CN111662873B - 一种适于太空环境的生物3d打印方法 - Google Patents

一种适于太空环境的生物3d打印方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例涉及一种适于太空环境的生物3D打印方法，包括：在成形区域内放置辅助成形凝胶盒，所述辅助成形凝胶盒中盛放有触变性凝胶，所述触变性凝胶具有剪切变稀特性；在所述辅助成形凝胶盒的触变性凝胶内打印生物墨水，使生物墨水交联固化，形成3D生物模型。本发明实施例以触变性强的凝胶作为辅助成形材料，利用凝胶对生物墨水的约束力，克服失重环境对生物墨水打印的影响，而不改变生物墨水生物学性能。

Description

一种适于太空环境的生物3D打印方法
技术领域
本发明属于生物3D打印技术领域，具体涉及一种适于太空环境的生物3D打印方法。
背景技术
生物3D打印技术是指将生物单元(细胞/蛋白质/DNA等)和生物材料按仿生形态学、生物结构或生物体功能、以及细胞特定微环境等要求用“三维打印”的技术手段制造出具有个性化的体外三维结构模型或三维生物功能结构体。关于3D打印技术的科学研究、技术应用和产业化发展广泛应用于生物3D打印装备和生物墨水的研发及制造、高端医疗器械的制造、复杂组织工程支架制造、体外生物功能结构体的制造、生物/病理/药理模型和新药检测模型制造等领域。
随着21世纪的到来，人类探索太空的脚步在逐渐加速，但太空的环境不同于地球上，失重或强辐射都可能对宇航员的健康带来危害，对动植物的特性带来改变，因此，在太空进行各种生物学实验的意义重大。生物3D打印设备可以在太空环境中打印各种体外仿生的生物/病理/药理模型和新药检测模型制造等，并可随时修改实验参数和实验条件进行太空随时打印实验，提高了单次太空实验的成功性。
因太空失重环境的影响，传统的生物3D打印方法在太空中难以精准打印原设计的形状，会出现生物打印墨水粘接不牢，层层剥离或脱落等问题。现有的解决方法主要为提升墨水间的粘结力，具体方法包括使用磁性墨水和高粘性墨水。
其中，磁性墨水是指在生物墨水中加入磁性材料，使得打印后的生物墨水能依靠磁性的吸力聚集在仪器上，避免出现墨水粘接不牢的情况。但磁性物质并非人体原有物质，磁性物质的加入会带来生物学结果的改变，影响生物学实验的准确性。
高粘性墨水是指通过特定成分添加使得生物墨水具有很强的粘性，使得生物墨水自身的结合力很强。但是高粘性墨水粘度很大，很难打印，需要很大的喷射力才能喷射，而大喷射力会带来细胞的损伤。
发明内容
为了解决上述在太空中生物3D打印面临的材料选择和制造工艺中的技术问题，本发明实施例提出一种适于太空环境的生物3D打印方法，包括如下步骤：
在成形区域内放置辅助成形凝胶盒，所述辅助成形凝胶盒中盛放有触变性凝胶，所述触变性凝胶具有剪切变稀特性；
在所述辅助成形凝胶盒的触变性凝胶内打印生物墨水，使生物墨水交联固化，形成3D生物模型。
进一步，所述触变性凝胶包括普朗尼克F127和水。
进一步，所述方法还包括制备触变性凝胶，将一定质量的普朗尼克F127粉末溶解在去离子水中，在4～10℃条件下放置12～72小时至普朗尼克F127粉末完全溶解，以制得普朗尼克F127溶液，并在4～10℃条件下将普朗尼克F127溶液输送到辅助成形凝胶盒中，恢复辅助成形凝胶盒至20-37℃，所制得溶液变成凝胶态。
进一步，所述触变性凝胶中还可以包括增稠剂、顺滑剂、离子成分、酶成分和生长因子中的一种或多种组合。
进一步，所述触变性凝胶中还包括1％～3％质量体积比的羧甲基纤维素，以增强触变性凝胶的顺滑性和去除剪切力后的凝胶恢复能力，所述质量体积比是指常温下羧甲基纤维素的质量与所述触变性凝胶的总体积之比，单位为g/ml。
进一步，所述普朗尼克F127的质量体积比为20～50％，所述普朗尼克F127的质量体积比是指常温下普朗尼克F127的质量与所述触变性凝胶的总体积之比，单位为g/ml。
进一步，所述普朗尼克F127的质量体积比为30～40％。
进一步，所述生物墨水包括明胶-甲基丙烯酸
和生物细胞，其交联固化方式为光固化；或者，
所述触变性凝胶中包括普朗尼克F127和氯化钙，所述生物墨水包括明胶、海藻酸钠和生物细胞，在所述辅助成形凝胶盒的触变性凝胶内打印生物墨水后，触变性凝胶中的钙离子渗透到生物墨水中，与生物墨水中的海藻酸钠发生离子交联固化；或者，
所述触变性凝胶中包括普朗尼克F127、氯化钙和羧甲基纤维素，所述生物墨水包括明胶、海藻酸钠和生物细胞，在所述辅助成形凝胶盒的触变性凝胶内打印生物墨水后，触变性凝胶中的钙离子渗透到生物墨水中，与生物墨水中的海藻酸钠发生离子交联固化。
进一步，所述生物墨水中含有细胞，其中细胞密度为104个/mL～108个/mL。
进一步，所述方法还包括：从辅助成形凝胶盒的触变性凝胶中取出打印好的3D生物模型，使用4℃的生理盐水温和震荡的方式，清洗从辅助成形凝胶盒的触变性凝胶中取出的3D生物模型上的残余凝胶。
进一步，执行所述打印方法的生物3D打印设备包括打印喷头、成形平台和辅助成形凝胶盒，所述打印喷头可装载生物墨水；所述成形平台上安装辅助成形凝胶盒，所述成形平台与辅助成形凝胶盒的安装方式为可拆卸连接；所述的辅助成形凝胶盒上方开口；所述的打印喷头设置在安装有辅助成形凝胶盒的成形平台上方，能够将生物墨水打印到所述辅助成形凝胶盒中的凝胶内部。
本发明的有益效果：本发明实施例提出的适于太空环境的生物3D打印方法，以触变性强的凝胶(普朗尼克F127)作为辅助成形材料，使得多种常规生物墨水材料在所述触变性凝胶中成形，利用凝胶对生物墨水的约束力，克服失重环境对生物墨水打印的影响，而不改变生物墨水生物学性能，增加了太空环境下可打印生物墨水材料的范围。
附图说明
图1是本发明实施例提出的适于太空环境的生物3D打印方法的流程图；
图2是本发明实施例提出的适于太空环境的生物3D打印方法的打印设备的结构图；
图3是本发明实施例提出的适于太空环境的生物3D打印方法的打印喷头的结构图；
图4是本发明实施例提出的适于太空环境的生物3D打印方法所采用的辅助成形凝胶的反重力实验图；
图5是本发明实施例提出的适于太空环境的生物3D打印方法所采用的辅助成形凝胶的打印结构图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。但本领域技术人员知晓，本发明并不局限于附图和以下实施例。
如本文中所述，术语“包括”及其各种变体可以被理解为开放式术语，其意味着“包括但不限于”。术语“上”、“下”及其类似表述仅用于表示相对物体之间的位置关系。术语“第一”、“第二”及其类似表述仅用于表示不同的技术特征，并无实质含义。
根据本发明的一个方面，提供一种适于太空环境的生物3D打印方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤S1、在成形区域内放置辅助成形凝胶盒，所述辅助成形凝胶盒中盛放有触变性凝胶，所述触变性凝胶具有剪切变稀特性，即，在无剪切力的情况下，凝胶表现为不可流动且不易变形的胶态，在受剪切力的情况下，凝胶变为可流动的形态。
具体的，所述触变性凝胶包括普朗尼克F127和水，所述触变性凝胶还可以包括添加物，所述添加物的成分包括但不限于增稠剂、顺滑剂、离子成分、酶成分和生长因子中的一种或多种组合，以适应于所要打印的生物墨水。
所述触变性凝胶中普朗尼克F127的质量体积比为20～50％，优选为30～40％，更优选为35％，所述普朗尼克F127的质量体积比是指常温下普朗尼克F127的质量与所述触变性凝胶的总体积之比，单位为g/ml。
所述触变性凝胶的配置优选先配置好凝胶，再将其输送到辅助成形凝胶盒中。
所述的辅助成形凝胶盒形状为任意形状，优选为长方体或圆柱体。
步骤S2、在辅助成形凝胶盒的触变性凝胶内打印生物墨水，使生物墨水交联固化，形成3D生物模型。
具体的，根据计算机3D模型，在辅助成形凝胶盒内打印生物墨水，所述计算机3D模型可以为STL或图片格式。
所述生物墨水的交联固化方式，可以为光固化交联、离子交联、酶促交联、温度交联、材料自组装或细胞自组装的一种或多种组合。所述光固化交联通过特定波长及特定功率的光在打印过程中或打印后照射打印区域实现；所述离子交联通过在凝胶中添加特定的离子成分实现；所述酶促交联通过在凝胶中添加特定的酶成分实现；所述温度交联通过改变所述触变性凝胶温度实现；所述材料自组装通过生物墨水材料的自身分子结构改变来实现；所述细胞自组装通过细胞自身的生长、聚集和增殖来实现。
所述的生物墨水优选的包括有高分子材料，所述高分子材料可以为明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原蛋白、多糖、透明质酸、壳聚糖、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白中的一种或多种；更优选为明胶-甲基丙烯酸(GelMA)，因为明胶-甲基丙烯酸(GelMA)为低粘度生物墨水，生物活性非常友好，是在太空环境中进行光固化打印的优选材料。
所述的生物墨水可以含有细胞，其中细胞的密度为104个/mL～108个/mL，优选为105个/mL～107个/mL，更优选为106个/mL。
图2和图3中示出了实现本实施例方法的生物3D打印设备和喷头，
如图2所示，执行所述打印方法的生物3D打印设备包括打印喷头100、成形平台300和辅助成形凝胶盒200。所述打印喷头100可装载生物墨水；所述成形平台300上安装辅助成形凝胶盒200，所述成形平台300与辅助成形凝胶盒200的安装方式为可拆卸连接，连接方式包括磁吸和机械锁紧的一种或多种组合，优选为磁吸方式；所述的辅助成形凝胶盒200上方开口；所述的打印喷头100设置在安装有辅助成形凝胶盒200的成形平台300上方，能够将生物墨水打印到所述辅助成形凝胶盒200中的凝胶内部。
如图3所示，所述的打印喷头100包括固定件安装座10、固定件20和可驱动固定件安装座10上下运动的驱动部件。所述固定件安装座20固定连接在驱动部件上，所述固定件安装座10与所述固定件20可拆卸连接，所述驱动部件能够带动所述固定件安装座上下运动。所述固定件20具有夹持注射器推杆的夹持结构，固定件20跟随固定件安装座10上下运动时，能够带动注射器推杆30上下运动，所述注射器的前端安装有管状针40，所述的管状针的材料优选为不锈钢。
所述生物3D打印设备设置有用于驱动所述打印喷头100在X-Y二维平面上运动的第一驱动机构和用于驱动成形平台300沿垂直方向Z运动的的第二驱动机构；
所述生物3D打印设备在打印过程中，所述触变性凝胶在静止时能够支持生物结构体保持稳定，在所述打印喷头快速移动时，所述管状针的快速移动对凝胶产生剪切力，使得凝胶能够快速变稀以容纳3D打印的生物结构体，并且，在打印喷头移动过后能够快速恢复静止，作为生物3D打印的支持材料。
步骤S3、从辅助成形凝胶盒的触变性凝胶中取出打印好的3D生物模型。
具体的，所述取出方法可以为用机械装置取出，优选为用勺状结构物将打印好的3D生物模型捞出，并清洗3D生物模型上的残余凝胶，例如使用4℃的生理盐水温和震荡进行清洗。
此外，本发明实施例的方法还包括制备触变性凝胶，将一定质量的普朗尼克F127(Sigma，P2443)粉末溶解在去离子水中，在4～10℃条件(优选为4℃)下放置12～72小时至普朗尼克F127粉末完全溶解，以制得20～50％，优选为30～40％，更优选为35％质量体积比的普朗尼克F127溶液，并在4～10℃(优选为4℃)条件下将普朗尼克F127溶液输送到辅助成形凝胶盒中，恢复辅助成形凝胶盒至20-37℃，优选的恢复至25℃，所制得溶液变成凝胶态。并且，本发明实施例的方法在20-37℃的条件下进行，优选的为25℃，这样所述触变性凝胶的性能更好。
下面通过优选实施例对本发明作进一步说明，本领域技术人员能够理解，可以以各种形式实现本发明而不应被下述实施例所限制。相反，提供这些实施例仅是为了能够更透彻地理解本发明，并将本发明公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1三维体外肿瘤模型的太空打印
本实施例提出了一种三维体外肿瘤模型的太空打印方法，包括以下步骤：
·制备触变性凝胶
将一定质量的普朗尼克F127(Sigma，P2443)粉末溶解在去离子水中，4℃放置48小时至普朗尼克F127粉末完全溶解，制得35％质量体积比的普朗尼克F127溶液，并在4℃条件下将普朗尼克F127溶液输送到辅助成形凝胶盒中，恢复辅助成形凝胶盒至25℃，所制得溶液变成凝胶态。
使用普朗尼克F127做为触变性凝胶的主要成分，在上述特定条件下制成的触变性凝胶具有优良的触变特性，图4中示出了所述触变性凝胶在重力环境中即使倒置也不会流动的效果。
·制备生物墨水
将一定质量的明胶-甲基丙烯酸(GelMA)粉末溶解在生理盐水中，70℃加热3小时至GelMA粉末完全溶解后，制成0.1g/ml GelMA溶液。再添加0.005g/ml的光引发剂(I2959，2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，106797-53-9，英力，中国)粉末溶于0.1g/mlGelMA溶液中，制成GelMA生物墨水。
将待打印的肺肿瘤细胞(A549)消化、计数、离心，用GelMA生物墨水重新吹打悬浮后得到细胞密度为4*106个/ml的含细胞GelMA生物墨水。
·打印及交联
将含有所制备凝胶的辅助成形凝胶盒安装在所采用生物3D打印设备的成形底板上，并用磁吸机构夹紧固定。
利用生物3D打印装置，以经上述步骤获得的生物墨水为原料，基于预设的计算机模型和打印路径，以5mm/s的喷头移动及1.5mm3/s的喷射速度，在凝胶中进行生物3D打印。打印完毕后，用10mW/cm2的365nm波长紫外光，照射全部辅助成形凝胶盒所在区域30秒，使得生物墨水可实现光固化交联。用小勺捞出交联好的三维体外肿瘤模型，放入装有4℃生理盐水的小盒中温和震荡清洗。待洗去残余凝胶后，转移三维体外肿瘤模型至培养装置中按预先设计的培养条件进行培养和开展生物学检测实验。图5中示出了所述触变性凝胶中打印的三维体外肿瘤模型实物图。
实施例2采用另一种生物墨水的三维体外肿瘤模型的太空打印
本实施例与实施例1相比，区别在于，本实施例的凝胶和生物墨水的组成成分不同。具体的，本实施例提出的一种三维体外肿瘤模型的太空打印方法包括：
·制备触变性凝胶
将一定质量的普朗尼克F127(Sigma，P2443)粉末和氯化钙粉末溶解在去离子水中，10℃放置12小时至普朗尼克F127粉末完全溶解，制得含30％质量体积比的普朗尼克F127及1％质量体积比的氯化钙复合成分的溶液，并在10℃将所得复合成分溶液输送到辅助成形凝胶盒中，恢复辅助成形凝胶盒至20℃，所制得溶液变成凝胶态。
·制备生物墨水
将一定质量的明胶粉末(Sigma,G1890)和海藻酸钠粉末(Sigma,A0682)溶解在生理盐水中，70℃震荡加热3小时至明胶和海藻酸钠粉末完全溶解后，制成含有0.1g/ml明胶和0.01g/mL海藻酸钠复合成分的生物墨水。
将待打印的肺肿瘤细胞(A549)消化、计数、离心，用上述方法所得的生物墨水重新吹打悬浮后得到4*106个/ml的含细胞生物墨水。
·打印及交联
将含有所制备凝胶的辅助成形凝胶盒安装在所采用生物3D打印设备的成形底板上，并用磁吸机构夹紧固定。
利用生物3D打印装置，以经上述步骤获得的生物墨水为原料，基于预设的计算机模型和打印路径，以5mm/s的喷头移动及1.5mm3/s的喷射速度，在凝胶中进行生物3D打印。打印完毕后，因凝胶中的钙离子成分会渗透到生物墨水中，使得生物墨水中的海藻酸钠成分发生离子交联固化。用小勺捞出交联好的三维体外肿瘤模型，放入装有4℃生理盐水的小盒中温和震荡清洗。待洗去残余凝胶后，转移三维体外肿瘤模型至培养装置中按预先设计的培养条件进行培养和开展生物学检测实验。
实施例3采用另一种辅助成形凝胶的三维体外肿瘤模型的太空打印
本实施例与实施例1相比，区别在于，本实施例的凝胶和生物墨水的组成成分不同。具体的，本实施例提出的一种三维体外肿瘤模型的太空打印方法包括：
·制备触变性凝胶
将一定质量的普朗尼克F127(Sigma，P2443)粉末，氯化钙粉末和羧甲基纤维素(Aladdin，取代度1.2)溶解在去离子水中，6℃放置60小时至普朗尼克F127粉末完全溶解，制得含40％质量体积比的普朗尼克F127，1％质量体积比的氯化钙及2％质量体积比的羧甲基纤维素复合成分的溶液，并在6℃将所得复合成分溶液输送到辅助成形凝胶盒中，恢复辅助成形凝胶盒至30℃，所制得溶液变成凝胶态。其中羧甲基纤维素可以增强凝胶的顺滑性和去除剪切力后的凝胶恢复能力，羧甲基纤维素的质量体积比的优选为1％～3％。
·制备生物墨水
将一定质量的明胶粉末(Sigma,G1890)和海藻酸钠粉末(Sigma,A0682)溶解在生理盐水中，70℃震荡加热3小时至明胶和海藻酸钠粉末完全溶解后，制成含有0.1g/ml明胶和0.01g/mL海藻酸钠复合成分的生物墨水。
将待打印的肺肿瘤细胞(A549)消化、计数、离心，用上述方法所得的生物墨水重新吹打悬浮后得到4*106个/ml的含细胞生物墨水。
·打印及交联
将含有所制备凝胶的辅助成形凝胶盒安装在所采用生物3D打印设备的成形底板上，并用磁吸机构夹紧固定。
利用生物3D打印装置，以经上述步骤获得的生物墨水为原料，基于预设的计算机模型和打印路径，以5mm/s的喷头移动及1.5mm3/s的喷射速度，在凝胶中进行生物3D打印。打印完毕后，因凝胶中的钙离子成分会渗透到生物墨水中，使得生物墨水中的海藻酸钠成分发生离子交联固化。用小勺捞出交联好的三维体外肿瘤模型，放入装有4℃生理盐水的小盒中温和震荡清洗。待洗去残余凝胶后，转移三维体外肿瘤模型至培养装置中按预先设计的培养条件进行培养和开展生物学检测实验。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种适于太空环境的生物3D打印方法，其特征在于，包括如下步骤：
在成形区域内放置辅助成形凝胶盒，所述辅助成形凝胶盒中盛放有触变性凝胶，所述触变性凝胶具有剪切变稀特性；
在所述辅助成形凝胶盒的触变性凝胶内打印生物墨水，使生物墨水交联固化，形成3D生物模型，
其中，所述触变性凝胶包括普朗尼克F127和水，所述普朗尼克F127的质量体积比为20～50%，所述普朗尼克F127的质量体积比是指常温下普朗尼克F127的质量与所述触变性凝胶的总体积之比，单位为g/ml，制备触变性凝胶的步骤包括：将一定质量的普朗尼克F127粉末溶解在去离子水中，在4～10℃条件下放置12～72小时至普朗尼克F127粉末完全溶解，以制得普朗尼克F127溶液，并在4～10℃条件下将普朗尼克F127溶液输送到辅助成形凝胶盒中，恢复辅助成形凝胶盒至20-37℃，所制得溶液变成凝胶态。
2.如权利要求1所述的生物3D打印方法，其特征在于，所述触变性凝胶中还包括增稠剂、顺滑剂、离子成分、酶成分和生长因子中的一种或多种组合。
3.如权利要求2所述的生物3D打印方法，其特征在于，所述触变性凝胶中还包括1%～3%质量体积比的羧甲基纤维素，以增强触变性凝胶的顺滑性和去除剪切力后的凝胶恢复能力，所述质量体积比是指常温下羧甲基纤维素的质量与所述触变性凝胶的总体积之比，单位为g/ml。
4.如权利要求1所述的生物3D打印方法，其特征在于，所述普朗尼克F127的质量体积比为30～40%。
5.如权利要求1所述的生物3D打印方法，其特征在于，所述生物墨水包括明胶-甲基丙烯酸和生物细胞，其交联固化方式为光固化；或者，
所述触变性凝胶中包括普朗尼克F127和氯化钙，所述生物墨水包括明胶、海藻酸钠和生物细胞，在所述辅助成形凝胶盒的触变性凝胶内打印生物墨水后，触变性凝胶中的钙离子渗透到生物墨水中，与生物墨水中的海藻酸钠发生离子交联固化；或者，
所述触变性凝胶中包括普朗尼克F127、氯化钙和羧甲基纤维素，所述生物墨水包括明胶、海藻酸钠和生物细胞，在所述辅助成形凝胶盒的触变性凝胶内打印生物墨水后，触变性凝胶中的钙离子渗透到生物墨水中，与生物墨水中的海藻酸钠发生离子交联固化。
6.如权利要求1或5所述的生物3D打印方法，其特征在于，所述生物墨水中含有细胞，其中细胞密度为104个/mL～108个/mL。
7.如权利要求1所述的生物3D打印方法，其特征在于，所述方法还包括：从辅助成形凝胶盒的触变性凝胶中取出打印好的3D生物模型，清洗3D生物模型上的残余凝胶。
8.如权利要求1所述的生物3D打印方法，其特征在于，执行所述打印方法的生物3D打印设备包括打印喷头（100）、成形平台（300）和辅助成形凝胶盒（200），所述打印喷头（100）装载生物墨水；所述成形平台（300）上安装辅助成形凝胶盒（200），所述成形平台（300）与辅助成形凝胶盒（200）的安装方式为可拆卸连接；所述的辅助成形凝胶盒（200）上方开口；所述的打印喷头（100）设置在安装有辅助成形凝胶盒（200）的成形平台（300）上方，能够将生物墨水打印到所述辅助成形凝胶盒（200）中的凝胶内部。
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