CN114366855B - 一种复合仿生体表组织及其一体化构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合仿生体表组织及其一体化构建方法，包括以下具体步骤：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的辅助剂一并混匀，获得软骨膜生物墨水；在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的辅助剂二并混匀，获得软骨生物墨水；将种子细胞加入软骨膜生物墨水中形成混合溶液一，同时将适量的种子细胞加入软骨生物墨水中形成混合溶液二；利用混合溶液一和混合溶液二一体化构建复合仿生体表组织。本发明的有益效果是构建出一种具有双侧软骨膜、中间软骨组织的体表组织，模拟含软骨膜体表组织的结构和组成成分特点，利用不同的仿生支架材料和功能细胞，以通过结构和成分仿生，实现力学仿生，提高构建物力学强度，满足体表组织再造的临床应用需求。

Description

一种复合仿生体表组织及其一体化构建方法
技术领域
本发明涉及三维生物打印及组织器官修复重建技术领域，具体涉及一种复合仿生体表组织及其一体化构建方法。
背景技术
先天性小耳畸形是我国第二大颅面部先天性畸形，严重影响患儿的身心健康。目前最有效的治疗方法是基于自体肋软骨雕刻的耳廓再造术，手术难度大、风险大、术后并发症多。组织工程与再生医学技术的迅速发展为耳廓再造带来了新的策略。目前基于软骨组织工程技术已经利用聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)和软骨细胞成功实现了组织工程耳廓的首个国际临床突破。但是，长期随访发现再造耳廓存在三维结构逐渐模糊、萎缩、变形和塌陷等现象，长期临床效果未达预期。因此，组织工程耳廓的力学强度不足成为制约其临床推广应用的瓶颈。
宏观的生物力学特性往往与组织成分与微观结构密切相关。模拟耳软骨组织成分及微观结构特点，进行仿生构建，可能是解决力学难题的一个突破口。前期研究发现耳廓软骨存在多尺度的结构特点，大体上来看耳软骨分为三层，由双侧软骨膜以及中间软骨组织构成。组织学显示背侧软骨膜在表层有数层疏松纤维组织；中间层细胞与软骨膜平行，胶原纤维交叉成网状，与软骨组织部分结合更加紧密，可见散在分布的纤维组织锚定并生长入软骨组织中；腹侧软骨膜仅为少量几层纤维组织。软骨膜不但为软骨组织提供营养和保护，在软骨的力学性能中也发挥重要作用。软骨膜能够提高软骨的抗弯强度和弹性模量，剥掉软骨膜，耳软骨很容易变形、断裂。因此，软骨特异性基质的成分和结构特点及软骨膜的存在共同赋予耳软骨良好的弹性和力学强度。
近年来，3D生物打印技术的发展解决了多细胞和多材料联合构建的难题，为组织器官的仿生构建提供了技术支持。3D生物打印可以将适合的细胞与凝胶材料混合成“生物墨水”，在组织或器官的三维模型指导下，定位放置，进行可控有序组装，制作具有生命功能的体外仿生三维生物结构体，用于人体组织器官的替代修复。3D生物打印因其个性化、精确性、智能化、标准化等组织构建的显著优势，为一体化构建含软骨膜的耳廓组织提供了技术支持，这可能是解决力学难题的一个突破口。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种复合仿生体表组织及其一体化构建方法，旨在解决现有技术中的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种复合仿生体表组织的一体化构建方法，包括以下具体步骤：
S1：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的辅助剂一并混匀，获得辅助剂一质量百分数为10-50％的软骨膜生物墨水；
S2：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的辅助剂二并混匀，获得辅助剂二质量百分数为10-50％的软骨生物墨水；
S3：将适量的种子细胞加入所述S1得到的软骨膜生物墨水中形成种子细胞浓度为(1～50)×106/mL的混合溶液一，同时将适量的种子细胞加入所述S2得到的软骨生物墨水中形成种子细胞浓度为(1～50)×106/mL的混合溶液二；
S4：利用所述S3得到的混合溶液一和混合溶液二一体化构建复合仿生体表组织。
本发明的有益效果是：本发明构建出一种具有双侧软骨膜、中间软骨组织的体表组织，模拟含软骨膜体表组织的结构和组成成分特点，利用不同的仿生支架材料和功能细胞，以通过结构和成分仿生，实现力学仿生，提高构建物力学强度，满足体表组织再造的临床应用需求。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述S1之前还包括S0：对软骨组织进行预处理，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶。
采用上述进一步方案的有益效果是制备工艺简单，为软骨膜和软骨生物墨水提供仿生原材料软骨脱细胞基质光敏凝胶。
进一步，所述S0中的软骨组织为耳软骨、关节软骨、肋软骨、肩胛软骨及半月板中的一种或多种。
采用上述进一步方案的有益效果是获取方便，有利于仿生再造体表组织的制备。
需要说明的是，上述软骨组织通常采用的是猪的软骨组织，可在市场上购买到，可实现工业化生产。
进一步，所述S0包括以下具体步骤：
S01：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
S02：称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数为0.1～10％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以0.1～1mL/min的速度加入甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为0.1～1％的混合溶液；
加入浓度为1～10mol/L的氢氧化钠，使得上述混合溶液维持pH值在8～10之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应8-12小时；
反应结束后，用浓度为1～10mol/L的盐酸中和至pH为7，然后将中和后的溶液装在透析袋内在蒸馏水中充分透析后7天以上后冷冻干燥，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶。
采用上述进一步方案的有益效果是软骨组织致密，将软骨组织彻底粉碎后再行脱细胞和酶消化处理，可以彻底脱干净细胞，去除免疫原性；经甲基丙烯酸酐修饰后的软骨脱细胞基质具有快速的光固化性能，具备可打印性；软骨脱细胞基质作为天然可降解材料，生物相容性好，免疫原性低，更重要的是，其含有的软骨基质成分可以提供软骨再生微环境，促进软骨细胞基质分泌和软骨形成。
进一步，所述S01中的脱细胞处理为低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理中的一种或多种组合。
采用上述进一步方案的有益效果是工艺简单，操作简便，省时省力。
进一步，所述S4包括以下具体步骤：
S41：构建人体体表组织形态的三维数字模型；
S42：基于上述三维数字模型，先利用3D生物打印机将所述S3得到的混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的一侧软骨膜层，然后利用3D生物打印机在上述软骨膜层上将所述S3得到的混合溶液二打印成相互连接的蜂窝状的软骨层，最后利用3D生物打印机在上述软骨层上将混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的另一侧软骨膜层，以一体化构建仿生体表组织。
采用上述进一步方案的有益效果是软骨膜的平行排列图案仿生软骨膜中的胶原平行排列方式，可以提高组织的抗拉强度；软骨层的蜂窝状打印图案仿生软骨基质中纤维的蜂窝网状结构，提高组织的整体性和稳定性；同时，整合3D生物打印技术，分别打印软骨膜生物墨水和软骨生物墨水可实现细胞和材料的精准空间分布，既解决了形态控制的问题，又保证了细胞和材料的定向分布，可以实现三明治状的含软骨膜体表组织的一体化仿生构建；同时还可以添加各类生物活性因子，为进一步的梯度构造或定向差异排列的调控功能提供了可能。
进一步，所述S1中的辅助剂一为甲基丙烯酸明胶、甲基丙烯酸透明质酸、甲基丙烯酸海藻酸钠、甲基丙烯酸丝素蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖、甲基丙烯酸硫酸软骨素及甲基丙烯酸弹性蛋白中的一种或多种组合。
采用上述进一步方案的有益效果是单一的软骨脱细胞基质水凝胶成型稳定性较差，辅以甲基丙烯酸明胶等平衡可打印性和物理特性以保证结构稳定性，同时还可以补充脱细胞过程中损失的部分胶原成分。
进一步，所述S2中的辅助剂二为甲基丙烯酸明胶、甲基丙烯酸透明质酸、甲基丙烯酸海藻酸钠、甲基丙烯酸丝素蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖、甲基丙烯酸硫酸软骨素及甲基丙烯酸弹性蛋白中的一种或多种组合。
采用上述进一步方案的有益效果是单一的软骨脱细胞基质水凝胶成型稳定性较差，辅以甲基丙烯酸明胶等平衡可打印性和物理特性以保证结构稳定性，同时还可以补充脱细胞过程中损失的部分胶原成分。
进一步，所述S3中的种子细胞为耳廓软骨细胞、关节软骨细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞及诱导多能干细胞中一种或多种。
采用上述进一步方案的有益效果是获取方便，其可在生物墨水中生长，增殖和分泌细胞外基质，借助细胞梯度形成基质梯度，达到功能细胞的仿生，有利于后续再造体表组织的制备。
本发明还涉及一种采用如上所述的一体化构建方法制备的复合仿生体表组织。
采用上述进一步方案的有益效果是本发明构建出一种具有双侧软骨膜、中间软骨组织的体表组织，模拟含软骨膜体表组织的结构和组成成分特点，利用不同的仿生支架材料和功能细胞，以通过结构和成分仿生，实现力学仿生，提高构建物力学强度，满足体表组织再造的临床应用需求。
附图说明
图1为本发明的制备流程图；
图2为本发明的操作流程图；
图3为本发明中3D生物打印机将软骨膜生物墨水打印成平行排列的线性或波浪形的一侧软骨膜层的示意图；
图4为本发明中3D生物打印机将软骨生物墨水打印成相互连接的蜂窝状的软骨层的示意图；
图5为本发明中3D生物打印机将软骨膜生物墨水打印成平行排列的线性或波浪形的另一侧软骨膜层的示意图；
图6为本发明中3D生物打印机一体化打印复合软骨膜和软骨构建仿生体表组织的示意图；
图7为本发明中3D生物打印机一体化构建的复合软骨膜和软骨的再生组织截面大体观的示意图；
图8为本发明中3D生物打印机一体化构建的复合软骨膜和软骨的再生组织截面组织学染色结果的示意图；
图9为本发明中3D生物打印机一体化构建的复合软骨膜和软骨的再生组织水平面大体观的示意图；
图10为本发明中的D生物打印机一体化构建的复合软骨膜和软骨的再生组织软骨膜层水平面组织学染色结果的示意图；
图11为本发明中3D生物打印机一体化构建的复合软骨膜和软骨的再生组织软骨层水平面组织学染色结果的示意图；
图12为本发明中3D生物打印机一体化构建的复合软骨膜和软骨的人体耳廓构建物的示意图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
如图1至图12所示，本实施例提供一种复合仿生体表组织的一体化构建方法，包括以下具体步骤：
S1：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的辅助剂一并混匀，获得辅助剂一质量百分数为10-50％的软骨膜生物墨水；
S2：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的辅助剂二并混匀，获得辅助剂二质量百分数为10-50％的软骨生物墨水；
S3：将适量的种子细胞加入所述S1得到的软骨膜生物墨水中形成种子细胞浓度为(1～50)×106/mL的混合溶液一，同时将适量的种子细胞加入所述S2得到的软骨生物墨水中形成种子细胞浓度为(1～50)×106/mL的混合溶液二；
S4：利用所述S3中得到的混合溶液一和混合溶液二一体化构建复合仿生体表组织。
本实施例构建出一种具有双侧软骨膜、中间软骨组织的体表组织，模拟含软骨膜体表组织的结构和组成成分特点，利用不同的仿生支架材料和功能细胞，以通过结构和成分仿生，实现力学仿生，提高构建物力学强度，满足体表组织再造的临床应用需求。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例中，所述S1之前还包括S0：对软骨组织进行预处理，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶。制备工艺简单，为软骨膜和软骨生物墨水提供仿生原材料软骨脱细胞基质光敏凝胶
实施例3
在实施例2的基础上，本实施例中，所述S0中的软骨组织为耳软骨、关节软骨、肋软骨、肩胛软骨及半月板中的一种或多种。获取方便，有利于仿生再造体表组织的制备。
需要说明的是，上述软骨组织通常采用的是猪的软骨组织，可在市场上购买到，可实现工业化生产。
实施例4
在实施例2至实施例3任一项的基础上，本实施例中，所述S0包括以下具体步骤：
S01：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
S02：称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数为0.1～10％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以0.1～1mL/min的速度加入甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为0.1～1％的混合溶液；
加入浓度为1～10mol/L的氢氧化钠，使得上述混合溶液维持pH值在8～10之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应8-12小时；
反应结束后，用浓度为1～10mol/L的盐酸中和至pH为7，然后将中和后的溶液装在透析袋(透析分子量为3500d)内在蒸馏水中充分透析后7天以上后冷冻干燥(真空冷冻干燥，-40°抽真空)，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶(粉末状)。
软骨组织致密，将软骨组织彻底粉碎后再行脱细胞和酶消化处理，可以彻底脱干净细胞，去除免疫原性；经甲基丙烯酸酐修饰后的软骨脱细胞基质具有快速的光固化性能，具备可打印性；软骨脱细胞基质作为天然可降解材料，生物相容性好，免疫原性低，更重要的是，其含有的软骨基质成分可以提供软骨再生微环境，促进软骨细胞基质分泌和软骨形成。
优选地，本实施例中，所述S01中的粉碎机包括低温冷冻研磨仪，采用低温冷冻研磨仪粉碎制成软骨粉末。
另外，所述S01中的粉碎机还包括组织破碎机，通过组织破碎机将上述软骨粉末进一步粉碎形成粒径在100-500um的软骨粉末。
实施例5
在实施例4的基础上，本实施例中，所述S01中的脱细胞处理为低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理中的一种或多种组合。工艺简单，操作简便，省时省力。
上述脱细胞处理的具体步骤为：软骨粉末依次经0.5％胰蛋白酶溶液37℃处理24小时、核酸酶溶液37℃处理4小时、10mM Tris-HCL于37℃处理24小时、1％Triton X-100于37℃处理24小时、去离子水充分洗涤3天。
优选地，本实施例中，所述S01中的酶消化处理为胶原酶处理、胃蛋白酶处理和透明质酸酶处理中的一种或多种组合消化方法。
上述酶消化处理制备水溶性的软骨脱细胞基质的具体步骤为：软骨脱细胞基质粉末经0.15％胶原酶或胃蛋白酶溶液于37℃处理24小时，3500D透析膜于去离子水中充分透析3天，真空冷冻干燥处理。
实施例6
在上述各实施例的基础上，本实施例中，所述S4包括以下具体步骤：
S41：构建人体体表组织形态的三维数字模型；
S42：基于上述三维数字模型，先利用3D生物打印机将所述S3得到的混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的一侧软骨膜层，然后利用3D生物打印机在上述软骨膜层上将所述S3得到的混合溶液二打印成相互连接的蜂窝状的软骨层，最后利用3D生物打印机在上述软骨层上将混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的另一侧软骨膜层，以一体化构建仿生体表组织。
软骨膜的平行排列图案仿生软骨膜中的胶原平行排列方式，可以提高组织的抗拉强度；软骨层的蜂窝状打印图案仿生软骨基质中纤维的蜂窝网状结构，提高组织的整体性和稳定性；同时，整合3D生物打印技术，分别打印软骨膜生物墨水和软骨生物墨水可实现细胞和材料的精准空间分布，既解决了形态控制的问题，又保证了细胞和材料的定向分布，可以实现含软骨膜体表组织的一体化仿生构建；同时还可以添加各类生物活性因子，为进一步的梯度构造或定向差异排列的调控功能提供了可能。
优选地，本实施例中，所述S41可应用CT(电子计算机断层扫描)、MRI(磁共振成像)或激光扫描、经计算机辅助设计构建人体体表组织形态的三维数字模型。
实施例7
在上述各实施例的基础上，本实施例中，所述S1中的辅助剂一为甲基丙烯酸明胶、甲基丙烯酸透明质酸、甲基丙烯酸海藻酸钠、甲基丙烯酸丝素蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖、甲基丙烯酸硫酸软骨素及甲基丙烯酸弹性蛋白中的一种或多种组合。上述单一的软骨脱细胞基质水凝胶成型稳定性较差，辅以甲基丙烯酸明胶等平衡可打印性和物理特性以保证结构稳定性，同时还可以补充脱细胞过程中损失的部分胶原成分。
实施例8
在上述各实施例的基础上，本实施例中，所述S1中的辅助剂一和/或所述S2中的辅助剂二为甲基丙烯酸明胶、甲基丙烯酸透明质酸、甲基丙烯酸海藻酸钠、甲基丙烯酸丝素蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖、甲基丙烯酸硫酸软骨素及甲基丙烯酸弹性蛋白中的一种或多种组合。
单一的软骨脱细胞基质水凝胶成型稳定性较差，辅以甲基丙烯酸明胶等平衡可打印性和物理特性以保证结构稳定性，同时还可以补充脱细胞过程中损失的部分胶原成分。
其中，所述S2可将软骨脱细胞基质光敏凝胶及适量的甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸弹性蛋白同时溶于去离子水中，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶、甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸弹性蛋白质量百分数为30-80％、10～50％及10～50％的软骨生物墨水。
实施例9
在上述各实施例的基础上，本实施例中，所述S3中的种子细胞为耳廓软骨细胞、关节软骨细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞及诱导多能干细胞中一种或多种。上述每一种子细胞均获取方便，其可在生物墨水中生长，增殖和分泌细胞外基质，借助细胞梯度形成基质梯度，达到功能细胞的仿生，有利于后续再造体表组织的制备。
实施例10
本实施例提供一种复合仿生体表组织的一体化构建方法，其包括以下具体步骤：
S0：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数为0.1％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以0.1mL/min的速度加入甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为0.1％的混合溶液；
加入浓度为1mol/L的氢氧化钠，使得上述混合溶液维持pH值在8之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应8小时；
反应结束后，用浓度为1mol/L的盐酸中和至pH为7，然后将中和后的溶液装在透析袋内在蒸馏水中充分透析后7天以上后冷冻干燥，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶；
S1：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的甲基丙烯酸明胶一并混匀，获得辅助剂一质量百分数为10％的软骨膜生物墨水；
S2：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸弹性蛋白并混匀，获得甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸弹性蛋白的质量百分数分别为10％和10％的软骨生物墨水；
S3：将适量的种子细胞加入所述S1得到的软骨膜生物墨水中形成种子细胞浓度为1×106/mL的混合溶液一，同时将适量的种子细胞加入所述S2得到的软骨生物墨水中形成种子细胞浓度为1×106/mL的混合溶液二；
S4：构建人体体表组织形态的三维数字模型；
基于上述三维数字模型，先利用3D生物打印机将所述S3得到的混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的一侧软骨膜层，然后利用3D生物打印机在上述软骨膜层上将所述S3得到的混合溶液二打印成相互连接的蜂窝状的软骨层，最后利用3D生物打印机在上述软骨层上将混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的另一侧软骨膜层，以一体化构建仿生体表组织。
实施例11
本实施例提供一种复合仿生体表组织的一体化构建方法，其包括以下具体步骤：
S0：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数为10％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以1mL/min的速度加入甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为1％的混合溶液；
加入浓度为10mol/L的氢氧化钠，使得上述混合溶液维持pH值在10之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应8-12小时；
反应结束后，用浓度为10mol/L的盐酸中和至pH为7，然后将中和后的溶液装在透析袋内在蒸馏水中充分透析后7天以上后冷冻干燥，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶；
S1：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的甲基丙烯酸明胶一并混匀，获得辅助剂一质量百分数为50％的软骨膜生物墨水；
S2：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸弹性蛋白并混匀，获得甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸弹性蛋白的质量百分数分别为50％和50％的软骨生物墨水；
S3：将适量的种子细胞加入所述S1得到的软骨膜生物墨水中形成种子细胞浓度为1×106/mL的混合溶液一，同时将适量的种子细胞加入所述S2得到的软骨生物墨水中形成种子细胞浓度为1×106/mL的混合溶液二；
S4：构建人体体表组织形态的三维数字模型；
基于上述三维数字模型，先利用3D生物打印机将所述S3得到的混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的一侧软骨膜层，然后利用3D生物打印机在上述软骨膜层上将所述S3得到的混合溶液二打印成相互连接的蜂窝状的软骨层，最后利用3D生物打印机在上述软骨层上将混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的另一侧软骨膜层，以一体化构建仿生体表组织。
实施例12
本实施例提供一种复合仿生体表组织的一体化构建方法，其包括以下具体步骤：
S0：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百分数为5％的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以0.5mL/min的速度加入甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为0.6％的混合溶液；
加入浓度为6mol/L的氢氧化钠，使得上述混合溶液维持pH值在9之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应10小时；
反应结束后，用浓度为6mol/L的盐酸中和至pH为7，然后将中和后的溶液装在透析袋内在蒸馏水中充分透析后7天以上后冷冻干燥，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶；
S1：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的甲基丙烯酸明胶一并混匀，获得辅助剂一质量百分数为30％的软骨膜生物墨水；
S2：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸弹性蛋白并混匀，获得甲基丙烯酸明胶和甲基丙烯酸弹性蛋白的质量百分数分别为30％和30％的软骨生物墨水；
S3：将适量的种子细胞加入所述S1得到的软骨膜生物墨水中形成种子细胞浓度为1×106/mL的混合溶液一，同时将适量的种子细胞加入所述S2得到的软骨生物墨水中形成种子细胞浓度为1×106/mL的混合溶液二；
S4：构建人体体表组织形态的三维数字模型；
基于上述三维数字模型，先利用3D生物打印机将所述S3得到的混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的一侧软骨膜层，然后利用3D生物打印机在上述软骨膜层上将所述S3得到的混合溶液二打印成相互连接的蜂窝状的软骨层，最后利用3D生物打印机在上述软骨层上将混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的另一侧软骨膜层，以一体化构建仿生体表组织。
实施例13
在上述各实施例的基础上，本实施例还提供一种采用如上所述的一体化构建方法制备的仿生体表组织。本发明构建出一种具有双侧软骨膜、中间软骨组织的体表组织，模拟含软骨膜体表组织的结构和组成成分特点，利用不同的仿生支架材料和功能细胞，以通过结构和成分仿生，实现力学仿生，提高构建物力学强度，满足体表组织再造的临床应用需求。
上述体表组织可以为耳廓组织，也可以为其他组织，例如鼻组织、气管组织和关节组织。
软骨膜生物墨水和软骨生物墨水分别经3D生物打印机成功地制备成规则排列的波浪状软骨膜和蜂窝状软骨层(图3-图5)，进一步结合一体化构建策略成功的制备成复合两侧软骨膜和中间软骨层的仿生体表组织(图6)，仿生构建物经体内培养后成功的再生为成熟的仿生软骨组织，截面观能看到软骨膜和软骨层具有明显的分层结构(图7)，组织学染色结果也显示有丰富的细胞外基质沉积，进一步证实了软骨膜和软骨组织的成功再生(图8)，再生组织的水平面大体观仍显示规则排列的波浪状(图9)，软骨膜层水平面组织学染色结果显示有大量的纤维胶原分泌，并排列为规则的波浪状(图10)，软骨层水平面组织学染色结果显示有大量成熟的软骨陷窝和软骨特异性细胞外基质沉积，并排列为规则的蜂窝状(图11)，最后，应用软骨膜生物墨水和软骨生物墨水，结合软骨膜和软骨的一体化仿生构建策略，经3D生物打印机成功了制备成复合软骨膜和软骨的人体耳廓构建物。
本发明中，微/纳米纤维由于具有比表面积大、孔隙率高、密度低、孔间结合性良好等结构特点，为软骨膜的结构仿生提供了技术支持；而生物打印技术可以实现多种细胞和材料联合构建，为软骨组织的结构仿生提供了技术支持；软骨脱细胞基质因具有软骨特异性微环境，良好的生物相容性和促进细胞增殖的潜能，为软骨膜和软骨组织的成分仿生提供了支撑。因此，本发明构建出一种具有双侧软骨膜、中间软骨组织的体表组织，模拟含软骨膜体表组织的结构和组成成分特点，利用不同的仿生支架材料和功能细胞，以通过结构和成分仿生，实现力学仿生，提高构建物力学强度，满足体表组织再造的临床应用需求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种复合仿生体表组织的一体化构建方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S0：对软骨组织进行预处理，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶；
S1：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的辅助剂一并混匀，获得辅助剂一质量百分数为10-50%的软骨膜生物墨水；
其中，所述S1中的辅助剂一为甲基丙烯酸明胶、甲基丙烯酸透明质酸、甲基丙烯酸海藻酸钠、甲基丙烯酸丝素蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖、甲基丙烯酸硫酸软骨素及甲基丙烯酸弹性蛋白中的一种或多种组合；
S2：在软骨脱细胞基质光敏凝胶中加入适量的辅助剂二并混匀，获得辅助剂二质量百分数为10-50%的软骨生物墨水；
其中，所述S2中的辅助剂二为甲基丙烯酸明胶、甲基丙烯酸透明质酸、甲基丙烯酸海藻酸钠、甲基丙烯酸丝素蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖、甲基丙烯酸硫酸软骨素及甲基丙烯酸弹性蛋白中的一种或多种组合；
S3：将适量的种子细胞加入所述S1得到的软骨膜生物墨水中形成种子细胞浓度为（1~50）×106/mL的混合溶液一，同时将适量的种子细胞加入所述S2得到的软骨生物墨水中形成种子细胞浓度为（1~50）×106/mL的混合溶液二；
S4：利用所述S3得到的混合溶液一和混合溶液二一体化构建复合仿生体表组织，包括以下具体步骤
S41：构建人体体表组织形态的三维数字模型；
S42：基于上述三维数字模型，先利用3D生物打印机将所述S3得到的混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的一侧软骨膜层，然后利用3D生物打印机在上述软骨膜层上将所述S3得到的混合溶液二打印成相互连接的蜂窝状的软骨层，最后利用3D生物打印机在上述软骨层上将混合溶液一打印成平行排列的线性或波浪形的另一侧软骨膜层，以一体化构建仿生体表组织。
2.根据权利要求1所述的复合仿生体表组织的一体化构建方法，其特征在于：所述S0中的软骨组织为耳软骨、关节软骨、肋软骨、肩胛软骨及半月板中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的复合仿生体表组织的一体化构建方法，其特征在于，所述S0包括以下具体步骤：
S01：软骨组织经液氮冷却后由粉碎机粉碎成软骨粉末，并依次经脱细
胞处理和酶消化处理后制成软骨脱细胞基质；
S02：称取适量的软骨脱细胞基质溶于适量的去离子水中配制成质量百
分数为0.1~10%的软骨脱细胞基质水溶液，然后在冰浴条件下以0.1~1 mL/min的速度加入甲基丙烯酸酐并混匀，获得甲基丙烯酸酐质量百分数为0.1~1%的混合溶液；
加入浓度为1~10mol/L的氢氧化钠，使得上述混合溶液维持pH值在
8~10之间，并于4℃避光条件下持续搅拌反应8-12小时；
反应结束后，用浓度为1~10mol/L的盐酸中和至pH为7，然后将中和
后的溶液装在透析袋内在蒸馏水中充分透析后7天以上后冷冻干燥，获得软骨脱细胞基质光敏凝胶。
4.根据权利要求3所述的复合仿生体表组织的一体化构建方法，其特征在于：所述S01中的脱细胞处理为低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理中的一种或多种组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的复合仿生体表组织的一体化构建方法，其特征在于：所述S3中的种子细胞为耳廓软骨细胞、关节软骨细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞及诱导多能干细胞中一种或多种。
6.一种采用如权利要求1-5任一项所述的一体化构建方法制备的复合仿生体表组织。
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