, 겔화된 고분자 복합체는 피부 내 구조적 지지 기능을 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 디알데히드 전분-콜라겐-헤파린을 포함하는 생체적합성 고분자 복합체가 필러로 투여되는 경우, 이의 우수한 물성 및 장시간의 분해 거동에 의해 피부의 구조적 형태를 장시간 유지시켜 주는 1차 기능과 함께, 주변 세포를 주화성으로 인해 이동을 유도함으로서 2차적으로 주변 조직과 유사한 조직을 재생시킬 수 있는 2차적 기능을 가질 수 있다.

실시예

재료(materials)

본 발명에 따른 실시예에서는 특별한 언급이 없는 한 하기의 재료가 사용되었다:

- 디알데히드 전분 (C9H16O4, MW: 188.223g/mol), MONOMER-POLYMER/Dialdehyde Starch

- 제I 형 콜라겐 분말, DSM/ Collagen powder

- 1mM 아세트산, Sigma-Aldrich/Acetic acid

- 헤파린 나트륨 염 (porcine intestinal mucosa 기원, CAS# 9041-08-1) Sigma-Aldrich/Heparin sodium porcine mucosa

- 10 x DPBS (10x Dulbecco's Phosphate-Buffered Salines , ThermoFisher SCIENTIFIC/DPBS (10X), no calcium, no magnesium)

- 페놀 레드 용액 (0.5%, 액상) Sigma-Aldrich/Phenol red solution

- NaHCO₃ Sigma-Aldrich/Sodium hydrogencarbonate

- HEPES sodium salt (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid sodium salt, Sigma-Aldrich/HEPES sodium salt)

- 0.75N NaOH Sigma-Aldrich/sodium phosphate

본 공정 전 사전 공정

- 재구성 용액: 2.2% NaHCO3 660mg 및 200mM HEPES 1.59mg를 0.75N NaOH에 용해시켜 30ml의 재구성용액을 수득하였다.

- 페놀 레드가 포함된 10xDPBS: 0.5% 페놀 레드를 10배 농축된 인산완충생리식염수 (PBS)에 첨가하였다.

실시예 1. DAS- COL 의 제조

5% (wt/v) 콜라겐 수용액의 제조

1mM 아세트산 10 mL을 비이커에 넣고 콜라겐 분말 500 mg을 첨가하여, 상온에서 700 rpm으로 5분간 교반하여 5%(wt/v) 콜라겐 수용액 10mL를 제조하였다.

10% (wt/v) DAS 용액 제조

10ml의 10x DPBS(Dubelcco’s phosphate buffered saline: 10배 농축 듀벨코스 인산완충액)에 DAS 분말 1000mg을 혼합하여, 90℃에서 700 rpm으로 30분간 교반하여 10%(wt/v) DAS 수용액 10mL를 제조하였다.

DAS 용액과 콜라겐 수용액의 혼합 수용액 제조

상기에서 제조된 5% 콜라겐 수용액 9ml과 제조된 10% DAS 용액 1ml를 혼합(COL:DAS=9:1 (v:v))하여 700 rpm으로 상온에서 5분간 교반하여 10 mL의 DAS-콜라겐 혼합수용액을 제조하였다.

DAS-콜라겐 수용액의 중화

방법1:

DAS-콜라겐 수용액을 중화하기 위하여 DAS-콜라겐 수용액 8,000 ul, 10x DPBS 1000ul, 중화용액(재구성용액) 1000 ul씩 8:1:1(v:v:v) 비율로 혼합 하여 10 ml의 DAS-COL 콜라겐 졸(sol)을 제조하였다. 중화된 졸은 주사기에 충진하였다.

방법2:

DAS-콜라겐 수용액 8,000 ul을 주사기 A에 옮긴다.

10x DPBS 1000ul, 와 중화용액(재구성용액) 1000 ul씩 1:1(v:v:v) 비율로 혼합 하여 주사기 B에 옮긴다. 주사기 A와 주시기 B를 커넥터를 연결하여 빠르게 혼합하여 주사기 A로 혼합액을 모두 이동시켰다.

실시예 2. DAS- COL -HEP의 제조

5% (wt/v) 콜라겐 수용액의 제조

10% (wt/v) DAS 용액 제조

DAS 용액과 콜라겐 수용액의 혼합 수용액 제조

제조된 5% 콜라겐 수용액 9ml과 제조된 10% (wt/v) DAS 용액 1ml씩 9:1 (v:v)의 비율로 혼합하여 700 rpm으로 5분간 교반하여 10 mL의 DAS-콜라겐 혼합수용액을 제조하였다.

헤파린 나트륨 염의 도입

DAS-콜라겐 혼합 수용액 10ml에 헤파린 나트륨 염 분말 10mg을 혼합하여 헤파린(1mg/ml)이 혼합된 DAS-COL 혼합 수용액을 제조하였다.

DAS-콜라겐 수용액의 중화 및 충진

1mg/ml의 헤파린 나트륨 염이 혼합된 DAS-콜라겐 수용액을 중화하기 위하여 헤파린 나트륨 염이 혼합된 DAS-콜라겐 수용액 8,000 ul, 10x DPBS 100ul, 중화용액(재구성용액) 100 ul씩 8:1:1(v:v:v) 비율로 혼합하여 HEP-DAS-COL 10 ml(sol) 을 제조하였다. 중화된 졸은 주사기에 충진되었다.

실시예 3. DAS- COL -HEP -성장인자 컨쥬게이트의 제조

5% (wt/v) 콜라겐 수용액의 제조

10% (wt/v) DAS 용액 제조 (예시: 10ml의 제조)

DAS 용액과 콜라겐 수용액의 혼합 수용액 제조

제조된 5% 콜라겐 수용액 9ml과 제조된 10% (wt/v) DAS 용액 1ml 씩 9:1 (v:v)의 비율로 혼합하여 700 rpm으로 5분간 교반하여 10 mL의 DAS-콜라겐 혼합수용액을 제조하였다.

헤파린 나트륨 염의 도입

DAS-콜라겐 혼합 수용액 10ml에 헤파린 나트륨 염 분말 10mg을 혼합하여 헤파린(1mg/ml)이 도입된 DAS-COL 혼합액을 제조하였다.

성장인자와의 컨쥬게이트 형성 및 중화

상기 제조된 DAS-COL-HEP 수용액에 혈소판 유래 성장인자 (platelet derived growth factor)를 50ng/ml에서 200ng/ml의 농도로 상온에서 혼합하였고, 상기 실시예 1에서 기재된 방법과 동일한 방법으로 중화하였고, 이를 주사기에 충진하였다.

실시예 4. DAS- COL , DAS- COL - HEP 의 물리적 특성의 확인

본 발명에 따른 DAS-COL-HEP의 물리적 특성을 확인하기 위하여, 본 발명에 따른 실시예 1 내지 3의 고분자 복합체를 37℃에서 겔화시킨 후, 형성된 혼합겔의 점도를 하기와 같이 회전점도 분석법으로 측정하였다:

특정 점도를 지니는 표준 물질(BROOKFIELD, USA)을 사용하여, 회전 속도의 조건을 조건을 달리하여 torque % 최소 10 이상이 되는 상태하에서 점도계 (BROOKFIELD, USA)를 검교정 하고, 영점 조정이 완료된 스핀들의 샘플 컵에 샘플을 첨가후 온도가 25℃가 되도록 유지시켰다. 점도를 측정 후 결과값을 저장, 비교 분석하였다.

상기 방법에 의한 점도의 측정 결과 본 발명에 따른 혼합겔이 우수한 물리적 특성, 특히 점도특성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 5. 세포독성 실험

본 발명에 따른 고분자 복합체의 세포 독성 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1mM 아세트산 4.5 mL을 비이커에 넣고 콜라겐 분말 250 mg을 첨가하여, 상온에서 700 rpm으로 5분간 교반하여 5%(W/V) 콜라겐 수용액 5ml를 제조하였다. 10% DAS 용액 500 uL을 콜라겐 용액 4.5 mL과 1:9의 용량비율로 혼합하여 700 rpm으로 5분간 교반하여 5 mL의 DAS-COL 고분자 복합체를 제조하였다. 이 때 골수유래줄기세포를 1x10⁶ cell/ml로 혼합하여 세포배양을 수행하였다. 이때 고분자 복합체와 배지의 혼합비율 (v/v)이 0%, 10%, 25%, 50%, 75%로 각각 달리하여 5% CO2 배양기에서 3일간 배양하였다. 그 후 2mM ethium homodimer 용액 20 ㎕를 멸균된 PBS 10 ㎖에 녹여 흔들어 용액 1을 만들고, 4mM의 calcein AM용액 5 ㎕를 용액 1에 넣고 vortexing 후 용액 2를 만들었다. 세포 담지겔이 들어있는 48 well culture plate dish의 배지를 제거하고 PBS 500 ㎕를 넣어 수세한 후 용액 2를 넣고 40분간 상온 암실에서 방치하였다. 그 후 세포독성을 확인하기 위하여 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.

상기 실험 결과를 도 4에 기술하였다. 도 4에 따르면, Live/dead 형광염색을 통해 살아있는 세포(녹색)만 보이며, 죽은 세포(빨간색)가 없는 것으로 보아, DAS-COL 복합체가 세포에 대한 독성이 없음을 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 DAS-COL-HEP 고분자 복합체도 동일한 결과가 획득되었다. (데이터 미제시)

실시예 6. 분해 거동 실험

1mM 아세트산 4.5 mL을 비이커에 넣고 콜라겐 분말 300 mg 또는 400mg을 첨가하여, 상온에서 700 rpm으로 5분간 교반하여 6% 또는 8%(W/V) 콜라겐 수용액 5ml를 제조하였다. 10(wt/v)% DAS 용액 500 uL을 콜라겐 용액 4.5 mL과 1:9의 용량 (v/v)비율로 혼합하여 700 rpm으로 5분간 교반하여 5 mL의 DAS-COL 고분자 복합체(sol)을 제조하였다. 그 후 37℃ 조건에서 48 well culture plate dish에서 고형화(gel) 시킨 후 28일간 배지를 넣고 분해 거동을 육안 확인하였다.

상기 실험 결과를 도 5에 기술하였다. 도 5에 따르면, 각각 다른 농도 (6, 8 (w/v %)의 콜라겐 수용액과 10 wt/v%의 농도를 가진 DAS수용액과 혼합하여 37℃ 조건에서 배지에 넣고 28일까지 분해 거동을 확인한 결과 분해가 되지 않고 그 형태가 유지되는 것을 확인할 수 있다. 반면, 일반적인 콜라겐 겔은 배지에 넣으면 24시간도 되지 않아 분해가 되었다(데이터 미제시).

실시예 7. DAS- COL -HEP 성장인자 도입 가능성 확인

DAS-COL-HEP 고분자 복합체의 피부 세포에 주입 시의 효과를 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

본 발명의 실시예 3에서 제조된 DAS-COL-heparin에 TGF, PDGF와 유사한 분자량을 가진 10kD(붉은색 형광), 40kD(녹색형광)의 Dextran을 혼합한 후 겔화시킨 후 고형화된 지지체 각각에 대하여 덱스트란의 존재 및 분포를 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 따르면, DAS-COL-HEP 지지체에 TGF, PDGF와 유사한 분자량을 가진 10kD(붉은색 형광), 40kD(녹색형광)의 Dextran이 존재 및 분포됨을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과는, 본 발명에 따른 DAS-COL-HEP 고분자 복합체가 피부에 주입되는 경우, 상기 dextran과 유사한 분자량을 가지는 TGF, PDGF와 같은 성장인자가 이들 복합체에 의해 형성된 지지체 내에 결합되어, 이들이 포집 및 저장될 수 있음을 예측할 수 있다. 또한, 덱스트란은 체내 다당류의 세포외 기질 성분과 유사한 형태를 가지고 있어 이들을 대표하는 물질이라는 점에 비추어 볼 때, 본 발명에 따른 고분자 복합체에 의해 형성된 지지체 내에 체내에 유사 다당류를 포함한 세포외 기질이 결합될 수 있음도 예측할 수 있다.

실시예 8. DAS- COL -HEP 겔의 세포 이동, 증식 효능의 확인

성장 인자와 컨쥬게이트 된 DAS-COL-HEP 겔의 세포 이동, 증식 촉진 효능을 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

세포배양접시에 세포(human meniscus avascular cell)를 증식시킨 후 30mm 간격을 스크래치 내어 세포를 제거한 후 성장인자가 도입되지 않은 군, 성장인자(혈장유래 성장인자:PDGF)가 50ng/ml로 도입된 헤파린-콜라겐-DAS 졸, 성장인자(혈장유래 성장인자:PDGF)가 200ng/ml로 도입된 헤파린-콜라겐-DAS 졸을 주사하여 37 도씨에서 겔화 시킨 후 겔화된 각 군으로 얼마나 빨리 세포가 이동, 증식되는지를 3일 후 관찰하여 확인하였다.

그 결과를 도 7에 기재하였다. 도 7에 따르면, 성장인자가 200ng/ml로 도입된 군에서 세포가 이동, 증식되어 스크래치가 있던 부분으로 다시 세포가 이동되어 들어오는 것을 확인할 수 있다. 이는 성장인자가 도입된 DAS-COL-HEP 겔을 포함하는 필러가 주름 개선효과를 줄 수 있는 진피 및 표피세포가 신속히 생성될 수 있음을 간접적으로 확인한 결과로서 일반 필러의 조직수복 단독 기능보다도 더 향상된 재생 기능을 있음을 시사한다.

이러한 결과를 토대로 본 발명에 따른 필러용 복합 고분자 복합체가 구조적 형태를 유지해주는 1차 기능(도 3)과 함께 주변 세포를 주화성으로 이동 유도하여 2차적으로 주변 조직과 유사한 조직재생, 형성을 촉진하는 역할(도 7)을 수행하는 할 수 있음을 확인할 수 있다.

Claims

콜라겐(COL: collagen), 디알데히드 전분(dialdehyde starch), 및 헤파린(heparin)을 포함하는 생체적합성 필러용 고분자 복합체로, 상기 콜라겐이 디알데히드 전분(DAS:dialdehyde starch)에 의해 이민(imine)결합으로 가교되고, 상기 헤파린은 콜라겐과 아마이드(amide) 결합에 의해 상호 연결되는 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체.
제1항에 있어서,
상기 필러용 고분자 복합체가 성장인자(growth factor)를 추가로 포함하고, 상기 성장 인자는 상기 고분자 복합체 내 헤파린에 의해 상기 고분자 복합체와 컨쥬게이트(conjugate)를 형성하는 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체.
제2항에 있어서
상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자(FGF, fibroblast growth factor), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF, platelet derived growth factor), 변환성장인자-베타1 또는 베타3 (TGF-beta 1 or beta 3, transforming growth factor), 상피세포성장인자 (EGF, Epidermal growth factor)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체.
제2항에 있어서,
상기 성장인자는 섬유아세포 성장인자 7 (FGF-7) 또는 혈소판 유래 성장인자 (PDGF)인 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 고분자 복합체가 콜라겐을 20 내지 100mg/ml 포함하는 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 고분자 복합체가 디알데히드전분을 3 내지 40 mg/ml 포함하는 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 고분자 복합체는 37℃의 온도에서 액체 형태에서 겔 형태로 변화되는 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 고분자 복합체가 주변 성장인자 및 세포외기질의 축적과 저장을 유도하는 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 고분자 복합체가 피부세포의 이동 및 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 필러용 고분자 복합체.
하기를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 필러용 고분자 복합체의 제조방법:
(a) 디알데히드전분 용액을 콜라겐 용액과 혼합하여 혼합물을 획득하는 단계; 및
(b) 상기 획득된 혼합물에 헤파린 염을 첨가하는 단계.
제10항에 있어서,
상기 단계 (a)의 디알데히드전분 용액으로 5 내지 20%(wt/v) 농도를 가지는 디알데히드전분 용액이 사용되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 단계(a)의 콜라겐 용액으로 3 내지 20%(wt/v) 농도를 가지는 콜라겐 용액이 사용되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 단계 (a)의 혼합이 상온에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제1항 또는 제2항에 따른 필러용 고분자 복합체를 포함하는 필러.
제14항에 있어서,
비경구 투여 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는, 필러.
제14항에 있어서,
상기 고분자 복합체는 액체 형태로 주사기 내 충진되고 투여 후 겔화되는 것을 특징으로 하는, 필러.