CN110743041A - 光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3d打印方法 - Google Patents

光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3d打印方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3D打印方法。该光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为0.1～50wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～50wt％，光引发剂的质量百分数为0.01～20wt％。本发明的光固化酶交联型生物墨水具有材料组分多样化，在甲基丙烯酸化明胶的紫外光交联基础上，增加纤维蛋白原的酶交联，构建含有生物活性细胞的双网络型水凝胶体系。应用该光固化酶交联型生物墨水打印而成的生物仿生结构具有高细胞相容性、高力学强度、高可降解性和无细胞毒性的特点，为生物活性细胞的增殖、分化和迁延提供良好的仿生环境，可应用于生物组织构建和修复等组织工程领域。

Description

光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3D打印方法
技术领域
本发明涉及生物3D打印技术领域，特别是涉及一种光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3D打印方法。
背景技术
生物3D打印技术作为生物仿生结构制备方法之一，具有精确控制生物仿生结构形态和细胞分布的优点。生物3D打印技术能够在三维空间中精确控制打印结构，可以根据人体独特的解剖和生理标准打印出复杂的仿生结构，为组织工程和临床修复组织或器官缺损的医疗领域提供了全新的技术手段。
现有的生物3D打印墨水组分单一，通常只包含一种水凝胶体系。交联方式亦较为单一，通常只采用化学交联，物理交联或者酶交联等方式的其中一种。这类生物墨水打印而成生物3D仿生结构呈单网络水凝胶体系，通常只具备一种特性，例如，由纤维蛋白原构成的水凝胶体系，虽然其具有优异的生物细胞相容性和细胞粘附性，但是其力学性能远不如由甲基丙烯酸化明胶构成的水凝胶体系。组分单一的生物3D打印墨水打印而成的生物3D仿生结构难以同时兼顾细胞相容性、力学强度和可降解性的要求。
因此，针对现有技术不足，提供一种光固化酶交联型生物墨水及其制备方法和3D打印方法以克服现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种光固化酶交联型生物墨水及其制备方法以解决现有技术中生物3D打印墨水组分单一，交联方式单一，打印成型的3D仿生结构难以同时兼顾细胞相容性、力学强度和可降解性的要求的问题。
为了实现上述发明的目的，本发明所采用的技术方案是：
一种光固化酶交联型生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
S1，预先制备纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液；
纤维蛋白原液的制备过程是将无菌纤维蛋白原粉末与1×～10×的细胞培养基溶液混合，于0℃～40℃条件下振荡溶解得到纤维蛋白原液，所得到的纤维蛋白原液在-80℃～37℃保存待用；
甲基丙烯酸酐化明胶液的制备是将甲基丙烯酸酐化明胶和光引发剂粉末共混，光引发剂与甲基丙烯酸酐化明胶的重量比为0.01～50:1，再加入1×～10×的细胞培养基溶液，在0℃～80℃、避光的条件下搅拌0.5～6h得到甲基丙烯酸酐化明胶液，所得到的甲基丙烯酸酐化明胶液避光在-80℃～37℃保存待用；
S2，将预先制备的纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液按照体积比1:1 至1:10的比例混合均匀得到生物墨水材料本体，按照1×105～5×107个/mL的量将生物活性细胞混入生物墨水材料本体中，余量为1×～10×的细胞培养基溶液，制备得到光固化酶交联型生物墨水；
优选的，上述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为 0.1～50wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～50wt％，光引发剂的质量百分数为0.01～20wt％。
优选的，上述光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。
优选的，上述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为 1～10wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～15wt％，光引发剂的质量百分数为0.1～1wt％。
优选的，上述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为 1～5wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为2.5～7.5wt％，光引发剂的质量百分数为0.1～0.2wt％。
优选的，上述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为 5wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为5wt％，光引发剂的质量百分数为0.2wt％。
本发明的第二个目的是提供一种光固化酶交联型生物墨水。该生物墨水通过上述方法制备得到，具有材料组分多样化，在甲基丙烯酸化明胶的紫外光交联基础上，增加纤维蛋白原的酶交联，构建含有生物活性细胞的双网络型水凝胶体系。应用该光固化酶交联型生物墨水打印而成的生物仿生结构具有高细胞相容性、高力学强度、高可降解性和无细胞毒性的特点，为生物活性细胞的增殖、分化和迁延提供良好的仿生环境。
本发明的第三个目的是提供一种应用光固化酶交联型生物墨水进行生物仿生结构的3D打印方法，包括如下步骤：
(1)将光固化酶交联型生物墨水装载入3D打印机的打印料仓内，设置料仓温度为0℃至45℃、喷头移动速度为0～100mm/s、挤出压力为0～25MPa、打印平台温度为0℃至45℃；
(2)根据所需数字模型进行打印，打印的同时进行紫外灯照射，并对打印结构进行光交联；所采用的紫外光的波长为500～315nm，光照强度为5～500 mw/cm2，照射时间为1～90s；
(3)在打印结构表面加入交联溶液，使得交联溶液完全浸没打印结构，放入孵箱培养10min至2h；
(4)将打印结构转移至完全培养基内，放置细胞培养箱内进行培养。
优选的，上述步骤(3)，在打印过程中，在每一层打印结构表面加入酶交联溶液，使得酶交联溶液均匀分布于打印结构中。
优选的，上述酶交联溶液由如下组分构成：当量浓度为0.1～400mM氯化钙溶液、当量浓度为1～100U/mL凝血酶溶液、余量为1×～10×的细胞培养基溶液。
优选的，上述酶交联溶液通过如下步骤制备：将当量浓度为100～400mM氯化钙溶液、当量浓度为1～100U/mL凝血酶溶液、余量为1×～10×的细胞培养基溶液共混，混合均匀后放置于-80℃～40℃保存。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
(1)本发明以纤维蛋白原和甲基丙烯酸酐化明胶为主要固相生物材料，以细胞培养基为液相材料，制备出一种交联方式多样化的生物墨水。
(2)本发明中纤维蛋白原在酶交联作用下形成的水凝胶体系具有高细胞粘附力，高细胞相容性的优点。甲基丙烯酸酐化明胶在光引发剂和紫外光照射作用下迅速进行化学交联形成的水凝胶，具有高力学强度高可降解性和无细胞毒性的优点。
(3)本发明的生物3D打印方法，打印结构在打印甲基丙烯酸化明胶的紫外光交联水凝胶的基础上，逐层增加纤维蛋白原的酶交联水凝胶，形成均匀、紧密分布的双网络型水凝胶体系。最终打印成型的仿生结构同时具有两种水凝胶体系的优点，即高细胞相容性、高力学强度、高可降解性和无细胞毒性，为生物活性细胞的增殖、分化和迁延提供良好的仿生环境，为组织工程和临床修复组织或器官缺损的医疗领域提供了全新的技术手段。
附图说明
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1是应用本发明的光固化酶交联型生物墨水进行生物仿生结构3D打印的过程示意图。
图2是生物活性细胞在本发明实施例5的光固化酶交联型生物墨水打印结构中培养2天后的活死染色实验结果图(二维与三维图)，生物活性细胞的生长情况良好。
图3是生物活性细胞在本发明实施例5的光固化酶交联型生物墨水打印结构中培养7天后，进行F-actin染色实验结果图(二维与三维图)，生物活性细胞的生长情况良好。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。本发明具体实施方式是通过制备和应用两方面进行实施的。
实施例1
一种光固化酶交联型生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
S1，预先制备纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液；
纤维蛋白原液的制备过程是将无菌纤维蛋白原粉末与1×～10×的细胞培养基溶液混合，于0℃～40℃条件下振荡溶解得到纤维蛋白原液，所得到的纤维蛋白原液在-80℃～37℃保存待用；
甲基丙烯酸酐化明胶液的制备是将甲基丙烯酸酐化明胶和光引发剂粉末共混，光引发剂与甲基丙烯酸酐化明胶的重量比为0.01～50:1，再加入1×～10×的细胞培养基溶液，在0℃～80℃、避光的条件下搅拌0.5～6h得到甲基丙烯酸酐化明胶液，所得到的甲基丙烯酸酐化明胶液避光在-80℃～37℃保存待用；
S2，将预先制备的纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液按照体积比1:1 至1:10的比例混合均匀得到生物墨水材料本体，按照1×105～5×107个/mL的量将生物活性细胞混入生物墨水材料本体中，余量为1×～10×的细胞培养基溶液，制备得到光固化酶交联型生物墨水。
该光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为0.1～50wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～50wt％，光引发剂的质量百分数为 0.01～20wt％。
需要说明的是，纤维蛋白原是一种内源性的、具有生物相容性的糖蛋白，能够为细胞表面受体、生长因子和细胞外基质蛋白获得许多结合位点。由于纤维蛋白高水平的生物活性，纤维蛋白结构已被广泛用于伤口修复应用。例如，纤维蛋白在临床上已被用作纤维蛋白胶和伤口敷料中的伤口密封剂。除此之外，纤维蛋白原还可以通过构建水凝胶的形式，将细胞包封，促进细胞的浸润与粘附。
需要说明的是，甲基丙烯酸酐明胶水凝胶与天然细胞外基质的特性非常相似，具有细胞黏附位点、基质金属蛋白酶反应肽基序列和可交联特性，表现出良好的组织亲和性，具有可调节的物理化学性质、一定的黏合性及可降解性，使其成为理想的细胞支架，允许各类细胞在其表面增殖、分化和迁延。
该光固化酶交联型生物墨水具有材料组分多样化，在甲基丙烯酸化明胶的紫外光交联基础上，增加纤维蛋白原的酶交联，构建含有生物活性细胞的双网络型水凝胶体系。应用该光固化酶交联型生物墨水打印而成的生物仿生结构具有高细胞相容性、高力学强度、高可降解性和无细胞毒性的特点，为生物活性细胞的增殖、分化和迁延提供良好的仿生环境。
实施例2
一种应用光固化酶交联型生物墨水进行生物仿生结构的3D打印方法，包括如下步骤：
(1)将光固化酶交联型生物墨水装载入3D打印机的打印料仓内，设置料仓温度为0℃至45℃、喷头移动速度为0～100mm/s、挤出压力为0～25MPa、打印平台温度为0℃至45℃；
(2)根据所需数字模型进行打印，打印的同时进行紫外灯照射，并对打印结构进行光交联；所采用的紫外光的波长为500～315nm，光照强度为5～500 mw/cm2，照射时间为1～90s；(3)在打印结构表面加入交联溶液，使得交联溶液完全浸没打印结构，放入孵箱培养10min至2h；
(4)将打印结构转移至完全培养基内，放置细胞培养箱内进行培养。
需要说明的是，上述步骤(3)具体是，在每一层打印结构表面加入酶交联溶液，使得酶交联溶液均匀分布于打印结构中。这一操作的目的是，使光固化的甲基丙烯酸化明胶水凝胶逐层与由酶交联的纤维蛋白原水凝胶叠加，形成分布均匀的双网络水凝胶结构，让整个3D打印仿生结构同时具备两种水凝胶网络的优点。
上述酶交联溶液由如下组分构成：当量浓度为0.1～400mM氯化钙溶液、当量浓度为1～100U/mL凝血酶溶液、余量为1×～10×的细胞培养基溶液。
上述酶交联溶液通过如下步骤制备：将当量浓度为100～400mM氯化钙溶液、当量浓度为1～100U/mL凝血酶溶液、余量为1×～10×的细胞培养基溶液共混，混合均匀后放置于-80℃～40℃保存。
该生物仿生结构的3D打印方法，打印结构在打印甲基丙烯酸化明胶的紫外光交联水凝胶的基础上，逐层增加纤维蛋白原的酶交联水凝胶，形成均匀、紧密分布的双网络型水凝胶体系。最终打印成型的仿生结构同时具有两种水凝胶体系的优点，即高细胞相容性、高力学强度、高可降解性和无细胞毒性，为生物活性细胞的增殖、分化和迁延提供良好的仿生环境，为组织工程和临床修复组织或器官缺损的医疗领域提供了全新的技术手段。
实施例3
本实施例所述的一种光固化酶交联型生物墨水，其组成与制备方法与实施例1相同，不同之处在于：该光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为1～10wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～15wt％，光引发剂的质量百分数为0.1～1wt％。
由实验可得，减少生物墨水配方中的固体材料用量，不影响双网络水凝胶体系的高细胞相容性、高力学强度、高可降解性和无细胞毒性的特性，生物活性细胞在其中的增殖、分化情况良好。
实施例4
本实施例所述的一种光固化酶交联型生物墨水，其组成与制备方法与实施例1相同，不同之处在于：该光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为0.1wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1wt％，光引发剂的质量百分数为0.1wt％。
由实验可得，该配比是纤维蛋白原-甲基丙烯酸化明胶双网络水凝胶体系成型的最低配比，低于此配比则无法打印出成型的固体结构。生物活性细胞在该配比的生物墨水打印结构中仍能增殖、分化。在组织修复过程中，植入最少量的外来物质，可以减少组织感染的风险。
实施例5
本实施例所述的一种光固化酶交联型生物墨水，其组成与制备方法与实施例1相同，不同之处在于：该光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为5wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为5wt％，光引发剂的质量百分数为0.2wt％。
生物活性细胞在本实施例的光固化酶交联型生物墨水打印结构中培养2天后的活死染色实验结果，如图2所示，生物活性细胞的生长情况良好。
生物活性细胞在本实施例的光固化酶交联型生物墨水打印结构中培养7天后的F-actin染色实验结果，如图3所示，生物活性细胞的生长情况良好。
由实验可得，按本实施例制备的光固化酶交联型生物墨水，生物活性细胞在其中的增殖、分化情况是实施例1所列配比范围里的最优情况。
实施例6
本实施例所述的一种生物仿生结构的3D打印方法，其步骤与实施例2相同，不同之处在于：
步骤(1)中，设置喷头移动速度为10～50mm/s、挤出压力为0.5～5MPa；
步骤(2)中，所采用的紫外光的波长为450～330nm，光照强度为5～100 mw/cm2；照射时间为1～60s。
使用本实施例中步骤(1)的参数打印的生物仿生结构，结构力学强度大，有利于生物细胞粘附，并能引导细胞按照目标结构生长。使用本实施例中步骤 (2)的参数打印的生物仿生结构，既能兼顾甲基丙烯酸化明胶光照固化的反应要求，又能减少对生物墨水中的生物活细胞的损伤，提高生物仿生结构中细胞的存活率。
实施例7
本实施例所述的一种生物仿生结构的3D打印方法，其步骤与实施例2相同，不同之处在于：
步骤(1)中，设置喷头移动速度为25mm/s、挤出压力为1.2MPa；
步骤(2)中，所采用的紫外光的波长为405nm，光照强度为100mw/cm2；照射时间为10s。
由实验可得，使用本实施例的3D打印参数打印而成的生物仿生结构，其力学性能、生物相容性，以及细胞存活最高，是实施例2所列参数范围里的最优情况。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，预先制备纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液；
纤维蛋白原液的制备过程是将无菌纤维蛋白原粉末与1×～10×的细胞培养基溶液混合，于0℃～40℃条件下振荡溶解得到纤维蛋白原液，所得到的纤维蛋白原液在-80℃～37℃保存待用；
甲基丙烯酸酐化明胶液的制备是将甲基丙烯酸酐化明胶和光引发剂粉末共混，光引发剂与甲基丙烯酸酐化明胶的重量比为0.01～50:1，再加入1×～10×的细胞培养基溶液，在0℃～80℃、避光的条件下搅拌0.5～6h得到甲基丙烯酸酐化明胶液，所得到的甲基丙烯酸酐化明胶液避光在-80℃～37℃保存待用；
S2，将预先制备的纤维蛋白原液和甲基丙烯酸酐化明胶液按照体积比1:1至1:10的比例混合均匀得到生物墨水材料本体，按照1×105～5×107个/mL的量将生物活性细胞混入生物墨水材料本体中，余量为1×～10×的细胞培养基溶液，制备得到光固化酶交联型生物墨水；
在光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为0.1～50wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～50wt％，光引发剂的质量百分数为0.01～20wt％。
2.根据权利要求1所述的光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。
3.根据权利要求1或2所述的光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，所述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为1～10wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为0.1～15wt％，光引发剂的质量百分数为0.1～1wt％。
4.根据权利要求3所述的光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，所述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为1～5wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为2.5～7.5wt％，光引发剂的质量百分数为0.1～0.2wt％。
5.根据权利要求3所述的光固化酶交联型生物墨水的制备方法，其特征在于，所述光固化酶交联型生物墨水中，纤维蛋白原的质量百分数为5wt％，甲基丙烯酸酐化明胶的质量百分数为5wt％，光引发剂的质量百分数为0.2wt％。
6.一种光固化酶交联型生物墨水，其特征在于，通过如权利要求1至5任意一项所述的方法制备而成。
7.根据权利要求1至5任意一项所制备的光固化酶交联型生物墨水进行生物仿生结构的3D打印方法，其特征在于，通过如下步骤进行：
(1)将光固化酶交联型生物墨水装载入3D打印机的打印料仓内，设置料仓温度为0℃至45℃、喷头移动速度为0～100mm/s、挤出压力为0～25MPa、打印平台温度为0℃至45℃；
(2)根据所需数字模型进行打印，打印的同时进行紫外灯照射，并对打印结构进行光交联；所采用的紫外光的波长为500～315nm，光照强度为5～500mw/cm2，照射时间为1～90s；
(3)在打印结构表面加入交联溶液，使得交联溶液完全浸没打印结构，放入孵箱培养10min至2h；
(4)将打印结构转移至完全培养基内，放置细胞培养箱内进行培养。
8.根据权利要求7所述的生物仿生结构的3D打印方法，其特征在于，步骤(3)具体是，在打印过程中，在每一层打印结构表面加入酶交联溶液，使得酶交联溶液均匀分布于打印结构中。
9.根据权利要求7所述的生物仿生结构的3D打印方法，其特征在于，酶交联溶液由如下组分构成：当量浓度为0.1～400mM氯化钙溶液、当量浓度为1～100U/mL凝血酶溶液、余量为1×～10×的细胞培养基溶液。
10.根据权利要求9所述的生物仿生结构的3D打印方法，其特征在于，所述酶交联溶液通过如下步骤制备：将当量浓度为100～400mM氯化钙溶液、当量浓度为1～100U/mL凝血酶溶液、余量为1×～10×的细胞培养基溶液共混，混合均匀后放置于-80℃～40℃保存。
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