CN113750292B - 一种用于3d打印角膜修复材料的生物墨水及制备方法、角膜修复材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于3D打印角膜修复材料的生物墨水，包括甲基丙烯酰胺基明胶、光引发剂、胶原和溶剂。所述甲基丙烯酰胺基明胶在生物墨水中的浓度为50～150mg/mL；所述光引发剂在生物墨水中的浓度为1～5mg/mL；所述胶原溶液在生物墨水中的浓度为0.5～6.0mg/mL。本发明还公开了上述用于3D打印角膜修复材料的生物墨水的制备方法和基于3D打印角膜修复材料的生物墨水的角膜修复材料的制备方法。本发明提高了角膜修复材料的打印精度，使得打印支架的力学性能得到提升，并且具有完整的曲率结构、光学透过性好、含水性能好、可充分满足角膜上皮细胞生长、增殖的需求。

Description

一种用于3D打印角膜修复材料的生物墨水及制备方法、角膜 修复材料的制备方法
技术领域
本发明涉及角膜修复材料领域，特别涉及一种用于3D打印角膜修复材料的生物墨水及制备方法、角膜修复材料的制备方法。
背景技术
角膜盲作为我国第二大致盲眼病，是我国面临的重大公共卫生问题。角膜移植是角膜盲患者重见光明的唯一途径，但角膜移植捐献供体极度匮乏，且国内外尚无在临床上实现大规模应用的角膜修复材料产品，因此角膜修复材料成为解决角膜盲患者复明的关键。
天然角膜是是一种具有曲率的、厚度平滑过度的层状有序组织，这使其具有独特的屈光性、透明性、营养渗透能力、力学性能，具有维持眼内压和保护眼球，透过光线并参与屈光，透氧，进行营养物质代谢，感知环境及外界刺激等视觉和生理功能。角膜细胞在这种曲率环境中生长，各种性质和行为势必会受到曲率的影响。研究表明细胞对其周围环境的物理因素如胞外基质的硬度和所黏附的基底的几何形状等是极其敏感的，并能通过改变自身的行为对这些微环境物理因素的变化做出响应。因此在构建角膜修复材料时，不仅要从成分上仿生获得较好组织相容性的支架，还要考虑到曲率结构等的仿生，促进角膜修复进程。目前用于角膜支架的材料主要有薄膜、水凝胶、海绵、纤维等，每种材料的成型方法可能有差异，主要的几种成型技术包括浇筑成型、静电纺丝和3D打印。这几种成型方式在做支架材料时较为常见，且静电纺丝与3D打印在生物组织学领域的发展具有独一无二的优势，可克服传统成型方式的局限性。生物打印是一种增材制造技术，通过逐层打印材料，可以实现复杂的几何形状以应对患者的特定问题。在实际中，每个个体的角膜曲率具有差异性，通过3D打印技术不仅可以解决角膜曲率的问题，还可以实现个性化定制，获得更匹配的角膜修复材料。
明胶作为其水解产物，较大程度上保留了胶原的生物优势，同时由于其具有易改性的优势而在组织工程领域广泛应用。其改性产物甲基丙烯酰胺基明胶(GelMA)具有温敏性、较好的生物相容性、可光固化等优点，在3D打印中是很好的挤出型生物材料，由于其有较多暴露在外的RGD结合位点，可促进细胞的黏附，适合角膜上皮细胞的生长与增殖。而纯GelMA粘度较稀，在打印角膜这一类具有曲率光滑表面的特殊结构时，不易成型，表面因出丝时已凝胶而不平整。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种用于3D打印角膜修复材料的生物墨水，改善纯GelMA低浓度较难打印的缺陷，提高了纯GelMA的打印精度，同时因添加了生物活性胶原成分，使得打印支架的力学，生物学性能得到提升。
本发明的另一目的在于提供一种用于3D打印角膜修复材料的生物墨水的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种角膜修复材料的制备方法，可实现不同性能的角膜修复材料的高通量制备。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于3D打印角膜修复材料的生物墨水，包括甲基丙烯酰胺基明胶、光引发剂、胶原和溶剂。
优选的，所述甲基丙烯酰胺基明胶在生物墨水中的质量浓度为50～150mg/mL；所述甲基丙烯酰胺基明胶的接枝率为60％～99％。
所述光引发剂在生物墨水中的质量浓度为1～5mg/mL；
所述胶原在生物墨水中的浓度为0.5～6.0mg/mL。
优选的，所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。
优选的，所述胶原为从牛肌腱中提取的经纯化过的I型胶原。
优选的，所述溶剂包括无机盐溶剂和无机酸溶剂。
优选的，所述无机盐溶剂为PBS或水；所述无机酸溶剂为盐酸或乙酸。
所述的用于3D打印角膜修复材料的生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
将甲基丙烯酰胺基明胶冻干固体溶于无机盐溶剂配置成GelMA溶液；
将光引发剂溶于GelMA溶液中得到可光交联GelMA溶液；
将胶原加入无机酸溶剂中，搅拌均匀，除去溶液中的气泡，得到胶原溶液；
将可光交联GelMA溶液和胶原溶液混合均匀，离心除去溶液中的气泡，得到生物墨水。
优选的，所述胶原溶液的质量浓度为0.5～6.0mg/mL。
优选的，所述盐酸溶液的摩尔浓度为0.001～0.01mol/L。
优选的，所述乙酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.15mol/L。
优选的，所述料筒为低温避光料筒。
优选的，所述料筒控制温度为20℃～30℃。
优选的，所述平台控制温度为4℃～15℃。
优选的，所述打印气压为0.01MPa～0.2MPa，打印速度为4mm/s～10mm/s。
角膜修复材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述的用于3D打印角膜修复材料的生物墨水置于3D打印的料筒中；
(2)设定打印参数，将料筒中的生物墨水挤出到温控角膜打印平台上，得到角膜修复材料的支架；
(3)对角膜修复材料的支架进行紫外光照射，得到角膜修复材料。
优选的，所述温控角膜打印平台上设有多个横截面为圆形的凸台；所述凸台的曲率为6.0～7.0；所述温控角膜打印平台的表面设有聚四氟乙烯或PDMS涂层。
优选的，所述将料筒中的生物墨水挤出到温控角膜打印平台上，具体为：
沿着凸台的表面，由下而上，以圆周的打印轨迹，将料筒中的生物墨水挤出到凸台上。
优选的，所述料筒可为两个以上，通过改变紫外光强度和打印速度控制材料强度，实现高通量打印。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明的生物墨水，在GelMA中加入胶原，胶原因其三股螺旋结构以及较高的分子量而具有一定的粘度，与GelMA复合后，可改善纯GelMA低浓度较难打印的缺陷，提高了纯GelMA的打印精度，使得打印支架的力学性能得到提升。
(2)本发明的生物墨水，添加的胶原为从牛肌腱中提取的经纯化过的I型胶原，生物墨水的生物学性能得到提升。
(3)采用本发明的生物墨水，通过本发明的角膜修复材料的制备方法制备得到的角膜修复材料，具有完整的曲率结构、光学透过性好、含水性能好、可充分满足角膜上皮细胞生长、增殖的需求。
(4)本发明的基于3D打印技术的角膜修复材料制备方法可用于医疗领域中受损角膜基质的修复，其原料廉价易得、制备工艺简单、耗时短(～2min/个)、可个性化定制、具有良好的应用前景和科学价值。
(5)本发明的生物墨水具有温度响应特性，可通过改变温度实现墨水模量以及粘度的控制，从而便于控制墨水的挤出以及成型；还可通过调节紫外光强度和打印速度控制材料强度，实现高通量打印。
(6)本发明的基于3D打印技术的角膜修复材料制备方法，采用具有多个凸台的温控角膜打印平台，可在打印过程中改变材料配比、紫外光强度、交联时间、打印参数等，完成不同性能(厚度，材料强度，材料配比等)的角膜修复材料的高通量制备。
附图说明
图1为实施例1制备得到的生物墨水的粘度测试结果。
图2为实施例1制备得到的生物墨水的温度-模量测试结果。
图3为实施例2制备得到的生物墨水的粘度测试结果。
图4为实施例1制备得到的生物墨水的温度-模量测试结果。
图5为实施例3采用的温控角膜打印平台示意图。
图6为实施例3制备的角膜修复材料的外观图片。
图7为实施例3打印的角膜修复材料的含水率测试结果。
图8为实施例3打印的角膜修复材料的光透过性能结果。
图9为实施例3打印的角膜修复材料的角膜上皮细胞生长测试结果
图10为实施例3打印的角膜修复材料可对角膜细胞取向进行调控的荧光照片，其中(a)为打印的角膜修复材料可对角膜细胞取向进行调控的荧光照片，(b)图是(a)图的三维立体照片。
图11为实施例3打印的角膜修复材料与对比样(GelMA质量浓度为10％mg/mL，胶原的质量浓度为0mg/mL，光引发剂I2959的质量浓度为0.5％mg/mL))的微观形貌对比图；图中(a)～(d)分别为对比样的表面SEM照片、实施例3打印的角膜修复材料的表面SEM照片、对比样的断面SEM照片、实施例3打印的角膜修复材料的断面SEM照片。
图12为实施例4的生物墨水的打印精度图。
图13本实施例5的高通量打印的角膜修复材料的力学测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的基于3D打印角膜修复材料的生物墨水，包括甲基丙烯酰胺基明胶、光引发剂、胶原和溶剂；本实施例中，所述甲基丙烯酰胺基明胶在生物墨水中的质量浓度为100mg/mL；所述光引发剂在生物墨水中的质量浓度为5mg/mL；所述胶原在生物墨水中的质量浓度为6.0mg/mL。
本实施例中，甲基丙烯酰胺基明胶的接枝率为99％；胶原为从牛跟腱中提取的I型胶原；光引发剂为I2959(2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮)；溶剂包括PBS和盐酸溶液。
本实施例的基于3D打印角膜修复材料的生物墨水的制备方法为：
(1)将接枝率为99％的GelMA冻干固体在50℃溶于1XPBS配置成浓度为100mg/mLGelMA溶液。
(2)避光条件下加入光引发剂I2959。
(3)将从牛跟腱中提取的I型胶原用0.001mol/L的盐酸溶液配制浓度为6mg/mL的胶原溶液，再在4℃冰箱中搅拌4小时，再在室温下搅拌24小时，除去气泡；
(4)避光下，将配制好的可光交联GelMA溶液和胶原溶液按照GelMA浓度为100mg/mL)，胶原浓度为6mg/mL，光引发剂I2959浓度为5mg/mL混合均匀，3000rpm离心除去溶液中的气泡，得到生物墨水。
本实施例制备得到的生物墨水的粘度如图1所示，由图可知，该墨水具有“剪切变稀”的特性，满足挤出生物打印的需求。
本实施例制备得到的生物墨水的温度-模量图2所示，由图可知，该墨水具有一定的温度响应特性，可通过改变温度实现墨水模量以及粘度的控制，从而便于控制墨水的挤出以及成型。
实施例2
本实施例的基于3D打印角膜修复材料的生物墨水，包括甲基丙烯酰胺基明胶、光引发剂、胶原和溶剂；本实施例中，所述光引发剂在生物墨水中的质量浓度为5mg/mL；所述甲基丙烯酰胺基明胶在生物墨水中的质量浓度为Amg/mL；所述胶原在生物墨水中的浓度为B mg/mL；具体配方如表1所示。
本实施例中，甲基丙烯酰胺基明胶的接枝率为99％；胶原为从牛跟腱中提取的I型胶原；光引发剂为I2959；溶剂包括PBS和盐酸溶液。
本实施例的基于3D打印角膜修复材料的生物墨水的制备方法为：
将接枝率为99％的GelMA冻干固体在50℃溶于1XPBS配置成质量浓度为Amg/mLGelMA溶液。
(1)避光条件下加入为光引发剂I2959。
(2)将从牛跟腱中提取的I型胶原用0.001mol/L的盐酸溶液配制质量浓度为B mg/mL的胶原溶液，再在4℃冰箱中搅拌4小时，再在室温下搅拌24小时，除去气泡；
(3)避光下，将配制好的可光交联GelMA溶液和胶原溶液按照GelMA质量浓度为Amg/mL，胶原质量浓度为B mg/mL，光引发剂I2959质量浓度为5mg/mL混合均匀，3000rpm离心除去溶液中的气泡，得到生物墨水。
表1
墨水简写名称 GelMA质量浓度Amg/mL 胶原质量浓度A mg/mL
G5C0 50 0
G5C0.2 50 2
G5C0.4 50 4
G5C0.6 50 6
G10C0 100 0
G10C0.2 100 2
G10C0.4 100 4
G10C0.6 100 6
G15C0 150 0
G15C0.2 150 2
G15C0.4 150 4
G15C0.6 150 6
本实施例制备得到的生物墨水的粘度如图3所示，由图可知不同配方的墨水均具有“剪切变稀”的特性，满足挤出生物打印的需求。
本实施例制备得到的生物墨水的温度-模量图4所示，由图可知不同配方的墨水均具有一定的温度响应特性，可通过改变温度实现墨水模量以及粘度的控制，从而便于控制墨水的挤出以及成型。
实施例3
利用实施例1制备的生物墨水实现角膜修复材料的制备方法，步骤如下：
(1)生物墨水置于3D打印的低温避光料筒中，设置打印机料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃，打印气压为0.035MPa，打印速度为6mm/s，将料筒中的生物墨水挤出到温控角膜打印平台上；
(2)设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为8mm/s。
(3)用镊子将角膜支架从打印平台取下，即得到本发明的3D打印角膜修复材料。
具体的，本实施例采用具有如图5所示结构温控角膜打印平台：所述温控角膜打印平台上设有多个横截面为圆形的凸台；所述凸台的曲率为6.0～7.0；所述温控角膜打印平台的表面设有聚四氟乙烯或PDMS涂层。
具体的，本实施例的打印路径为：沿着凸台的表面，由下而上，以圆周的打印轨迹，将料筒中的生物墨水挤出到凸台上。
本实施例制备的角膜修复材料，具有完整光滑的曲率结构(如图6所示)，厚度为500～600um，人眼角膜厚度为500～600um，可满足使用需求。
图7为本实施例打印的角膜修复材料的含水率测试结果，由图6可知：纯GelMA与添加了胶原的角膜修复材料都具有较高的含水率。
图8为本实施例打印的角膜修复材料的光透过性能结果，由图8可知：纯GelMA与添加了胶原的角膜修复材料都具有较高的光透过性能，且均随着光波长的增加其光透过率也增加，与健康角膜相一致。
图9为本实施例打印的角膜修复材料的角膜上皮细胞生长测试结果，由图9可知：添加了胶原组分的角膜修复材料具有更好的促角膜上皮细胞增殖的能力，说明该方法打印的角膜修复材料具有较好的生物相容性以及促角膜修复能力。
图10为本实施例打印的角膜修复材料可对角膜细胞取向进行调控的荧光照片，其中(a)为打印的角膜修复材料可对角膜细胞取向进行调控的荧光照片，(b)图是(a)图的三维立体照片。由图10可知：细胞在3D打印的曲率支架上会沿曲率定向生长，排列较为整齐，说明曲率结构对角膜细胞具有调控作用，能更好的促进角膜修复进程。
图11为本实施例打印的角膜修复材料与对比样(GelMA质量浓度为10％mg/mL，胶原的质量浓度为0mg/mL，光引发剂I2959的质量浓度为0.5％mg/mL的微观形貌对比图。图中(a)～(d)分别为对比样的表面SEM照片、本实施例打印的角膜修复材料的表面SEM照片、对比样的断面SEM照片、本实施例打印的角膜修复材料的断面SEM照片，由图可知，本实施例打印的角膜修复材料具有多孔层状结构，能使得细胞更好的生长，天然角膜具有层状结构，该角膜修复材料在最大程度实现了结构的仿生。添加胶原后，打印的角膜修复材料更加致密，因此力学性能得到提升。
实施例4
利用实施例2制备的生物墨水实现角膜修复材料的制备方法，步骤如下：
(1)生物墨水置于3D打印的低温避光料筒中，设置打印机料筒温度为30℃，打印平台温度为10℃，打印气压为0.035MPa，打印速度为6mm/s，将料筒中的生物墨水挤出到温控角膜打印平台上；
(2)设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为8mm/s。
(3)用镊子将角膜支架从打印平台取下，即得到本发明的3D打印角膜修复材料。
具体的，本实施例采用具有如下结构温控角膜打印平台：所述温控角膜打印平台上设有多个横截面为圆形的凸台；所述凸台的曲率为6.0～7.0；所述温控角膜打印平台的表面设有聚四氟乙烯或PDMS涂层。
具体的，本实施例的打印路径为：沿着凸台的表面，由下而上，以圆周的打印轨迹，将料筒中的生物墨水挤出到凸台上。
本实施例的生物墨水的打印精度如图12所示,由图可知，随着胶原浓度的提高，墨水的可打印性能随之提高，其中当0.9<Pr<1.1时，被定义为墨水具有较好的可打印性能。特别地，当GelMA质量浓度较低时，胶原的添加对墨水的改善性能更加明显。
实施例5
采用实施例1制备的生物墨水、温控角膜打印平台及打印路径，进行高通量打印的实现过程如下：
选取两组不同配比的生物墨水比例，如墨水1的质量浓度GelMA为10％mg/mL，胶原的质量浓度为6mg/mL，光引发剂I2959的质量浓度为0.5％mg/mL，墨水2的质量浓度GelMA为10％mg/mL，胶原为0mg/mL，光引发剂I2959的质量浓度为0.5％mg/mL，将两组墨水分别装载到不同低温避光料筒中，放入打印机的不同低温挤出喷头处；
设置打印机料筒1温度为30℃，打印平台温度为10℃，打印气压为0.035MPa，打印速度为6mm/s，打印机料筒2温度为28℃，打印平台温度为10℃，打印气压为0.02MPa，打印速度为6mm/s，打印平台材质为聚四氟乙烯涂层，选择打印路径，墨水1打印20个，墨水2打印20个，进行角膜修复材料高通量打印。
在打印每一个支架时，可调节紫外光强度和打印速度控制材料强度，设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为4mm/s，打印墨水1的1～5个，设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为6mm/s，打印墨水1的6～10个设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为8mm/s，打印墨水1的11～15个，设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为10mm/s，打印墨水1的16～20个。同理，设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为4mm/s，打印墨水2的1～5个，设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为6mm/s，打印墨水2的6～10个设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为8mm/s，打印墨水2的11～15个，设置紫外光强度为100mW/cm2，打印速度为10mm/s，打印墨水2的16～20个，进行高通量角膜打印。
用镊子将所有角膜支架从打印平台取下，即得到本发明的高通量3D打印角膜修复材料。
图13为本实施例高通量打印的角膜修复材料的力学测试结果，由图13可知：高通量打印的支架具有不同的力学性质，可通过改变打印参数、材料配比等实现高通量打印以及材料的调控。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.角膜修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将用于3D打印角膜修复材料的生物墨水置于3D打印的料筒中；
所述用于3D打印角膜修复材料的生物墨水包括甲基丙烯酰胺基明胶、光引发剂、胶原和溶剂；
所述胶原为从牛肌腱中提取的经纯化过的I型胶原；
所述甲基丙烯酰胺基明胶在生物墨水中的质量浓度为100~150 mg/mL；所述胶原在生物墨水中的浓度为4～6.0mg/mL；
（2）设定打印参数，将料筒中的生物墨水挤出到温控角膜打印平台上，得到角膜修复材料的支架；其中，所述料筒控制温度为20℃~30℃；所述平台控制温度为4℃~15℃；
（3）对角膜修复材料的支架进行紫外光照射，得到角膜修复材料。
2.根据权利要求1所述的角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述温控角膜打印平台上设有多个横截面为圆形的凸台；所述凸台的曲率为6.0~7.0；所述温控角膜打印平台的表面设有聚四氟乙烯或PDMS涂层。
3.根据权利要求2所述的角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述将料筒中的生物墨水挤出到温控角膜打印平台上，具体为：
沿着凸台的表面，由下而上，以圆周的打印轨迹，将料筒中的生物墨水挤出到凸台上。
4.根据权利要求1所述的角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰胺基明胶在生物墨水中的质量浓度为100mg/mL；所述胶原在生物墨水中的浓度为6.0mg/mL。
5.根据权利要求1或4所述的角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述光引发剂在生物墨水中的质量浓度为1~5mg/mL。
6.根据权利要求1或4所述的角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮；所述溶剂包括无机盐溶剂和无机酸溶剂；所述无机盐溶剂为PBS或水；所述无机酸溶剂为盐酸或乙酸。
7.根据权利要求1所述的角膜修复材料的制备方法，其特征在于，所述的用于3D打印角膜修复材料的生物墨水的制备过程如下：
将甲基丙烯酰胺基明胶冻干固体溶于无机盐溶剂配置成GelMA溶液；
将光引发剂溶于GelMA溶液中得到可光交联GelMA溶液；
将胶原加入无机酸溶剂中，搅拌均匀，除去溶液中的气泡，得到胶原溶液；
将可光交联GelMA溶液和胶原溶液混合均匀，离心除去溶液中的气泡，得到生物墨水。
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