CN110801532A - 一种生物墨水及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于3D生物打印的生物墨水及其制备方法。所述生物墨水包括如下质量百分比的组分：质量分数8％～20％的具有交联功能的亲水性高分子、质量分数10～20％的具有交联功能的水溶性酶、质量分数0.1％～1％的细菌纤维素、余量为无菌PBS溶液。生物打印墨水与细胞混合后即可用于3D打印，所用材料的剪切变稀性能，使得生物墨水挤出后具有自支撑的特点。并且所用材料细胞相容性很好，酶交联剂在生理温度(37℃左右)形成水凝胶，反应条件温和，对细胞无伤害，水凝胶支架在培养液中稳定性较好可以支持细胞增殖。

Description

一种生物墨水及其制备方法
技术领域
本发明属于生物墨水制备技术领域，具体涉及一种具有优异生物相容性的生物墨水及其制备方法与应用。
背景技术
3D生物打印是基于离散-堆积成形原理，以活细胞、生物活性因子及生物材料的基本成形单元，设计制造具有生物活性的人工器官、植入物或细胞三维结构的技术，融合了制造科学与生物医学，是一项具有交叉性和前沿性的新兴技术。3D生物打印具有高精度、高效率、个性化制造等特点，在生物医药领域已引起人们足够重视，具有非常广泛的应用前景。
生物墨水是可用于3D生物打印的材料，通常是含有营养成分、基质成分和细胞的流体。理想的生物墨水不仅需要具有良好的生物相容性的生物活性保证细胞生存，而且在打印过程中可以快速成型，又不能堵塞打印机。获得有效的生物打印墨水是研究者目前一直致力的目标。迄今为止，采用3D打印技术制造真正适合于体内植入的器官或组织还面临很大的挑战，其中关键的瓶颈是研发适合于3D打印的生物材料。对细胞而言，生物材料代替天然组织作为其细胞外基质，其微环境必须要保证细胞正常的贴附和增殖，并且维持良好的细胞活性。目前用于3D打印的天然材料中应用最广泛地是有机凝胶类材料，如海藻酸盐、明胶、透明质酸、纤维蛋白、胶原等。天然水凝胶由于与组织细胞外基质成分的相似性，具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此成为包裹细胞的首选。海藻酸钠通过与二价阳离子的化学交联使得它在短时间内从溶胶变为凝胶，这一特性使得海藻酸盐在3D组织、器官打印中具有广泛的应用。但是海藻酸盐本身缺少细胞识别位点，并且离子交联型海藻酸盐水凝胶支架的稳定性差，会因为二价阳离子的流失发生不可控的解体。胶原是细胞外基质的主要结构蛋白之一，在生理条件下可以交联形成凝胶，但是较高的成本和较差的机械强度限制了它的应用。明胶是胶原进一步降解而成的，因其成本较低，并且可以促进细胞粘附而得到了广泛应用。但是明胶本身不能快速成型，因此需要与其他水凝胶材料混用。明胶通过甲基丙烯酰胺修饰之后可以由紫外光引发进行交联，因此也被广泛应用与生物打印平台。但是目前明胶交联的过程中使用的交联剂，如戊二醛，具有一定的毒性，紫外光也对细胞会造成一定的损伤。因此，生物墨水，尤其是用于软组织仿生制造的生物墨水，这是至今全世界都没有很好解决的难题。
发明内容
针对现有生物打印材料的不足，为了解决目前用于3D打印的生物墨水匮乏的难题，本发明提供了一种同时具有生物活性和温和固化条件，同时具备剪切变稀性能和体内可降解吸收性能的用于3D生物打印的生物墨水。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种用于3D打印的生物墨水，包括如下组分：具有交联功能的亲水性高分子、具有交联功能的水溶性酶溶液、具有增稠作用的细菌纤维素。
优选地，所述用于3D打印的生物墨水，包括如下质量百分比的组分：质量分数8％～20％的具有交联功能的亲水性高分子、质量分数10～20％的具有交联功能的水溶性酶溶液、质量分数0.1％～1％的细菌纤维素、余量为无菌PBS溶液。
更优选地，所述用于3D打印的生物墨水，包括如下质量百分比的组分：质量分数8％～16％的具有交联功能的亲水性高分子、质量分数10～20％(具体可为16.7％)的具有交联功能的水溶性酶溶液、质量分数0.1％～0.5％的细菌纤维素、余量为无菌PBS溶液。
进一步的，所述用于3D打印的生物墨水中还可包括：质量分数0.1％～1％的细胞生长因子。
优选的，所述具有交联功能的亲水性高分子物质主要是指明胶、胶原、大豆蛋白、酪蛋白等所有含有赖氨酸和谷氨酸残基的蛋白质。其中，蛋白质包括并不限于明胶、胶原、大豆蛋白、酪蛋白。
优选的，所述具有交联功能的交联剂为催化蛋白质间(或内)酰基转移反应，从而导致蛋白质(或多肽)之间发生共价交联的谷氨酰胺转氨酶。
优选的，所述细胞生长因子为：神经生长因子、表皮生长因子、骨骼生长因子、造血生长因子、内皮生长因子、胶质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、多肽生长因子中的一种或任意几种。
所述无菌PBS溶液含KH2PO4、NaCl、Na2HPO4，pH 7.2-7.4，15-30℃保存。
本发明还提供了上述生物墨水的制备方法。
本发明所提供的生物墨水(不含细胞生长因子)的制备方法，包括如下步骤：
1)在2-4℃环境下，将具有交联功能的亲水性高分子、具有交联功能的水溶性酶溶液、细菌纤维素分别加入到不同培养皿中，紫外照射12-24小时；
2)将步骤1)中紫外照射后的所述具有交联功能的亲水性高分子、细菌纤维素和和无菌PBS溶液加入蜀牛瓶中，并在35-40℃磁力搅拌加热，使各组分全部溶解，形成混合物；
3)向所述混合物中加入步骤1)中紫外照射后的具有交联功能的水溶性酶溶液，混合均匀，制成复合生物墨水材料。
上述方法步骤1)中，所述紫外照射的强度为30w/cm2，所述紫外照射的时间为12-24小时。
上述方法步骤2)中，所述加热的时间为30min-60min。
本发明所提供的生物墨水使用时可根据待处理的生物细胞，在所述生物墨水中加入经计数的生物细胞以及与所述生物细胞相匹配的细胞生长因子。
所述细胞生长因子在使用前需经过紫外照射12-24小时，所述紫外照射的强度可为30w/cm2。
本发明所提供的生物墨水(含细胞生长因子)的制备方法，包括如下步骤：
1)在2-4℃环境下，将具有交联功能的亲水性高分子、具有交联功能的水溶性酶溶液、细菌纤维素和细胞生长因子分别加入到不同培养皿中，紫外照射12-24小时；
2)将步骤1)中紫外照射后的所述具有交联功能的亲水性高分子、细菌纤维素、细胞生长因子和和无菌PBS溶液加入蜀牛瓶中，并在35-40℃磁力搅拌加热，使各组分全部溶解，形成混合物；
3)向所述混合物中加入步骤1)中紫外照射后的具有交联功能的水溶性酶溶液，混合均匀，制成复合生物墨水材料。
上述方法步骤1)中，所述紫外照射的强度为30w/cm2，所述紫外照射的时间为12-24小时。
上述方法步骤2)中，所述加热的时间为30min-60min。
另外，适用于本发明的生物细胞可以是任何一种脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人的细胞或其组合，其类型取决于所生产的细胞构建体、组织或器官的类型。例如所述细胞可以包括并不限于为收缩性细胞或肌肉细胞、结缔组织细胞、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、胃肠道细胞、肝细胞、胰腺细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、生殖细胞、脂肪细胞、间皮细胞、间质细胞、内胚层源细胞、中胚层源细胞、外胚层源细胞及其组合。在一个优选实施例中，所述细胞为干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导性多能干细胞等。其中生物细胞的添加量根据不同组织、生长速度的不同进行添加。所述生物细胞单独冻存在液氮罐中，需要时解冻复苏，复苏后用PBS洗涤2-4次，离心去除PBS，用细胞培养基重悬并计数。
优选的，所述细胞生长因子为：神经生长因子、表皮生长因子、骨骼生长因子、造血生长因子、内皮生长因子、胶质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、多肽生长因子中的一种或任意几种。本发明将细胞生长因子引入水凝胶中，优点在于可以给生物墨水中的细胞提供营养。运用3D打印技术打印出支架，细胞因子可以促进水凝胶支架上的细胞分化、增值，加速组织重建。
优选的，所述用于3D生物打印的生物墨水在生理温度(37℃左右)形成水凝胶，反应条件温和，对细胞无伤害。
本发明还提供了上述用于3D生物打印的生物墨水的应用。
所述应用为：所述生物墨水在生物打印方面中的应用。
本发明具有以下的特点和有益效果：1)生物墨水的水凝胶液所用材料为水溶性天然高分子，生物相容性好，可以与细胞良好复合，降解产物安全无毒，不存在过敏反应或者毒性反应的潜在危险；2)生物墨水具备剪切变稀的性能，可以满足打印过程中快速成型的要求；3)生物墨水的固化为生理条件，反应温和，对细胞无害；4)生物墨水在打印过程中，可通过打印参数的调节，控制打印密度和打印形态，实现个性化打印；5)生物墨水中的活性生长因子成分可以促进细胞的增殖分化，提高了打印效率；6)本发明的生物墨水配制过程简单，降低了操作人员的培训难度。
附图说明
图1为本发明生物墨水的剪切变稀性能表征；
图2为本发明生物墨水在37℃条件下固化的表征；
图3为本发明生物墨水三维多组分个性化打印成型制得的水凝胶。
图4为本发明生物墨水固化成型制得的水凝胶的细胞活性表征。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶8.0％，细菌纤维素0.1％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液74.4％。
(2)制备步骤具体如下：
1)将明胶、细菌纤维素、生长因子在37℃环境下，依次加入到方形培养皿中，紫外照射12-24小时。
2)将1)中照射后的明胶、细菌纤维素和细胞生长因子和无菌PBS溶液加入蜀牛瓶中，然后在30-35℃磁力搅拌加热1小时，使各组分全部溶解，形成混合物(水凝胶液)。
3)在水凝胶液中加入经计数的生物细胞制成悬液。
4)在悬液中加入谷氨酰胺转氨酶溶液。
实施例2生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶8.0％，细菌纤维素0.2％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液74.3％。
(2)制备方法与本发明实施例1中相同，形成生物墨水。
实施例3生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶8.0％，细菌纤维素0.3％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液74.2％。
(2)制备方法与本发明实施例1中相同，形成生物打印墨水。
实施例4生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶8.0％，细菌纤维素0.4％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液74.1％。
(2)制备方法与本发明实施例1中相同，形成生物打印墨水。
实施例5生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶8.0％，细菌纤维素0.5％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液74.0％。
(2)制备方法与本发明实施例1中相同，形成生物打印墨水。
上述本发明实施例1-5所得生物墨水的剪切变稀性能如图1所示，该生物墨水具有剪切变稀性能，随着剪切速率的增大，黏度降低，并且可以通过调节细菌纤维素的量控制生物墨水的黏度。
本发明制备得到的生物墨水在37℃下固化成水凝胶的过程，如图2所示。图2(a)所示储能模量随着时间增长而增大；图2(b)所示，水凝胶的固体占比随着时间增长而增大。
实施例6生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶16.0％，细菌纤维素0.1％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液66.4％。
(2)制备方法与本发明实施例1中相同，形成生物打印墨水。
实施例7生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶16.0％，细菌纤维素0.2％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液66.3％。
(2)制备方法与本发明实施例1中相同，形成生物打印墨水。
实施例8生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶16.0％，细菌纤维素0.3％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液66.2％。
(2)制备方法与本发明实施例1中相同，形成生物打印墨水。
实施例9生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶16.0％，细菌纤维素0.4％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液66.1％。
(2)制备方法与本发明实施例1中相同，形成生物打印墨水。
实施例10生物打印墨水的制备
(1)本实施例中生物墨水所用原料由如下组成，以质量百分比计：明胶16.0％，细菌纤维素0.5％，生长因子0.8％，谷氨酰胺转氨酶16.7％，无菌PBS溶液66.0％。
(2)制备方法与本发明实施例1中相同，形成生物打印墨水。
实施例11生物打印墨水的三维可打印性测试
选取实施例1-3的生物墨水(实施例1：红色；实施例2：蓝色；实施例3：黄色)分别转移至三维打印机的三个注射器中，将注射器置于3D生物打印机恒温挤出槽内，维持温度为37℃；打印接受地板区域温度维持25℃；打印出如图3所示的多组分水凝胶结构。本实施例可以体现出本生物墨水体系采用3D打印出的支架结构具有宏微观两级结构，其中，宏观结构是由3D打印技术所控制，微观结构是由墨水水凝胶材料自身性质所控制。
实施例12生物打印墨水细胞活性的检测
将实施例1制得的1.0g生物打印墨水在37℃的条件下浸没在10mL杜氏改良伊格尔培养基-高糖(DMEM高糖)培养液中24h，获得浸提液。然后对该浸提液进行稀释分别获得浓度为0.100g/mL、0.010g/mL、0.001g/mL的浸提液。将上述不同浓度的浸提液作用于L929细胞，分别检测24h、48h及72h的细胞毒性。如图3所示，为L929细胞在不同浓度浸提液中细胞活性的条形统计图。图4数据显示细胞活性在90％以上，验证本发明的生物墨水材料无细胞毒性。

Claims (10)

1.一种用于3D打印的生物墨水，包括如下质量百分比的组分：质量分数8％～20％的具有交联功能的亲水性高分子、质量分数10～20％的具有交联功能的水溶性酶、质量分数0.1％～1％的细菌纤维素、余量为无菌PBS溶液。
2.根据权利要求1所述的用于3D打印的生物墨水，其特征在于：所述具有交联功能的亲水性高分子物质是含有赖氨酸和谷氨酸残基的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的用于3D打印的生物墨水，其特征在于：所述蛋白质包括明胶、胶原、大豆蛋白和酪蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于3D打印的生物墨水，其特征在于：所述具有交联功能的水溶性酶为谷氨酰胺转氨酶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于3D打印的生物墨水，其特征在于：所述生物墨水还包括：质量分数0.1％～1％的细胞生长因子。
6.根据权利要求5所述的用于3D打印的生物墨水，其特征在于：所述细胞生长因子为：神经生长因子、表皮生长因子、骨骼生长因子、造血生长因子、内皮生长因子、胶质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、多肽生长因子中的一种或任意几种。
7.权利要求1-4中任一项所述生物墨水的制备方法，包括下述步骤：
1)在2-4℃环境下，将所述的具有交联功能的亲水性高分子、具有交联功能的水溶性酶溶液、细菌纤维素分别加入到培养皿中，紫外照射；
2)将步骤1)中紫外照射后的所述具有交联功能的亲水性高分子、细菌纤维素和和无菌PBS溶液加入蜀牛瓶中，并在35-40℃磁力搅拌加热，使各组分全部溶解，形成混合物；
3)向所述混合物中加入步骤1)中紫外照射后的具有交联功能的水溶性酶溶液，混合均匀，制成复合生物墨水材料。
8.权利要求5或6所述生物墨水的制备方法，包括下述步骤：
a)在2-4℃环境下，将所述具有交联功能的亲水性高分子、所述具有交联功能的水溶性酶溶液、所述细菌纤维素和所述细胞生长因子分别加入到不同培养皿中，紫外照射12-24小时；
b)将步骤1)中紫外照射后的所述具有交联功能的亲水性高分子、细菌纤维素、细胞生长因子和和无菌PBS溶液加入蜀牛瓶中，并在30-35℃磁力搅拌加热，使各组分全部溶解，形成混合物；
c)向所述混合物中加入步骤1)中紫外照射后的具有交联功能的水溶性酶溶液，混合均匀，制成复合生物墨水材料。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述紫外照射的强度为30w/cm2，所述紫外照射的时间为12-24小时；
所述步骤2)中，所述加热的时间为30min-60min。
10.权利要求1-6中任一项所述生物墨水在生物打印方面中的应用。
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