CN114288477B

CN114288477B - 重组胶原蛋白水凝胶3d打印墨水及其应用

Info

Publication number: CN114288477B
Application number: CN202111566881.XA
Authority: CN
Inventors: 李梦杰; 李晨昱; 王永会; 李冲
Original assignee: Jiangsu Jland Biotech Co ltd
Current assignee: Jiangsu Jland Biotech Co ltd
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2023-02-17
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN114288477A

Abstract

本发明公开了一种重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水及其应用。本发明所述的重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水由以下成分组成：明胶10wt％～15wt％，RHC‑NHS 2wt％～8wt％，纳米甲壳素1wt％～3wt％，余量为水；RHC‑NHS为经EDC/NHS活化的重组胶原蛋白，重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生。本发明通过将明胶、RHC‑NHS和纳米甲壳素三组分共混，有效调控水凝胶的快速成型、结构固化、凝胶强度及生物活性等性质，不再单纯地依靠改变体系的粘度来调整凝胶的性质，有效地降低预凝胶溶液的粘度，提高打印精度，在3D打印高精度生物材料具有广泛的应用前景。

Description

重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水及其应用

技术领域

本发明属于3D打印生物材料技术领域，涉及一种重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水及其在3D打印生物材料中的应用。

背景技术

3D打印是一种以数字模型为基础，由计算机辅助设计(CAD)或断层扫描(CT)技术获得的数据，在计算机控制下，按照逐层叠加的原理，通过打印材料来构建出三维立体精细结构的技术。3D打印具有灵活、快速、精密等特点，已在航天、军工等行业中发挥重要作用。在医学领域中，3D打印的骨、牙齿等简单组织已经应用到临床中，但这些纯材料打印的支架材料只能起到支撑替代的作用而无法修复受损的组织器官。近年来，众多研究者探索将3D打印技术引入组织修复与再生医学领域，应用3D生物打印技术以细胞与材料共混打印来实现组织器官的体外个性化快速构建。但传统打印材料难以满足生物打印的严格要求，制约3D生物打印技术的发展。

水凝胶是交联的三维亲水聚合物网络，具有类似人体正常生理组织的性质，适宜作为支架材料用于组织修复，在组织工程、药物传递等生物医用材料领域已有广泛的应用。因此水凝胶也适用于生物打印，与细胞共打印来构建组织器官。在生物打印过程前，细胞、预凝胶材料、生物活性物质需要预先混合均匀，打印时则需要快速地固化成型，固化后的材料根据不同的组织需求要具有一定的力学强度。因此可用于生物打印的水凝胶材料除了具有细胞支架的一般特点外，还必须具有以下的性质：(1)具有良好生物相容性的同时，其凝胶化过程中所涉及的刺激因素或化学反应必须对细胞活性没有明显影响；(2)连续地打印过程要求材料的凝胶化要在几十秒内完成；(3)固化后的材料要具有一定的力学强度且可保持一定的细胞存活率。

能够满足材料细胞共混打印严苛的要求进行生物打印的水凝胶材料很少。基于钙离子交联的海藻酸钙水凝胶是一种被广泛研究的生物打印材料。海藻酸或混合明胶等其他水溶性高分子的海藻酸溶液与种子细胞共混打印后，用含钙离子的溶液处理，由于钙离子的交联作用使水凝胶固化成型。这种方法打印的水凝胶结构稳定，很少变形。以明胶/海藻酸/纤维蛋白为打印材料混合海拉细胞共混打印，用氯化钙及凝血酶处理使水凝胶结构交联固化，打印后细胞活性可保持90％以上。但离子交联的海藻酸钙水凝胶结构不稳定，多次更换培养液时，钙离子的流失会引起凝胶结构的塌陷，难以满足长时间培养的需求。同时海藻酸溶液粘度较大，对打印的精度也有一定的影响。这些因素使得海藻酸钙凝胶在体内修复受损组织的应用中受到诸多限制。

通过在聚乙二醇、透明质酸、明胶等具有良好生物相容性的材料上引入双键，打印过程中加入少量引发剂通过逐层紫外光照射来固化凝胶结构是另一种常见的生物打印方法，这类光辅助固化打印在生物打印中也获得了较多的研究关注。通过在明胶分子链上修饰双键同时共混可促进干细胞分化的功能化胶原微纤维，以此为预凝胶溶液共混间充质干细胞后，紫外光照辅助打印，打印后混合体中干细胞活性可达90％以上，同时发现干细胞在三维环境中的分化效率优于骨诱导培养液中的间充质干细胞，是一种理想的打印材料([1]BIOMATERIALS 2014,35,49.[2]BIOFABRICATION 2014,6,24105)。但这类凝胶在交联过程中紫外光的照射及自由基的产生会对细胞的活性造成一定的影响，打印的精度也会受到交联速率的影响。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水。该3D打印墨水利用明胶的温敏性，实现快速固化成型，通过温和条件下RHC-NHS与明胶、纳米甲壳素表面的氨基反应形成酰胺键来进一步固化水凝胶结构，同时纳米甲壳素还能够调节水凝胶的力学强度。

本发明所述的重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水，由以下成分组成：明胶10wt％～15wt％，RHC-NHS 2wt％～8wt％，纳米甲壳素1wt％～3wt％，余量为水；所述的RHC-NHS为经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化的重组胶原蛋白。

作为优选，本发明所述的重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水，由以下成分组成：明胶10wt％～15wt％，RHC-NHS 4wt％～8wt％，纳米甲壳素1wt％～3wt％，余量为水。

在本发明具体实施方式中，采用的重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生。

具体地，本发明所述的RHC-NHS通过以下步骤制备：将重组胶原蛋白溶液、EDC溶液和NHS溶液混合，搅拌反应，反应结束后，将反应物冷冻，沉淀于-20℃乙醇中，经-20℃乙醇充分洗涤后，真空干燥得到RHC-NHS。

在本发明具体实施方式中，采用的重组胶原蛋白溶液的浓度为10wt％，EDC溶液的浓度为67wt％，NHS溶液的浓度为25wt％；反应温度为37℃。

本发明所述的纳米甲壳素为本领域常规使用的纳米级的甲壳素微晶，可以通过以下步骤制备：将碱化提纯过的甲壳素分散于HCl溶液中，搅拌煮沸回流，冷却后多次离心清洗，透析至溶液pH呈中性，冷冻干燥得到纳米甲壳素。

本发明的目的之二在于提供上述重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水在3D打印生物材料中的应用。

本发明所述的生物材料为本领域常规使用的生物材料，例如组织工程支架、药物递送载体、人工组织和器官等。

本发明所述的重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水在3D打印生物材料中的应用，具体应用方法为：直接以重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水为原料，或者在重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水中加入功能材料混合均匀，设置打印承接板温度为10～20℃，进行3D打印。

本发明中所述的功能材料可以是细胞、生长因子、药物等其他促进细胞生长或者组织修复的材料。

上述应用中，打印在10分钟内即可完成。

上述应用中，打印完成后保持2-20分钟，优选为5-15分钟。在本发明具体实施方式中，打印完成后保持10分钟为例。

上述应用中，打印承接板温度优选为14～16℃。在本发明具体实施方式中，打印温度以15℃为例。

本发明以具有良好生物相容性的天然高分子材料重组胶原蛋白、甲壳素及明胶为原料，共混形成预凝胶溶液。明胶是一种具有温敏性的天然高分子，可溶于热水，当浓度达到一定范围内时，降温后明胶链之间会发生物理交联而凝胶化。因此在打印过程中含明胶的生物打印材料由37℃环境打印至≤15℃的承接板上时，明胶会通过物理交联迅速地凝胶化固定打印结构，同时均匀分布于凝胶中的RHC-NHS开始与明胶、纳米甲壳素表面的氨基反应生成稳定的酰胺键，经三者的化学交联实现进一步固化。化学交联过程可在打印温度以及室温下缓慢进行，也可转移至37℃的培养基中加快进行。经物理交联和化学交联制得的水凝胶再次升温至37℃后，凝胶仍可保持打印的形状而不塌陷。

本发明水凝胶体系的固化速率决定于明胶的温敏性，可通过打印时承接板的温度来控制。水凝胶的力学强度可由复合体系中纳米甲壳素的含量来调节。本发明的水凝胶体系有效地降低了预凝胶溶液的粘度，提高了打印精度。体系内重组胶原蛋白在起到化学交联的同时也具有较好的促进细胞增殖迁移效果，有效改善细胞的生存环境。

在3D生物打印中，为提高水凝胶的固化速率及最终凝胶强度，通常预凝胶溶液需要较大的粘度，但这会影响打印的精度。本发明通过将明胶、RHC-NHS和纳米甲壳素三组分共混，有效调控水凝胶的快速成型、结构固化、凝胶强度及生物活性等性质。利用明胶的温敏性作为打印过程中快速成型的控制因素，利用RHC-NHS与明胶、纳米甲壳素的酰胺化反应固化水凝胶结构，同时添加纳米甲壳素微晶提升凝胶的力学强度。本发明不再单纯地依靠改变体系的粘度来调整凝胶的性质，有效地降低预凝胶溶液的粘度，提高打印精度，对于打印高精度复杂组织结构具有重要的意义。

附图说明

图1为重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水的配制流程示意图。

图2为以重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水为原料进行3D打印的工作流程示意图。

图3为以重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水为原料打印出的支架经冷冻干燥后的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

下述实施例和对比例中，RHC-NHS的制备方法如下：分别配制10wt％重组胶原蛋白、67wt％EDC溶液和25wt％NHS溶液，按4.5：1：1的体积比共混后置于37℃下搅拌反应10min。反应结束后，产物冷冻后沉淀于-20℃乙醇中，使用-20℃乙醇多次洗涤后真空干燥，即得RHC-NHS。

纳米甲壳素的制备方法如下：称取碱化提纯过的甲壳素10g分散于100mL 3N HCl中搅拌煮沸回流90min，冷却后多次离心清洗(5000rpm，15min)，置于截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，透析至溶液pH呈中性，冷冻干燥可得纳米甲壳素。

实施例1

(1)预凝胶溶液的配制：按预凝胶溶液中明胶10wt％、RHC-NHS 4wt％、纳米甲壳素1wt％的比例，将明胶、RHC-NHS、纳米甲壳素和水混合均匀，37℃下制得预凝胶溶液。

(2)重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水的配制：在预凝胶溶液中加入细胞悬液，混合均匀，制得3D打印墨水。

(3)3D打印重组胶原蛋白水凝胶：将3D打印墨水装入打印机料槽中，开始打印，10分钟内完成打印，其中打印承接板的温度为15℃。打印完成后保持10分钟，再转移至37℃培养基内进行细胞培养。

实施例2

(1)预凝胶溶液的配制：按预凝胶溶液中明胶10wt％、RHC-NHS 2wt％、纳米甲壳素1wt％的比例，将明胶、RHC-NHS、纳米甲壳素和水混合均匀，37℃下制得预凝胶溶液。

实施例3

(1)预凝胶溶液的配制：按预凝胶溶液中明胶10wt％、RHC-NHS 8wt％、纳米甲壳素1wt％的比例，将明胶、RHC-NHS、纳米甲壳素和水混合均匀，37℃下制得预凝胶溶液。

实施例4

(1)预凝胶溶液的配制：按预凝胶溶液中明胶10wt％、RHC-NHS 4wt％、纳米甲壳素3wt％的比例，将明胶、RHC-NHS、纳米甲壳素和水混合均匀，37℃下制得预凝胶溶液。

实施例5

(1)预凝胶溶液的配制：按预凝胶溶液中明胶15wt％、RHC-NHS 4wt％、纳米甲壳素1wt％的比例，将明胶、RHC-NHS、纳米甲壳素和水混合均匀，37℃下制得预凝胶溶液。

对比例1

本对比例与实施例1大致相同，不同之处在于，预凝胶溶液中明胶的加入量为5wt％。

对比例2

本对比例与实施例1大致相同，不同之处在于，预凝胶溶液中明胶的加入量为25wt％、RHC-NHS 0wt％、纳米甲壳素0wt％。

对比例3

本对比例与实施例1大致相同，不同之处在于，预凝胶溶液中RHC-NHS的加入量为12wt％。

对比例4

本对比例与实施例1大致相同，不同之处在于，打印承接板的温度设为30℃。

性能测试例1

对各实施例及对比例的样品进行理化性质测试：

(1)预凝胶溶液在37℃配置完成后，立即使用旋转粘度计进行粘度测试；

(2)预凝胶溶液配置好后，装入打印机料筒进行打印测试；

(3)对于可打印的实施例或对比例，使用流变仪模拟打印温度变化情况进行凝胶强度测试，即在37℃样品装载完成后，降低温度至15℃保持10分钟，然后升温至37℃，保持30分钟，读取测试凝胶的储能模量数值即为凝胶强度。检测结果见表1。

表1各实施例和对比例样品的测试结果

注：+表示可打印成型。

本发明的3D打印墨水中，明胶起到初步的固化成型作用，明胶含量过低时，体系无法固化，含量过高时则体系粘度过高，影响打印精度。具体地，对比实施例1、实施例5、对比例1、对比例2可知，明胶的含量直接影响到能否打印，明胶含量为5wt％时，体系无法固化，无法打印成型。对比明胶含量为10wt％的实施例，含15wt％明胶的体系粘度增加，影响打印精度。同时对比例2为常规使用明胶进行生物打印的方式，其粘度为38.6mPa·S，远大于实施例1的10.1mPa·S，因此在打印精度方面，本发明具有明显优势。

本发明的3D打印墨水中，纳米甲壳素为机械性能增强剂。对比实施例1、实施例4，二者区别为纳米甲壳素的含量，其预凝胶溶液的粘度类似，均可正常打印，但凝胶固化成型后实施例4的凝胶强度明显大于实施例1，这是因为添加刚性材料纳米甲壳素含量不同的原因。本发明制备的水凝胶的强度可通过调节纳米甲壳素含量进行调节。

本发明的3D打印墨水中，RHC-NHS为交联剂，其使用量需在一定范围内。对比实施例1、2、3及对比例3可见，当RHC-NHS含量在2wt％、4wt％、8wt％时体系均可正常打印成型，当其含量为12wt％时，由于交联反应的进度大大加速，预凝胶溶液装于料筒内未及打印即已经固化，无法进行下一步。

图3为采用本发明方法打印形成的重组胶原蛋白水凝胶3D打印支架经冷冻干燥后的SEM图，看出支架的成型效果好，有明显三维孔隙，支架内表面积增大，有利于细胞的黏附和向支架内部的生长。

Claims

1.重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水，其特征在于，由以下成分组成：明胶10 wt%~15wt%，RHC-NHS 2 wt%~8 wt%，纳米甲壳素1 wt%~3 wt%，余量为水；所述的RHC-NHS为经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化的重组胶原蛋白，通过以下步骤制备：将10 wt%重组胶原蛋白溶液、67 wt% 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和25 wt%N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合，边搅拌边在37℃下反应，反应结束后，将反应物冷冻，沉淀于-20℃乙醇中，经-20℃乙醇充分洗涤后，真空干燥得到RHC-NHS；所述重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生。

2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水，其特征在于，由以下成分组成：明胶10 wt%~15 wt%，RHC-NHS 4 wt %~8 wt%，纳米甲壳素1 wt%~3 wt%，余量为水。

3.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水，其特征在于，所述的纳米甲壳素通过以下步骤制备：将碱化提纯过的甲壳素分散于HCl溶液中，搅拌煮沸回流，冷却后多次离心清洗，透析至溶液 pH呈中性，冷冻干燥得到纳米甲壳素。

4.根据权利要求1至3任一所述的重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水在3D打印生物材料中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的生物材料为组织工程支架、药物递送载体、人工组织或人工器官。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体应用方法为：直接以重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水为原料，或者在重组胶原蛋白水凝胶3D打印墨水中加入功能材料混合均匀，设置打印承接板温度为10~20℃，进行3D打印。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的功能材料为细胞、生长因子或药物。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，打印在10分钟内完成；打印完成后保持2-20分钟。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，打印完成后保持5-15分钟。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，打印完成后保持10分钟。

11.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，打印承接板温度为14~16℃。

12.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，打印承接板温度为15℃。